הערכה של שחרור LC3-II באמצעות שלפוחיות חוץ-תאיות ביחס להצטברות שלפוחיות חיוביות ל-LC3 תוך תאיות

סיכום

כאן, אנו מציגים את המתודולוגיה להערכה תמציתית של רמות סמן אוטופגוזום LC3-II בשלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) על ידי immunoblotting. ניתוח רמות LC3-II ברכבים חשמליים, היווצרות אוטוליזוזום והיווצרות אומגה מצביע על התפקיד החדש של STX6 בשחרור רכבים חשמליים חיוביים ל-LC3-II כאשר איחוי אוטופגוזום-ליזוזום מעוכב.

תקציר

אוטופגיה (מאקרו) מייצגת מסלול פירוק תאי בסיסי. בתהליך זה, שלפוחיות בעלות קרום כפול הידועות בשם אוטופגוזומים בולעות תוכן ציטופלזמי, ולאחר מכן מתמזגות עם ליזוזומים לצורך פירוק. מעבר לתפקיד הקנוני, גנים הקשורים לאוטופגיה מווסתים גם מסלול הפרשה הכולל שחרור של מולקולות דלקתיות, גורמי תיקון רקמות ובועיות חוץ-תאיות (EV). יש לציין כי תהליך הפצת חלבונים פתולוגיים בין תאים, במיוחד במחלות נוירודגנרטיביות הפוגעות במוח ובחוט השדרה, מדגיש את חשיבות הבנת התופעה. מחקרים אחרונים מצביעים על כך שהחלבון קושר הדנ"א 43 kDa (TDP-43), שחקן מפתח בטרשת אמיוטרופית צידית וניוון האונה הקדמית-טמפורלית, משתחרר באופן תלוי אוטופגיה באמצעות כלי רכב חשמליים המועשרים בסמן האוטופגוזום חלבונים הקשורים למיקרוטובולים 1A/1B שרשרת אור 3B-II (LC3-II), במיוחד כאשר איחוי אוטופגוזום-ליזוזום מעוכב.

כדי להבהיר את המנגנון העומד בבסיס היווצרותם ושחרורם של כלי רכב חשמליים חיוביים ל-LC3-II, הכרחי לבסס שיטה נגישה וניתנת לשחזור להערכת שלפוחיות חיוביות LC3-II תוך-תאיות וחוץ-תאיות. מחקר זה מציג פרוטוקול מפורט להערכת רמות LC3-II באמצעות אימונובלוטינג בשברים תאיים וחשמליים המתקבלים באמצעות צנטריפוגה דיפרנציאלית. Bafilomycin A1 (Baf), מעכב של איחוי אוטופגוזום-ליזוזום, משמש כבקרה חיובית לשיפור רמות השלפוחיות החיוביות LC3-II תוך תאיות וחוץ-תאיות. הגן 101 (TSG101) משמש כסמן לגופים רב-שלפוחיתיים. ביישום פרוטוקול זה, הוכח כי הפלה בתיווך siRNA של תחביר-6 (STX6), גורם סיכון גנטי למחלת קרויצפלד-יעקב ספורדית, מעלה את רמות LC3-II בחלק EV של תאים שטופלו ב- Baf מבלי להראות השפעה משמעותית על רמות TSG101. ממצאים אלה מצביעים על כך ש-STX6 עשוי לווסת באופן שלילי את השחרור החוץ-תאי של LC3-II באמצעות כלי רכב חשמליים, במיוחד בתנאים שבהם איחוי אוטופגוזום-ליזוזום נפגע. בשילוב עם שיטות מבוססות להערכת אוטופגיה, פרוטוקול זה מספק תובנות חשובות לגבי תפקידן של מולקולות ספציפיות בהיווצרות ושחרור של כלי רכב חשמליים חיוביים LC3-II.

מבוא

תגובת טרנסאקטיבציה חלבון קושר DNA 43 (TDP-43) הוא ריבונוקלפרוטאין גרעיני הטרוגני בעל ביטוי נרחב המעורב בוויסות שחבור אקסון, שעתוק גנים ויציבות mRNA, כולם חיוניים להישרדות התא ^1,2. במצבים נוירודגנרטיביים כמו טרשת אמיוטרופית צידית (ALS) וניוון אונה פרונטו-טמפורלית (FTLD), חלבון גרעיני TDP-43 מצטבר באופן חריג בציטופלסמה. שינוי זה גורם לאובדן תפקוד TDP-43 בגרעין ולעלייה רעילה בתפקוד הציטופלסמה. הצטברות פתולוגית של TDP-43 מתחילה באזורים ספציפיים של המוח וחוט השדרה, ומתפשטת באזורים אלה באופן דמוי פריון, תהליך הקשור קשר הדוק עם התקדמות המחלה³. עם זאת, המנגנון המדויק שבו פתולוגיה TDP-43 מתפשטת דרך המוח וחוט השדרה נותר לא ידוע.

TDP-43 מופרש באמצעות שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs), ורמות גבוהות של TDP-43 מזוהות בפלזמה ובנוזל השדרה (CSF) של חולי ALS ו-FTLD-TDP ^4,5,6. CSF מחולים שאובחנו עם ALS ו- FTLD גורם למיקום שגוי תוך תאי וצבירה של TDP-43 אנדוגני בתאי גליומה אנושיים⁷. לפיכך, TDP-43 המשתחרר מחוץ לתא באמצעות כלי רכב חשמליים עשוי לתווך את התפשטות התא לתא של פתולוגיית TDP-43.

אוטופגיה היא מנגנון פירוק תאי שמור היטב הכולל סגירה של חומרים לא רצויים בתוך שלפוחיות קרום כפול, הידועות בשם אוטופגוזומים, המסומנות על ידי LC3. אוטופגוזומים אלה מתמזגים עם ליזוזומים חיוביים לחלבון הממברנה הקשור לליזוזומלים 1 (LAMP1) ליצירת אוטוליזוזומים (LC3⁺/LAMP1⁺), מה שמוביל לפירוק תכולתם⁸. ניתוחים היסטולוגיים מצביעים על כך שאוטופגוזומים הבולעים תכלילים מצטברים בנוירונים של חולי ALS ספורדיים⁹. חלק מהגנים הסיבתיים של ALS משפחתי ו- FTLD-TDP קשורים לוויסות אוטופגיה 10,11,12. ממצאים אלה מצביעים על כך שאוטופגיה מדוכאת בחולי ALS ו-FTLD-TDP.

המחקר הקודם הצביע על כך ש-TDP-43 מופרש באמצעות כלי רכב חשמליים חיוביים לסמן האוטופגוזום LC3-II כאשר איחוי אוטופגוזום-ליזוזום מעוכב¹³. חוסר ויסות של מסלול אוטופגיה-ליזוזום עלול לגרום לא רק להצטברות תוך-תאית של TDP-43 אלא גם לשחרור חוץ-תאי של TDP-43 באמצעות EVs¹⁴. עם זאת, עדיין לא ידוע כיצד משוחררים כלי רכב חשמליים חיוביים LC3-II ועד כמה זה משמעותי בהתפשטות הפתולוגיה של TDP-43.

כלי רכב חשמליים מסווגים לכלי רכב חשמליים גדולים (בקוטר 100 עד 1000 ננומטר), המיוצרים מניצני פני השטח של התא, ולכלי רכב חשמליים קטנים (בקוטר 50 עד 150 ננומטר), המיוצרים מניצני קרומים אנדוזומליים לכיוון פנים האנדוזום (המכונים אקסוזומים) ומנגנון גולג'י. כדי לאסוף בנפרד כלי רכב חשמליים גדולים וקטנים, אנו מבצעים צנטריפוגות רציפות ואוספים כדוריות באמצעות צנטריפוגות ב-20,000 × גרם ו-110,000 × גרם, בהתאמה. מקטע P1 EV (20,000 × גרם כדורים) מוכן לאסוף כלי רכב חשמליים גדולים, ושבר P2 EV (110,000 × גרם כדורים) מוכן לאסוף כדורי EV קטנים¹⁵. המתודולוגיה להערכת רמות LC3-II בכלי רכב חשמליים גדולים וקטנים הנגזרים מצנטריפוגה רציפה על ידי אימונובלוטינג היא יציבה וניתנת לשחזור¹⁶. בנוסף לניתוח רמות LC3-II ברכבים חשמליים, ניתוח היווצרות אוטוליזוזום ואומגה משפר את ההבנה כיצד חוסר ויסות של אוטופגיה מוביל לשחרור של כלי רכב חשמליים חיוביים LC3-II. כאן, המחקר הנוכחי מראה את התפקיד המדכא של תחביר 6 (STX6), חלבון SNARE, אשר מקדם את התנועה של בועיות הובלה כדי להתמקד בממברנות¹⁷, בשחרור של EV חיובי LC3-II כאשר איחוי אוטופגוזום-ליזוזום מעוכב.

פרוטוקול

1. הכנת חלק התא, P1 ו-P2 EV מהתווך התרבית של תאי HeLa

1. הכנת חלק P1 ו- P2 EV מהמדיום התרבית של תאי HeLa
   1. יום 1
      1. ספרו את התאים באמצעות מונה תאים וזרעו 1 × 10⁶ תאים על צלחת בגודל 6 ס"מ המכילה מדיום תרבית המורכב מגלוקוז גבוה DMEM, 10% FBS ו-1% פניצילין/סטרפטומיצין. לדגור על התאים ב 37 ° C עם 5% CO₂ ולחות מבוקרת במשך 24 שעות.
   2. יום 2 (אופציונלי)
      1. הכינו תמיסת siRNA של 20 מיקרומטר.
      2. יש לערבב 100 μL של מדיום סרום מופחת ו-3 μL של siRNA בצינור בעל שימור נמוך כדי להכין תמיסה A.
      3. יש לערבב 100 μL של מדיום סרום מופחת ו-5 μL של מגיב טרנספקציה בצינור בעל שימור נמוך כדי להכין תמיסה B.
      4. ערבבו תמיסה A ותמיסה B, ולאחר מכן דגרו על התערובת בטמפרטורת החדר (RT) במשך 5 דקות.
      5. הוסף את תערובת התמיסות A ו - B למדיום המשמש לגידול תאי HeLa. לדגור על התאים ב 37 ° C עם 5% CO₂ ולחות מבוקרת במשך 24 שעות.
   3. יום 3
      1. שטפו את התאים עם PBS וחשפו אותם ל-500 מיקרוליטר של 0.25% טריפסין ותמיסת 1 mM EDTA ב-37°C עם 5% CO₂ ולחות מבוקרת למשך 5 דקות.
      2. הוסיפו 2.5 מ"ל של מדיום התרבית לתאים, והשתמשו בפיפטת העברת פסטר עם קצה פיפטה של 200 מיקרוליטר מחובר להכנת תרחיף חד תאי.
      3. ספרו את התאים באמצעות מונה תאים, וזרעו 1 × 10⁶ תאים על צלחת של 10 ס"מ. לדגור על התאים ב 37 ° C עם 5% CO₂ ולחות מבוקרת במשך 24 שעות.
         הערה: יש צורך להכין לפחות 1 × 10⁶ תאים כדי לאסוף EVs ממדיום התרבית הדרוש לניתוח immunoblotting.
   4. יום 4
      1. הכן מדיום תרבית (ראה שלב 1.1.1.1) המכיל רכב (DMSO) או 100 ננומטר Bafilomycin A1 (Baf).
      2. חשוף את התאים לתווך המכיל רכב או 100 ננומטר Baf ודגור עליהם ב 37 ° C עם 5% CO₂ ולחות מבוקרת במשך 24 שעות.
   5. יום 5
      1. אספו את כל אמצעי התרבית מהצלחת בקוטר 10 ס"מ, העבירו אותה לצינור של 15 מ"ל וצנטריפוגו אותה בטמפרטורה של 3,000 × גרם למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4°C כדי להסיר פסולת תאים.
         הערה: התאים הנותרים בלוח בגודל 10 ס"מ ישמשו בסעיף 1.2.1.
      2. לבידוד של מקטע P1 EV, העבירו את הסופרנאטנט לאחר צנטריפוגה ב-3,000 × גרם לתוך צינור צנטריפוגה, ולאחר מכן בצעו צנטריפוגה ב-20,000 × גרם ב-4°C למשך שעה אחת.
      3. לבידוד חלק P2 EV, העבירו את הסופרנאטנט לאחר צנטריפוגה ב-20,000 × גרם לתוך צינור אולטרה-צנטריפוגה, ולאחר מכן בצעו צנטריפוגה ב-110,000 × גרם ב-4°C למשך שעה אחת.
      4. לאחר ניגוב הלחות העודפת בתוך הצינור באמצעות מגבון מעבדה, יש להשהות מחדש את הכדורים הנותרים בצינור הצנטריפוגה ב-50 μL של חיץ דגימה פי 2 [2.5% SDS, 125mM Tris-HCl buffer (pH 6.8), 30% גליצרול, 10% 2-מרקפטואתנול, 0.4% Bromophenol Blue] כדי להכין את מקטע P1 EV.
      5. הסר את supernatant על ידי decanting, לנגב את הלחות העודפת בתוך הצינור עם מגבון מעבדה, ולאחר מכן להשעות מחדש את הכדורים הנותרים בצינור ultracentrifugation ב 50 μL של 2x חיץ דגימה כדי להכין את החלק P2 EV.
      6. יש לדגור על שברי P1 ו-P2 EV בטמפרטורה של 100°C על בלוק חום למשך 10 דקות.
         הערה: אין לנער את הצינורות לאחר הצנטריפוגה בעוצמה של 20,000 × גרם ו-110,000 × גרם כדי למנוע השלכה בטעות של הכדורים הנותרים. לאחר הטיית הצינור כדי להעביר את הסופרנאטנט, שמרו על מיקום הצינור כדי למנוע מהגלולה לשקוע שוב בסופרנאטנט שנותר.
2. הכנת מקטע התא מתאי HeLa בתרבית
   1. יום 5
      1. לאחר העברת מדיום התרבית מהצלחת בקוטר 10 ס"מ לצינור של 15 מ"ל, שטפו את התאים בצלחת של 10 ס"מ עם PBS וחשפו אותם ל-2 מ"ל של 0.25% טריפסין ותמיסת EDTA של 1 מ"מ ב-37°C עם 5% CO₂ ולחות מבוקרת למשך 5 דקות.
      2. הוסף 8 מ"ל של מדיום גידול לתאים, ולאחר מכן השתמש פיפטה העברת פסטר עם קצה פיפטה 200 μL כדי פיפטה פיפטה את התאים ולהכין תרחיף תא יחיד.
      3. מעבירים את מתלה התא לצינור בנפח 15 מ"ל וצנטריפוגות אותו בטמפרטורה של 1,000 × למשך 10 דקות ב-4°C.
      4. הסר את supernatant על ידי אספירטור, להוסיף PBS לגלולה התא, ולאחר מכן צנטריפוגה ב 1,000 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
      5. הסר את PBS באמצעות שואב וסוניק את גלולת התא ב 1 מ"ל של חיץ A68 [10 mM Tris-HCl buffer, pH 7.5, 0.8 M NaCl, 1 mM אתילן גליקול bis(β-aminoethyl אתר)-N,N,N,N,N-חומצה טטראצטית (EGTA)] המכיל 1% סרקוזיל.
      6. מדוד את ריכוז החלבון של התא ליזט באמצעות ערכת בדיקת חלבון BCA.
      7. מערבבים 300 μL של ליזט התא עם 100 μL של מאגר דגימה 4x ודגרים על התערובת ב 100 ° C על בלוק חום במשך 10 דקות כדי להכין את חלק התא.

2. ניתוח אימונובלוטינג

1. הפרד כמויות שוות ערך של חלבונים בדגימות על ידי SDS-PAGE¹⁸.
2. העבירו את החלבונים המופרדים לקרומי פוליווינילידן דיפלואוריד (PVDF).
3. לאחר ההעברה, לחסום את הממברנות עם סוכן חוסם למשך 20 דקות.
4. יש לדגור על הקרום החסום למשך הלילה עם הנוגדן הראשוני המצוין במאגר Tris המכיל 10% (v/v) נסיוב עגל ב-RT.
5. שטפו את הממברנה עם חיץ Tris במשך 5 שניות ולאחר מכן דגרו עליו עם נוגדן משני מצומד ביוטין ב- RT למשך שעתיים.
6. שטפו את הממברנה עם חיץ Tris למשך 5 שניות ולאחר מכן דגרו עליו עם חיץ Tris המכיל 0.4% (v/v) תמיסות A ותמיסה B מהערכה ב- RT למשך שעה אחת.
7. שטפו את הממברנה עם PBS, ולאחר מכן דגרו עליה עם PBS המכיל 0.04% (w/v) diaminobenzidine, 0.8% (w/v) NiCl₂·6H₂O, ו-0.3% (v/v) H₂O₂ לזיהוי קולורימטרי של פסים.
   הערה: לזיהוי אותות, מקובלת גם שיטת כימילומינסנציה.
8. דיגיטציה של תמונת הממברנה על ידי סורק והכפפתה לניתוח צפיפות באמצעות פיג'י.
   1. פתח את התמונה הדיגיטלית באמצעות פיג'י, והמר את תמונת הצבע RGB לתמונה של 8 סיביות על ידי לחיצה על תמונה | סוג | 8 סיביות.
   2. לחץ על כלי המלבן והתאם את גודל המלבן על ידי גרירתו כדי להקיף את הפסים. זהה את הרצועה לניתוח על-ידי לחיצה על נתח | ג'לים | בחר נתיב ראשון.
   3. מקם את המלבן על הפס השני ועל הפסים הבאים, וזהה את הפסים לניתוח על-ידי לחיצה על נתח | ג'לים | בחר הנתיב הבא.
   4. לאחר זיהוי הרצועה הסופית, מדוד את הצפיפות על פני המלבן על-ידי לחיצה על נתח | ג'לים | נתיבי עלילה.
   5. הקף את אזור האות של הרצועה בקו ישר, לחץ על הכלי שרביט ולחץ באזור כדי לחשב את עוצמת האות של הפס.

3. ניתוח מספר האוטופגוזומים והאוטוליזוזומים

1. יום 1
   1. ספרו את מספר תאי HeLa באמצעות מונה תאים, וזרעו 1 × 10⁵ תאי HeLa המבטאים LAMP1-GFP ו- mCherry-LC3 על צלחת של 3.5 ס"מ. לדגור על התאים ב 37 ° C עם 5% CO₂ ולחות מבוקרת במשך 24 שעות.
2. יום 2 (אופציונלי)
   1. בצע את השלבים המתוארים בסעיף 1.1.2 בצלחות של 3.5 ס"מ.
3. יום 3
   1. השליכו את מדיום התרבית מהכלים בקוטר 3.5 ס"מ.
   2. יש לשטוף תאים עם PBS, לחשוף אותם ל-400 מיקרוליטר של 0.25% טריפסין ותמיסת 1 mM EDTA, ולדגור ב-37°C עם 5%_CO2 ולחות מבוקרת למשך 5 דקות.
   3. מוסיפים 1.6 מ"ל ממדיום הגידול לתאים, ומפיפטים אותם עם פיפטה להעברת פסטר להכנת תרחיף חד תאי.
   4. ספור את מספר התאים באמצעות מונה התא, וזרע 1 × 10⁴ תאים על מכסה 8 תאים. לדגור על התאים ב 37 ° C עם 5% CO₂ ולחות מבוקרת במשך 24 שעות.
      הערה: שתי בארות של הכיסוי התאי מוכנות לבקרה ולתאי הפלת STX6, בהתאמה, לאחר טיפול DMSO או Baf כמתואר בסעיף 3.4.2.
4. יום 4
   1. הכינו את מדיום הגידול ללא פנול אדום (DMEM ללא פנול אדום, 10% FBS, 1% פניצילין/סטרפטומיצין), המכיל רכב (DMSO) או 100 ננומטר Baf מומס ב-DMSO.
   2. החליפו את מדיום התרבית בתווך ללא פנול אדום, המכיל רכב או 100 ננומטר באף, ודגרו במשך 4 שעות.
      הערה: כדי להעריך את ההשפעה של Baf על מספרים אוטופגוזום ואוטוליזוזומים, הכינו תאים שטופלו ברכב כבקרות.
   3. הכתימו את הגרעינים ב-0.33 מיקרוגרם/מ"ל Hoechst 33342 למשך 30 דקות לפני התצפית.
   4. בצע הדמיה של תאים חיים באמצעות עדשה אובייקטיבית של 60x במיקרוסקופ לייזר קונפוקלי וצלם עשרה פריימים שונים.
      1. פתח את התמונה הממוזגת RGB בפיג'י, ופצל אותה לרכיבי התמונה האדומים, הירוקים והכחולים המתאימים על ידי לחיצה על תמונה | צבע | ערוצים מפוצלים.
      2. הגדר סף קבוע עבור האותות האדומים והירוקים בכל תמונה על-ידי לחיצה על תמונה | התאמה | סף לכל ניסוי.
      3. ספור את מספר האזורים החיוביים לאותות אדומים או ירוקים על-ידי לחיצה על נתח | לנתח חלקיקים. סמן את התיבה סיכום ולאחר מכן לחץ על אישור. רשום את הערכים מהספירה כדי לזהות שלפוחיות הקשורות לאוטופגוזום וליזוזום.
      4. כדי לכסות את התמונה הירוקה על התמונה האדומה, הגדר את מצב ההעברה ל - AND על-ידי לחיצה על ערוך | פקד הדבקה. העתק את התמונה הירוקה ולאחר מכן הדבק אותה בתמונה האדומה כדי למזג אותה, תוך הדגשת אזורים חיוביים הן לאותות אדומים והן לאותות ירוקים.
      5. כדי לזהות מספרים אוטומטיזומים, ספור את מספר האזורים החיוביים לאותות אדומים וירוקים על-ידי לחיצה על נתח | לנתח חלקיקים. סמן את התיבה סיכום , לחץ על אישור ורשום את הערכים במקטע ספירה כדי לזהות שלפוחיות המשויכות לאוטופגוזומים וליזוזומים.
   5. חלק את המספר הכולל של אוטוליזוזומים ואוטופגוזומים במספר התאים הכולל כדי לחשב את מספר האוטוליזוזומים והאוטופגוזומים לכל תא.
      הערה: ספרו לפחות 35 תאים בכל אחד משלושת הניסויים הבלתי תלויים.

4. ניתוח היווצרות אומגה

1. יום 1
   1. ספרו את מספר תאי HeLa באמצעות מונה תאים, וזרעו 1 × 10⁵ תאים על צלחת של 3.5 ס"מ. לדגור על התאים ב 37 ° C עם 5% CO₂ ולחות מבוקרת במשך 24 שעות.
2. יום 2 (אופציונלי)
   1. בצע את השלבים המתוארים בסעיף 1.1.2.
3. יום 3
   1. הכן תרחיף חד-תאי כמתואר בשלבים 3.3.1-3.3.2.
   2. ספרו את התאים באמצעות מונה התאים, וזרעו 1 × 10⁵ תאים על צלחת של 3.5 ס"מ. לדגור על התאים ב 37 ° C עם 5% CO₂ ולחות מבוקרת במשך 24 שעות.
4. יום 4
   1. יש לערבב 1 מיקרוגרם של pEGFP-C1-hAtg13, 3 μL של מגיב טרנספקציה של DNA, ו-100 μL של מדיום סרום מופחת בצינור בעל שימור נמוך. דוגרים על התערובת במשך 20 דקות, ואז מוסיפים אותה למדיום המתורבת.
   2. לדגור על התאים ב 37 ° C עם 5% CO₂ ולחות מבוקרת במשך 24 שעות.
5. יום 5
   1. טריפסין את התאים כמתואר בשלבים 3.3.1-3.3.2.
   2. הוסף 2.5 מ"ל של מדיום הגידול לתאים. פיפטה את התערובת באמצעות פיפטה העברת פסטר להכנת תרחיף חד תא.
   3. ספור את התאים באמצעות מונה התא, וזרע 1 × 10⁴ תאים על מכסה 8 תאים. לדגור על התאים ב 37 ° C עם 5% CO₂ ולחות מבוקרת במשך 24 שעות.
6. יום 6
   1. בצע את שלבים 3.4.1-3.4.4 כדי לבצע הדמיה של תאים חיים של התאים משלב 4.5.3 באמצעות מיקרוסקופ לייזר קונפוקלי. צלם עשר מסגרות שונות של תמונות.
      1. בצעו את שלבים 3.4.4.1-3.4.4.3 כדי לפצל את התמונות הממוזגות RGB לרכיבי התמונה האדומים, הירוקים והכחולים המתאימים, לקבוע סף קבוע לאותות הירוקים בכל תמונה ולקבוע את עוצמת אות GFP. רשום את הערכים מהמקטע Total Area כדי לקבוע את עוצמת האות של GFP-ATG13.
      2. חלק את עוצמת האות הכוללת במספר התאים שנבדקו כדי לחשב את עוצמת האות לכל תא.
         הערה: ספרו לפחות 34 תאים בכל אחד משלושת הניסויים הבלתי תלויים.

תוצאות

כפי שהוכח במחקרים קודמים, טיפול Baf הגדיל את רמות TSG101 (P1: P < 0.01, P2: P = 0.012, כפי שנקבע על ידי ANOVA דו-כיווני ב- EZR¹⁹) ו- LC3-II (P1: P < 0.01, P2: P < 0.01, כפי שנקבע על ידי ANOVA דו-כיווני ב- EZR¹⁹) בחלק העשיר ב- EV. יש לציין כי טיפול Baf גם הגביר את רמות STX6 (P1: P < 0.01, P2: P < 0.01, כפי שנקבע על-ידי ANOVA דו-כיווני ב-EZR¹⁹) בחלק EV (איור 1A), דבר המצביע על כך ש-STX6 עשוי להיות רכיב של כלי רכב חשמליים. אנטיגן גרעיני תאי מתפשט (PCNA) לא נצפה בחלק EV. אימונובלוטציה של STX6 במקטע התא גילתה שרמות STX6 ירדו בחצי עם הפלת ה-siRNA שלו (איור 1B). הפלת STX6 לא השפיעה על רמות TSG101 בשברים של תאים ושל EV הן בתנאים של כלי רכב והן בתנאים שטופלו ב-BAF (איור 1C). עם זאת, הפלת STX6 הגדילה את רמות LC3-II בחלק התא במצב שטופל ברכב, אך לא במצב שטופל ב-BAF. הפלת STX6 גם הגדילה את רמות LC3-II בחלק החשמלי במצב שטופל ב-BAF (איור 1D). ממצאים אלה מצביעים על כך שהשיטות המשמשות לזיהוי LC3-II בכלי רכב חשמליים על ידי אימונובלוטינג רגישות מספיק, גם אם יעילות ההפלות אינה משמעותית. בנוסף, תוצאות אלה מצביעות על כך ש-STX6 מגדיל את מספר האוטופגוזום התוך-תאי ומגביר את השחרור החוץ-תאי של בועיות הקשורות לאוטופגוזום תחת טיפול Baf.

כדי להמשיך ולחקור אם STX6 משפיע על מספרים אוטופגוזומיים תוך-תאיים ואוטוליזוזומים, אוטופגוזומים וליזוזומים הודגמו באמצעות הסמן האוטופגוזום mCherry-LC3 והסמן הליזוזום LAMP1-GFP. הדמיה קונפוקלית של תאים חיים חשפה בועיות חיוביות ל-GFP ול-mCherry בתאי HeLa המבטאות LAMP1-GFP ו-mCherry-LC3 (איור 2A). אוטוליזוזומים זוהו כשלפוחיות חיוביות ל-GFP ול-mCherry, בעוד שאוטופגוזומים זוהו כשלפוחיות GFP שליליות ו-mCherry-positive. הפלת STX6 הגדילה את מספר האוטופגוזומים והאוטוליזוזומים במצב של טיפול ברכב (איור 2B,C). אולם הפלה של STX6 לא השפיעה על מספרים אוטופגוזומיים ואוטוליזוזום במצב שטופל ב-BAF (איור 2B,C).

כדי לקבוע אם העלייה במספר האוטופגוזום התוך-תאי עקב הפלת STX6 נבעה מהיווצרות אוטופגוזום מוגברת, נבדק היווצרות אומגהזום, תהליך הנדרש ליצירת אוטופגוזום, באמצעות עוצמת האות של סמן האומגה GFP-ATG13. הדמיה קונפוקלית של תאים חיים סיפקה תמונה מורכבת של GFP-ATG13, המעידה על היווצרות אומגה (איור 3A). הפלת STX6 הפחיתה את עוצמת האות GFP-ATG13 (P = 0.023, כפי שנקבע על ידי ANOVA דו-כיווני ב-EZR¹⁹). בעוד שהפלה של STX6 לא השפיעה באופן משמעותי על עוצמת האות של GFP-ATG13 בתנאי הטיפול ברכב, היא הפחיתה באופן משמעותי את האות בתנאים שטופלו ב-BAF (איור 3B). באופן קולקטיבי, ממצאים אלה מצביעים על כך שהפלת STX6 מגבירה את שחרורן של בועיות חיוביות LC3-II הקשורות להצטברות שלפוחיות הקשורות לאוטופגוזום.

איור 1: תוצאות אימונובלוטינג של שברי התא, P1 ו-P2 מתאי HeLa שעברו בקרה או STX6 siRNA תחת טיפול ברכב או Baf. תאי HeLa טופלו ברכב (DMSO) או 100 ננומטר Baf במשך 24 שעות לאחר טרנספקציה עם בקרה או STX6 siRNA. התא, P1 (20,000 × גרם כדור) ו-P2 (110,000 × גרם כדור) בודדו. (A) תמונות אימונובלוטינג מייצגות של כל שבר המציגות STX6, TSG101, LC3 ו-PCNA. (ב-ד) ניתוח דנסיטומטרי עבור (B) STX6, (C) TSG101 ו-(D) LC3-II בוצע מתמונות האימונובלוט. עוצמות האות נורמלו לתאי הבקרה או STX6 siRNA שטופלו ברכב או ב-Baf. תרשימי העמודות מייצגים ערכים ממוצעים ±- S.E.M. (N = 3). * מציין P < 0.05 על ידי מבחן t לא משויך דו-זנבי ב- Excel. קיצורים: STX6 = תחביר 6; Baf = bafilomycin A1; DMSO = dimethyl sulfoxide; TSG101 = גן רגישות לגידול 101; LC3 = חלבונים הקשורים למיקרוטובול 1A/1B שרשרת אור 3B; PCNA = אנטיגן גרעיני תאים מתרבים; S.E.M. = שגיאת תקן של הממוצע. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: ניתוח תמונה קונפוקלית של תאי HeLa המבטאים במשותף Lamp1-GFP ו-mCherry-LC3 שעברו בקרה או SIRNA STX6 במצב של טיפול ברכב וב-Baf. (A) תמונות קונפוקליות של תאי HeLa המבטאים ביציבות LAMP1-GFP ו-mCherry-LC3 הודבקו בבקרה או ב-STX6 siRNA במשך 48 שעות, ולאחר מכן נחשפו ל-DMSO או ל-400 ננומטר Baf במשך 4 שעות. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. (B,C) כימות של (B) אוטופגוזומים (נקודות שליליות LAMP1-GFP ונקודות חיוביות mCherry-LC3) ו-(C) אוטוליזוזומים (LAMP1-GFP ונקודות חיוביות כפולות mCherry-LC3) בוצע באמצעות תוכנת פיג'י. הנתונים בתרשימי העמודות מוצגים כערכים ממוצעים ±- S.E.M. (N = 3). * מציין P < 0.05, בהתבסס על מבחן t לא משויך דו-זנבי ב- Excel. קיצורים: Lamp1 = חלבון קרום ליזוזומלי 1; LC3 = חלבונים הקשורים למיקרוטובול 1A/1B שרשרת אור 3B; STX6 = תחביר 6; Baf = bafilomycin A1; GFP = חלבון פלואורסצנטי ירוק; S.E.M. = שגיאת תקן של הממוצע. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: הדמיה קונפוקלית של תאי HeLa המבטאים GFP-ATG13, שעברו טרנספורמציה עם בקרה או עם STX6 siRNA, ועברו טיפול ברכב או ב-Baf. (A) תאי HeLa הודבקו בבקרת ביקורת או ב-STX6 siRNA, ולאחר מכן בטרנספקציה pEGFP-C1-hAtg13, וטופלו ב-DMSO או 400 nM Baf במשך 4 שעות. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. (B) עוצמות האות היחסיות נקבעו על ידי נרמול האות בכל מצב לזה של תאי ביקורת siRNA שטופלו ב- Baf. גרף העמודות מציג את הנתונים כאמצעי ± S.E.M. (N = 3). * מציין P < 0.05 על-ידי מבחן t דו-זנבי לא משויך ב- Excel. קיצורים: hAtg13 = גן הקשור לאוטופגיה אנושית 13; STX6 = תחביר 6; Baf = bafilomycin A1; DMSO = dimethyl sulfoxide; S.E.M. = שגיאת תקן של הממוצע. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור משלים S1: ניתוח אימונובלוט של שברי התא, P1 ו-P2 מתאי HeLa שעברו סינה-רנ"א בקרה וטופלו ב-Baf. תאי HeLa הודבקו ב-siRNA בקרה ונחשפו ל-100 ננומטר Baf במשך 24 שעות. לאחר מכן הוכנו שברים: תא, P1 (20,000 × גרם גלולה) ו-P2 (110,000 × גרם כדור). תמונות אימונובלוט מייצגות של ULK1 ו- PCNA, המציגות את רמותיהם בכל שבר לצורך השוואה. קיצורים: Baf = bafilomycin A1; ULK1 = unc-51 כמו אוטופגיה המפעילה קינאז 1; PCNA = אנטיגן גרעיני תאים מתרבים. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

דיון

מחקר האימונובלוטינג חשף רמות LC3-II ו-TSG101 בחלק התאי, במקטע P1 EV העשיר במיקרו-שלפוחיות ובמקטע P2 EV העשיר באקסוזומים. דימות תאים חיים שימש לבחינת אוטופגוזומים, אוטוליזוזומים ואומגה, וסיפק תובנה האם STX6 משפיע על אוטופגיה. תוצאות משולבות אלה מצביעות על כך שהפלה של STX6 משפיעה על שחרורם של כלי רכב חשמליים חיוביים LC3-II, מה שעשוי להיות קשור לחוסר ויסות של מסלול האוטופגיה. יתרון מרכזי של שיטה זו הוא יכולתה להבחין בין כלי רכב חשמליים גדולים וקטנים שמקורם במקורות שונים. ניתוח ציטומטריית זרימה באמצעות סמנים ספציפיים עבור microvesicles, exosomes, או מנגנון Golgi עשוי להבהיר עוד יותר כיצד STX6 knockdown משפיע על שחרור שלפוחיות חיוביות LC3-II.

עם זאת, מגבלה של מחקר האימונובלוטינג היא שעדיין לא ברור אם העלייה שנצפתה ברמות LC3-II בחלק EV לאחר הפלת STX6 תחת טיפול Baf נובעת ממספר מוגבר של שלפוחיות חיוביות LC3-II שמשתחררות או מעלייה ברמות LC3-II לכל EV. כדי להבחין בין אפשרויות אלה, ספירת שלפוחיות באמצעות ניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים או ניתוח ציטומטריית זרימה עשויה לעזור לקבוע אם מספר השלפוחיות החיוביות LC3-II גדל או אם רמות LC3-II לכל שלפוחית גבוהות.

שלב קריטי בפרוטוקול הוא שבר המדיום המתורבת כדי להכין את החלק החשמלי. כלי רכב חשמליים נצפים ככדורים זעירים בצינור הצנטריפוגה. כדי להכין חלק EV דומה, חשוב להעביר בזהירות או להשליך supernatant לאחר צנטריפוגה כדי למנוע דילול ריכוז החלבון של כדורי EV. כדי לבחון זיהום ממקטע התא למקטע EV, רמות של חלבון ציטופלזמי, אוטופגיה דמוית unc-51 המפעילה קינאז 1 (ULK1) וחלבון גרעיני, PCNA הושוו בין השברים במחקר זה (איור משלים S1). ריכוז החלבון בחלק התא משקף בדרך כלל את מספרי התאים, אך ריכוז החלבון התאי מושפע משלבי מחזור התא²⁰ או הפרעות בפרוטאוסטזיס²¹. אוטופגיה חיונית לשמירה על פרוטאוסטאזיס²². דיסרגולציה של אוטופגיה על ידי STX6 knockdown או טיפול Baf עלולה לשנות את ריכוז החלבונים ללא קשר למספר התא.

הפלת STX6 מושגת באמצעות טרנספקציה של siRNA, וביטוי יתר של GFP-ATG13 מושג באמצעות טרנספקציה של DNA. יעילות הטרנספקציה מושפעת מסוג התא, צפיפותו ומספרים. יישור יעיל של רצפי siRNA עשוי גם הוא להשפיע על יעילות ההפלה. התאמות נחוצות כאשר יעילות ההעברה נמוכה.

התוצאות הנוכחיות מצביעות על כך שהפלת STX6 העלתה את רמות הסמן האוטופגוזום LC3-II בחלק EV בתנאים שטופלו ב-BAF, אך לא השפיעה על רמות TSG101. זה מצביע על כך ש-STX6 מדכא שחרור של בועיות שמקורן באוטופגוזומים, אך לא מ-MVBs, כאשר איחוי אוטופגוזום-ליזוזום מעוכב.

הפלת STX6 גם העלתה את רמות LC3-II בתאים בתנאי גידול, מה שמרמז על כך ש-STX6 מווסת אוטופגיה. ואכן, STX6 הגדיל את מספר האוטופגוזומים והאוטוליזוזומים, בעוד שהוא לא שיפר את היווצרות האומגה. הבשלה של אוטוליזוזומים גורמת לרפורמציה אוטופגית של ליזוזום²³. ייתכן כי STX6 מתווך את תהליך ההבשלה של אוטוליזוזומים, ואובדן תפקודו עלול להגדיל את מספר האוטוליזוזומים הלא בשלים, מה שמוביל לחוסר ויסות של איחוי אוטופגוזום-ליזוזום עקב דיכוי של רפורמציה ליזוזומית אוטופגית.

טיפול Baf העלה את רמות STX6 בחלק EV, גם כאשר הביטוי שלו היה מווסת פחות. מחקרים קודמים הציעו כי שלפוחיות הקשורות לאוטופגוזום משתחררות ככלי רכב חשמליים כאשר תפקוד ליזוזומלי מעוכב^13,14. STX6 ידוע כמותאם לשלפוחיות הקשורות לאוטופגוזום, כגון סטרפטוקוקוס מקבוצה A (GAS) המכיל vacuoles דמוי אוטופגוזום²⁴. לכן, STX6 עשוי להיות מקומי לבועיות הקשורות לאוטופגוזום המשתחררות ככלי רכב חשמליים כאשר איחוי אוטופגוזום-ליזוזום מעוכב.

התפשטות הפתולוגיה של TDP-43 קשורה קשר הדוק להתקדמות ALS ו- FTLD-TDP³. למרות שעדיין לא ברור כיצד פתולוגיה של TDP-43 מתפשטת דרך המוח וחוט השדרה, מסלול EV עשוי לתווך את התפשטותו. מחקרים קודמים הצביעו על כך שחוסר ויסות של מסלול אוטופגיה-ליזוזום גורם לשחרור של כלי רכב חשמליים חיוביים LC3-II המכילים TDP-43¹³. המחקר הנוכחי מציע תפקיד ל-STX6 בוויסות שחרור רכב חשמלי כאשר איחוי אוטופגוזום-ליזוזום מעוכב. המתודולוגיה להערכת רמות LC3-II בשברים של תאים ושל EV על ידי immunoblotting אמורה להיות מועילה במחקרים עתידיים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
0.25 % טריפסין EDTA	Fujifilm Wako	201-16945
10 ס"מ צלחת	תרמו פישר סיינטיפיק	150464
15 מ"ל צינור	תרמו פישר סיינטיפיק	339650
200 μ L Pipette Tip	Nippon Genetics	FG-301	pipetting
2-Mercaptoethanol	Nacalai Tesque	21417-52	חומר ל תמיסת חיץ דגימה
3,3'-Diaminobenzidine Tetrahydrochloride	Nacalai Tesque	11009-41	חומר לתמיסת DAB
3.5 ס"מ צלחת	תרמו פישר סיינטיפיק	150460
6 ס"מ צלחת	TrueLine	TR4001
אמבטיות תרמוסטטיות בלוק אלומיניום (אמבטיות תרמיות יבשות)	EYELA	273860
שואב	SANSYO	SAP-102	תמיסת שאיפה
Avanti JXN-30	בקמן קולטר	B34193
Bafilomycin A1	Adipogen	BVT-0252
וקטור נוגדן IgG מצומד ביוטין	מעבדות	BA-1000	נוגדן שני לאימונובלוטינג
ביוטין מצומד סוס IgG Antibody	Vector Laboratories	BA-2000	נוגדן שני לאימונובלטינג
חסימה אחת	נקלאי טסק	03953-95	חומר לאימונובלוטינג
ברומופנול כחול	נקלאי טסק	05808-61	חומר ל תמיסת חיץ דגימה
סרום	עגל cytiva	SH30073.03
CanoScan LiDE 220	Canon	CSLIDE220	סורק
צנטריפוגה 5702 R	eppendolf	5703000039
ספירת שקופיות תא כפול	תא Bio-Rad	1450015J	ספירת תאים
דיגיטלי סוניפייר 450	ברנסון
דימתיל סולפוקסיד	nacalai tasque	09659-14	רכב
DMEM גלוקוז גבוה	Nacalai Tesque	08458-45	תרבית בינונית
DMEM ללא פנול אדום	Nacalai Tesque	08489-45	מדיום תרבית
EGTA	Dojindo	348-01311	חומר לפתרון A68
Excel	מיקרוסופט	גרסה 16.16.27	ניתוח סאטיסטי
EZR	הפניה מס' 24	גרסה 1.68	ניתוח סאטיסטי
FBS	Sigma		173012 Culture מדיום
פיג'י	NIH		כלי ניתוח תמונה
גליצרול	נקלאי טסק	09886-05	חומר ל תמיסת חיץ דגימה
Hoehst33342	Dojindo	H342
מי חמצן	Fujifilm Wako	080-0186	חומר לתמיסת DAB
Kimwipe S-200	NIPPON PAPER CRECIA	62011	ניקוי לנגב
צינור שמירה נמוך	Nippon Genetics	FG-MCT015CLB	siRNA והעברת DNA
LSM780 מיקרוסקופ לייזר קונפוקלי	Carl Zeiss
עכבר מונוקלונלי Anti-LC3 נוגדן	MBL	M186-3	נוגדן ראשון לאימונובלוטינג
ניקל (II) כלוריד הקסהידראט	פוג'יפילם Wako	149-01041	חומר לתמיסת DAB
N-Lauroylsarcosine נתרן מלח	Nacalai Tesque	20117-12
אופטימה XE-90 אולטרה-צנטריפוגה	בקמן קולטר	A94471
Opti-MEM I סרום מופחת	תרמו פישר מדעי	31985-070	siRNA וטרנספקציה של DNA
pEGFP-C1-hAtg13	Addgene	22875
פניצילין/סטרפטומיצין	נקלאי טסק	26253-84	תרבית בינונית
ערכות בדיקת חלבון BCA Thermo	Fisher Scientific	23225
ארנב פוליקלונלי נוגדן נגד PCNA	BioAcademia	70-080	נוגדן ראשון עבור אימונובלוטינג
ארנב פוליקלונלי אנטי-סינטקסין 6 נוגדן	ProteinTech	10841-1-AP	נוגדן ראשון לאימונובלוטינג
ארנב פוליקלונלי אנטי-TSG101 נוגדן	ProteinTech	28283-1-AP	נוגדן ראשון לאימונובלוטינג
ארנב פוליקלונלי אנטי-ULK1 נוגדן	ProteinTech	20986-1-AP	נוגדן ראשון לאימונובלוטינג
פוליווינילידן דיפלואוריד ממברנה	Milliore	IPVH00010	חומר לאימונובלטינג
צוות ליבה של פיתוח	R	גרסה 4.4.1	ניתוח סאטיסטי
RNAiMAX	Thermo Fisher Scientific	13778	siRNA transfection reagent
siRNA STX6	Thermo Fisher Scientific	HSS115604	siRNA לטרנספקציה
נתרן כלורי	נקלאי טסק	31320-05	חומר למאגר Tris ותמיסת A68
נתרן דודציל סולפט	פוג'יפילם Wako	192-13981	חומר ל תמיסת חיץ דגימה
SPARK Microplate Reader	TECAN
Stealth RNAi דופלקסים בקרה שלילית, Med GC	Thermo Fisher Scientific	12935300	siRNA transfection
Sucrose	Fujifilm Wako	193-00025	חומר לתמיסת A68
TC20 מונה תאים אוטומטי עם מדפסת תרמית	Bio-Rad	1450109J1	ספירת תאים
Thermobath	TOKYO RIKAKIKAI	MG-3100	דגירה
TransIT-293	Mirus Bio	MIR 2700	מגיב טרנספקציה DNA
TransIT-LT1	Mirus Bio		MIR2300 מגיב
טרנספקציה DNATris(hydroxymethyl)aminomethane	Nacalai Tesque	35406-75	חומר עבור Tris buffer, מאגר דגימה ותמיסת A68
Trypan Blue Dye 0.40%	Bio-Rad	1450021	ספירת תאים צינור
פתוח ברור במיוחד, 16 x 96 מ"מ	בקמן קולטר	361706	P1 EV
, 14 x 89 מ"מ	בקמן קולטר	344059	איסוף עבור שבר P2 EV
Vectastain ABC Standard Kit	Vector Laboratories	PK-4000	immunoblotting
לשטוף בקבוק	כמו אחד	1-4640-02	כביסה קרום
μ-שקופית 8 היטב	גבוה ibidi	80806