מאמר שיטה

מודל ריפוי פצעי כוויה דמוי לוח שחמט של עכברים המבוסס על מכשיר חימום דיגיטלי

2.4K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/67375

⸱

27 בדצמבר 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Oral Diseases & National Center for Stomatology & National Clinical Research Center for Oral Diseases, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University, 2Department of Endodontics, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University

במאמר זה

סיכום

מוצג פרוטוקול יעיל להקמת מודל ריפוי פצעי כוויות בעכברים באמצעות מכשיר חימום דיגיטלי. אתרי הניסוי דמויי לוח השחמט שנוצרו על העור מאפשרים ניתוח פונקציונלי נוסף לבדיקת ריפוי הפצעים.

תקציר

פציעות כוויות חמורות הן בין המצבים הטראומטיים והמתישים ביותר מבחינה פיזית, המשפיעות כמעט על כל מערכת איברים וגורמות לתחלואה ותמותה ניכרות. בהתחשב במורכבותם ובמעורבותם של איברים מרובים, נוצרו מודלים שונים של בעלי חיים כדי לשכפל היבטים שונים של פציעות כוויות. השיטות המשמשות לייצור משטחים שרופים משתנות בין מודלים של חיות ניסוי. מחקר זה מתאר מודל צריבת עכבר פשוט, חסכוני וידידותי למשתמש ליצירת כוויות עקביות בעובי מלא באמצעות מכשיר חימום דיגיטלי. קצה המכשיר הונח על הגב של עכברים למשך 10 שניות ב-97 מעלות צלזיוס כדי ליצור כוויה דמוית לוח שחמט ולבחון ריפוי פצעים בטיפול של חבישה ניסיונית. דגימות עור נאספו לניתוח היסטולוגי, כולל צביעת המטוקסילין ואאוזין (H&E) וצביעה של מאסון. ריפוי הפצע הוערך באמצעות ניתוח אזור הפצע ובדיקה מיקרוסקופית של חדירה דלקתית, אפיתל מחדש והיווצרות רקמת גרנולציה. מודל פציעת כוויות עכברים יכול לשמש כלי בסיסי בחקר הפתופיזיולוגיה של פגיעות תרמיות והערכת התערבויות טיפוליות.

מבוא

כוויות נחשבות לאחת הפגיעות הקריטיות בעור, הנגרמות מחשיפה לחום, חשמל, חומרים כימיים וחשיפה לקרינה 1,2. ניתן לסווג אותו לארבע מעלות בהתאם לעומק הפציעה, החל מהאפידרמיס ועד לעובי המלא של העור, ואפילו לשרירים ולעצמות. כוויות קטנות עלולות להוביל להיווצרות צלקות ולהגביר את הסיכון לזיהום. אזור גדול של פגיעת כוויות לא רק גורם לנזק מקומי, אלא גם ממריץ הפרעות בלב, בכליות ובאיברים או מערכות אחרות בגוף באמצעות דלקת חמורה וארוכת טווח ותגובות חיסוניות, מה שמוביל להשלכות מערכתיות חמורות ותחלואה גבוהה3. רוב ניצולי פציעות הכוויות מלווים בנכויות פיזיות ארוכות טווח, מצוקה רגשית וירידה באיכות החיים 4,5. לכן, חשוב ללמוד את התהליך הפתולוגי של כוויות ואת מנגנוני ההתחדשות של רקמה שרופה.

מעורב בתגובות חיסוניות, התחדשות רקמות והומאוסטזיס שיטתי, מחקרי מבחנה לא יכלו לחקור באופן מקיף את התהליך הפתולוגי של ריפוי פצעי כוויות. לפיכך, במהלך שני העשורים האחרונים, על מנת לחקור התערבויות טיפוליות פוטנציאליות, פותחו מודלים שונים של בעלי חיים לריפוי פצעי כוויות כדי לשכפל את המאפיינים השונים של פציעת כוויות 6,7. פצעי כוויות מיוצרים בדרך כלל על פני הגב של חזירים, חולדות, עכברים, ארנבות ובעלי חיים אחרים לאחר הסרת שיער. זמן הצריבה יכול להימשך 3 שניות עד 30 שניות כדי ליצור נזק תרמי בעובי חלקי עד מלא עם טווח של 5% עד 30% שטח פנים כולל של הגוף (TBSA)8. כיום אין מודלים סטנדרטיים של שיטות אלה במחקר בבעלי חיים כוויות בשל השונות הגבוהה של הטכניקות בהן נעשה שימוש. השיטות המשמשות לייצור משטחים שרופים משתנות בין מודלים של חיות ניסוי, כולל להבת גז9, אמבט אתנול בוער10, צלחת/מוט מתכת בודד מחומם מראש11,12, מים רותחים או חמים13,14. עם זאת, הטכניקה של גרימת כוויה ועומק הכוויה המיוצר לרוב אינם עקביים ומתוארים בצורה גרועה במחקרים קודמים, וזה חיוני בקביעת חומרת הכוויה ושיטת הטיפול בכוויות.

מחקר זה נועד לפתח מודל פשוט, חסכוני וידידותי למשתמש של כוויות עכברים ליצירת כוויות עקביות בעובי מלא בתרחישים קליניים מדומים. בפרוטוקול זה, השתמשנו במכשיר חימום דיגיטלי נוח כדי לשלוט בעומק הכוויה על ידי התאמת הטמפרטורה המופעלת על העור. ניתן להחליף את הקצה של מכשיר זה לגדלים שונים כדי לגרום לכוויות תרמיות עם טווחים משתנים של TBSA. זה מאפשר יצירת פצע כוויה דמוי לוח שחמט על גב העכבר, מה שמאפשר השוואה בין מספר טיפולים ניסיוניים וביקורת באותה חיה. צפינו ותיעדנו את תהליך סגירת הפצע. דגימות עור נאספו להערכה היסטולוגית (צביעת המטוקסילין ואאוזין (H&E) וצביעה טריכרומית של מאסון) בשלבים שונים של ריפוי הפצע. גישה זו מפחיתה את מספר בעלי החיים המשמשים בניסוי, ולכן מפחיתה את העלויות הכלכליות תוך התאמה רבה יותר לאתיקה של בעלי חיים. מחקר זה יספק לחוקרים כלים חיוניים כדי להקל על פיתוח טיפולים חדשניים לפציעות כוויות ולחשוף את המנגנונים הפתופיזיולוגיים של ריפוי פצעי כוויות.

פרוטוקול

כל ההליכים בבעלי חיים במחקר זה נבדקו ואושרו על ידי הוועדה האתית של בית הספר לסטומטולוגיה של מערב סין, אוניברסיטת סצ'ואן (WCHSIRB-D-2024-499). עשרים וארבעה עכברים בני שמונה שבועות C57BL/6 (נקבה, משקל גוף 25-30 גרם) שימשו למחקר הנוכחי. פרטי הריאגנטים והציוד המשמש מפורטים בטבלת החומרים.

1. הכנת ציוד ועכבר לפני פציעת כוויה

  1. רכשו את בעלי החיים ושיכנו אותם בכלובים למשך 7 ימים עם הגעתם כדי לאפשר להם להתאקלם בסביבה.
  2. עקר את אזור העבודה על ידי ריסוס וניגוב עם 70% אתנול (v/v). מכסים את שולחן הניתוחים ברפידות סופגות כירורגיות סטריליות.
  3. התאם את הטמפרטורה של מכשיר החימום הדיגיטלי ל-97 מעלות צלזיוס. מכשיר החימום מורכב משלושה חלקים (איור 1).
    הערה: ניתן לכוונן טמפרטורה בין 50-450 מעלות צלזיוס באמצעות בקר הטמפרטורה (איור 1A). בסיס המעמד משמש להצבת הקצה (איור 1B), הניתן לפירוק (איור 1C) כדי להחליף גדלים שונים של מכשירים. יש לחטא את הקצה ביודופור או באלכוהול.
  4. להרדים את העכבר עם איזופלורן 5% ב-100% חמצן בתא אינדוקציה למשך 3 דקות (קצב זרימה: 4 ליטר לדקה) עד להאטת הנשימה. העריכו את עומק ההרדמה באמצעות בדיקת צביטה בבוהן.
    הערה: שאיפת איזופלורן עלולה להוביל לנמנום ולפגוע במערכת הלב וכלי הדם. חיוני ללבוש ציוד מגן ולטפל בו בתוך מכסה אדים באזור מאוורר היטב.
  5. לאחר שהעכבר מורדם עמוק, העבירו אותו לכרית מחוממת במצב נוטה כדי לשמור על חום ולמנוע היפותרמיה במהלך ההתאוששות מההרדמה. הפחיתו את האיזופלורן ל-1. 5% חמצן לתחזוקה באמצעות חרוט אף.
  6. מרחו ג'ל סיכה על שתי עיני העכבר בעזרת צמר גפן כדי למנוע ייבוש בקרנית.

2. גרימת פציעת כוויה בעובי מלא

הערה: התהליך הכללי של אינדוקציה וניתוח כוויות מוצג באיור 2.

  1. לגלח את עור העכבר בעזרת מכונת גילוח חשמלית על שטח באורך של כ -5 ס"מ ורוחב של 4 ס"מ מהצוואר ועד הזנב. עבוד בעדינות כדי למנוע פציעה של העור בעת הגילוח (איור 3C).
  2. השתמש באפליקטור עם קצה כותנה כדי למרוח קרם הסרת שיער על אזור העור המגולח למשך 3 דקות (איור 3D).
    הערה: הימנע ממריחת קרם האפילציה על חלקים אחרים של העכבר כדי למנוע כוויות, שעלולות להיות קשות לזיהוי. הקרם גרם לפריחות בעור בשימוש במשך יותר מ-5 דקות. משך הזמן המדויק ליעילות אופטימלית משתנה בין המוצרים וצריך להיקבע על ידי המפעיל.
  3. נגבו את הקרם בעזרת גזה לחה עד שלא מזהים קרם ושיער. חיטוי אזור הניתוח עם קרצוף כלורהקסידין ואחריו 70% אתנול (v/v) שלוש פעמים כל אחד. יש לנקות ולייבש את האזור בעזרת גזה סטרילית.
  4. השתמש בקצה פיפטה מעוקר של 1 מ"ל בקוטר 9 מ"מ (איור 3A) טבול בדיו מעוקר כדי לאתר במדויק את אתרי הפציעה הרצויים. עור הגב של העכבר מאופיין בטופוגרפיה לא אחידה. הגדרת אזור הפצע בנפרד מחוט השדרה של עכברים חיונית כדי להבטיח חזרתיות.
  5. כסו את העור בווילון סטרילי שנגזז בעבר, והשאירו את אזור הניתוח פנוי (איור 3). לבש כפפות עמידות בחום ובדוק את הטמפרטורה של מכשיר החימום הדיגיטלי. לפני ואחרי השראת כוויה, יש לחטא את קצה המכשיר עם 70% אתנול (v/v).
  6. מרחו את קצה מכשיר החימום על מרכז אתרי הפצע הממוקמים (97 מעלות צלזיוס למשך 10 שניות) כדי ליצור שישה פצעים עגולים בקוטר של 4 מ"מ (איור 3B). המרווח בין כוויות סמוכות הוא 0.5-1 ס"מ. קבע את מספר הכוויות בהתאם לתכנון הניסוי.
    הערה: הכוויה נגרמת בעיקר על ידי הולכת חום; לכן, אין צורך להפעיל לחץ על המוט, כלומר לשמור אותו במגע עם העור על ידי כוח הכבידה בזמן השראת כוויה. היו שש כוויות לתכנון הניסוי. זהו המספר המקסימלי של פצעי כוויות שניתן לבנות בהתאם למכשיר בו השתמשנו ואזור הגב של העכבר. ניתן להשיג שכפולים מרובים של אותה קבוצת ניסוי על בסיס זה.

3. טיפול ומדידה לאחר כוויה

  1. מרחו קרח על פצע הכוויה למשך 5 דקות כדי להפחית כאב פוטנציאלי לטיפול בכאב (איור 3G).
  2. כבה את האיזופלורן, והסר את חרוט האף לאחר פציעת הכוויה. העבר את העכבר לכרית חימום עד שהעכבר זז כרגיל (למשל, לא כפוף או רועד).
  3. הנח כל עכבר בכלוב התאוששות כדי למנוע מהם לשרוט אחד את השני. רככו כמה כדורי מזון על ידי הוספת 5-10 טיפות מי שתייה לכל כדור והניחו אותם על רצפת הכלוב כדי להקל על ההאכלה.
    הערה: עיקור הכלובים על ידי ריסוס וניגוב עם 70% אתנול (נפח/נפח). יש להחליף את המצעים באופן קבוע כדי לשמור על חום העכברים ולספוג שתן.
  4. יש לתת בופרנורפין (0.1 מ"ג/ק"ג) תת עורי במקום זנב פעמיים ביום למשך 3 ימים בסך הכל, תוך הקפדה על לפחות 8 שעות בין הזריקות.
  5. נקה את כל הפצעים עם גזה סטרילית לחה במי מלח לאחר 24 שעות של השראת כוויה. יש למרוח את העור בגזה ולמרוח כמות קטנה של ג'ל אנטיבקטריאלי (הידרוג'ל TKH) באמצעות מזרק לכיסוי פצע הכוויה12,14. חזור על הליך זה בימים 3, 7 ו-10 לאחר מכן.
  6. השתמש בתחבושת נושמת ושקופה כדי לכסות את הפצעים. גודל התחבושת צריך לכסות כ-1 ס"מ סביב הפצע ולא לכסות את האזור ללא הסרת שיער.
    הערה: החלף את חבישת הפצע לפחות אחת ליומיים. שימוש ממושך בתחבושת ללא החלפה עלול להוביל לזיהום בפצע עם היווצרות מוגלה, וכתוצאה מכך לעיכוב בריפוי הפצע.
  7. לאורך כל תקופת המעקב, יש למדוד את המשקל כל 2-3 ימים. באופן כללי, עכברים שמאבדים 15%-20% ממשקל גופם ההתחלתי צריכים להיות מוקרבים ולהוציא אותם מהניסוי.

4. איסוף פצעים

  1. בגיל 0, 3, 7, 10 ו-14 ימים, סמנו את הפצע בקצה קצה פיפטה סטרילי של 1 מ"ל, והקליטו אותו במצלמה דיגיטלית.
  2. המתת חסד של העכברים על ידי מנת יתר של הרדמה ופריקת צוואר הרחם (בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי המוסד).
    הערה: היזהר במהלך פריקת צוואר הרחם כדי למנוע משיכה מוגזמת, שעלולה לפגוע בפצעי הגב.
  3. בעזרת מספריים, בודד את מקום הפצע והעור שמסביב, כולל השרירים הבסיסיים (1 ס"מ על 1 ס"מ). התכוננו לפחות לשלוש דגימות לכל קבוצה.
  4. יש לקבע את דגימות העור ב-4% פרפורמלדהיד (PFA) למשך 24 שעות ולאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. נפח הקיבוע חייב להיות פי 30 מנפח הרקמה15,16.
    הערה: PFA מסוכן. הקפידו לעבוד באזור מאוורר היטב והשתמשו בציוד מגן מתאים.

5. הערכת ריפוי פצעים

  1. שטפו את רקמת הפצע פעמיים עם PBS ומרחו אותה עם נייר פילטר, אותו יש לקצץ לגודל מתאים (איור 2H). בשל נוכחותו של תוכן רירי כלשהו בתוך שכבת הרקמה התת עורית, הוא נצמד למשטח נייר הסינון ללא תנועה או סלסול רקמות.
    1. הכניסו את נייר הסינון והדגימה לקלטת טישו להתייבשות פרפין כדי לקבל דגימות רקמה חלקות יחסית ולאחר מכן הטמיעו את הרקמה15,16. יש לאחסן דגימות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
      הערה: מתחו את הרקמה ככל האפשר והימנעו מכל קיפול, מכיוון שהקפלים הללו יהפכו לקבועים לאחר הקיבוע.
  2. חותכים את הדגימות המשובצות בפרפין למקטעים בעובי של 5 מיקרומטר ומכתימים שקופיות באמצעות H&E וטריכרום של מאסון להערכת היקף רקמת הגרנולציה, היווצרות אנגיוגנזה ושקיעת קולגן, ומספקים ראיות להערכת השלבים השונים והתקדמות ריפוי הפצע17,18.
  3. צלם תמונות של כל הדגימות באמצעות מיקרוסקופ עם מטרה של פי 40.
  4. השתמש בתוכנה תואמת כדי לנתח את קטע העור המוכתם, כולל האפידרמיס, הדרמיס, הרקמה התת עורית ומצב השרירים.

תוצאות

בפרוטוקול זה, פצעי כוויה דמויי לוח שחמט נוצרו עם משך צריבה של 10 שניות ב-97 מעלות צלזיוס על ידי התקן החימום הדיגיטלי (איור 1). קצה המכשיר עשוי מנחושת טהורה, הידועה בהולכת החום המצוינת וביכולות החימום המהירות שלה. האחיזה המוחזקת על ידי הנסיין עשויה מחומר פוליקרבונט, המספק עמידות בחום ואי דליקות. בהשוואה לשיטות צלחת/מוט מתכת בודד או מים רותחים או מים חמים המחוממים מראש, מכשיר זה מפגין ביצועי בטיחות מעולים ומפחית את זמן ההרדמה בעכברים, וכתוצאה מכך מקצר את משך הניסוי הכולל.

התהליך הכללי של אינדוקציה וניתוח כוויות מוצג באיור 2. לכל חיה היו שישה פצעי כוויה על הגב, מסודרים כפי שמתואר באיור 2E. גודל הפצע בבעלי חיים אלה הוערך, ודגימות עור נאספו לניתוח היסטולוגי, כולל צביעת H&E ו-Masson trichrome בימים 1, 3, 7, 10 ו-14, בהתאמה.

כל פצע כוויה היה עגול בצורתו עם שטח שווה כמו גם עומק אחיד לאחר השראת כוויה. צבע הקצה של פציעת הכוויה השתנה מלבן שעווה לאדום, מלווה באזור היפרמי עקב התגובה הדלקתית המיידית לפציעה. נוסף על כך, גודל פצע הכוויה גדל מעט במהלך 72 השעות שלאחר הכוויה (איור 4A).

ניתוח מיקרוסקופי של קטעי הפצעים המוכתמים בטריכרום של H&E ומאסון (איור 4B) חשף הרס מוחלט של שכבת האפידרמיס ונזק לעובי המלא של הדרמיס, המשפיע הן על השומן התת עורי והן על השרירים. בדיקה היסטולוגית הצביעה על כך שתהליך ריפוי הפצע היה בשלב הדלקתי ביום השלישי, המאופיין בהרחבת כלי דם וחדירה משמעותית של תאים דלקתיים. ירידה ניכרת באזור הפצע נצפתה ביום 7 לאחר הצריבה בהשוואה ליום 3, כפי שניתן לראות בתמונות מיקרוסקופיות של הדגימות. רקמת גרנולציה ולב וכלי דם נוצרו, וסיבי קולגן מופקדים בצפיפות ביום ה-14, מה שאומר שריפוי פצעים נכנס לשלב השיפוץ. הפצעים החלימו ללא זיהום ברור לאורך תהליך הריפוי.

נוסף על כך, יכולות ריפוי הפצעים הוערכו על ידי כימות נתוני ריפוי פצעים וניתוח מעקב אחר פצעים (איור 5). החלמת הפצע נצפתה כמשופרת בפצעים שטופלו בהידרוג'ל פפטיד TKH12,14, כפי שמעידים אזורי פצע קטנים משמעותית בימים 7, 10 ו-14.

המרווח בין פצעים סמוכים (איור 6), רוחבי או אורכי, לא אישר שום הבדל בהשוואה לעור ללא כוויות. האפידרמיס, הדרמיס והרקמות התת-עוריות היו שלמות, ולא הייתה חדירת לימפוציטים ולא הרחבת כלי דם. תהליך הריפוי של שני הפצעים אינו מפריע זה לזה. לכן, ניתן ליישם תרופות או חבישות שונות לטיפול בפצעים על בסיס המודל כדי להעריך את ההשפעה in vivo.

figure-results-1
איור 1: התקן חימום דיגיטלי עבור השראת צריבה. מכשיר החימום הדיגיטלי המשמש לגרימת פציעות כוויות. (א) בקר הטמפרטורה מאפשר הגדרות טמפרטורה הנעות בין 50-450 מעלות צלזיוס. (ב) בסיס המעמד משמש להחזקת קצה השריפה. (ג) ניתן להחליף את קצה המכשיר לגדלים שונים. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: סכמטי של מודל הפצע דמוי לוח השחמט. מתווה שלב אחר שלב לשחזור מודל הפצע דמוי לוח השחמט המתואר במאמר. (A) עכבר בן 8 שבועות משמש כמודל לניסויים בריפוי פצעים. (B) השיער מוסר מאזור הפציעה המיועד. (C) ששת אתרי הפציעה מסומנים באמצעות קצה פיפטה של 1 מ"ל. (ד) מכשיר חימום דיגיטלי משמש ליצירת שישה פצעי כוויות במרכז כל אתר מסומן (E). (F) תמונת תקריב של הגב לאחר השראת כוויה. (G) דגימות עור (כ-1 ס"מ ×-1 ס"מ) נקצרות בימים 3, 7, 10 ו-14. (H) דגימות העור משוטחות באמצעות נייר פילט ומועברות לקלטות מוטמעות. (I) מבוצעת התייבשות פרפין, ו-(J) הדגימות נחתכות לעובי של 5 מיקרומטר. (K) הקטעים מוכתמים באמצעות המטוקסילין ואאוזין (H&E), והטריכרום של מאסון. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: תהליך אינדוקציה של פציעות כוויות בעובי מלא. (A) הקוטר של קצה פיפטה של 1 מ"ל ו-(B) קצה התקן החימום הדיגיטלי הם 9 מ"מ ו-4 מ"מ, בהתאמה. (C) האזור הגבי של העכבר מגולח באמצעות מכונת גילוח חשמלית. (D) קרם אפילציה נמרח במשך 3 דקות. (E) האזור המגולח מנוקה ומייבש, ונקודות הפציעה מסומנות בקצה פיפטה מעוקר של 1 מ"ל. (F) מכשיר החימום הדיגיטלי מופעל בטמפרטורה של 97 מעלות צלזיוס למשך 10 שניות כדי ליצור שישה פצעי כוויות. (G) מורחים קרח על פצעי הכוויות לטיפול בכאב. (H) כל החלק האחורי של העכבר מראה את ששת פצעי הכוויה בעובי מלא. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4
איור 4: תמונות מייצגות של פצעי כוויות וניתוח היסטולוגי. (A) תמונות של פצעי כוויות בימים 3, 7, 10 ו-14, שמראות את התקדמות הריפוי. (B) תמונות היסטולוגיות מוכתמות ב-H&E ובטריכרום של מאסון מדגימות ריפוי פצעים והתחדשות העור. פסי קנה מידה = 200 מיקרומטר. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-5
איור 5: שינויים בגודל הפצע לאורך זמן. (A) השונות בגודל הפצע בקבוצת הביקורת ובחיות שטופלו בהידרוג'ל TKH לאורך זמן, מנותחת באמצעות תוכנת ImageJ. (ב) מוצגים נתוני עקבות פצעים מתאימים. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-6
איור 6: פצעי כוויות סמוכים וניתוח היסטולוגי. (A) תמונות מייצגות של פצעי כוויות סמוכים ביום הראשון. (B) דגימות פצעים סמוכות שנאספו לניתוח היסטולוגי ביום השלישי (מוקפות בעיגול אדום). (C) נייר סינון משמש להשטחת דגימות הרקמה לפני התייבשות פרפין. (D) ניתוח הטריכרום של H&E ומאסון של פצעים סמוכים. פסי קנה מידה: 1 מ"מ ו-200 מיקרומטר (מוגדל). אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

דיון

עבור מחקרי כוויות, מודלים במבחנה מתמקדים בדרך כלל בהשפעות המעכבות של חומרים אנטי-מיקרוביאליים מקומיים או אנטיביוטיקה על חיידקים הקשורים לכוויות, כגון Staphylococcus aureus ו-Pseudomonas aeruginosa19, כמו גם בהשפעה של חומרים ביולוגיים שונים (כמו אלסטין, משי וחבישות הידרוג'ל14,20) על תאים דלקתיים לאחר שריפה (כגון נויטרופילים, מקרופאגים) או תאי גזע (כמו תאי גזע מזנכימליים). ניסויים אלה נערכים בדרך כלל בסביבות מבוקרות באופן מלאכותי, ותאים שגודלו במבחנה עשויים להפגין מאפייני גדילה והתנהגויות שונות מאלה in vivo, שעלולים להיכשל בשכפול מלא של התהליכים הפיזיולוגיים של ריפוי פצעי כוויות, כגון אינטראקציות בין תאים והשפעת המטריצה החוץ-תאית. מסיבות אלה, מודלים של כוויות בבעלי חיים חיוניים להבהרת המנגנונים הפתולוגיים לאחר כוויה ולהערכת גישות טיפוליות חדשות. תהליך ריפוי הפצעים בעכברים ובבני אדם עובר ארבעה שלבים חופפים אך נפרדים: דלקת, התפשטות, אפיתל מחדש ועיצוב מחדש21,22. ישנם מספר יתרונות ביולוגיים לשימוש בעכברים כנבדקי ניסוי, כולל הזמינות של ריאגנטים רבים ספציפיים לעכבר וההיתכנות של יצירת מודלים טרנסגניים כדי לחקור את מסלולי האיתות המולקולריים המעורבים בתהליך ההתאוששות. זה הופך את העכברים לאחד המודלים הנפוצים ביותר של בעלי חיים למחקר על כוויות וריפוי פצעים.

המחקר הנוכחי ביסס מודל פצע דמוי לוח שחמט של פציעת כוויות בעובי מלא והעריך את היעילות של חבישת הידרוג'ל באמצעות מודל זה. התוצאות מצביעות על כך שמודל זה יכול לנטר ביעילות את הביצועים הקליניים של חבישות ניסיוניות. בתוך כל בעל חיים, שישה פצעי כוויות פוזרו באופן סימטרי לאורך עמוד השדרה. פצעי כוויות יכולים להיווצר במקומות דומים אך בעכברים שונים. בשל שטח העור המוגבל של הגב ומספר הפצעים, ניתוח היסטולוגי הראה כי הפצעים לא היו באינטראקציה זה עם זה, מה שהבטיח הערכה עצמאית של כל חבישה ניסויית במקומות שונים על אותו גב עכבר, תוך מזעור הטיה הקשורה לתהליך ריפוי הפצע. בנוסף, מודל זה נהנה גם מהבטחה שכל עכבר ישמש כבקרה משלו, מה שמאפשר להשוות טיפולי ניסוי ובקרה על הגב של אותו עכבר, מה שמוביל להפחתה משמעותית במספר בעלי החיים ובעלות הניסוי. בשל ההשפעות השונות של תרופות שונות על הבריאות הכללית של עכברים, אם יש למרוח מספר תרופות על עורו של אותו עכבר לטיפול בפצעים שונים והשוואה לאחר מכן, ייתכן שיהיה צורך להתבונן ולוודא אם יישום של תרופה בודדת או יישום משולב של תרופות שונות ישפיעו על הבריאות הכללית של העכבר. בנוסף, יש לשים לב ליציבות או הדבקה של תרופות שונות על פני העור כדי למנוע זיהום צולב של תרופות או זיהום פצעים עקב גירוד העכבר בתהליך הריפוי.

איסוף דגימות עור הוא חיוני לניתוח היסטולוגי שלאחר מכן. קצה הרקמה יתכווץ ויתקפל בקיבוע ללא כל טיפול16. לאחר התייבשות פרפין וחתך, הוא גם יהיה מעוקל או אפילו חופף חלקית בשקופית, וכתוצאה מכך תמונות מכוערות מתחת למיקרוסקופ ועלולות להשפיע על ניתוח היסטולוגי נוסף, כגון ניתוח סטטיסטי של אורך או עובי הפצע. לכן, שימוש בנייר פילטר כדי לשטח את הרקמה יכול לקבל קטע חלק יותר בשקופית, מה שהופך את התמונה ההיסטולוגית למסודרת ומקל על ניתוח סטטיסטי נוסף. ניסינו גם להשתמש במהדק נייר כדי לתקן את הדגימה לפני התייבשות, מה שעזר להבטיח את חלקות הרקמות. עם זאת, מריחת מהדקי נייר עלולה להפעיל לחץ על הרקמה המהודקת, מה שמוביל לסחיטת רקמות ועיוות. לכן, בעת שימוש בשיטה זו, לא ניתן להדק את חלק פצע הכוויה כדי למנוע השפעה על התצפית.

גורמים רבים יכולים להשפיע על תהליך הריפוי, כולל כאב, גירוד וזיהום חיידקי23. ניהול יעיל של כאבי כוויות הוא חיוני להחלמה ושילוב מחדש של חולים עם פציעות כוויות. שליטה לא מספקת בכאב עלולה לעכב את תהליך הריפוי, ולהוביל לאתגרים פיזיים ופסיכולוגיים מתמשכים, כמו גם אשפוז ממושךבבית החולים. באופן כללי, כאב משפיע על התנהגות האכלה בעכברים. לכן, כל פצע טופל מיד בקרח לאחר הכוויה, והזריק בופרנורפין (0.1 מ"ג/ק"ג) תת עורי פעמיים ביום למשך 3 ימים לטיפול בכאב. בנוסף, כדורי מזון רוככו והונחו על רצפת הכלוב כדי להקל על ההאכלה. במסגרות דיור משותפות, עכברים עלולים לשרוט וללקק את פצעיו של זה, מה שעלול לעכב את ריפוי הפצעים או לגרום לזיהומים. לכן, דיור פרטני של עכברים הופך להיות הכרחי כאמצעי מניעה. שימוש בחבישה נושמת לכיסוי הגב לאחר השראת כוויה יכול למנוע מהעכברים לשרוט את הפצע ולהפחית את הסיכון לזיהום25. עם זאת, חיוני לבחור חבישות בשיקול דעת ולחתוך אותן לגודל המתאים כדי לאפשר תנועה תקינה של העכברים. יש להחליף מיד תחבושות אם הן נושרות, עם המלצה להחליף אותן לפחות אחת ליומיים. שימוש ממושך בתחבושות עלול להוביל לספיגה לא מספקת של הפרשות פצעים.

למרות שלמודל העכבר יש את היתרונות הספציפיים שלו, הוא עדיין לא יכול לדמות באופן מלא את תהליך ריפוי הפצעים בבני אדם. בני אדם נרפאים בעיקר באמצעות אפיתל מחדש וגרנולציה. לעומת זאת, עור העכבר כולל panniculus carnosus ייחודי, שכבה דקה של שריר השלד הקיימת רק בפלטיזמה של הצווארבבני אדם, כך שריפוי פצעים מתרחש בעיקר באמצעות התכווצות פצע. בנוסף, עור העכבר עשוי להיות בעל מאגר מועשר של תאי אב, המאפשר ריפוי מהיר של העור וקרטיניזציה26,27. גורמים אלה תורמים באופן קולקטיבי לקיצור משמעותי של זמן הריפוי. במודלים של בעלי חיים, טבעות נגד התכווצות פצע שימשו כדי להפחית את ההשפעה של התכווצות הפצע על תהליך הריפוי ולחקות ריפוי פצעים פיזיולוגי דמוי אדם הנרפא עם רקמת גרנולציה ואפיתל מחדש 12,17,28.

ההקמה המוצלחת של מודל פציעת כוויות עכברים מספקת כלי רב ערך לחקר הפתופיזיולוגיה של פציעות תרמיות ולהערכת התערבויות טיפוליות פוטנציאליות. השינויים ההיסטולוגיים שנצפו ברקמת העור השרופה עולים בקנה אחד עם המאפיינים האופייניים לפגיעה תרמית, ומדגישים את האמינות והתוקף של המודל בסיכום הביטויים הקליניים של כוויות.

בסך הכל, מודל פציעת כוויות עכברים מציע פלטפורמה חזקה לחקירת המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס נזק לרקמות הנגרמות על ידי כוויות, דלקת ותהליכי ריפוי פצעים. מחקרים עתידיים המשתמשים במודל זה עשויים לתרום לפיתוח גישות טיפוליות חדשות שמטרתן לשפר את התוצאות עבור חולי כוויות ולהפחית את נטל התחלואה והתמותה הקשורות לכוויות.

גילויים

המחברים מצהירים שאין ניגוד עניינים.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי תוכנית המדע והטכנולוגיה של סצ'ואן (23ZYZYTS0120), מענקי אוניברסיטת סצ'ואן של בית החולים לסטומטולוגיה של מערב סין (RD-03-202011) ותוכנית המדע והטכנולוגיה של סצ'ואן (2022NSFSC0614). הדמויות נוצרו באמצעות BioRender. com.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
קצה פיפטה 1 מ"לKIRGEN, ארה"בKG1333משמש לאיתור אתרי פצעי כוויה
3 M סרט Tegaderm3M, ארה"ב1624WCN 6 ס"מ x 7 ס"מלכיסוי הפצע לאחר אינדוקציה של כוויה
4% paraformaldehyde (PFA)Biosharp, סיןBL539Aמשמש לתיקון דגימות העור
BuprenorphineSigma-Aldrich, ארה"בPHR8955-50MGלטיפול בכאב של העכברים
C57BL / 6 עכבריםצ'נגדו Dashuo חברת בעלי חיים ניסיוניים, סיןאף אחדלהקמת מודל לשרוף
קרם אפילטוריVeet, סין& mdash;להסרת שיער הגב של העכברים
מכשיר חימום דיגיטלישנזן Kapper Technology Company, סיןNo.936Dלשריפה אינדוקציה של עכברים
מכונת גילוח חשמליתAUX, סיןAUX-A5להסרת שיער הגב של העכברים
נייר סינון——משמש לפתיחת דגימות העור
תוכנת GraphPad—מנסרת GraphPad 9.5.0לניתוח אזור פצע כוויות
כפפות עמידות בחום——משמש להחזקת קצה מכשיר החימום הדיגיטלי
ערכת כתמי המטוקסילין ואאוזיןSolarbio,ChinaG1120לניתוח היסטולוגי של השקופיות
תוכנת ImageJmdash;ImageJ 1.54fלניתוח אזור פצע הכוויה
IsofluraneRWD, סיןR510-22-10להרדמת העכברים
ערכת כתמי הטריכרום של מאסוןSolarbio, סיןG1340לניתוח היסטולוגי של השקופיות
מיקרוסקופאולימפוס, יפן VS200 ASWמשמש לסריקת H& שקופיות מוכתמות E ומאסון
רקמותCITOTEST LABWARE MANUFACTURING CO., LTD, סין31050102Wלהתייבשות פרפין רקמות והטמעת פרפין
& קלטת

מקורות

  1. Mofazzal Jahromi, M. A., et al. Nanomedicine and advanced technologies for burns: Preventing infection and facilitating wound healing. Adv Drug Deliv Rev. 123, 33-64 (2018).
  2. Burgess, M., Valdera, F., Varon, D., Kankuri, E., Nuutila, K. The immune and regenerative response to burn injury. Cells. 11 (19), 3073(2022).
  3. Arbuthnot, M. K., Garcia, A. V. Early resuscitation and management of severe pediatric burns. Sem Pediatr Surg. 28 (1), 73-78 (2019).
  4. Smolle, C., et al. Recent trends in burn epidemiology worldwide: A systematic review. Burns. 43 (2), 249-257 (2017).
  5. Jeschke, M. G., et al. Burn injury. Nat Rev Dis Primers. 6, 11(2020).
  6. Nomellini, V., Gomez, C. R., Gamelli, R. L., Kovacs, E. J. Aging and animal models of systemic insult: Trauma, burn, and sepsis. Shock. 31 (1), 11-20 (2009).
  7. Wong, V. W., Sorkin, M., Glotzbach, J. P., Longaker, M. T., Gurtner, G. C. Surgical approaches to create murine models of human wound healing. J Biomed Biotechnol. 2011, 969618(2011).
  8. Abdullahi, A., Amini-Nik, S., Jeschke, M. G. Animal models in burn research. Cell Mol Life Sci. 71 (17), 3241-3255 (2014).
  9. Katakura, T., Yoshida, T., Kobayashi, M., Herndon, D. N., Suzuki, F. Immunological control of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) infection in an immunodeficient murine model of thermal injuries. Clin Exp Immunol. 142 (3), 419-425 (2005).
  10. Dai, T., et al. Animal models of external traumatic wound infections. Virulence. 2 (4), 296-315 (2011).
  11. Tavares Pereira, D. D. S., Lima-Ribeiro, M. H. M., De Pontes-Filho, N. T., Carneiro-Leão, A. M. D. A., Correia, M. T. D. S. Development of animal model for studying deep second-degree thermal burns. J Biomed Biotechnol. 2012, 460841(2012).
  12. Gong, Y., et al. Exudate absorbing and antimicrobial hydrogel integrated with multifunctional curcumin-loaded magnesium polyphenol network for facilitating burn wound healing. ACS Nano. 17 (22), 22355-22370 (2023).
  13. Dahiya, P. Burns as a model of sirs. Front Biosci. 14 (13), 4962-4967 (2009).
  14. Yergoz, F., et al. Heparin mimetic peptide nanofiber gel promotes regeneration of full-thickness burn injury. Biomaterials. 134, 117-127 (2017).
  15. Rao, G., et al. Rat burn model to study full-thickness cutaneous thermal burn and infection. J Vis Exp. (186), e64345(2022).
  16. Yampolsky, M., Bachelet, I., Fuchs, Y. Reproducible strategy for excisional skin-wound-healing studies in mice. Nat Protoc. 19 (1), 184-206 (2024).
  17. Wang, C., et al. Engineering bioactive self-healing antibacterial exosomes hydrogel for promoting chronic diabetic wound healing and complete skin regeneration. Theranostics. 9 (1), 65-76 (2019).
  18. Papp, A., et al. The progression of burn depth in experimental burns: A histological and methodological study. Burns. 30 (7), 684-690 (2004).
  19. Barrett, J. P., et al. An in vitro study into the antimicrobial and cytotoxic effect of Acticoat dressings supplemented with chlorhexidine. Burns. 48 (4), 941-951 (2022).
  20. Lou, P., et al. Injectable self-assembling peptide nanofiber hydrogel as a bioactive 3D platform to promote chronic wound tissue regeneration. Acta Biomater. 135, 100-112 (2021).
  21. Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. Wound repair and regeneration. Nature. 453 (7193), 314-321 (2008).
  22. Bielefeld, K. A., Amini-Nik, S., Alman, B. A. Cutaneous wound healing: Recruiting developmental pathways for regeneration. Cell Mol Life Sci. 70 (12), 2059-2081 (2013).
  23. Yildiz, S. C., Demir, C., Ayhanci, A. Examination of the effects of kefir on healing factors in a mice burn model infected with E. coli, S. aureus and P. aeruginosa using qRT-PCR. Burns. 49 (2), 425-431 (2023).
  24. Wang, Y., et al. Burn injury: Challenges and advances in burn wound healing, infection, pain and scarring. Adv Drug Deliv Rev. 123, 3-17 (2018).
  25. Chen, Y., et al. Research advances in smart responsive-hydrogel dressings with potential clinical diabetic wound healing properties. Mil Med Res. 10 (1), 37(2023).
  26. Ito, M., et al. Stem cells in the hair follicle bulge contribute to wound repair but not to homeostasis of the epidermis. Nat Med. 11 (12), 1351-1354 (2005).
  27. Ito, M., et al. Wnt-dependent de novo hair follicle regeneration in adult mouse skin after wounding. Nature. 447 (7142), 316-320 (2007).
  28. Chen, K., et al. Pullulan-collagen hydrogel wound dressing promotes dermal remodeling and wound healing compared to commercially available collagen dressings. Wound Repair Regen. 30 (3), 397-408 (2022).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים