הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הדמיה תלת מימדית של רקמות אבי העורקים בטרשת עורקים

1.9K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/67400

⸱

25 באוקטובר 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Vascular Surgery, The First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, 2Institute for Cardiovascular Prevention (IPEK), Ludwig-Maximilians-University, 3Institute of Precision Medicine, The First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, 4German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich Heart Alliance

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מציגים פרוטוקולים אופטימליים לניקוי רקמות כדי לדמות את אבי העורקים העכברי בתלת מימד (3D). אנו מתארים נהלים חדישים לצביעה חיסונית, ניקוי אופטי והדמיה מתוך כוונה להגדיר את הקרבה האנטומית של מערכת העצבים ההיקפית עם פלאק טרשת עורקים והאדוונטיטיה בטרשת עורקים.

תקציר

מחקרים אחרונים קידם את ההבנה של טרשת עורקים כמחלה דלקתית כרונית טרנסמורלית המערבת את כל שלוש השכבות של דופן העורק, כולל רובד האינטימה, המדיה והאדוונטיטיה, היוצרת את מעטפת רקמת החיבור החיצונית של העורקים. המחקרים האחרונים שלנו הציעו כי האדוונטיציה משמשת את מערכת העצבים ההיקפית כצינור להגעה לכל תאי הרקמה. מצאנו גם שמערכת העצבים ההיקפית, כלומר מערכת העצבים התחושתית והסימפתטית, עוברת תהליכי שיפוץ גדולים הכוללים ניאוגנזה של רשתות אקסונים הסמוכות לפלאק טרשת עורקים. בהקשר זה, הבנת מבנה הרשת העצבית והאינטראקציות שלה עם מרכיבי כלי הדם של עורקים חולים טומנת בחובה הבטחות גדולות להבנה טובה יותר של פתוגנזה של מחלות לב וכלי דם. כדי להשיג מטרות אלה, יש צורך בשיטות להמחשת הארכיטקטורה התת-תאית של העורקים הבריאים והחולים השלמים יחד עם התאים הפרי-וסקולריים הסובבים אותם. ניקוי רקמות מאפשר הדמיה שלמה של רקמות עמוקות של תאי רקמה גדולים יותר שאינם נגישים אחרת. הוא מאפשר הדמיה נפחית של עורקים שלמים באמצעות שילוב של כלי תיוג, ניקוי, הדמיה מיקרוסקופית מתקדמת ועיבוד תמונה. כאן, אנו מתארים שתי גישות נפרדות אך משלימות לניקוי רקמות פסיביות, כלומר, ניקוי 2, 2-תיודיתנול (TDE) מבוסס מימי והדמיה תלת מימדית המאפשרת תיוג חיסוני מבוסס ממס של ניקוי איברים מנוקים מממס (iDISCO) כדי לדמות מקטעי אבי העורקים מבודדים או אבי העורקים השלם באתרו בעכבר כולו.

מבוא

טכניקות היסטולוגיות מספקות הבנה בסיסית של דגימות ביולוגיות באמצעות חתך רקמות/איברים. עם זאת, תיחום אינטראקציות אנטומיות מורכבות של תאים/תאים ורקמות/רקמות בשלושה דימנמנטים (תלת מימד) היה - עד לאחרונה - קשה להשגה. צורך בלתי מסופק זה היה בולט במיוחד בהקשר של מערכת הלב וכלי הדם במצבים בריאים וחולים. הדמיית רקמות שלמות הייתה מאתגרת בעבר עקב ספיגת אור ופיזור אור, מה שהופך אותן לאטומות במהותן. ניקוי רקמות הופך את הדגימה הביולוגית השלמה לשקופה על ידי מזעור מגבלות אלה. ההתפתחויות האחרונות בטכניקות ניקוי רקמות מאפשרות הדמיה תלת מימדית ברזולוציה גבוהה של רקמות שקופות לא חתוכות כדי לספק תובנה ניכרת לגבי המיקרו-ארכיטקטורה התאית והמבנית של איברים שלמים ברזולוציה מיקרומטרית, ובכך לאפשר הגדרה של רשתות קישוריות אנטומיות.

טרשת עורקים מערבת שלוש שכבות של דופן העורק, כולל שכבת האינטימה הפנימית, שכבת המדיה האמצעית ושכבת רקמת החיבור החיצונית, המכונה אדוונטיטיה. פלאק טרשת עורקים בשכבה הפנימית של העורקים היה יעד קונבנציונלי למחקר במשך עשרות שנים 1,2. עם זאת, שכבת האדוונטיטיה מכילה כלי דם, כלי לימפה וסיבי עצב של מערכת העצבים ההיקפית. יתר על כן, האדוונטיציה קשורה לרקמת השומן הפרי-וסקולרית ולמרכיבי הרקמה העצבית, כולל עצבים היקפיים וגרעינים פריוסקולריים 3,4. ידוע כי עצבים היקפיים משתמשים באדוונטיציה כצינורות כדי להגיע לרקמות מטרה רחוקות, ולמעשה, לתאים5. המחקרים האחרונים שלנו קידמו את ההתקדמות בהבנת האינטראקציות הרב-שכבתיות של המערכות הביולוגיות העיקריות, הכוללות את מערכת החיסון, מערכת העצבים ומערכת הלב וכלי הדם. קראנו לאינטראקציות הללו ממשקים נוירו-אימוניים-קרדיווסקולריים 6,7. במהלך אטרוגנזה, רכיבי דופן העורקים עוברים ארגון מחדש ועיצוב מחדש חזקים. לדוגמה, בסמוך להתקדמות רובד טרשת עורקים באינטימה, נוצרים אגרגטים של תאים חיסוניים, וניאוגנזה של אקסון עצבי מתרחשת באדוונטיציה אבי העורקים של העכברים 6,8,9. ככל שטרשת העורקים מתקדמת, אגרגטים של תאי חיסון מתפתחים לאיברי לימפה שלישוניים בעורקים (ATLOs) מובנים היטב עם אזורי תאי T, תאי B ותאי פלזמה מובחנים10. עם זאת, כדי לתאר את השינויים הללו בתלת מימד, הדמיה ברזולוציה גבוהה של הרקמה השלמה הייתה מאתגרת בגלל חדירות לא מספקת של הממברנה ופיזור אור מובנה11. גישות ניקוי רקמות התגברו על המגבלות העיקריות של גישות היסטולוגיה קונבנציונליות 11,12,13,14,15 עם חדירה משופרת של נוגדנים כדי להגיע עמוק לרקמות או איברים שלמים על ידי התאמה אחידה של מקדם השבירה (RI), מה שמוביל לתמונות ברזולוציה בקנה מידה מיקרומטרי עם עומק הדמיה גבוה יותר בווקסלים. ניתן להתאים RIs של דגימות לגליצרול (RI 1.46) או לשמן טבילה (RI 1.52), ובכך להפחית מאוד את פיזור האור והסטיות הכדוריות, מה שמאפשר רזולוציה גבוהה. ההתקדמות האחרונה בטכניקות ניקוי של כל האיברים או רקמות הגוף כולו, כגון 2,2-תיודיתנול (TDE) מבוסס מים והדמיה תלת מימדית של איברים מנוקים ממסים (iDISCO), בהתאמה, יחד עם טכניקות הדמיה נפחית (כולל הדמיית מיקרוסקופיה קונפוקלית, מולטיפוטונית ומיקרוסקופיה קלה) אפשרו שחזורים של המיקרואנטומיה של ארכיטקטורת כלי הדם על ידי בניית אטלס הקישוריות שלהם11,16. הדמיה של הקשרים התאיים והמבניים הללו בתלת מימד יכולה לספק תובנות חדשות כדי לענות על שאלות ביולוגיות שעד כה לא נענו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

המחקר הנוכחי בוצע על פי הנחיות הוועדה המקומית והארצית לשימוש וטיפול בבעלי חיים. במחקר הנוכחי נעשה שימוש בעכברי Apoe-/- זכרים היפרליפידמיים על רקע C57BL/6J שנשמרו על דיאטת צ'או מכרסמים סטנדרטית המפתחים באופן ספונטני טרשת עורקים במהלך ההזדקנות.

1. הדמיה שלמה של אבי העורקים המבודד וניקוי TDE

  1. הכנת רקמות
    1. הכן את חומר ההרדמה ב-150 מ"ג/ק"ג קטמין ו-30 מ"ג/ק"ג קסילזין (ראה טבלת חומרים) לכל עכבר. הרדמה עמוקה של עכברים על ידי הזרקה תוך צפקית ואישור זה על ידי חוסר תגובה לבדיקת הכאב העמוק.
      הערה: ריכוז ונפח ההזרקה הם כדלקמן: קטמין 100 מ"ג/מ"ל; קסילזין 20 מ"ג/מ"ל; נפח הזרקה 50:50 לפי נפח תערובת של קטמין וקסילזין ב-3 מיקרוליטר לגרם.
    2. הנח את העכבר על צלחת קצף מכוסה במגבות נייר כירורגיות, וקבע את הידיים והרגליים במצב שכיבה בעזרת סרטים. יש לחטא את החזה עם אתנול 75% (ראה טבלת חומרים) ולקחת דם דרך החדר השמאלי עם מזרק חד פעמי של 1 מ"ל כדי להסיר את הדם לזלוף טוב יותר.
      הערה: ניתן להשתמש גם באיסוף דם לבבי באמצעות כריתת בית החזה.
    3. בצע חתך בקו האמצע בחזה כדי לחשוף את הלב וחתך קטן בפרוזדור הימני כדי לאפשר זלוף טרנס-לבבי. החדרו את העכבר דרך החדר השמאלי עם 10 מ"ל של 5 מ"ל חומצה אתילנדיאמינטטראצטית (EDTA; ראו טבלת חומרים) בתמיסת מלח עם פוספט (PBS) למשך 5 דקות, ולאחר מכן 20 מ"ל של PBS למשך 5-10 דקות עד שהדם נשטף החוצה. לבסוף, יש להחדיר 10 מ"ל של 4% פרפורמלדהיד (PFA) למשך 20 דקות.
      הערה: ניתן לבצע את כל ההליכים באמצעות משאבת זלוף פריסטלטית בלחץ של 100-125 מ"מ כספית בטמפרטורת החדר (RT). מחט הזלוף מוחדרת ללב העכבר דרך אותו חור כמו שאיבת הדם.
    4. הסר איברים פנימיים, כולל הטחול, הכבד, הריאות ואיברי מערכת העיכול והרבייה, באמצעות מכשירים כירורגיים. שמור על הלב, אבי העורקים והכליות שלמים באתרם.
      הערה: מכשירים כירורגיים המשמשים לדיסקציה והסרת איברים הם מספריים לדיסקציה, מספריים קשתית עדינה, מספריים קפיציים, מלקחיים קהים, מלקחיים מעוקלים ומלקחיים עדינים מעוקלים.
    5. חשוף את כל אבי העורקים מאבי העורקים העולה להתפצלות הכסל תחת הסטריאומיקרוסקופ המנתח (הגדלה פי 30-40). הסר בזהירות את בלוטת התימוס ורקמת השומן מבלי לפגוע באבי העורקים.
      הערה: היזהר לא לחתוך את אבי העורקים. עבור עכברי Apoe-/- , שמור על רקמת השומן הפרי-וסקולרית המינימלית של אבי העורקים למבנה מחובר.
    6. קצרו את כל אבי העורקים לצלחת פטרי מלאה ב-PBS. הפרד את אבי העורקים למקטעים שונים ופצל את כל אבי העורקים לאורך באמצעות קשתית או מספריים קפיציים כדי לחשוף את המשטח האינטימי בהתאם לרצף ולכיוון המצוינים באיור 1A לניקוי TDE.
    7. הצמד את אבי העורקים על לוחית השעווה השחורה השטוחה בצורת Y, כפי שמצוין באיור 1A. מקבעים אותו ב-4% PFA למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס.
      הערה: הצמד את אבי העורקים לצלחת השעווה לפני הקיבוע כדי למנוע קיפול וסלסול בשלבים הבאים.
    8. בטל את הצמדת אבי העורקים והעבר אותו ל-PBS. יש לשטוף היטב את אבי העורקים למשך 5 דקות למשך 5 פעמים.
      הערה: העבירו את אבי העורקים לצינורות שונים מלאים ב-PBS בכל פעם לשטיפה.
  2. מכתים נוגדנים לאבי העורקים בפנים
    הערה: כל שלבי הדגירה מבוצעים בצינורות נעילה בטוחה של 2 מ"ל עם סיבוב עדין או טלטול ב-RT.
    1. העבירו את אבי העורקים הקבוע לתמיסת חסימה למשך שעתיים לחסימה וחדירה.
      הערה: תמיסת החסימה משתנה בהתאם לנוגדנים הראשוניים והמשניים. לדוגמה, תמיסת חסימה: 0.5 מ"ג/מ"ל CD16/32 (1:100), 10% סרום חמור רגיל, 2% טריטון X-100 ב-PBS (ראה טבלת חומרים)
    2. דגרו על אבי העורקים עם נוגדנים ראשוניים בתמיסת החסימה לעיל (שלב 1.2.1), לדוגמה, CD3e (דילול 1:100), NF200 (דילול 1:200) ו-B220 (דילול 1:200) למשך 24 שעות (ראה טבלת חומרים). שטפו את אבי העורקים ב-PBS למשך 5 דקות למשך 5 פעמים.
    3. דגירה על אבי העורקים עם נוגדנים משניים בסרום חמור רגיל של 10% (דילול של 1:300) ו-4',6-דיאמידינו-2-פנילינדול (DAPI; 1 מ"ג/מ"ל) לצביעה גרעינית למשך הלילה (ראה טבלת חומרים). שטפו את אבי העורקים ב-PBS למשך 5 דקות 5 פעמים ואחסנו את אבי העורקים ב-PBS בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד להליך ניקוי הרקמות.
      הערה: העבירו את אבי העורקים לצינורות שונים מלאים ב-PBS בכל פעם לשטיפה. מכסים את הצינורות בנייר אלומיניום כדי לשמור אותם בחושך לשלב 1.2.3.
  3. ניקוי רקמות TDE
    הערה: כל שלבי הדגירה מבוצעים בצינורות נעילה בטוחה של 2 מ"ל, מסתובבים בעדינות ב-RT, ומכוסים בנייר אלומיניום בחושך. פתרונות עבודה TDE (ראה טבלת חומרים) הם חדירים מאוד ויש לטפל בהם בזהירות במכסה אדים. אסוף והשליך פסולת בהתאם לתקנות המקומיות.
    1. העבירו את אבי העורקים המוכתם לתמיסות עבודה של 20% TDE ודגרו למשך שעה.
    2. העבירו את אבי העורקים לתמיסות עבודה של 47% TDE ודגרו למשך 12 שעות. העבירו את אבי העורקים לתמיסות עבודה של 60% TDE ודגרו במשך 24-36 שעות עד שהדגימות הופכות שקופות באור נראה כדי להתאים ל-RI.
    3. אחסן את אבי העורקים ב-60% TDE ב-RT בחושך עד להדמיה.
      הערה: רענן פתרונות עבודה כל 30 דקות לטווח הדגירה הקצר (למשלample, שלב 1.3.1) וכל 4 שעות לטווח ארוך של דגירה (למשלample, שלב 1.3.2). ניתן להתאים את זמן הדגירה לכל שלב בהתאם לגודל הרקמה כדי לקבל חדירת נוגדנים טובה יותר או שקיפות ניקוי. עבור אבי העורקים של עכבר Apoe-/- המוקף ברקמת שומן, יש להאריך את זמן הדגירה כראוי.
  4. הדמיה של אבי העורקים מנקה TDE באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי (CLSM)
    1. השתמש בבארות מרווח הדמיה מלבניות דביקות דו-צדדיות הזמינות מסחרית בעובי של 0.2 מ"מ (ראה טבלת חומרים). הדביקו את הבאר למגלשת זכוכית נקייה והעבירו את אבי העורקים הנקי. ודא שההרפתקאות אבי העורקים פונות לכיסוי.
      הערה: הקש בעדינות על אבי העורקים שטוח עם הצד הבלומינלי של אבי העורקים בחלק העליון באמצעות מלקחיים זוויתיים. ערמו בארות מרווח הדמיה מרובות כך שיתאימו לגודל הרקמה במידת הצורך.
    2. הרכיבו את אבי העורקים בטיפות של תמיסת TDE 60%. חבר בזהירות כיסוי לבאר, הימנע מבועות אוויר בין הדגימה לכיסוי.
      הערה: הסר בזהירות את הבועות בעזרת מחט לפני החלקת הכיסוי. אל תשתמש בכמות מוגזמת של תמיסת הרכבה, מכיוון שהדגימה עלולה לצוף.
    3. השתמש במכשיר CLSM הפוך (ראה טבלת חומרים) המצויד במטרת טבילה (רב-תכליתית) פי 20 (NA: 0.75).
      הערה: CLSM מאפשר הדמיה נפחית בעומק של עד 70 מיקרומטר ברזולוציה גבוהה יותר, הדרושה לניתוח קוטר העצב והאינטראקציה בין תאי העצב והחיסון באדוונטיציה של אבי העורקים.
    4. בחר את יעד הטבילה (שמן) של 20x/0.75. כוונן את גלאי הדיודות ההיברידיות על סמך הצבעים המוכתמים. התאם את הגדרות התצוגה ובחר בפורמט XY של 1024 x 1024 פיקסלים להדמיה.
      הערה: לכידת עדשת אובייקט טבילה בשמן מאותתת טוב יותר ממים.
    5. זרוק שמן טבילה (עם גליצרול) באופן שווה לאורך אבי העורקים על הכיסוי. הזז את המטרה פי 63 גס לכיוון הדגימה עד שהיא נוגעת בשמן הטבילה/כיסוי.
    6. הזז את המטרה פי 63 בעדינות מתחת למיקרוסקופ כדי לאתר את אזור העניין. רכוש Z-stack מהצד האדוונטיטי של אבי העורקים הפנימי בגודל צעד של 2-4 מיקרומטר עד לעומק של 60 מיקרומטר עבור הדמיה תלת מימדית.
    7. תן שם לקובץ עם פרטים לדוגמה, סרוק פרטים ושמור את הנתונים.
  5. הדמיה של אבי העורקים מנקה TDE באמצעות מיקרוסקופ מולטיפוטון
    1. בצע את שלבים 1.4.1-1.4.2 כדי להרכיב את אבי העורקים על השקופית.
    2. השתמש במיקרוסקופ רב-פוטוני זקוף (ראה טבלת חומרים) המצויד במטרה פי 20 (טבילה במים, NA: 1.00, מרחק עבודה = 2 מ"מ), המאפשר הדמיה נפחית בעומק של עד 1.5 מ"מ.
    3. רכשו חבילות Z מהצד האלומינלי בגודל צעד של 10-15 מיקרומטר עד לעומק של 700 מיקרומטר. תן שם לקובץ ושמור את הנתונים כמו בשלב 1.4.7.

2. צביעה חיסונית של כל הגוף וניקוי רקמות iDISCO

  1. הכנת רקמות
    1. בצע את השלבים 1.1.1-1.1.3 לעיל להרדמה, קיבוע העכבר וזילוף.
    2. הסר את העור והאיברים הפנימיים, כולל הטחול, הכבד, הריאות ואיברי מערכת העיכול והרבייה, באמצעות מכשירים כירורגיים. שמור על הלב, אבי העורקים והכליות שלמים באתרם.
    3. נתח את חלק הגוף מעל רמת הסרעפת וקבע את חלק פלג הגוף התחתון עם 4% PFA למשך 1-2 ימים ב-4 מעלות צלזיוס.
      הערה: בצע את הקיבוע, הכביסה והדגירה בצינורות של 50 מ"ל על שייקר מסתובב בעדינות. רענן את התמיסה בצינורות חדשים 2-3 פעמים.
    4. שטפו היטב את הדגימה למשך 10 דקות 3 פעמים ב-RT.
      הערה: העבירו את אבי העורקים לצינורות שונים מלאים ב-PBS בכל פעם.
    5. דגרו את הדגימה בקוקטיילים של הדמיית מוח/גוף שקופים וללא הפרעה ובתמיסת ניתוח חישובי (CUBIC) למשך 48 שעות להסרת צבע.
      הערה: לקבלת תמיסה של 20% מעוקב, ממיסים 25 גרם אוריאה ב-15 מ"ל של Triton X-100 ו-28 מ"ל של Quadrol, ומוסיפים PBS לנפח הסופי של 100 מ"ל. הכן אותו במכסה המנוע מכיוון שהמרכיבים מגרים (ראה טבלת חומרים).
    6. שטפו היטב את הדגימה למשך שעה חמש פעמים ב-PBS ב-RT.
  2. צביעת נוגדנים
    הערה: כל שלבי הדגירה מבוצעים בצינורות נעילה בטוחה של 50 מ"ל עם סיבוב עדין או טלטול ב-4 מעלות צלזיוס.
    1. דגרו את הדגימה בתמיסת PBS-gelatin-Triton X-100-serum (PGST) למשך הלילה לחדירה וחסימה.
      הערה: תמיסת החסימה משתנה בהתאם לנוגדנים. לדוגמה, תמיסת חסימה: תמיסת PBS-gelatin-Triton X-100-serum (PGST, ראה טבלת חומרים): 0.2% ג'לטין עור חזיר, 0.5% טריטון X-100 ו-5% סרום עיזים ב-PBS.
    2. דגרו את הדגימה עם נוגדנים ראשוניים בתמיסת PGST, למשלample, NF200 (דילול 1:200, ראה טבלת חומרים) ב-4 מעלות צלזיוס, ונערו בעדינות במשך 10-12 ימים. לאחר מכן, שטפו היטב את הדגימה ב-PGST למשך שעה 5 פעמים ב-RT.
    3. דגרו את הדגימה עם תמיסת נוגדנים משנית (דילול של 1:300) ו-DAPI (1 מ"ג/מ"ל) ב-PGST ב-4 מעלות צלזיוס למשך 7 ימים.
    4. שטפו היטב את הדגימה ב-PGST למשך שעה 5 פעמים ב-RT. העבירו את הדגימה ל-PBS ואחסנו את אבי העורקים ב-PBS ב-4 מעלות צלזיוס לשלבים נוספים.
      הערה: מכסים את הצינורות בנייר אלומיניום כדי לשמור עליהם כהים לשלבים 2.2.3-2.2.4.
  3. ניקוי רקמות iDISCO שונה
    הערה: במהלך הניקוי, יש לכסות את הצינורות בנייר אלומיניום כדי למנוע הלבנה/כיבוי אותות עקב חשיפה ישירה לאור טבעי/מלאכותי. כל הריאגנטים האורגניים המשמשים בניקוי DISCO מזיקים, וכל שלבי הפינוי צריכים להיעשות במכסה אדים. ללבוש חלוק מעבדה, כפפות ומסכה בעת התמודדות עם הריאגנטים כדי למנוע שאיפה ומגע עם העור והעיניים. אסוף והשליך את פסולת הפינוי למיכלי פסולת מתאימים במכסה המנוע.
    1. העבר את הדגימות המוכתמות משלב 2.2.4 לסדרה של ריכוזים מוגברים של טטרהידרופוראן (THF, ראה טבלת חומרים) פתרונות עבודה להתייבשות, כלומר 50%, 70%, 90% ו-100% (פעמיים 100%). דגירה למשך 12 שעות לכל ריכוז.
      הערה: יש לדלל את מגיב ה-THF (99%-100%) במים מזוקקים לתמיסות עבודה בריכוזים שונים במכסה המנוע. רענון פתרונות עבודה כל 6 שעות.
    2. העבר את הדגימה לתמיסת דיכלורומתאן מוחלטת (DCM, ראה טבלת חומרים) למשך 3 שעות להסרת שומנים.
    3. העבר את הדגימה לפתרון עבודה תואם RI בנזיל-אלכוהול-בנזיל-בנזואט (BABB) (ראה טבלת חומרים). דגרו במשך 3-6 שעות עד שהרקמה שקופה ובעיקר שקופה באור נראה.
      הערה: להכנת תמיסת עבודה של BABB, מערבבים חלק אחד של בנזיל אלכוהול ו-2 חלקים של בנזיל בנזואט (1:2) בבקבוק זכוכית. יש לנער אותו בעדינות למשך 5 דקות במכסה המנוע.
  4. הדמיה של רקמת ניקוי iDISCO באמצעות מיקרוסקופ יריעת אור
    הערה: צלם את הדגימה שנוקה ברגע שהושגה שקיפות אופטימלית. מיקרוסקופ גיליון אור, כגון אולטרה-מיקרוסקופ-II (ראה טבלת חומרים), משמש להדמיה. מלאו את מאגר ההדמיה בתמיסת הפינוי הסופית, תמיסת BABB. היזהר לא לשפוך BABB על המכשיר כדי למנוע נזק למכשיר.
    1. השתמש במטרת אוויר 1x לתמונות בהגדלה נמוכה המכסות את כל רוחב הדגימה כולה. העבירו בעדינות את הדגימה מתמיסת הפינוי על מטלית נייר וייבשו אותה תוך זמן קצר.
      הערה: השתמש במלקחיים קהים כדי למנוע סחיטת הדגימה.
    2. בחר מחזיק מדגם בגודל מתאים על סמך גודל הדגימה/רקמה והצמד את הצד האחורי של הדגימה למחזיק המדגם בעזרת דבק-על.
      הערה: המתן 1-2 דקות עד שהדגימה מחוברת היטב למחזיק הדגימה.
    3. מלאו את מאגר ההדמיה של מיקרוסקופ גיליון האור בתמיסת BABB והניחו לתוכו בעדינות את הדגימה. כוונן את מחזיק המדגם כדי להבטיח שהדגימה מאונכת לגיליון האור ומוארת כהלכה.
    4. הורד את המטרה כדי למקד את הדגימה ולהתאים את הגדרות התצוגה תוך כדי מיקוד כדי view הדגימה כראוי. בחר את גיליון האור המתאים בתוכנת המיקרוסקופ והתאם את רוחבו כדי להאיר באופן שווה את כל שדה התצוגה.
      הערה: במערכת אולטרה-מיקרוסקופ עם תאורת לייזר משני הצדדים, התחל ביישור ומיקוד הלייזר בצד אחד. לאחר ששני הצדדים מוגדרים, הפעל את שני הלייזרים הצדדיים כדי לצפות בתמונת סריקה ממוזגת משתי התאורות.
    5. בחר ערוץ אדום רחוק (680 ננומטר) כדי לדמות מבנים עצביים מוכתמים ב-NF200 ותעלה אוטופלואורסצנטית (488 ננומטר) כדי לדמות אבי עורקים ורקמות חיבור לא מוכתמים. התאם את עוצמת הלייזר בהתאם לעוצמת האות הפלואורסצנטי לקבלת יחס אות לרעש אופטימלי, זמן החשיפה ורוחב גיליון האור.
    6. בחר את מצב הסריקה xyz. הגדר את סריקת z-stack עם צעד z של 2-8 מיקרומטר ובחר חפיפה של 25%-60% לאורך ציר ה-y האורכי של סריקות האריחים (16 סיביות) המכסות את משטחי הגחון והגב של הדגימות כדי לדמות את כל נפח הדגימה (עד 6-8 מ"מ עומק).
    7. תן שם לסריקה עם מידע מפורט, כולל תאריך הסריקה, שם המדגם, הנוגדן בו נעשה שימוש, אובייקטיבי, גורם זום, שלבי z ולייזרים שבהם נעשה שימוש. שמור את הנתונים.
    8. שנה להגדלה גבוהה יותר (2x או 4x) באמצעות פונקציית זום כדי לדמות אזורי עניין ספציפיים בגוף.
    9. בצע את השלבים 2.4.4-2.4.7 לעיל להדמיה ושמור את הנתונים.

3. עיבוד תמונה וניתוחים

הערה: יש צורך בתחנת עבודה לעיבוד בעוצמה גבוהה לצורך העיבוד. ודא גיבוי נתונים מיד לאחר העיבוד עקב נפח ההדמיה הגבוה (5-100 GB לתמונה).

  1. עיבוד תמונה של תמונות CLSM ורב-פוטונים
    1. טען את התמונות המרוצפות באריחי Z ממיקרוסקופים CLSM ורב-פוטונים לתחנת העבודה לעיבוד תמונה המצוידת בתוכנת Las X, Imaris (תוכנת ניתוח תמונה) או פיג'י להדמיה, פילוח וכימות תלת מימדיים ודו-ממדיים (2D).
    2. כדי לקודד בצבע את עומק הנפח של תא או מבנה, השתמש בתוכנת שחזור תמונה (ראה טבלת חומרים) כדי לפרק את התמונה הגולמית וליצור הקרנה בעוצמה מקסימלית של הנתונים המפותלים באמצעות קידוד צבע זמני בלאס X או פיג'י.
  2. עיבוד תמונה של תמונות גיליון אור
    1. טען את סדרת תמונות ה-TIFF באריחי Z-stack לתוכנת פיג'י. תפר תמונות עם תוסף התפירה של פיג'י ושמור תמונות תפורות בפורמט TIFF.
      הערה: במידת הצורך, דחוס את התמונות התפורות בפורמט LZW כדי לאפשר עיבוד מהיר עם תוכנות שונות.
    2. טען את התמונות התפורות בתוכנת הדמיה תלת-ממדית (ראה טבלת חומרים) לצורך פילוח תמונה. עקוב ידנית אחר המבנים העצביים וכלי הדם בציר xyz. למעקב ידני אחר סיבי עצב קטנים, בחר ידנית את אותות NF200+ פיקסל אחר פיקסל בכל מישור z לאורך כל הנתיב של סיב העצב בין אבי העורקים לגרעין.
    3. טען תמונות מעובדות מראש לתוכנת ניתוח תמונות (ראה טבלת חומרים) ליצירת וידאו, הדמיה דו-ממדית ותלת-ממדית של התמונות.
    4. השתמש באוטופלואורסצנציה כדי לפלח את אבי העורקים ורקמות החיבור, כולל בלוטות לימפה ושרירים, בתוכנת ניתוח התמונה. החל פסאודו-צבעים נפרדים בתוכנת ניתוח התמונות כדי לדמיין מקטעים מובהקים של אבי העורקים כגון דופן אבי העורקים ורובד.
    5. השתמש בפונקציית השוואת היסטוגרמה אדפטיבית מוגבלת ניגודיות (CLAHE) בתוכנת פיג'י כדי לשפר את הניגודיות המקומית על רקע התמונות המעובדות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

כדי להדגים את המיקרואנטומיה של אבי העורקים הבריא והחולה השלם, ולחשוף את החיבורים הפיזיים בין מערכת החיסון, מערכת העצבים ומערכת הלב וכלי הדם במודלים של טרשת עורקים בעכברים, השתמשנו בשתי גישות משלימות לניקוי רקמות: ניקוי TDE של אבי העורקים המבודד, וניקוי iDISCO של העכבר כולו (איור 1). לאחר צביעה חיסונית שלמה, אבי העורקים נוקה עם סדרה של פתרונות עבודה TDE. ה-RI מותאם ב-1.4-1.5, בהתאם לריכוז ה-TDE של השלב הסופי, כדי להשיג שקיפות אופטימלית של רקמת אבי העורקים מבלי לשנות את נפחה (

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

ניתן לראות בטרשת עורקים מחלה דלקתית טרנסמורלית של עורקים המערבת את כל שלוש השכבות של דופן העורק. יתר על כן, העורקים מוקפים ברקמות השומן הפרי-וסקולריות והעצביות. במהלך התקדמות טרשת עורקים, כל אחת מהרקמות הללו עוברת שינויים תאיים ומבניים ניכרים, מה שמחייב שיטות לרכישת גישה אופטית תת-תאית לרקמות השלמות המקיפות עורקים בריאים וחולים. שיטות אלה ניתנות כאן כדי להבין טוב יותר אינטראקציות תא-תא ותא רקמה ולקדם את ההבנה של פתוגנזה של מחלות לב וכלי דם. ניקוי רקמות והדמיה מיקרוסקופית תלת מימדית לאחר ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

SKM, CJY ו-AJRH הם המייסדים המשותפים של Easemedcontrol R&D GmbH ו-Co. KG.

תודות

עבודה זו מומנה על ידי קרן המחקר הגרמנית (DFG) SFB1123/Z1, המרכז הגרמני לחקר הלב וכלי הדם (DZHK) DZHK 81X2600282, ומענק קרן קורונה (S199/10087/2022) ל-SKM; ו-ERA-CVD (PLAQUEFIGHT) 01KL1808 ומענק ממשלתי ל-AJRH ב-Easemedcontrol R&D GmbH and Co. KG.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
2,2'-תיודיתנול (TDE)סיגמא 166782ריאגנט סליקה
AmiraThermo Fisher תוכנת; תוכנת עיבוד תמונה המשמשת לפילוח ידני ומעקב בתמונות תלת מימד
בנזיל אלכוהולסיגמא מגיבניקוי
בנזיל בנזואטסיגמאB6630ריאגנט קלירינג
CD16/32eBioscience14-0161-82תמיסת חסימה
מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי מכשיר הדמיה Leica MicrosystemsTCS-SP8 3Xלהדמיה רב-ממדית ברזולוציה גבוהה של רקמות ביולוגיות שלמות או מקטעים בעלי סגוליות גבוהה ברזולוציה תת-תאית.
DAPIInvitrogenD3571סמן גרעין
דיכלורומתאן (DCM)סיגמא 270997ריאגנט ניקוי
ניתוח שעווה שחורה פאן תרמו סיינטיפיק S17432דיסקציה וקיבוע של אבי העורקים 
סטריאומיקרוסקופ דיסקציהLeica Microsystems Stemi 2000דיסקציה של איברי עכבר
אתנול עריקת סיגמאE7023 
חומצה אתילנדיאמינטטראצטית (EDTA)רוט 8040.1מאגר זלוף 
פיג'י (ImageJ, NIH)תוכנת עיבוד תמונה בקוד פתוח לתמונות דו-ממדיות ותלת-ממדיות
עז נגד אוגר IgG, Cy3Dianova 127-165-099נוגדן משני
עז נגד ארנב IgG, Alexa Fluor 680Thermo Fisher Scientific / InvitrogenA-21109נוגדן משני 
עז נגד חולדה IgG, Cy5Dianova712-175-150נוגדן משני
אוגר אנטי-CD3e BD ביוסיינס145-2C11 סמן תא Pan-T
Huygens ProfessionalScientific Volume Imaging, הולנדגרסה 19.10תוכנת שחזור תמונה; תוכנת עיבוד תמונה המשמשת בעיקר לפירוק תמונות דו-ממדיות ותלת-ממדיות
תחנת עבודה לעיבוד תמונהMIFCOM לעיבוד תמונה MIFCOM X5מצוידת בכל תוכנות עיבוד התמונה כולל חבילת היישומים של Leica X, פיג'י ואימאריס לעיבוד לאחר של תמונות שנרכשו על ידי מיקרוסקופים קונפוקליים, מולטיפוטונים וגיליונות אור
ImarisBitplaneגרסה 8.4תוכנת ניתוח תמונה; תוכנה לעיבוד תמונה המשמשת לפילוח אוטומטי של תמונות תלת מימד
אינקובטור ומסובב מרשל סיינטיפיק Innova 4230מכשיר דגירה וסיבוב במהלך ניקוי רקמות
;
iSpacerSunjin LabIS4020מלבני כמו גם מחזיק המדגם
קטמיןליביסטוהרדמה
Leica Application Suite X (LAS-X) LeicaMicrosystems גרסה 3.5תוכנת עיבוד תמונה לתמונות שנרכשו במיקרוסקופ Leica
מיקרוסקופ אורLeica MicrosystemsDM LBמכשיר הדמיה להדמיה בתיוק בהיר
גיליון אור  מיקרוסקופLaVision BioTechUltramicroscope IIטכניקת הדמיה להדמיה מהירה ברזולוציה גבוהה של דגימות ביולוגיות גדולות או עכבר שלם עם חשיפה לאור חלש על ידי השגה מהירה של תמונות של מקטעים אופטיים דקים.
מיקרוסקופיה מרובת פוטוניםLeica MicrosystemsTCS-SP5II MP שיטת הדמיה להדמיה רב-ממדית ברזולוציה גבוהה של רקמות ביולוגיות שלמות וקיימות ברמה התת-תאית והמולקולרית לאורך תקופות זמן ממושכות, עמוק בתוך הדגימה ועם פלישה מינימלית.
סרום עיזים רגיל SigmaG9023תמיסת חסימת
פרפורמלדהיד (PFA) סיגמא פ-6148 קיבוע 
תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS)Sigma P4417-100TAB מאגר כביסה
ג'לטין עור חזירסיגמא G1890מאגר דגירה
QuadrolSigma122262מגיב פינוי מעוקב
ארנב אנטי-NF200SigmaN4142סמן פאן-עצבי
חולדה נגד B220 BD BioscienceRA3-6B2סמן תאי Pan-B
סוכרוזסיגמא 90M003524V התייבשות 
SytoxThermo Fisher ScientificS11380סמן גרעין
TetrahydrofuranSigma 401757ריאגנט סליקה 
טריטון X-100רות' 3051.1
חדירת אוריאהסיגמא U5128מגיב פינוי מעוקב
קסילן פישר כימיקלים x/0250/17 הרדמה 
הדמיה תלת מימדית מדעיתW213713תחנת עבודה

מקורות

  1. Libby, P. The changing landscape of atherosclerosis. Nature. 592 (7855), 524-533 (2021).
  2. Mohanta, S., Yin, C., Weber, C., Hu, D., Habenicht, A. J. Aorta atherosclerosis lesion analysis in hyperlipidemic mice. Bio Protoc. 6 (11), e1833(2016).
  3. Yin, C., Mohanta, S. K., Srikakulapu, P., Weber, C., Habenicht, A. J. Artery tertiary lymphoid organs: Powerhouses of atherosclerosis immunity. Front Immunol. 7, 387(2016).
  4. Mohanta, S. K., et al. Artery tertiary lymphoid organs contribute to innate and adaptive immune responses in advanced mouse atherosclerosis. Circ Res. 114 (11), 1772-1787 (2014).
  5. Carmeliet, P., Tessier-Lavigne, M. Common mechanisms of nerve and blood vessel wiring. Nature. 436 (7048), 193-200 (2005).
  6. Mohanta, S. K., et al. Neuroimmune cardiovascular interfaces control atherosclerosis. Nature. 605 (7908), 152-159 (2022).
  7. Mohanta, S. K., et al. Cardiovascular brain circuits. Circ Res. 132 (11), 1546-1565 (2023).
  8. Hu, D., Yin, C., Luo, S., Habenicht, A. J. R., Mohanta, S. K. Vascular smooth muscle cells contribute to atherosclerosis immunity. Front Immunol. 10, 1101(2019).
  9. Newland, S. A., et al. Type-2 innate lymphoid cells control the development of atherosclerosis in mice. Nat Commun. 8, 15781(2017).
  10. Grabner, R., et al. Lymphotoxin beta receptor signaling promotes tertiary lymphoid organogenesis in the aorta adventitia of aged Apoe-/- mice. J Exp Med. 206 (1), 233-248 (2009).
  11. Mai, H., et al. Whole-body cellular mapping in mouse using standard igg antibodies. Nat Biotechnol. 42 (4), 617-627 (2024).
  12. Molbay, M., Kolabas, Z. I., Todorov, M. I., Ohn, T. L., Erturk, A. A guidebook for disco tissue clearing. Mol Syst Biol. 17 (3), e9807(2021).
  13. Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159 (4), 911-924 (2014).
  14. Tian, T., Yang, Z., Li, X. Tissue clearing technique: Recent progress and biomedical applications. J Anat. 238 (2), 489-507 (2021).
  15. Adolfs, Y., Raj, D. D. A., Brignani, S., Pasterkamp, R. J. Protocol for tissue clearing and 3d analysis of dopamine neurons in the developing mouse midbrain. STAR Protoc. 2 (3), 100669(2021).
  16. Power, R. M., Huisken, J. A guide to light-sheet fluorescence microscopy for multiscale imaging. Nat Methods. 14 (4), 360-373 (2017).
  17. Sun, T., et al. Tissue clearing approaches in atherosclerosis. Methods Mol Biol. 2419, 747-763 (2022).
  18. Chistiakov, D. A., Ashwell, K. W., Orekhov, A. N., Bobryshev, Y. V. Innervation of the arterial wall and its modification in atherosclerosis. Auton Neurosci. 193, 7-11 (2015).
  19. Cao, Y., Wang, H., Wang, Q., Han, X., Zeng, W. Three-dimensional volume fluorescence-imaging of vascular plasticity in adipose tissues. Mol Metab. 14, 71-81 (2018).
  20. Kirst, C., et al. Mapping the fine-scale organization and plasticity of the brain vasculature. Cell. 180 (4), 780-795.e25 (2020).
  21. Todorov, M. I., et al. Machine learning analysis of whole mouse brain vasculature. Nat Methods. 17 (4), 442-449 (2020).
  22. Bhatia, H. S., et al. Spatial proteomics in three-dimensional intact specimens. Cell. 185 (26), 5040-5058.e19 (2022).
  23. Mai, H., et al. Scalable tissue labeling and clearing of intact human organs. Nat Protoc. 17 (10), 2188-2215 (2022).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

דימות רקמת אבי העורקיםהתקדמות טרשת עורקיםהבהרת רקמהמיקרוסקופיה קונפוקאליתדימות רב-פוטוניסימון אימונולוגיעיצוב מחדש של האדוונטיציהויזואליזציה של רשת עצביתסגמנטציית תמונה
הדמיה תלת מימדית של רקמות אבי העורקים בטרשת עורקים
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.