הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

שיטה לחקר חילוף החומרים בתאי לימפה באמצעות כימיה למדידת שילוב פורומיצין על ידי ציטומטריית זרימה

978 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/67377

⸱

15 באוגוסט 2025

 ,  , 
1Laboratory of Immune System Biology, NIAID, NIH, 2Department of Pediatrics, Kyoto University Graduate School of Medicine

במאמר זה

סיכום

הפרוטוקול מציג שיטה מבוססת ציטומטריית זרימה המשתמשת בכימיה כדי לחקור מטבוליזם אנרגיה בתאים.

תקציר

עם גירוי אנטיגן, תאי T נאיביים עוברים התפשטות והתרחבות מהירה לתאי T אפקטיביים. חילוף החומרים ממלא תפקיד חשוב ביצירת ביומסה הדרושה לתאים אלה המתרבים במהירות וליצירת מולקולות הנדרשות להתמיינות ותפקוד תאי T אפקטיביים, המשפיעים על התוצאה של התגובה החיסונית הנרכשת בזיהום או בסרטן. תאי T נאיביים מתכנתים מחדש את חילוף החומרים שלהם על ידי גירוי אנטיגני כדי להגביר את ייצור ה-ATP, הנדרש כדי לתמוך בגדילה, בביוסינתזה ובתפקודי האפקטור שלהם. ATP יכול להיווצר בתא על ידי מסלול הזרחן המיטוכונדריאלי-חמצוני (OXPHOS) או על ידי המסלול הגליקוליטי. מכיוון שרוב ה-ATP שנוצר בתא מתחלק וגדל משמש לסינתזה של חלבונים, סינתזת חלבון שימשה כתחליף לרמות ATP. ניתן למדוד סינתזת חלבון על ידי שילוב של פורומיצין, המחקה את האדנוזין 3' של tRNA טעון בטירוזין שונה ומוביל לסיום ספונטני של תרגום החלבון. ניתן להשתמש במעכבים מטבוליים כמו 2-דאוקסיגלוקוז (2DG), החוסם את המסלול הגליקוליטי, ואוליגומיצין (O), החוסם קומפלקס 5 של שרשרת הובלת האלקטרונים (ETC), כדי לחקור את התלות של יצירת ATP תאית בשני המסלולים הללו בשילוב עם הערכת סינתזת החלבון בשיטה הנקראת SCENITH. אנו מתארים כאן וריאציה של שיטה זו המזהה שילוב פורומיצין על ידי זרימה ציטומטרית באמצעות כימיה. שיטה זו לחקר חילוף החומרים קלה יחסית וניתן להשתמש בה להערכת אוכלוסיות תאים נדירות, כמו גם דגימות חולים, על ידי ציטומטריית זרימה.

מבוא

בשנים האחרונות גוברת ההערכה לתפקיד החשוב של חילוף החומרים בוויסות תאי T. חילוף החומרים התאי מווסת פונקציות קריטיות רבות בלימפוציטים, כולל התרחבות משובטת של תאי T ספציפיים לפתוגן והתמיינות שלהם לתת-קבוצות של תאי אפקטור, המסנתזים מגוון מולקולות אפקטור, כולל ציטוקינים דלקתיים וגראנזימים ציטוליטיים הנדרשים להרוג פתוגנים1. לכן חקר חילוף החומרים של תאי T חשוב הן להערכת תפקוד תקין של תאי T והן לפיתוח טיפולים פוטנציאליים.

תאי T נאיביים הם שקטים מבחינה מטבולית ומסתמכים על מטבוליזם קטבולי וזרחון חמצוני (OXPHOS) לצרכי האנרגיה שלהם 1,2. עם הפעלת קולטן תאי T (TCR), תאי T עוברים תכנות מחדש מטבולי מהיר המונע בין היתר על ידי ויסות של מובילי חומרים מזינים על פני התאים, מה שמגביר את ספיגת הגלוקוז וחומצות אמינו מרובות, כולל גלוטמין, מהסביבה. לאחר מכן משתמשים באבני הבניין התזונתיות הללו במסלולים אנבוליים לייצור מקרומולקולות התורמות לצמיחת התאים ותומכות בדרישות האנרגיה המוגברות הקשורות לצמיחה מוגברת של תאים וחלוקה 1,2,3. תכנות מחדש מטבולי בתאי T מופעלים הופך את התאים לתלויים יותר בגליקוליזה אירובית ובגלוטמינוליזה לצרכי האנרגיה שלהם 1,2,3. עם גירוי TCR, ספיגת החומרים המזינים ממלאת גם תפקיד קריטי בהפעלת מסלולים מולקולריים במורד הזרם3. לדוגמה, ספיגה של חומצות אמינו וריכוז מוגבר של חומצות אמינו מקומיות מפעילים את איתות mTORC14. לעומת זאת, הפחתת הזמינות של חומצות אמינו תוך-תאיות מפחיתה את מסלול האיתות mTORC1 2,3,5,6,7. לפיכך, חילוף החומרים ותפקוד התא קשורים קשר הדוק בתא T אפקטור.

הגידול הגדול בביומסה הנדרשת לחלוקה מהירה של תאי T דורש ויסות מוגבר של סינתזת חלבון/תרגום8. ניתן לכמת סינתזת חלבון בתא על ידי חקר השילוב של פורומיצין9, חיקוי טירוזיל-tRNA החוסם תרגום על ידי שילוב, סימון ושחרור שרשראות פוליפפטיד מתארכות מתרגום ריבוזומים9. תרגום חלבונים הוא תהליך תלוי באנרגיה גבוהה; ואכן, רוב ה-ATP שנוצר בתאים מתחלקים וגדלים משמש לסינתזה של חלבונים. לפיכך, סינתזת חלבון שימשה כמדידה חלופית ל-ATP10 תאי. כדי לייצר ATP, תאים מסתמכים בדרך כלל על גליקוליזה ו/או מסלול OXPHOS המיטוכונדריאלי11. גליקוליזה מייצרת שתי מולקולות ATP לכל מולקולת גלוקוז. מסלול OXPHOS מייצר 36 ATPs לכל גלוקוז12,13, אך גליקוליזה יכולה לייצר ATP מהר יותר14. לפיכך, תאי T מופעלים המתחלקים במהירות, כמו תאים סרטניים, מסתמכים במידה רבה על המסלול הגליקוליטי ליצירת ATP.

ניתן ללמוד את התלות של תא בכל מסלול מטבולי על ידי שימוש במעכבים ספציפיים. מעכב המסלול הגליקוליטי 2-דאוקסיגלוקוז (2-DG), שהוא אנלוגי גלוקוז, פועל כמעכב תחרותי לאנזים הגליקוליטי הקסוקינאז15. 2-DG עובר זרחן ל-2DG-פוספט (2DG-P) על ידי הקסוקינאז. לא ניתן לבצע חילוף חומרים נוסף של 2DG-P על ידי איזומראז פוספוהקסוזה, אשר בדרך כלל ממיר גלוקוז-6-פוספט (G-6-P) לפרוקטוז-6-פוספט16. 2DG-P, אם כן, נלכד ומצטבר בתאים, מה שמוביל לעיכוב הגליקוליזה ולדלדול ה-ATP התאי, ובכך חוסם את סינתזת החלבון17. באופן דומה, ניתן לחקור את התלות של תאים במסלול OXPHOS המיטוכונדריאלי באמצעות אוליגומיצין, שנקשר לתעלת הפרוטונים של ATP סינתאז של שרשרת הובלת האלקטרונים (ETC)18, ובכך חוסם את סינתזת ה-ATP המיטוכונדריאלית (איור 1). השימוש במעכבים אלה בשילוב עם הערכה של סינתזת חלבון יכול לספק תמונה של המצב המטבולי של התאים ונעשה בו שימוש בשיטה חד-תאית רבת עוצמה המכונה SCENITH המעריכה שילוב פורומיצין באמצעות זרימה ציטומטרית10. עם זאת, הזמינות של ריאגנטים של SCENITH יכולה להיות מגבילה. טכניקות נפוצות אחרות להערכת גליקוליזה ו-OXPHOS כוללות ניתוחי שטף חוץ-תאי של סוסון ים, הדורשים מספרי תאים גדולים יותר, שאולי אינם אפשריים מבחינה ניסויית. במאמר זה, אנו מתארים שיטה חלופית להערכת שילוב פורומיצין באמצעות ריאגנט כימי Click-it זמין מסחרית. הקלות של שיטה זו מאפשרת הערכה מהירה של המצב המטבולי של לימפוציטים, כולל אוכלוסיות תאים נדירות ודגימות חולים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

גידול בעלי חיים וניסויים בוצעו בהתאם לפרוטוקול G98-3 שאושר על ידי הוועדה לשימוש וטיפול בבעלי חיים של המכון הלאומי לחקר הגנום האנושי, NIH, ופרוטוקול מאושר LISB 22E על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים של המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות, NIH. עכברים זכרים C57Bl/6J בגילאי 6-12 שבועות, שגודלו ושוכנו בתנאים ספציפיים ללא פתוגן (SPF), שימשו למחקר הנוכחי. תוצאות דומות התקבלו עם עכברים נקבות. דם מלא אנושי התקבל מבנק הדם של ה-NIH תחת פרוטוקול 99-CC-0168 שאושר על ידי המרכז הקליני של ה-NIH IRB איסוף והפצה של רכיבי דם מתורמים בריאים לשימוש במחקר חוץ גופית. הסכמה מדעת בכתב התקבלה מכל הנבדקים בהתאם להצהרת הלסינקי.

1. בידוד ותרבית תאי CD4+ T נאיביים של עכבר

  1. טהר תאי CD4+ T נאיביים על ידי בחירה שלילית מתרחיפים חד-תאיים מאוגדים של טחול או בלוטות לימפה של עכברים זכרים בני 6 עד 12 שבועות באמצעות מערכת הפרדת תאים מגנטיים על פי פרוטוקול היצרן.
  2. תאי תרבית (כמתואר להלן) במצע IMDM המכיל דיפפטיד L-alanyl-L-גלוטמין ותוספת של 10% סרום בקר עוברי, 2 מ"מ L-גלוטמין, 100 U/mL פניצילין, 100 U/mL סטרפטומיצין ו-0.05 מ"מ 2-β-מרקפטואתנול.
  3. תרבית משותפת של תאי CD4 T נאיביים ביחס של 1:8 עם טחול מדולל T שטופל במיטומיצין-C (מתואר להלן) כ-APCs בלוחות של 48 בארות תחת לא מקוטב (1 מיקרוגרם/מ"ל של אנטי-CD3 [שיבוט 2C11] ו-3 מיקרוגרם/מ"ל של אנטי-CD28 [שיבוט 37.51]), ותנאי Th0 (1 מיקרוגרם/מ"ל של אנטי-CD3, 3 מיקרוגרם/מ"ל של אנטי-CD28, 10 מיקרוגרם/מ"ל כל אחד של אנטי-IFNg [שיבוט XMG1.2], אנטי-IL-12 [שיבוט C17.8], ואנטי-IL-4 [שיבוט 11B11]) למשך 72 שעות ב-37 מעלות צלזיוס. הגדר תרביות באמצעות 1 x 106 APCs ו-0.13 x 106 תאי CD4 T נאיביים לכל באר של צלחת של 48 בארות (טבלת חומרים)
  4. יצירת טחול מדולל T שטופל במיטומיצין-C כנגמ"שים: בקצרה, צבעו תרחיף תא בודד של טחול עכבר בנוגדנים CD4 ו-CD8 מצומדים ל-FITC. לאחר מכן, סמן את התאים באופן מגנטי עם מיקרו-חרוזים נגד FITC (ראה טבלת חומרים). לאחר מכן, באמצעות מערכת הפרדת תאים מגנטיים בהתאם לפרוטוקול היצרן, בחרו באופן שלילי את ה-APCs מתאי T. לאחר מכן, טפל בנגמ"שים עם 50 מיקרוגרם/מ"ל מיטומיצין C למשך 40 דקות באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן שטיפה 3x עם 1x PBS.

2. בידוד ותרבות PBMCs אנושיים

  1. יש לבודד PBMCs מדם מלא באמצעות אמצעי הפרדת לימפוציטים ובהתאם לפרוטוקול היצרן (ראה טבלת חומרים).
  2. PBMCs בתרבית במדיה RPMI בתוספת 2 מ"מ L-גלוטמין, 0.01 M HEPES, 1 מ"מ נתרן פירובט, 1% חומצות אמינו לא חיוניות, 100 U/mL פניצילין וסטרפטומיצין, 0.05 מ"מ 2-β-מרקפטואתנול ו-5% סרום אנושי.
  3. תרבית 1 x 106 PBMCs לבאר של צלחת 96 בארות עם תחתית U עם 5 מיקרוגרם/מ"ל של Phytohemagglutinin-L (PHA-L) למשך 18-24 שעות ב-37 מעלות צלזיוס.

3. בדיקה מטבולית

הערה: חשוב לשמור על כל התאים, המעכבים [אוליגומיצין (O), 2-דאוקסיגלוקוז (2-DG), DMSO (Co)], ומגיב O-פרופרגיל-פורומיצין (OPP) קרוב ככל האפשר ל-37 מעלות צלזיוס. יש להוציא את התאים, המעכבים ומגיב ה-OPP על 96 צלחות עם תחתית U ולהשאיר את הצלחות באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס ככל האפשר. מעכבי Aliquot 2-DG ו-O לנפחים קטנים יותר כדי למנוע הפשרה מרובה של הקפאה.

  1. צרו פתרון מלאי של 2 M (20x) של 2-DG ופתרון מלאי של 40 מיקרומטר (40x) של O. עבור OPP, יש לדלל 1 מיקרוליטר של OPP ב-49 מיקרוליטר של מדיום כך שהריכוז יהיה 400 מיקרומטר - זה יהיה פתרון המלאי פי 20.
  2. ודא שכל שאר הרכיבים של ערכת סינתזת החלבון OPP (ראה טבלת חומרים) נמצאים בטמפרטורת החדר (RT), לפני תחילת הניסוי.
  3. הכן מאגר תגובת OPP 1x על ידי דילול אליקוט מבקבוק רכיב C 1:10 במים נטולי יונים. לאחר השימוש, יש לאחסן את כל התמיסה שנותרה בטמפרטורה של 2-8 מעלות צלזיוס.
  4. זרע 0.1-2 x 106 תאים לבאר של צלחת 96 בארות תחתונה עגולה לכל מצב (Co / DG / O / DGO) ב -100 מיקרוליטר של IMDM שלם (לתאי CD4 T של עכבר) או RPMI שלם (עבור PBMCs אנושיים) או כל מדיה שלמה לבחירה. שמור את הצלחת בחממה ככל האפשר.
  5. הוסף מעכבי 1x מתמיסות מלאי (5 μL של 20x DG, Co), (2.5 μL של 40x O) ודגירה למשך 15 דקות ב-37 מעלות צלזיוס, 5% CO2. הריכוזים הסופיים בתאים הם 100 מ"מ DG ו-1 מיקרומטר O. מערבבים את המעכבים עם התאים בזהירות עם פיפטה. להקלה, יש להוציא מעכבים בצלחת של 96 בארות ולהוסיף תאים למעכבים ולערבב היטב על ידי פיפטינג למעלה ולמטה כמה פעמים.
  6. בדגימת DGO, הוסף 1x של DG (5 מיקרוליטר), ערבב בזהירות עם פיפטה ודגירה במשך 10 דקות ב-37 מעלות צלזיוס, 5% CO2. לאחר מכן, הוסיפו 1x O (2.5 מיקרוליטר), פיפטה כמה פעמים ודגרו במשך 5 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2.
  7. מבלי לשטוף את המעכבים, הוסף 5 μL של OPP מתמיסת המלאי של 20x (400 μM) לכל דגימה כך שהריכוז יהיה 20 μM בתאים, פיפטה למעלה ולמטה מספר פעמים ודגירה 30 דקות ב-37 מעלות צלזיוס, 5% CO2. כדי להקל עליו, יש להוציא OPP על צלחת של 96 בארות, להוסיף תאים עם מעכבים למגיב OPP ולערבב היטב.
    הערה: עבור תאים פחות פעילים מבחינה מטבולית ותאים המבודדים ישירות ex vivo, הגדל את זמן הדגירה לאחר הוספת OPP. זמן הדגירה עם OPP צריך להיות סטנדרטי עבור כל סוג תא.
  8. לאחר הדגירה עם OPP, הוסף 100-150 מיקרוליטר של מאגר FACS קר כקרח (2% FBS ו-1 מ"מ EDTA ב-1x PBS). צנטריפוגה ב-750 x גרם למשך 2 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. השליכו את הסופרנטנט וחזרו על שלב הכביסה.
  9. תאי כתמים עם סמני משטח מתאימים, נוגדן CD4 נגד עכבר (בשימוש בדילול 1/200) או נוגדן CD4 אנטי אנושי (בשימוש בדילול 1/50), מגיב חי/מת (בשימוש בדילול 1/600), בנוכחות Fc Block (בשימוש בדילול 1/200). יש לדגור במשך 25-30 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס בחושך.
  10. שטפו את הצלחת עם 150-200 מיקרוליטר של מאגר FACS וצנטריפוגה ב-750 x גרם למשך 2 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. החלק בעדינות את הצלחת כדי להשליך את הסופרנטנט, ולאחר מכן חזור על שלב הכביסה. בשלב זה, התאים מוכתמים על פני השטח.
  11. השעו מחדש את התאים ב-1% PFA ב-PBS, ערבבו היטב ודגרו במשך 10-15 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. יש להגן מפני אור.
  12. שטפו עם FACS Buffer וצנטריפוגה ב-750 x גרם למשך 2 דקות ב-4 מעלות צלזיוס, וחזרו על הכביסה.
  13. השעו מחדש את גלולת התא ב-200 מיקרוליטר של מאגר חדירה קר 1x ספונין (0.1% (משקל/נפח) ספונין + 3% FBS ב-1x PBS). דגירה ב- RT, מוגן מפני אור למשך 5-15 דקות. התאים קבועים וחדירים בשלב זה.
  14. הכן תוסף מאגר תגובה 1x OPP (רכיב E) על ידי דילול תמיסת 10x 1:10 במים נטולי יונים. הכן תמיסה זו טרייה והשתמש בה באותו היום.
  15. הכן קוקטייל תגובת OPP לפי טבלה 1. השתמש בקוקטייל התגובה תוך 15 דקות מההכנה.
  16. צנטריפוגה את הדגימות משלב 3.13 ב 750 x גרם למשך 2 דקות. השליכו את הסופרנטנט. שטפו את התאים פי 2 עם 200 מיקרוליטר של מאגר חדירות ספונין 1x. סובב והשליך את הסופרנטנט.
  17. מוסיפים 50-100 מיקרוליטר קוקטייל תגובת OPP (שהוכן בשלב 3.12) לכל באר ומערבבים היטב. דגירה למשך 30 דקות ב-RT, מוגן מפני אור. לאחר מכן, סובב צלחות ב-750 x גרם או 2 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. השליכו את הסופרנטנט.
  18. השעו מחדש את הגלולה ב-200 מיקרוליטר של 1x דגימות מאגר חדירות וצנטריפוגה של ספונין ב-750 x גרם למשך 2 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. השליכו את הסופרנטנט.
  19. השעו מחדש ב-50 מיקרוליטר של מאגר שטיפה תגובה (רכיב F) לבאר וצנטריפוגה ב-750 x גרם למשך 2 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. השעו מחדש תאים מוכתמים ב-200 מיקרוליטר של מאגר FACS.
  20. נתח דגימות לפי זרימה ציטומטרית (ראה איור משלים 1) באותו יום, או אחסן את התאים בחושך ב-4 מעלות צלזיוס ונתח אותם למחרת.

4. ניתוח בדיקה מטבולית

  1. למדוד את השילוב של פורומיצין (OPP) כתחליף לסינתזת חלבון בתנאים הבאים: 1) תנאי בקרה (Co); 2) בתאים שבהם המסלול הגליקוליטי נחסם על ידי 2-DG; 3) בתאים שבהם מסלול ה-OXPHOS המיטוכונדריאלי נחסם על ידי O; ו-4) בתאים שבהם גם המסלול הגליקוליטי וגם המסלול המיטוכונדריאלי נחסמים על ידי מעכבים (DGO), על ידי הערכת עוצמת הקרינה הממוצעת (MFI) של OPP (איור 2).
  2. נתח את התלות של תאים במסלול מסוים על ידי התבוננות ב-MFI של OPP בכל מצב. להעריך ישירות את ה-MFI כמדד לסינתזת חלבון. חשב את התלות בגלוקוז, הקיבולת הגליקוליטית, יכולת חמצון חומצות השומן (FAO) וחמצון חומצות אמינו (AAO) והתלות המיטוכונדריאלית לפי10.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

תאי CD4+ T נאיביים בודדו מהטחול ובלוטות הלימפה של עכברים והתמיינו לשושלות Th0 או לא מקוטבות (NP) למשך 72 שעות. התאים נאספו אחרי 0 שעות, 48 שעות ו-72 שעות של תרבית, ושילוב OPP נמדד על ידי התבוננות ב-MFI של ה-OPP. תאי CD4+ T נאיביים היו פחות סינתטיים מתאי T המופעלים, כפי שניתן לראות על ידי ה-MFI של OPP (איור 3). תאים נאיביים היו תלויים חלקית בגליקוליזה אך יותר במסלול OXPHOS כפי שהוערך על ידי MFI ושינוי הקיפול של שילוב OPP. אם ניקח את הבקרה (Co) שנקבעה ל-100%, אז חסימת גלי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מאמר זה מספק שיטה לחקר חילוף החומרים בתאי לימפה על ידי זרימה ציטומטרית, המבוססת על טכנולוגיית SCENITH, אך באמצעות תיוג כימי של פורומיצין משולב. למרות שהתמקדנו בלימפוציטים, ניתן להתאים פרוטוקול זה לחקר חילוף החומרים בכל סוג תא. שיטה זו מועילה גם לחקר חילוף החומרים באוכלוסיות נדירות של תאים ודגימות חולים, כאשר טכניקות אחרות, כגון סוסון ים, דורשות מספר גדול יותר של תאים.

שלב קריטי בפרוטוקול הוא לוודא שהתאים, המעכבים וכל הריאגנטים המשמשים נמצאים בטמפרטורת החדר אלא...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגודי אינטרסים לחשוף.

תודות

אנו מודים לד"ר צ'ין שו ולד"ר אביק דוטה על אספקת דגימות PBMC והצעות ניסיוניות יקרות ערך. מחקר זה נתמך בחלקו על ידי המחלקה למחקר תוך-מוראלי של NIAID, NIH.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
2-MercaptoethanolThermo Fisher21985-023
Alexa Fluor 488 נוגדן נגד PuromycinBiolegend381506דילול בשימוש: 1/100
Alexa Fluor 647 אנטי-אנושי CD4 נוגדןBiolegend357422דילול בשימוש:  1/50
BD Horizon BUV737 עכברוש נגד עכבר CD4BD612761דילול בשימוש:  1/200
Click-iT Plus OPP Alexa Fluor 488 ערכת בדיקת סינתזת חלבוןThermo FisherC10456
HEPES (1 מ')Thermo Fisher15630080
סרום אנושיMillipore SigmaH4522
IMDM, תוסף GlutaMAX, 500 מ"לThermo Fisher31980030
InVivoMAb נגד עכבר CD28, שיבוט:  37.51BioXcellBE0015-1
InVivoMAb נגד עכבר CD3ε, שיבוט:  145-2C11BioXcellBE0001-1
InVivoMAb נגד עכבר IFNγ, שיבוט:  XMG1.2BioXcellBE0055
InVivoMAb נגד עכבר IL-12 p40, שיבוט:  C17.8BioXcellBE0051
InVivoMAb נגד עכבר IL-4, שיבוט:  11B11BioXcellBE0045
L-גלוטמין (200 מ"מ)Thermo Fisher25030081
LIVE / DEAD ערכת כתמי תאים מתים לתיקון, לעירור 405 ננומטר דילולThermo FisherL34966בשימוש:  1/600
LSM הפרדת לימפוציטים בינוניMP Biomedicals50494X
MEM תמיסת חומצות אמינו לא חיוניות (100X)Thermo Fisher11140050
מיטומיצין C מ- Streptomyces caespitosusSigmaM0503-10X2MG
Naive CD4 ערכת בידוד, עכברMiltenyi Biotec130-104-453
פרפורמלדהיד 16% תמיסה מימית מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית15710
PBS (1X), pH 7.4, 500 מ"לביולוגיות באיכות114-058-101
פניצילין-סטרפטומיצין (10,000 U/mL). 100 מ"לתרמו פישר15140122
פיטוהמגלוטינין-L (PHA-L)Millipore Sigma11249738001
סרום בקר עוברי בדרגת פרימיום (FBS)Avantor97068-085
RPMI 1640 בינוני, ללא גלוטמיןתרמו פישר21870076
ספוניןתרמו פישרA18820.22
נתרן פירובט (100 מ"מ)תרמו פישר11360070
בדרגת EM

מקורות

  1. Saravia, J., Raynor, J. L., Chapman, N. M., Lim, S. A., Chi, H. Signaling networks in immunometabolism. Cell Res. 30, 328-342 (2020).
  2. Chapman, N. M., Boothby, M. R., Chi, H. Metabolic coordination of T cell quiescence and activation. Nat Rev Immunol. 20, 55-70 (2020).
  3. Raynor, J. L., Chi, H. Nutrients: Signal 4 in T cell immunity. J Exp Med. (221), e20221839(2024).
  4. Shimobayashi, M., Hall, M. N. Multiple amino acid sensing inputs to mTORC1. Cell Res. 26, 7-20 (2016).
  5. Huang, H., et al. In vivo CRISPR screening reveals nutrient signaling processes underpinning CD8(+) T cell fate decisions. Cell. 184, 1245-1261.e21 (2021).
  6. Pollizzi, K. N., et al. Asymmetric inheritance of mTORC1 kinase activity during division dictates CD8(+) T cell differentiation. Nat Immunol. 17, 704-711 (2016).
  7. Verbist, K. C., et al. Metabolic maintenance of cell asymmetry following division in activated T lymphocytes. Nature. 532, 389-393 (2016).
  8. Marchingo, J. M., Cantrell, D. A. Protein synthesis, degradation, and energy metabolism in T cell immunity. Cell Mol Immunol. 19, 303-315 (2022).
  9. Enam, S. U., et al. Puromycin reactivity does not accurately localize translation at the subcellular level. Elife. 9, e60303(2020).
  10. Argüello, R. J., et al. SCENITH: A Flow Cytometry-Based Method to Functionally Profile Energy Metabolism with Single-Cell Resolution. Cell Metab. 32, 1063-1075.e7 (2020).
  11. Dunn, J., Grider, M. H. Physiology, Adenosine Triphosphate. , StatPearls Publishing LLC. (2024).
  12. Shiratori, R., et al. Glycolytic suppression dramatically changes the intracellular metabolic profile of multiple cancer cell lines in a mitochondrial metabolism-dependent manner. Sci Rep. 9, 18699(2019).
  13. Vander Heiden, M. G., Cantley, L. C., Thompson, C. B. Understanding the Warburg effect: the metabolic requirements of cell proliferation. Science. 324, 1029-1033 (2009).
  14. Pfeiffer, T., Schuster, S., Bonhoeffer, S. Cooperation and competition in the evolution of ATP-producing pathways. Science. 292, 504-507 (2001).
  15. Brown, J. Effects of 2-deoxyglucose on carbohydrate metabolism: review of the literature and studies in the rat. Metabolism. 11, 1098-1112 (1962).
  16. Weindruch, R., et al. Caloric restriction mimetics: metabolic interventions. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 56 Spec No1, 20-33 (2001).
  17. Gronostajski, R. M., Pardee, A. B., Goldberg, A. L. The ATP dependence of the degradation of short- and long-lived proteins in growing fibroblasts. J Biol Chem. 260, 3344-3349 (1985).
  18. Hearne, A., Chen, H., Monarchino, A., Wiseman, J. S. Oligomycin-induced proton uncoupling. Toxicol In Vitro. 67, 104907(2020).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

TSCENITH
הסרטון יגיע בקרוב
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.