מאמר שיטה

בדיקת פלישה משותפת של מקרופאגים-גידול ספרואידים

1.7K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/67374

⸱

24 בינואר 2025

 , 
1Institute for Medical Microbiology, Virology and Hygiene, University Medical Center Hamburg-Eppendorf

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לחקירת האינטראקציה של מקרופאגים ראשוניים שמקורם במונוציטים אנושיים עם ספרואיד גידול במטריצת קולגן I תלת מימדית (תלת מימדית), עם אפשרות להשוות את ההשפעה של תכונות מסיסות ופיזיקליות של המיקרו-סביבה על פלישת התאים.

תקציר

האינטראקציה בין תאים חיסוניים ותאי סרטן והשפעתם על גרורות מייצגת היבט חשוב בחקר הסרטן. עד כה, רק כמה פרוטוקולים זמינים המאפשרים קירוב במבחנה של המצב in vivo . כאן, אנו מציגים גישה חדשה להתבוננות בהשפעה של מקרופאגים אנושיים על הפולשניות של תאים סרטניים, תוך שימוש בספרואידים של תאי קרצינומה של תאים לא קטנים H1299 המשובצים במטריצת קולגן I תלת מימדית (3D). עם מערך גידול משותף זה, בדקנו את ההשפעה של דלדול מבוסס RNA מפריע קטן (siRNA) של גורמים רגולטוריים במקרופאגים על הפלישה התלת-ממדית של תאים סרטניים מהספרואיד של הגידול בהשוואה לביקורת. שיטה זו מאפשרת קביעת פרמטרים שונים, כגון שטח הספרואיד או מספר התאים הסרטניים הפולשים, ובכך לזהות הבדלים בפלישת תאים סרטניים. במאמר זה אנו מציגים את ההגדרה המתאימה, דנים בניתוח שלאחר מכן, כמו גם ביתרונות ובמלכודות הפוטנציאליות של שיטה זו.

מבוא

מקרופאגים הם חלק עיקרי ממערכת החיסון המולדת ומייצגים את קו ההגנה הראשון במצבים פתולוגיים רבים, כגון זיהומים או פינוי פסולת תאים לאחר פציעות1. במהלך העשורים האחרונים, ההשפעה של תאי חיסון על התקדמות הסרטן הייתה היבט של מחקרים רבים. בהתאם לכך, הוכח כי מקרופאגים יכולים להקל על גרורות על ידי שיוך לגידולים ראשוניים והפיכתם למקרופאגים הקשורים לגידול (TAMs)2. מקרופאגים יכולים לשנות את פרופיל הביטוי שלהם כאשר הם נחשפים לתאים סרטניים, ומעדיפים בריחה של גרורות ממערכת החיסון3. בנוסף, הוכח שתאי סרטן יכולים לנצל פגמים במטריצה החוץ-תאית (ECM) הנוצרת על ידי מקרופאגים כדי לברוח מהגידול הראשוני וכי התנהגותם מתומרנת גם על ידי קליטת גורמים מופרשים, כולל שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs)4,5. משחק גומלין זה של היבטים פיזיקליים וכימיים מחייב פיתוח שיטות חדשות לאפיון ההשפעה של תאי חיסון על התפשטות הגידול והמיקרו-סביבה שמסביב.

גישות שונות פותחו לחקר התנהגות תאי החיסון בהקשר של גרורות in vivo6. עם זאת, באשר לכל הניסויים כולל בעלי חיים, יש צורך ברישיון לניסויים בבעלי חיים ומתקן לבעלי חיים; גישות אלה כבר דורשות הרבה פיתוח והכנה. יתר על כן, הניתוח הוא לעתים קרובות מסובך, במיוחד בכל הנוגע להדמיית תאים חיים, מכיוון שלא כל הדגימות נגישות לרוב ההגדרות המיקרוסקופיות. פיתוח שיטות חדשות לבדיקת השערות תחילה בתנאי מבחנה מוסמכים הוא גם הכרחי ומתוזמן, שכן המדע והחברה שואפים למחקר ללא בעלי חיים כדי להפחית את מספר בעלי החיים שהוקרבו.

בפרסום 7 שפורסםלאחרונה, חקרנו את ההשפעה של מקרופאגים אנושיים ראשוניים על הפולשניות של תאים סרטניים פולשים מכדור גידול. למטרה זו, הקמנו מבחן פלישה משותפת של מקרופאגים-גידול גידול מבוסס קולגן I. בהקשר זה, מטרתנו הייתה להבהיר את תפקידם של מסלולי מיחזור מהירים של מטריצת הממברנה מסוג 1 מטאלופרוטאינאז (MT1-MMP) במקרופאגים. בדקנו מקרופאגים שהתרוקנו עבור הקינזין הסופר-תהליכי KIF16B, שזיהינו כמניע עיקרי למיחזור MT1-MMP, והשפעתם על היכולות הפולשניות של תאי H1299 - חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) מספרואיד מוצק. מקרופאגים מדוללי KIF16B מראים רמות מופחתות של MT1-MMP הקשור לממברנה על פני השטח שלהם, בעוד שתאי H1299 עצמם לא טופלו.

למיטב ידיעתנו, לא תוארה שיטה דומה המאפשרת הדמיה וניתוח מלא של פלישה משותפת של מקרופאגים-גידול-ספרואידים. למרות שהתמקדנו בפרסום האחרון שלנו7 בניתוח תאים נודדים בנפרד המרוחקים מהספרואיד, הבדיקה מאפשרת מספר חקירות נוספות כגון מספר הגדילים הפולשים, חלבונים המעורבים באינטראקציה בין תא סרטני למקרופאגים, כמות פירוק הקולגן I או תכונות ספרואידיות אחרות כמו אורך ההיקף שלו.

פרוטוקול

פרוטוקול זה כולל שימוש במקרופאגים אנושיים ראשוניים שמקורם בדגימות דם של תורם. על פי ההנחיות האתיות של המרכז הרפואי האוניברסיטאי המבורג-אפנדורף, נאספו דגימות דם והתורמים פוצו. עיבוד נוסף של הדגימות בוצע בהתאם להנחיות הבטיחות שניתנו (למשל, טיפול בדגימות שלא נבדקו). עבודה עם מקרופאגים אנושיים ראשוניים במחקר זה נשפטה כבלתי מעורערת על ידי Ärztekammer Hamburg, גרמניה.

1. יצירת ספרואידים של גידול H1299 בגישה נטולת פיגומים (3 ימים מראש)

  1. לטפח תאים סרטניים באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2 ב-25 ס"מ2 צלוחיות תרבית תאים (ראה טבלת חומרים) עם מדיום תאים סרטני (מדיום הנשרים המותאם של Dulbecco [DMEM] + 1% פניצילין-סטרפטומיצין [pen-strep] + 10% סרום בקר עוברי [FBS] + 0.1 מ"מ חומצות אמינו לא חיוניות + 2 מ"מ L-גלוטמין) עד למפגש של 80%.
  2. שטפו את התאים פעם אחת עם תמיסת מלח פוספט (DPBS) של Dulbecco ונתקו אותם על ידי הוספת 1 מ"ל של חומצה טריפסין-אתילנדיאמינטטראצטית (EDTA) (0.25%, פנול-אדום) למשך 2 דקות. עצור את התגובה האנזימטית על ידי הוספת 2 מ"ל של מדיה של תאים סרטניים ובדוק את הניתוק תחת מיקרוסקופ אור.
    הערה: חשוב שתאי הסרטן יופרדו ושלא יהיו אשכולות של תאים סרטניים.
  3. העבירו את מתלה התאים לצינור תגובה של 15 מ"ל וצנטריפוגה אותו ב-245 x גרם למשך 5 דקות. לאחר מכן, הסר את תמיסת הטריפסין על ידי פיפטינג או שימוש במשאבה, שטוף את הגלולה לאחר מכן על ידי הוספת 5 מ"ל DPBS, וצנטריפוגה אותם שוב באותם תנאים.
  4. השעו מחדש את הגלולה ב-5 מ"ל של מדיום תאים סרטניים וספרו את התאים, למשל, עם תא נויבאואר. העבר 8,000 תאי H1299-GFP לתוך צלחת הידבקות נמוכה במיוחד של 96 בארות (ראה טבלת חומרים) בנפח סופי של 25 מיקרוליטר של מדיום תאים סרטניים.
  5. דגרו את החדר למשך 3 ימים בחממה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2. בדוק את הספרואידים מתחת למיקרוסקופ לאחידות. אל תשקול ספרואידים עם צפיפות נמוכה יותר או תאי סרטן בודדים לא מחוברים לניסויים נוספים.

2. הכנת מקרופאגים אנושיים ראשוניים מדגימות דם של תורם

  1. אם דגימות הדם של התורם אינן משמשות לבידוד תאים באופן מיידי, יש לאחסן אותן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, תוך ניעור.
  2. העבירו 20 מ"ל דם משקית עירוי לצינור תגובה של 50 מ"ל.
  3. לאחר מכן, הכינו צינור חדש של 50 מ"ל והוסיפו 15 מ"ל של מדיום הפרדת לימפוציטים (LSM).
  4. הוסף בזהירות את 20 מ"ל הדם לכל צינור המכיל LSM מבלי לערבב וצנטריפוגה אותו ב-450 x גרם למשך 30 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
  5. בינתיים, הכינו צינור חדש של 50 מ"ל והוסיפו 10 מ"ל של מכון הזיכרון רוזוול פארק (RPMI) -1640 בינוני.
  6. לאחר הצנטריפוגה, העבירו את השלב הצפוף והלבן ("מעיל באפי") בתוך הצינור המכיל דם לתוך הצינור המכיל RPMI המוכן והוסיפו את הנפח ל-50 מ"ל עם RPMI קר.
  7. צנטריפוגה את המתלה ב-450 x g למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס והשליכו את הסופרנטנט.
  8. השעו מחדש את התאים ב -10 מ"ל של RPMI קר.
  9. צנטריפוגה את התערובת שוב ב-450 x גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס, השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את הגלולה ב-50 מ"ל של RPMI.
  10. צנטריפוגה את הדגימה שוב ב-450 x g למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס, השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את גלולת התא ב-1.5 מ"ל של מאגר מונוציטים קרים (0.5% אלבומין בסרום אנושי + 5 מ"מ EDTA ב-25 מ"ל DPBS).
  11. הניחו את תרחיף התאים על קרח, הוסיפו 250 מיקרוליטר של מיקרו-חרוזים נגד CD14 ודגרו במשך 15 דקות על קרח.
  12. הכן עמודת הפרדה על ידי הוספת מסנן במדף מפריד מגנטי והוסף 900 מיקרוליטר של מאגר מונוציטים לשיווי משקל.
  13. יוצקים את מתלה התאים על המסנן ונותנים לו לזרום לתוך צינור פסולת על ידי כוח הכבידה.
  14. שטפו את העמודה, המכילה את התאים הקשורים לחרוזים המגנטיים, על ידי הוספת 1 מ"ל של מאגר מונוציטים.
  15. הכן צינור טרי של 50 מ"ל המכיל 20 מ"ל RPMI והחלף את צינור הפסולת מתחת לעמוד.
  16. הוסף 3 מ"ל של מאגר מונוציטים לעמודה, הסר אותו מהמתלה המגנטי והצמד את החותמת.
  17. לחץ את התאים לתוך הצינור המוכן של 50 מ"ל ומלא אותו עד 30 מ"ל נפח עם RPMI.
  18. ספרו את התאים (למשל, באמצעות תא ספירה של נויבאואר) תחת מיקרוסקופ אור והתאימו את מספר התא על ידי הוספת RPMI ל-2 x 106 תאים/מ"ל.
  19. זרע 1 מ"ל של תרחיף התא לכל באר של תא בן 6 בארות ודגר את הצלחת למשך 2-4 שעות ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2.
  20. בדוק אם התאים נדבקו כראוי והחלף את ה-RPMI במונומדיום של 1.5 מ"ל (20% סרום אנושי + 1% עט-סטרפטוקוקוס ב-RPMI).
  21. החלף את המדיום לאחר 24 שעות דגירה. בתנאים אלה, מונוציטים מתמיינים למקרופאגים תוך 6 ימים.

3. הכנת מקרופאגים

  1. ביום הניסוי יש לנתק את המקרופאגים בכמות מתאימה של אקוטאז לתנאי התרבות האישיים. לדוגמה, השתמש ב -500 מיקרוליטר של אקוטאז אם התאים נזרעים בצלחת של 6 בארות. דגרו את התאים במשך כ-40 דקות בתוך התמיסה, שטפו אותם פעם אחת עם 2 מ"ל DPBS וספרו אותם עם תא נויבאואר.
  2. עבור ספרואיד אחד, יש לדלל את המספר הרצוי של מקרופאגים ב-40 מיקרוליטר של קולגן שאני מערבב (2.5 מ"ג/מ"ל קולגן זנב חולדה I) ולערבב אותם על ידי מערבולת קצרה של צינור התגובה. בניסויים שנערכו, 200,000 תאים/מ"ל הראו הבדל ניתן לזיהוי בפלישת תאים סרטניים. שמור את תערובת תאי הקולגן על קרח, מכיוון שהיא תתחיל להתפלמר במהירות בטמפרטורת החדר (RT).

4. הגדרת מבחן הפלישה המשותפת

הערה: בהתאם לפורמט תא ההדמיה, מטרת הניתוח או מערך ההדמיה המתאים, ייתכן שיהיה צורך להעביר את ספרואיד הגידול מלוח ההדבקה הנמוך במיוחד ולהתאים את ערכי הקולגן והמדיה. השלבים הבאים מתארים את ההגדרה עבור דוגמה אחת בשקופית μ של 15 בארות.

  1. ראשית, שטפו את הכדור על ידי הוספת 300 מיקרוליטר DPBS. חותכים את קצה הפיפטה הכחולה של 1 מ"ל ולוקחים את הכדור עם DPBS. לאחר שאיבת הספרואיד התייצב בקצה, דחף לזמן קצר את הפיפטה לתחתית תא ההדמיה כדי להעביר את הגידול-ספרואיד על ידי מתח פנים.
    הערה: חשוב לציין שהחיכוך בקצוות שלא השתנו עלול להפריע לשלמות הספרואיד.
  2. הסר שאריות DPBS שהועברו עם הספרואיד ככל האפשר על ידי פיפטינג.
  3. הוסף במהירות 40 מיקרוליטר של תערובת קולגן I/מקרופאגים (ראה שלב 3.4) לתא ההדמיה המכיל את הספרואיד H1299-GFP.
  4. העבירו את הצלחת לאינקובטור תאים ודגרו את הצלחת למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 בתנאים לחים כדי לפלמר את תערובת הקולגן במלואה.
  5. לאחר פילמור יש להוסיף בזהירות 25 מיקרוליטר של מדיה של תאים סרטניים לכל באר ולדגור את הצלחת למשך 3 ימים בחממה בתנאים שתוארו קודם לכן. במידת הצורך, צלם את הדגימה החיה במיקרוסקופ סריקת לייזר בנקודות זמן רצויות.

5. קיבוע ומכתים נוספים

  1. על מנת לבצע צביעה אימונופלואורסצנטית, יש לתקן את המקרופאגים ואת הספרואידים H1299-GFP בתוך מטריצת הקולגן I. ראשית, הסר בזהירות את הסופרנטנט מכל דגימה בעזרת משאבה מבלי לגעת במטריצה.
    הערה: כדי למנוע הרס דגימה, ניתן להסיר את הסופרנטנט גם על ידי פיפטינג ידני ללא שימוש במשאבה.
  2. הוסף 50 מיקרוליטר של פורמלדהיד 3.7% ב-DPBS לכל באר ודגר את הדגימות למשך 5 דקות על קרח. לאחר מכן, הסר את תמיסת הקיבוע והוסף לה שוב 50 מיקרוליטר של תמיסת קיבוע טרייה. שלב זה חשוב להשגת רמת פורמלדהיד אחידה יותר בתוך הבאר. דגרו את הדגימות למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
    הערה: בהתאם לכמות הקולגן שאני מערבבת, זמני הדגירה עשויים להתארך למספר שעות.
  3. הסר את הקיבוע למחרת ושטוף את הדגימות על ידי הסרה חוזרת ונשנית של לפחות פעמיים DPBS בהתאם לנפח תא ההדמיה. דגרו אותם בקצרה במשך 5 דקות על קרח על שייקר לפני הסרת ה-DPBS על ידי פיפטינג. הדגימות מוכנות כעת לצביעה.
  4. צבעו את הדגימות על ידי הוספת תערובת של 1:100 של 4',6-דיאמידינו-2-פנילינדול (DAPI) (1 מ"ג/מ"ל, כדי להכתים גרעינים), ופאלודין 568 (כדי להכתים F-actin) ב-DPBS למשך 30 דקות לפחות ושטפו אותן פעמיים עם DPBS לפני ההדמיה.

6. הדמיה וניתוח פרמטרים שונים של גדילת גידול

הערה: ניתן לבצע את השלבים הבאים עבור דגימות הדמיה קבועות של תאים חיים.

  1. לתצפית על הגידול-ספרואיד, השתמש במיקרוסקופ סריקת לייזר הפוך המצויד במטרה פי 10 המאפשרת הדמיה של ערימת z של בערך השליש התחתון של הספרואיד.
    הערה: בשל עובי הדגימה, מיקרוסקופ דו-פוטוני עשוי להיות גם יתרון. לזיהוי אופטימלי של תאים בודדים, ייתכן שיהיה צורך בעוצמת לייזר וזמן חשיפה גבוהים יותר.
  2. לאחר הרכישה, שלב את המחסניות על ידי הקרנת z באמצעות פיג'י, שהיא תוכנת ImageJ (פיג'י). יתר על כן, עבד את הערוץ המתקבל של אות H1299-GFP על ידי החלת סף אוטומטי (למשל, סף אוטומטי של הואנג) והסר רעש שיורי על ידי הסרת כתמי התמונה בהתאם לכמות הרקע ועוצמת האות.
  3. מדוד את הפרמטרים הספרואידים באמצעות פיג'י.
    1. Area: מדדו את גודל הכדור בעזרת הכלי Wand .
    2. היקף: כלול את ההיקף בהגדרות המדידה.
    3. קוטר: כלול את קוטר החמוס בהגדרות המדידה.
    4. מעגליות: כללו את מתארי הצורה בקביעות המדידה.
  4. מדוד את הפרמטרים הבודדים של תאי הסרטן באמצעות פיג'י.
    1. מדוד את מספר התאים הפולשים.
      1. בחר את הספרואיד המרכזי עם הכלי Wand ומחק את האות. זה יסיר את הספרואיד כמו גם את כל האותות המחוברים של התאים, שעדיין מחוברים לספרואיד, מהניתוח.
      2. לאחר מכן, השתמש בכלי ניתוח חלקיקים או כמת את כל האותות הבודדים הנותרים.
        הערה: התוצאה תהיה מספר התאים הסרטניים הפולשים. בנוסף, התוצאה יכולה גם להראות את האזור המייצג המכוסה על ידי תאי הסרטן ולהתפרש כפלישה קולקטיבית או פלישה של תא בודד, בהתאם לגודל השטח. כדי לאמת עוד יותר את מספר התאים הסרטניים הפולשים, ניתן היה להניח מסכה של החלקיקים המנותחים מעל תעלת DAPI, ולספור גרעינים.
  5. יתר על כן, הערך את התוצאות באמצעות תוכנית סטטיסטית כגון GraphPad Prism או Microsoft Excel.
    הערה: פרוטוקול זה הוכח כחזק וגמיש כאחד. הוא שימש במעבדה שלנו יותר מ-50 פעמים, תמיד עם מקרופאגים אנושיים ראשוניים מ-3 תורמים לפחות, כדי להסביר את השונות של התורמים. במתכונתו הנוכחית, הפרוטוקול הוכח כמוביל לשיעור הצלחה של 90-95%. עם זאת, מכיוון שההגדרה מורכבת, תוצאות שונות עשויות להיות גם תוצאה, שכן האינטראקציה של מקרופאגים עבור כל ספרואיד היא אינדיבידואלית. לפיכך, ביצוע הניסוי לפחות 3 פעמים עם 5 ספרואידים מוצע לקבל תוצאה מובהקת סטטיסטית.

תוצאות

איור 1 מציג ספרואיד H1299-GFP שצולם בימי הדגירה המתאימים במטריצת קולגן I. תמונת שדה בהירות בהתאמה, שצולמה ביום 0, מראה גם את המקרופאגים האנושיים העיקריים בתרבות משותפת עם הספרואיד. התמונה המייצגת שתועדה ביום השלישי של הניסוי מוגדלת לאחר העיבוד. מצוינים פרמטרים שונים שניתן לנתח, כולל מספר התאים הפולשים, אתרי פלישה קולקטיבית והיקף כדורי. הטבלה המצורפת מציגה את התוצאות שהתקבלו מתמונה זו. מספר האותות שזוהו תואם את הרושם החזותי. לא נראים שיבושים בספרואיד המרכזי, מה שמעיד על פלישה ממשית של תאי סרטן בודדים ולא על תאים שמקורם בפסולת ספרואידית. כעת ניתן להשוות את התוצאות של ספרואידים ומצבים שונים באמצעות ניתוח סטטיסטי.

figure-results-1
איור 1: תוצאות מייצגות. (פאנל עליון) ספרואיד H1299-GFP צולם ביום 0, יום 1, יום 2 ויום 3 של הדגירה במטריצת קולגן I. (פאנל שמאלי אמצעי) תמונת שדה בהיר של הספרואיד המציגה את המקרופאגים האנושיים הראשוניים המתורבתים. (פאנל ימני אמצעי) תמונה מייצגת שנרכשה ביום השלישי הוגדלה לאחר העיבוד, ומציגה את הפרמטרים השונים שניתן לנתח (היקף ספרואיד באדום; מעקב ידני להדמיה טובה יותר). (פאנל תחתון) התוצאות שהתקבלו מהתמונה בלוח הימני האמצעי. הערה: מקרופאגים אינם נראים לעין, מכיוון שרק ערוץ ה-GFP נרשם כדי להבהיר את התנהגות התאים הסרטניים. פסי קנה מידה: 100 מיקרומטר. אנא לחצו כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

דיון

פלישת תאים סרטניים נותרה נושא חשוב אך לא נחקר בהקשר של תאי חיסון פולשים כמו מקרופאגים. פלישת תאי סרטן קולקטיבית ואינדיבידואלית הם תהליכים קריטיים במהלך גרורות והוכחו כמורידים את שיעור ההישרדות של חולי סרטן עקב ריבוי הנגיעות באיברים שונים 8,9. מחקרי in vivo מורכבים ומוגבלים למעבדות עם גישה למתקני דיור לבעלי חיים. יתר על כן, קשה גם לשלוט בתנאי in vivo או לתפעל באופן ספציפי היבטים בודדים. לכן, הצורך במערכת נגישה יותר נותר חיוני כדי לענות על שאלות בסיסיות בקו המחקר הראשון.

בעזרת השיטה המוצגת כאן, פיתחנו דרך שבה ניתן לנתח עוד יותר את ההשפעה של תאים במיקרו-סביבת הגידול (TME) על רכיבי ECM. ניתן להשתמש בו כדי להשוות את ההשפעה של מקרופאגים שעברו שינוי (למשל, מדולדל עבור מווסתים ספציפיים על ידי טיפול ב-siRNA) על הפולשניות של תאי סרטן בודדים מספרואיד מוצק. האם הסידור הפיזי מחדש של ה-TME או הגורמים המופרשים מייצג את הגורם העיקרי להתנהגות תאי הסרטן הנצפית אינו ברור כרגע ויש לנתח אותו ביתר פירוט.

בנוסף, גם תאי הסרטן עצמם יכולים להיות ניתנים למניפולציה, למשל על ידי טיפול ב-siRNA או נוקאאוט של רגולטורים ספציפיים. יתר על כן, ניתן לשפר את הניתוח על ידי השוואת מספר הגרעינים שנספרו בפרופיל התא המזוהה כדי לאפשר קביעה מדויקת יותר של תאים סרטניים פולשים.

השתמשנו בבדיקה זו כדי לקבוע את ההשפעה של מקרופאגים ב-TME על פלישת תאי הגידול. עם זאת, יש לציין גם שתאי גידול עשויים להשפיע על פעילות המקרופאגים, אולי באמצעות גורמים המופרשים בתוך המדיה. לכן יהיה זה גם מאמץ כדאי לזהות שינויים במקרופאגים, כגון שינוי במצב הקיטוב (M1 לעומת M2) על ידי צביעה אימונופלואורסצנטית באמצעות נוגדנים מתאימים. בעבר, ההשוואה בין תאים הגדלים בחד-שכבות לבין אלה שגודלו בסביבה תלת-ממדית הראתה הבדלים משמעותיים בפרופילי הביטוי שלהם10.

בנוסף, מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות (FACS) של תת-אוכלוסיות מקרופאגים ושילובם בהליך הניסוי יכול להיות מאלף. אחרון חביב, הדמיה מפורטת יותר של אזורי המגע שבהם מקרופאגים מקיימים אינטראקציה עם תאים סרטניים או עם פני השטח של הגידול יכולה להוביל לזיהוי מנגנונים נוספים הרלוונטיים לפלישה ואינטראקציה תלת מימדית.

ראוי לציין שלא ניתן לשלוט בו באופן מלא הוא המיקום המדויק של הכדור במרכז הבאר לאחר הוספת תערובת הקולגן. קשה במיוחד לווסת את כמות הקולגן מתחת לספרואיד. כאן, נקבעו שיטות אחרות המאפשרות מיקום מדויק של הספרואיד, למשל, על גבי תבניות אגרוז עם מספרי דגימה גבוהים יותר11. עם זאת, מכיוון ששחרור ציטוקינים הוא מנגנון נפוץ, כל הספרואידים בבדיקה רב-ספרואידית זו חשופים לגורמים מופרשים, וקשה לשלוט במספר תאי החיסון הפועלים על ספרואיד בודד.

מגבלה בסיסית אחת של פרוטוקול זה היא היכולת של קווי תאים סרטניים ליצור ספרואידים אחידים, ולכן הם ישימים רק לתת-קבוצה של קווי תאים. לדוגמה, תאי מלנומה של MeWo יוצרים מבנים תלת מימדיים לא אחידים, אך ללא ספרואידים אחידים.

כמו כן, יש לציין כי הבדיקה ניתנת להתאמה רבה, שכן ניתן לשנות רבות מתכונותיה, כגון חומר ה-ECM, מספר התא או על ידי הוספת גורמים ספציפיים כגון ציטוקינים לסופרנטנט. לכן הוא צריך להתאים מאוד למחקרים ראשוניים במבחנה של האינטראקציה בין תא סרטני לתא חיסוני וניתן להתאים אותו לשאלת המחקר הספציפית המטופלת כיום.

גילויים

המחברים מצהירים כי אין אינטרסים מתחרים.

תודות

המחברים רוצים להודות לאנדריאה מורדהורסט על התמיכה הטכנית המצוינת ותרביות התאים ולמרטין אפלבאכר על התמיכה המתמשכת. העבודה על פלישת מקרופאגים במעבדת SL נתמכת על ידי Deutsche Forschungsgemeinschaft (CRC877/B13; LI925/13-1).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
15 &מיקרו;-שקופיות אנגיוגנזה ibidi81506
AccutaseInvitrogen00-4555-56
Alexa Fluor 568 Phalloidin ThermoFisher ScientificA12380
CD14 MicroBeadsMiltenyi Biotec130-050-201
CO2 אינקובטורקלסר
קולגן I זנב עכברוש Corning354236
DAPIAppliChem
DMEM (1x) + GlutaMAXGibco31966-021
DPBSAnprotecMS01Y71003
FBSBio& תאFBS. S 0613
פיג'י NIHImageJ 2 גרסה: 2.3.0/1.53s
פורמלדהיד 37% 252549-500 מ"לסיגמא-אולדריץ'
H1299-GFP קו
אלבומין סרום אנושיסיגמא-אולדריץ'A5843
Leica TCS SP8 XLeica
L-גלוטמין Gibco25030-024
מדיום הפרדת לימפוציטים (LSM) 1077PromoCellC-44010
MS עמודותMiltenyi Biotec130-042-201
חומצות אמינו לא חיוניות סיגמא-אולדריץ'11140050
עט סטרפטוקוקוסגיבקו15140-122
RPMI-1640 גיבקו81275-034
TC-Platte 96 באר, BIOFLOAT, R SARSTEDT83,39,25,400
VORTEX-GENE 2 תעשיות מדעיות
תאים

מקורות

  1. Lendeckel, U., Venz, S., Wolke, C. Macrophages: shapes and functions. ChemTexts. 8 (2), 12(2022).
  2. Dallavalasa, S., et al. The role of tumor associated macrophages (TAMs) in cancer progression, chemoresistance, angiogenesis and metastasis - Current status. Curr Med Chem. 28 (39), 8203-8236 (2021).
  3. Pan, Y., Yu, Y., Wang, X., Zhang, T. Tumor-associated macrophages in tumor immunity. Front Immunol. 11, 583084(2020).
  4. Boutilier, A. J., Elsawa, S. F. Macrophage Polarization States in the Tumor Microenvironment. Int J Mol Sci. 22 (13), 6995(2021).
  5. Wenzel, E. M., et al. Intercellular transfer of cancer cell invasiveness via endosome-mediated protease shedding. Nat Commun. 15 (1), 1277(2024).
  6. Anfray, C., Ummarino, A., Calvo, A., Allavena, P., Torres Andon, F. In vivo analysis of tumor-associated macrophages in the tumor microenvironment. Methods Mol Biol. 2614, 93-108 (2023).
  7. Hey, S., Wiesner, C., Barcelona, B., Linder, S. KIF16B drives MT1-MMP recycling in macrophages and promotes co-invasion of cancer cells. Life Sci Alliance. 6 (11), e202302158(2023).
  8. Wu, J. S., et al. Plasticity of cancer cell invasion: Patterns and mechanisms. Transl Oncol. 14 (1), 100899(2021).
  9. Shi, X., et al. Mechanism insights and therapeutic intervention of tumor metastasis: latest developments and perspectives. Signal Transduct Target Ther. 9 (1), 192(2024).
  10. Li, G. N., Livi, L. L., Gourd, C. M., Deweerd, E. S., Hoffman-Kim, D. Genomic and morphological changes of neuroblastoma cells in response to three-dimensional matrices. Tissue Eng. 13 (5), 1035-1047 (2007).
  11. Lin, Y. N., et al. Monitoring cancer cell invasion and T-cell cytotoxicity in 3D culture. J Vis Exp. 160, e61392(2020).

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

הסגת ספרואידים של גידולמטריצת קולגן תלת-ממדיתפלישת תאי סרטןדילול מקרופאגיםRNA מפריע קטןמקרופאגים אנושיים ראשונייםמיקרוסקופיה של סריקת לייזרשילוב תרביות של תאים
בדיקת פלישה משותפת של מקרופאגים-גידול ספרואידים
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.