הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הערכה של שחרור LC3-II באמצעות שלפוחיות חוץ-תאיות ביחס להצטברות שלפוחיות חיוביות ל-LC3 תוך תאיות

1.6K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/67385

⸱

18 באוקטובר 2024

 , 
1Biochemistry Unit, Faculty of Veterinary Medicine, Okayama University of Science

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מציגים את המתודולוגיה להערכה תמציתית של רמות סמן אוטופגוזום LC3-II בשלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) על ידי immunoblotting. ניתוח רמות LC3-II ברכבים חשמליים, היווצרות אוטוליזוזום והיווצרות אומגה מצביע על התפקיד החדש של STX6 בשחרור רכבים חשמליים חיוביים ל-LC3-II כאשר איחוי אוטופגוזום-ליזוזום מעוכב.

תקציר

אוטופגיה (מאקרו) מייצגת מסלול פירוק תאי בסיסי. בתהליך זה, שלפוחיות בעלות קרום כפול הידועות בשם אוטופגוזומים בולעות תוכן ציטופלזמי, ולאחר מכן מתמזגות עם ליזוזומים לצורך פירוק. מעבר לתפקיד הקנוני, גנים הקשורים לאוטופגיה מווסתים גם מסלול הפרשה הכולל שחרור של מולקולות דלקתיות, גורמי תיקון רקמות ובועיות חוץ-תאיות (EV). יש לציין כי תהליך הפצת חלבונים פתולוגיים בין תאים, במיוחד במחלות נוירודגנרטיביות הפוגעות במוח ובחוט השדרה, מדגיש את חשיבות הבנת התופעה. מחקרים אחרונים מצביעים על כך שהחלבון קושר הדנ"א 43 kDa (TDP-43), שחקן מפתח בטרשת אמיוטרופית צידית וניוון האונה הקדמית-טמפורלית, משתחרר באופן תלוי אוטופגיה באמצעות כלי רכב חשמליים המועשרים בסמן האוטופגוזום חלבונים הקשורים למיקרוטובולים 1A/1B שרשרת אור 3B-II (LC3-II), במיוחד כאשר איחוי אוטופגוזום-ליזוזום מעוכב.

כדי להבהיר את המנגנון העומד בבסיס היווצרותם ושחרורם של כלי רכב חשמליים חיוביים ל-LC3-II, הכרחי לבסס שיטה נגישה וניתנת לשחזור להערכת שלפוחיות חיוביות LC3-II תוך-תאיות וחוץ-תאיות. מחקר זה מציג פרוטוקול מפורט להערכת רמות LC3-II באמצעות אימונובלוטינג בשברים תאיים וחשמליים המתקבלים באמצעות צנטריפוגה דיפרנציאלית. Bafilomycin A1 (Baf), מעכב של איחוי אוטופגוזום-ליזוזום, משמש כבקרה חיובית לשיפור רמות השלפוחיות החיוביות LC3-II תוך תאיות וחוץ-תאיות. הגן 101 (TSG101) משמש כסמן לגופים רב-שלפוחיתיים. ביישום פרוטוקול זה, הוכח כי הפלה בתיווך siRNA של תחביר-6 (STX6), גורם סיכון גנטי למחלת קרויצפלד-יעקב ספורדית, מעלה את רמות LC3-II בחלק EV של תאים שטופלו ב- Baf מבלי להראות השפעה משמעותית על רמות TSG101. ממצאים אלה מצביעים על כך ש-STX6 עשוי לווסת באופן שלילי את השחרור החוץ-תאי של LC3-II באמצעות כלי רכב חשמליים, במיוחד בתנאים שבהם איחוי אוטופגוזום-ליזוזום נפגע. בשילוב עם שיטות מבוססות להערכת אוטופגיה, פרוטוקול זה מספק תובנות חשובות לגבי תפקידן של מולקולות ספציפיות בהיווצרות ושחרור של כלי רכב חשמליים חיוביים LC3-II.

מבוא

תגובת טרנסאקטיבציה חלבון קושר DNA 43 (TDP-43) הוא ריבונוקלפרוטאין גרעיני הטרוגני בעל ביטוי נרחב המעורב בוויסות שחבור אקסון, שעתוק גנים ויציבות mRNA, כולם חיוניים להישרדות התא 1,2. במצבים נוירודגנרטיביים כמו טרשת אמיוטרופית צידית (ALS) וניוון אונה פרונטו-טמפורלית (FTLD), חלבון גרעיני TDP-43 מצטבר באופן חריג בציטופלסמה. שינוי זה גורם לאובדן תפקוד TDP-43 בגרעין ולעלייה רעילה בתפקוד הציטופלסמה. הצטברות פתולוגית של TDP-43 מתחילה באזורים ספציפיים של המוח וחוט השדרה, ומתפשטת באזורים אלה באופן דמוי פריון, תהליך הקשור קשר הדוק עם התקדמות המחלה3. עם זאת, המנגנון המדויק שבו פתולוגיה TDP-43 מתפשטת דרך המוח וחוט השדרה נותר לא ידוע.

TDP-43 מופרש באמצעות שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs), ורמות גבוהות של TDP-43 מזוהות בפלזמה ובנוזל השדרה (CSF) של חולי ALS ו-FTLD-TDP 4,5,6. CSF מחולים שאובחנו עם ALS ו- FTLD גורם למיקום שגוי תוך תאי וצבירה של TDP-43 אנדוגני בתאי גליומה אנושיים7. לפיכך, TDP-43 המשתחרר מחוץ לתא באמצעות כלי רכב חשמליים עשוי לתווך את התפשטות התא לתא של פתולוגיית TDP-43.

אוטופגיה היא מנגנון פירוק תאי שמור היטב הכולל סגירה של חומרים לא רצויים בתוך שלפוחיות קרום כפול, הידועות בשם אוטופגוזומים, המסומנות על ידי LC3. אוטופגוזומים אלה מתמזגים עם ליזוזומים חיוביים לחלבון הממברנה הקשור לליזוזומלים 1 (LAMP1) ליצירת אוטוליזוזומים (LC3+/LAMP1+), מה שמוביל לפירוק תכולתם8. ניתוחים היסטולוגיים מצביעים על כך שאוטופגוזומים הבולעים תכלילים מצטברים בנוירונים של חולי ALS ספורדיים9. חלק מהגנים הסיבתיים של ALS משפחתי ו- FTLD-TDP קשורים לוויסות אוטופגיה 10,11,12. ממצאים אלה מצביעים על כך שאוטופגיה מדוכאת בחולי ALS ו-FTLD-TDP.

המחקר הקודם הצביע על כך ש-TDP-43 מופרש באמצעות כלי רכב חשמליים חיוביים לסמן האוטופגוזום LC3-II כאשר איחוי אוטופגוזום-ליזוזום מעוכב13. חוסר ויסות של מסלול אוטופגיה-ליזוזום עלול לגרום לא רק להצטברות תוך-תאית של TDP-43 אלא גם לשחרור חוץ-תאי של TDP-43 באמצעות EVs14. עם זאת, עדיין לא ידוע כיצד משוחררים כלי רכב חשמליים חיוביים LC3-II ועד כמה זה משמעותי בהתפשטות הפתולוגיה של TDP-43.

כלי רכב חשמליים מסווגים לכלי רכב חשמליים גדולים (בקוטר 100 עד 1000 ננומטר), המיוצרים מניצני פני השטח של התא, ולכלי רכב חשמליים קטנים (בקוטר 50 עד 150 ננומטר), המיוצרים מניצני קרומים אנדוזומליים לכיוון פנים האנדוזום (המכונים אקסוזומים) ומנגנון גולג'י. כדי לאסוף בנפרד כלי רכב חשמליים גדולים וקטנים, אנו מבצעים צנטריפוגות רציפות ואוספים כדוריות באמצעות צנטריפוגות ב-20,000 × גרם ו-110,000 × גרם, בהתאמה. מקטע P1 EV (20,000 × גרם כדורים) מוכן לאסוף כלי רכב חשמליים גדולים, ושבר P2 EV (110,000 × גרם כדורים) מוכן לאסוף כדורי EV קטנים15. המתודולוגיה להערכת רמות LC3-II בכלי רכב חשמליים גדולים וקטנים הנגזרים מצנטריפוגה רציפה על ידי אימונובלוטינג היא יציבה וניתנת לשחזור16. בנוסף לניתוח רמות LC3-II ברכבים חשמליים, ניתוח היווצרות אוטוליזוזום ואומגה משפר את ההבנה כיצד חוסר ויסות של אוטופגיה מוביל לשחרור של כלי רכב חשמליים חיוביים LC3-II. כאן, המחקר הנוכחי מראה את התפקיד המדכא של תחביר 6 (STX6), חלבון SNARE, אשר מקדם את התנועה של בועיות הובלה כדי להתמקד בממברנות17, בשחרור של EV חיובי LC3-II כאשר איחוי אוטופגוזום-ליזוזום מעוכב.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. הכנת חלק התא, P1 ו-P2 EV מהתווך התרבית של תאי HeLa

  1. הכנת חלק P1 ו- P2 EV מהמדיום התרבית של תאי HeLa
    1. יום 1
      1. ספרו את התאים באמצעות מונה תאים וזרעו 1 × 106 תאים על צלחת בגודל 6 ס"מ המכילה מדיום תרבית המורכב מגלוקוז גבוה DMEM, 10% FBS ו-1% פניצילין/סטרפטומיצין. לדגור על התאים ב 37 ° C עם 5% CO2 ולחות מבוקרת במשך 24 שעות.
    2. יום 2 (אופציונלי)
      1. הכינו תמיסת siRNA של 20 מיקרומטר.
      2. יש לערבב 100 μL של מדיום סרום מופחת ו-3 μL של siRNA בצינור בעל שימור נמוך כדי להכין תמיסה A.
      3. יש לערבב 100 μL של מדיום סרום מופחת ו-5 μL של מגיב טרנספקציה בצינור בעל שימור נמוך כדי להכין תמיסה B.
      4. ערבבו תמיסה A ותמיסה B, ולאחר מכן דגרו על התערובת בטמפרטורת החדר (RT) במשך 5 דקות.
      5. הוסף את תערובת התמיסות A ו - B למדיום המשמש לגידול תאי HeLa. לדגור על התאים ב 37 ° C עם 5% CO2 ולחות מבוקרת במשך 24 שעות.
    3. יום 3
      1. שטפו את התאים עם PBS וחשפו אותם ל-500 מיקרוליטר של 0.25% טריפסין ותמיסת 1 mM EDTA ב-37°C עם 5% CO2 ולחות מבוקרת למשך 5 דקות.
      2. הוסיפו 2.5 מ"ל של מדיום התרבית לתאים, והשתמשו בפיפטת העברת פסטר עם קצה פיפטה של 200 מיקרוליטר מחובר להכנת תרחיף חד תאי.
      3. ספרו את התאים באמצעות מונה תאים, וזרעו 1 × 106 תאים על צלחת של 10 ס"מ. לדגור על התאים ב 37 ° C עם 5% CO2 ולחות מבוקרת במשך 24 שעות.
        הערה: יש צורך להכין לפחות 1 × 106 תאים כדי לאסוף EVs ממדיום התרבית הדרוש לניתוח immunoblotting.
    4. יום 4
      1. הכן מדיום תרבית (ראה שלב 1.1.1.1) המכיל רכב (DMSO) או 100 ננומטר Bafilomycin A1 (Baf).
      2. חשוף את התאים לתווך המכיל רכב או 100 ננומטר Baf ודגור עליהם ב 37 ° C עם 5% CO2 ולחות מבוקרת במשך 24 שעות.
    5. יום 5
      1. אספו את כל אמצעי התרבית מהצלחת בקוטר 10 ס"מ, העבירו אותה לצינור של 15 מ"ל וצנטריפוגו אותה בטמפרטורה של 3,000 × גרם למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4°C כדי להסיר פסולת תאים.
        הערה: התאים הנותרים בלוח בגודל 10 ס"מ ישמשו בסעיף 1.2.1.
      2. לבידוד של מקטע P1 EV, העבירו את הסופרנאטנט לאחר צנטריפוגה ב-3,000 × גרם לתוך צינור צנטריפוגה, ולאחר מכן בצעו צנטריפוגה ב-20,000 × גרם ב-4°C למשך שעה אחת.
      3. לבידוד חלק P2 EV, העבירו את הסופרנאטנט לאחר צנטריפוגה ב-20,000 × גרם לתוך צינור אולטרה-צנטריפוגה, ולאחר מכן בצעו צנטריפוגה ב-110,000 × גרם ב-4°C למשך שעה אחת.
      4. לאחר ניגוב הלחות העודפת בתוך הצינור באמצעות מגבון מעבדה, יש להשהות מחדש את הכדורים הנותרים בצינור הצנטריפוגה ב-50 μL של חיץ דגימה פי 2 [2.5% SDS, 125mM Tris-HCl buffer (pH 6.8), 30% גליצרול, 10% 2-מרקפטואתנול, 0.4% Bromophenol Blue] כדי להכין את מקטע P1 EV.
      5. הסר את supernatant על ידי decanting, לנגב את הלחות העודפת בתוך הצינור עם מגבון מעבדה, ולאחר מכן להשעות מחדש את הכדורים הנותרים בצינור ultracentrifugation ב 50 μL של 2x חיץ דגימה כדי להכין את החלק P2 EV.
      6. יש לדגור על שברי P1 ו-P2 EV בטמפרטורה של 100°C על בלוק חום למשך 10 דקות.
        הערה: אין לנער את הצינורות לאחר הצנטריפוגה בעוצמה של 20,000 × גרם ו-110,000 × גרם כדי למנוע השלכה בטעות של הכדורים הנותרים. לאחר הטיית הצינור כדי להעביר את הסופרנאטנט, שמרו על מיקום הצינור כדי למנוע מהגלולה לשקוע שוב בסופרנאטנט שנותר.
  2. הכנת מקטע התא מתאי HeLa בתרבית
    1. יום 5
      1. לאחר העברת מדיום התרבית מהצלחת בקוטר 10 ס"מ לצינור של 15 מ"ל, שטפו את התאים בצלחת של 10 ס"מ עם PBS וחשפו אותם ל-2 מ"ל של 0.25% טריפסין ותמיסת EDTA של 1 מ"מ ב-37°C עם 5% CO2 ולחות מבוקרת למשך 5 דקות.
      2. הוסף 8 מ"ל של מדיום גידול לתאים, ולאחר מכן השתמש פיפטה העברת פסטר עם קצה פיפטה 200 μL כדי פיפטה פיפטה את התאים ולהכין תרחיף תא יחיד.
      3. מעבירים את מתלה התא לצינור בנפח 15 מ"ל וצנטריפוגות אותו בטמפרטורה של 1,000 × למשך 10 דקות ב-4°C.
      4. הסר את supernatant על ידי אספירטור, להוסיף PBS לגלולה התא, ולאחר מכן צנטריפוגה ב 1,000 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
      5. הסר את PBS באמצעות שואב וסוניק את גלולת התא ב 1 מ"ל של חיץ A68 [10 mM Tris-HCl buffer, pH 7.5, 0.8 M NaCl, 1 mM אתילן גליקול bis(β-aminoethyl אתר)-N,N,N,N,N-חומצה טטראצטית (EGTA)] המכיל 1% סרקוזיל.
      6. מדוד את ריכוז החלבון של התא ליזט באמצעות ערכת בדיקת חלבון BCA.
      7. מערבבים 300 μL של ליזט התא עם 100 μL של מאגר דגימה 4x ודגרים על התערובת ב 100 ° C על בלוק חום במשך 10 דקות כדי להכין את חלק התא.

2. ניתוח אימונובלוטינג

  1. הפרד כמויות שוות ערך של חלבונים בדגימות על ידי SDS-PAGE18.
  2. העבירו את החלבונים המופרדים לקרומי פוליווינילידן דיפלואוריד (PVDF).
  3. לאחר ההעברה, לחסום את הממברנות עם סוכן חוסם למשך 20 דקות.
  4. יש לדגור על הקרום החסום למשך הלילה עם הנוגדן הראשוני המצוין במאגר Tris המכיל 10% (v/v) נסיוב עגל ב-RT.
  5. שטפו את הממברנה עם חיץ Tris במשך 5 שניות ולאחר מכן דגרו עליו עם נוגדן משני מצומד ביוטין ב- RT למשך שעתיים.
  6. שטפו את הממברנה עם חיץ Tris למשך 5 שניות ולאחר מכן דגרו עליו עם חיץ Tris המכיל 0.4% (v/v) תמיסות A ותמיסה B מהערכה ב- RT למשך שעה אחת.
  7. שטפו את הממברנה עם PBS, ולאחר מכן דגרו עליה עם PBS המכיל 0.04% (w/v) diaminobenzidine, 0.8% (w/v) NiCl2·6H2O, ו-0.3% (v/v) H2O2 לזיהוי קולורימטרי של פסים.
    הערה: לזיהוי אותות, מקובלת גם שיטת כימילומינסנציה.
  8. דיגיטציה של תמונת הממברנה על ידי סורק והכפפתה לניתוח צפיפות באמצעות פיג'י.
    1. פתח את התמונה הדיגיטלית באמצעות פיג'י, והמר את תמונת הצבע RGB לתמונה של 8 סיביות על ידי לחיצה על תמונה | סוג | 8 סיביות.
    2. לחץ על כלי המלבן והתאם את גודל המלבן על ידי גרירתו כדי להקיף את הפסים. זהה את הרצועה לניתוח על-ידי לחיצה על נתח | ג'לים | בחר נתיב ראשון.
    3. מקם את המלבן על הפס השני ועל הפסים הבאים, וזהה את הפסים לניתוח על-ידי לחיצה על נתח | ג'לים | בחר הנתיב הבא.
    4. לאחר זיהוי הרצועה הסופית, מדוד את הצפיפות על פני המלבן על-ידי לחיצה על נתח | ג'לים | נתיבי עלילה.
    5. הקף את אזור האות של הרצועה בקו ישר, לחץ על הכלי שרביט ולחץ באזור כדי לחשב את עוצמת האות של הפס.

3. ניתוח מספר האוטופגוזומים והאוטוליזוזומים

  1. יום 1
    1. ספרו את מספר תאי HeLa באמצעות מונה תאים, וזרעו 1 × 105 תאי HeLa המבטאים LAMP1-GFP ו- mCherry-LC3 על צלחת של 3.5 ס"מ. לדגור על התאים ב 37 ° C עם 5% CO2 ולחות מבוקרת במשך 24 שעות.
  2. יום 2 (אופציונלי)
    1. בצע את השלבים המתוארים בסעיף 1.1.2 בצלחות של 3.5 ס"מ.
  3. יום 3
    1. השליכו את מדיום התרבית מהכלים בקוטר 3.5 ס"מ.
    2. יש לשטוף תאים עם PBS, לחשוף אותם ל-400 מיקרוליטר של 0.25% טריפסין ותמיסת 1 mM EDTA, ולדגור ב-37°C עם 5%CO2 ולחות מבוקרת למשך 5 דקות.
    3. מוסיפים 1.6 מ"ל ממדיום הגידול לתאים, ומפיפטים אותם עם פיפטה להעברת פסטר להכנת תרחיף חד תאי.
    4. ספור את מספר התאים באמצעות מונה התא, וזרע 1 × 104 תאים על מכסה 8 תאים. לדגור על התאים ב 37 ° C עם 5% CO2 ולחות מבוקרת במשך 24 שעות.
      הערה: שתי בארות של הכיסוי התאי מוכנות לבקרה ולתאי הפלת STX6, בהתאמה, לאחר טיפול DMSO או Baf כמתואר בסעיף 3.4.2.
  4. יום 4
    1. הכינו את מדיום הגידול ללא פנול אדום (DMEM ללא פנול אדום, 10% FBS, 1% פניצילין/סטרפטומיצין), המכיל רכב (DMSO) או 100 ננומטר Baf מומס ב-DMSO.
    2. החליפו את מדיום התרבית בתווך ללא פנול אדום, המכיל רכב או 100 ננומטר באף, ודגרו במשך 4 שעות.
      הערה: כדי להעריך את ההשפעה של Baf על מספרים אוטופגוזום ואוטוליזוזומים, הכינו תאים שטופלו ברכב כבקרות.
    3. הכתימו את הגרעינים ב-0.33 מיקרוגרם/מ"ל Hoechst 33342 למשך 30 דקות לפני התצפית.
    4. בצע הדמיה של תאים חיים באמצעות עדשה אובייקטיבית של 60x במיקרוסקופ לייזר קונפוקלי וצלם עשרה פריימים שונים.
      1. פתח את התמונה הממוזגת RGB בפיג'י, ופצל אותה לרכיבי התמונה האדומים, הירוקים והכחולים המתאימים על ידי לחיצה על תמונה | צבע | ערוצים מפוצלים.
      2. הגדר סף קבוע עבור האותות האדומים והירוקים בכל תמונה על-ידי לחיצה על תמונה | התאמה | סף לכל ניסוי.
      3. ספור את מספר האזורים החיוביים לאותות אדומים או ירוקים על-ידי לחיצה על נתח | לנתח חלקיקים. סמן את התיבה סיכום ולאחר מכן לחץ על אישור. רשום את הערכים מהספירה כדי לזהות שלפוחיות הקשורות לאוטופגוזום וליזוזום.
      4. כדי לכסות את התמונה הירוקה על התמונה האדומה, הגדר את מצב ההעברה ל - AND על-ידי לחיצה על ערוך | פקד הדבקה. העתק את התמונה הירוקה ולאחר מכן הדבק אותה בתמונה האדומה כדי למזג אותה, תוך הדגשת אזורים חיוביים הן לאותות אדומים והן לאותות ירוקים.
      5. כדי לזהות מספרים אוטומטיזומים, ספור את מספר האזורים החיוביים לאותות אדומים וירוקים על-ידי לחיצה על נתח | לנתח חלקיקים. סמן את התיבה סיכום , לחץ על אישור ורשום את הערכים במקטע ספירה כדי לזהות שלפוחיות המשויכות לאוטופגוזומים וליזוזומים.
    5. חלק את המספר הכולל של אוטוליזוזומים ואוטופגוזומים במספר התאים הכולל כדי לחשב את מספר האוטוליזוזומים והאוטופגוזומים לכל תא.
      הערה: ספרו לפחות 35 תאים בכל אחד משלושת הניסויים הבלתי תלויים.

4. ניתוח היווצרות אומגה

  1. יום 1
    1. ספרו את מספר תאי HeLa באמצעות מונה תאים, וזרעו 1 × 105 תאים על צלחת של 3.5 ס"מ. לדגור על התאים ב 37 ° C עם 5% CO2 ולחות מבוקרת במשך 24 שעות.
  2. יום 2 (אופציונלי)
    1. בצע את השלבים המתוארים בסעיף 1.1.2.
  3. יום 3
    1. הכן תרחיף חד-תאי כמתואר בשלבים 3.3.1-3.3.2.
    2. ספרו את התאים באמצעות מונה התאים, וזרעו 1 × 105 תאים על צלחת של 3.5 ס"מ. לדגור על התאים ב 37 ° C עם 5% CO2 ולחות מבוקרת במשך 24 שעות.
  4. יום 4
    1. יש לערבב 1 מיקרוגרם של pEGFP-C1-hAtg13, 3 μL של מגיב טרנספקציה של DNA, ו-100 μL של מדיום סרום מופחת בצינור בעל שימור נמוך. דוגרים על התערובת במשך 20 דקות, ואז מוסיפים אותה למדיום המתורבת.
    2. לדגור על התאים ב 37 ° C עם 5% CO2 ולחות מבוקרת במשך 24 שעות.
  5. יום 5
    1. טריפסין את התאים כמתואר בשלבים 3.3.1-3.3.2.
    2. הוסף 2.5 מ"ל של מדיום הגידול לתאים. פיפטה את התערובת באמצעות פיפטה העברת פסטר להכנת תרחיף חד תא.
    3. ספור את התאים באמצעות מונה התא, וזרע 1 × 104 תאים על מכסה 8 תאים. לדגור על התאים ב 37 ° C עם 5% CO2 ולחות מבוקרת במשך 24 שעות.
  6. יום 6
    1. בצע את שלבים 3.4.1-3.4.4 כדי לבצע הדמיה של תאים חיים של התאים משלב 4.5.3 באמצעות מיקרוסקופ לייזר קונפוקלי. צלם עשר מסגרות שונות של תמונות.
      1. בצעו את שלבים 3.4.4.1-3.4.4.3 כדי לפצל את התמונות הממוזגות RGB לרכיבי התמונה האדומים, הירוקים והכחולים המתאימים, לקבוע סף קבוע לאותות הירוקים בכל תמונה ולקבוע את עוצמת אות GFP. רשום את הערכים מהמקטע Total Area כדי לקבוע את עוצמת האות של GFP-ATG13.
      2. חלק את עוצמת האות הכוללת במספר התאים שנבדקו כדי לחשב את עוצמת האות לכל תא.
        הערה: ספרו לפחות 34 תאים בכל אחד משלושת הניסויים הבלתי תלויים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

כפי שהוכח במחקרים קודמים, טיפול Baf הגדיל את רמות TSG101 (P1: P < 0.01, P2: P = 0.012, כפי שנקבע על ידי ANOVA דו-כיווני ב- EZR19) ו- LC3-II (P1: P < 0.01, P2: P < 0.01, כפי שנקבע על ידי ANOVA דו-כיווני ב- EZR19) בחלק העשיר ב- EV. יש לציין כי טיפול Baf גם הגביר את רמות STX6 (P1: P < 0.01, P2: P < 0.01, כפי שנקבע על-ידי ANOVA דו-כיווני ב-EZR19) בחלק EV (איור 1A), דבר המצביע על כך ש-STX6 עשוי להיות רכיב של כל...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מחקר האימונובלוטינג חשף רמות LC3-II ו-TSG101 בחלק התאי, במקטע P1 EV העשיר במיקרו-שלפוחיות ובמקטע P2 EV העשיר באקסוזומים. דימות תאים חיים שימש לבחינת אוטופגוזומים, אוטוליזוזומים ואומגה, וסיפק תובנה האם STX6 משפיע על אוטופגיה. תוצאות משולבות אלה מצביעות על כך שהפלה של STX6 משפיעה על שחרורם של כלי רכב חשמליים חיוביים LC3-II, מה שעשוי להיות קשור לחוסר ויסות של מסלול האוטופגיה. יתרון מרכזי של שיטה זו הוא יכולתה להבחין בין כלי רכב חשמליים גדולים וקטנים שמקורם במקורות שונים. נ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי עניינים עם תוכן מאמר זה.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי מימון ל- Y.T. מהאגודה היפנית לקידום המדע KAKENHI [מענק מספר 23K06837] (טוקיו, יפן) וקרן המדע טקדה (אוסקה, יפן). המחברים מעריכים את ד"ר דיוויד רובינשטיין (מכון קיימברידג' למחקר רפואי, קיימברידג', בריטניה) על אספקת תאי HeLa.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.25 % טריפסין EDTAFujifilm Wako201-16945
10 ס"מ צלחתתרמו פישר סיינטיפיק150464
15 מ"ל צינורתרמו פישר סיינטיפיק339650
200 μ L Pipette TipNippon GeneticsFG-301pipetting
2-MercaptoethanolNacalai Tesque21417-52חומר ל
תמיסת חיץ דגימה
3,3'-Diaminobenzidine TetrahydrochlorideNacalai Tesque11009-41חומר לתמיסת DAB
3.5 ס"מ צלחת תרמו פישר סיינטיפיק150460
6 ס"מ צלחת TrueLineTR4001
אמבטיות תרמוסטטיות בלוק אלומיניום (אמבטיות תרמיות יבשות)EYELA273860
שואבSANSYOSAP-102תמיסת שאיפה
Avanti JXN-30בקמן קולטרB34193
Bafilomycin A1AdipogenBVT-0252
וקטור נוגדן IgG מצומד ביוטין מעבדות BA-1000נוגדן שני לאימונובלוטינג
ביוטין מצומד סוס IgG AntibodyVector Laboratories BA-2000נוגדן שני לאימונובלטינג
חסימה אחתנקלאי טסק03953-95חומר לאימונובלוטינג
ברומופנול כחולנקלאי טסק05808-61חומר ל
תמיסת חיץ דגימה
סרוםעגל cytivaSH30073.03
CanoScan LiDE 220CanonCSLIDE220סורק
צנטריפוגה 5702 Reppendolf5703000039
ספירת שקופיות תא כפולתא Bio-Rad1450015Jספירת תאים
דיגיטלי סוניפייר 450ברנסון
דימתיל סולפוקסידnacalai tasque09659-14רכב
DMEM גלוקוז גבוהNacalai Tesque08458-45תרבית בינונית
DMEM ללא פנול אדוםNacalai Tesque08489-45מדיום תרבית
EGTADojindo 348-01311חומר לפתרון A68
Excelמיקרוסופטגרסה 16.16.27ניתוח סאטיסטי
EZRהפניה מס' 24גרסה 1.68ניתוח סאטיסטי
FBSSigma173012 Culture מדיום
פיג'יNIHכלי ניתוח תמונה
גליצרולנקלאי טסק09886-05חומר ל
תמיסת חיץ דגימה
Hoehst33342Dojindo H342
מי חמצןFujifilm Wako080-0186חומר לתמיסת DAB
Kimwipe S-200NIPPON PAPER CRECIA62011ניקוי לנגב
צינור שמירה נמוךNippon GeneticsFG-MCT015CLBsiRNA והעברת DNA
LSM780 מיקרוסקופ לייזר קונפוקליCarl Zeiss
עכבר מונוקלונלי Anti-LC3 נוגדןMBLM186-3נוגדן ראשון לאימונובלוטינג
ניקל (II) כלוריד הקסהידראטפוג'יפילם Wako149-01041חומר לתמיסת DAB
N-Lauroylsarcosine נתרן מלחNacalai Tesque20117-12
אופטימה XE-90 אולטרה-צנטריפוגהבקמן קולטרA94471
Opti-MEM I סרום מופחתתרמו פישר מדעי31985-070siRNA וטרנספקציה של DNA
pEGFP-C1-hAtg13Addgene22875
פניצילין/סטרפטומיציןנקלאי טסק26253-84תרבית בינונית
ערכות בדיקת חלבון BCA ThermoFisher Scientific23225
ארנב פוליקלונלי נוגדן נגד PCNABioAcademia70-080נוגדן ראשון עבור אימונובלוטינג
ארנב פוליקלונלי אנטי-סינטקסין 6 נוגדןProteinTech10841-1-APנוגדן ראשון לאימונובלוטינג
ארנב פוליקלונלי אנטי-TSG101 נוגדןProteinTech28283-1-APנוגדן ראשון לאימונובלוטינג
ארנב פוליקלונלי אנטי-ULK1 נוגדןProteinTech20986-1-APנוגדן ראשון לאימונובלוטינג
פוליווינילידן דיפלואוריד ממברנהMillioreIPVH00010חומר לאימונובלטינג
צוות ליבה של פיתוחRגרסה 4.4.1ניתוח סאטיסטי
RNAiMAXThermo Fisher Scientific13778siRNA transfection reagent
siRNA STX6Thermo Fisher ScientificHSS115604siRNA לטרנספקציה
נתרן כלורינקלאי טסק31320-05חומר למאגר Tris
ותמיסת A68
נתרן דודציל סולפטפוג'יפילם Wako192-13981חומר ל
תמיסת חיץ דגימה
SPARK Microplate ReaderTECAN
Stealth RNAi דופלקסים בקרה שלילית, Med GCThermo Fisher Scientific12935300siRNA transfection
SucroseFujifilm Wako193-00025חומר לתמיסת A68
TC20 מונה תאים אוטומטי עם מדפסת תרמיתBio-Rad1450109J1ספירת תאים
ThermobathTOKYO RIKAKIKAIMG-3100דגירה
TransIT-293Mirus BioMIR 2700מגיב טרנספקציה DNA
TransIT-LT1Mirus BioMIR2300 מגיב
טרנספקציה DNATris(hydroxymethyl)aminomethaneNacalai Tesque35406-75חומר עבור Tris buffer, מאגר דגימה ותמיסת A68
Trypan Blue Dye 0.40%Bio-Rad1450021ספירת תאים צינור
פתוח ברור במיוחד, 16 x 96 מ"מ בקמן קולטר361706P1 EV
, 14 x 89 מ"מבקמן קולטר344059איסוף עבור שבר P2 EV
Vectastain ABC Standard KitVector Laboratories PK-4000immunoblotting
לשטוף בקבוקכמו אחד1-4640-02כביסה קרום
μ-שקופית 8 היטבגבוה ibidi80806
בינוני איסוף עבור הצינור האולטרה-שקוף

מקורות

  1. Tanaka, Y., Hasegawa, M. Profilin 1 mutants form aggregates that induce accumulation of prion-like tdp-43. Prion. 10 (4), 283-289 (2016).
  2. Mehta, P. R., Brown, A. L., Ward, M. E., Fratta, P. The era of cryptic exons: Implications for als-ftd. Mol Neurodegener. 18 (1), 16(2023).
  3. Kawakami, I., Arai, T., Hasegawa, M. The basis of clinicopathological heterogeneity in tdp-43 proteinopathy. Acta Neuropathol. 138 (5), 751-770 (2019).
  4. Chatterjee, M., et al. Plasma extracellular vesicle tau and tdp-43 as diagnostic biomarkers in ftd and als. Nat Med. 30 (6), 1771-1783 (2024).
  5. Kasai, T., et al. Combined use of csf nfl and csf tdp-43 improves diagnostic performance in als. Ann Clin Transl Neurol. 6 (12), 2489-2502 (2019).
  6. Iguchi, Y., et al. Exosome secretion is a key pathway for clearance of pathological tdp-43. Brain. 139 (Pt 12), 3187-3201 (2016).
  7. Ding, X., et al. Exposure to als-ftd-csf generates tdp-43 aggregates in glioblastoma cells through exosomes and tnts-like structure. Oncotarget. 6 (27), 24178-24191 (2015).
  8. Mizushima, N., Levine, B. Autophagy in human diseases. N Engl J Med. 383 (16), 1564-1576 (2020).
  9. Sasaki, S. Autophagy in spinal cord motor neurons in sporadic amyotrophic lateral sclerosis. J Neuropathol Exp Neurol. 70 (5), 349-359 (2011).
  10. Ling, S. C., Polymenidou, M., Cleveland, D. W. Converging mechanisms in als and ftd: Disrupted rna and protein homeostasis. Neuron. 79 (3), 416-438 (2013).
  11. Nguyen, D. K. H., Thombre, R., Wang, J. Autophagy as a common pathway in amyotrophic lateral sclerosis. Neurosci Lett. 697, 34-48 (2019).
  12. Tanaka, Y., et al. Possible involvement of lysosomal dysfunction in pathological changes of the brain in aged progranulin-deficient mice. Acta Neuropathol Commun. 2, 78(2014).
  13. Tanaka, Y., et al. Dysregulation of the progranulin-driven autophagy-lysosomal pathway mediates secretion of the nuclear protein tdp-43. J Biol Chem. 299 (11), 105272(2023).
  14. Tanaka, Y., Ito, S., Suzuki, G. TDP-43 secretion via extracellular vesicles is regulated by macroautophagy. Autophagy Rep. 3 (1), (2024).
  15. Ratajczak, M., Ratajczak, J. Extracellular microvesicles/exosomes: discovery, disbelief, acceptance, and the future. Leukemia. 34 (12), 3126-3135 (2020).
  16. Tanaka, Y., Kozuma, L., Hino, H., Takeya, K., Eto, M. Abemaciclib and vacuolin-1 decrease aggregate-prone tdp-43 accumulation by accelerating autophagic flux. Biochem Biophys Rep. 38, 101705(2024).
  17. Dingjan, I., et al. Endosomal and phagosomal snares. Physiol Rev. 98 (3), 1465-1492 (2018).
  18. Tanaka, Y., et al. Progranulin regulates lysosomal function and biogenesis through acidification of lysosomes. Hum Mol Genet. 26 (5), 969-988 (2017).
  19. Kanda, Y. Investigation of the freely available easy-to-use software 'EZR' for medical statistics. Bone Marrow Transpl. 48 (3), 452-458 (2013).
  20. Cookson, N. A., Cookson, S. W., Tsimring, L. S., Hasty, J. Cell cycle-dependent variations in protein concentration. Nucleic Acids Res. 38 (8), 2676-2681 (2010).
  21. Plate, L., et al. Small molecule proteostasis regulators that reprogram the ER to reduce extracellular protein aggregation. eLife. 5, e15550(2016).
  22. Mizushima, N. The role of mammalian autophagy in protein metabolism. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 83 (2), 39-46 (2007).
  23. Nanayakkara, R., et al. Autophagic lysosome reformation in health and disease. Autophagy. 19 (5), 1378-1395 (2023).
  24. Nozawa, T., Minowa-Nozawa, A., Aikawa, C., Nakagawa, I. The STX6-VTI1B-VAMP3 complex facilitates xenophagy by regulating the fusion between recycling endosomes and autophagosomes. Autophagy. 13 (1), 57-69 (2017).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

מסלול האוטופגיהפתולוגיה של TDP-43סנטריפוגציה דיפרנציאליתBafilomycin A1אימונובלוטינגהשתקת siRNASyntaxin-6גופי רב-שלפחית (Multivesicular Bodies)
הערכה של שחרור LC3-II באמצעות שלפוחיות חוץ-תאיות ביחס להצטברות שלפוחיות חיוביות ל-LC3 תוך תאיות
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.