מאמר שיטה

גליקופרוטאומיקה מונחית גליקומיקס מאפשרת יצירת פרופיל מקיפה של הגליקופרוטאום במיקרו-סביבות גידוליות מורכבות

DOI:

10.3791/67405

⸱

7 בפברואר 2025

 ,  ,  ,  , 
1School of Natural Sciences, Faculty of Science and Engineering, Macquarie University, 2Institute for Glyco-core Research (iGCORE), Nagoya University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מפרט את שיטת הגליקופרוטאומיקה מונחית הגליקומיקה, טכנולוגיית אומיקס משולבת המציעה תובנות מקיפות על הגליקופרוטאום ההטרוגני במיקרו-סביבות גידוליות מורכבות הדרושות להבנה טובה יותר של הגליקוביולוגיה של סרטן.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

גליקוזילציה היא שינוי חלבוני נפוץ ומגוון מבחינה מבנית המשפיע על מגוון רחב של תהליכים גידוליים. גליקומיקה וגליקופרוטאומיקה מונחות ספקטרומטריית מסה התפתחו כגישות רבות עוצמה לניתוח גליקנים משוחררים וגליקופפטידים שלמים, בהתאמה, ומציעות הבנה עמוקה יותר של הגליקופרוטאום ההטרוגני במיקרו-סביבה של הגידול (TME). פרוטוקול זה מפרט את שיטת הגליקופרוטאומיקה מונחית הגליקומיקה, טכנולוגיית אומיקס משולבת, המשתמשת תחילה בגליקומיקה מבוססת פחמן נקבובי LC-MS/MS כדי להבהיר את מבני הגליקן ואת התפלגות כמותית שלהם בגליקום של רקמות גידול, אוכלוסיות תאים או נוזלי גוף הנחקרים. זה מאפשר ניתוח גליקומי השוואתי כדי לזהות גליקוזילציה שונה על פני קבוצות חולים, שלבי מחלה, או תנאים, וחשוב מכך, משמש כדי לשפר את ניתוח גליקופרוטאומיקה במורד הזרם של אותן דגימות (ים) על ידי יצירת ספרייה של מבנים גליקניים ידועים, ובכך להפחית את זמן חיפוש הנתונים ואת שיעור זיהוי שגוי של גליקופרוטאין. תוך התמקדות בפרופיל N-glycoproteome, שלבי הכנת הדגימה לשיטת הגליקופרוטאומיקה מונחית הגליקומיקה מפורטים בפרוטוקול זה, ונדונים היבטים מרכזיים של איסוף הנתונים וניתוחם. שיטת הגליקופרוטאומיקה מונחית הגליקומיקס מספקת מידע כמותי על הגליקופרוטאינים הנמצאים ב-TME ואתרי הגליקוזילציה שלהם, תפוסת האתר ומבני גליקן ספציפיים לאתר. תוצאות מייצגות מוצגות מרקמות גידול משובצות פרפין קבועות פורמלין מחולי סרטן המעי הגס, המוכיחות כי השיטה רגישה ותואמת לקטעי רקמה הנפוצים בביובנקים. לכן, גליקופרוטאומיקה מונחית גליקומיקס מציעה מבט מקיף על ההטרוגניות והדינמיקה של הגליקופרוטאום ב-TMEs מורכבים, ומייצרת נתונים ביוכימיים חזקים הדרושים להבנה טובה יותר של הגליקוביולוגיה של סרטן.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

גליקוזילציה של חלבונים היא סוג נפוץ ומורכב של שינוי משותף ולאחר תרגום של חלבונים המיוצרים על ידי מינים ברחבי עץ החיים הפילוגנטי 1,2,3. הגליקנים הקשורים לחלבון ידועים כמשפיעים על מגוון רחב של תהליכים ביולוגיים החשובים לבריאות האדם, כולל תיווך וויסות של אינטראקציות תאיות ואירועי תקשורת 4,5. גליקוזילציה של חלבון חריג נחשבה כגורם לשינוי ממאיר, התקדמות הגידול והתפשטות 6,7,8. זה מסבך גליקנים בתהליכים גידוליים מרכזיים במיקרו-סביבה של הגידול (TME) ומציע פוטנציאל ניכר ובלתי מנוצל במידה רבה לגילוי סמנים ביולוגיים מבוססי גליקן ויישומים טיפוליים. הגליקוביולוגיה זוכה, אם כן, לתשומת לב הולכת וגוברת בחקר הסרטן ובמדעי החיים9.

מופעל על ידי התפתחויות מרכזיות בגליקואנליטיקה ואינפורמטיקה במהלך העשור האחרון 10,11,12,13,14,15,16,17, גליקומיקה וגליקופרוטאומיקה מונעת כרומטוגרפיה נוזלית (LC-MS/MS) נקבעו ככלים רבי עוצמה ליצירת פרופיל מערכתי של גליקנים משוחררים וגליקופפטידים שלמים מתערובות מורכבות של גליקופרוטאינים המופקים ישירות ממקור הדגימה הביולוגית שלהם, כגון סוגים שונים של דגימות חולי סרטן (למשל, רקמות גידול, אוכלוסיות תאים, נוזלי גוף)3,13,18,19,20.

גליקומיקס מספק מידע על המבנה והכמות של רפרטואר הגליקן (הגליקום), אשר מיוצר באופן דינמי על ידי תאים, רקמות ואפילו אורגניזמים שלמים. מצד שני, גליקופרוטאומיקה מספקת מידע כמותי על נשאי החלבונים ואתר(י) הגליקוזילציה שלהם, שיעורי התפוסה באתר (מאקרו-הטרוגניות), הרכבי הגליקן הספציפיים לאתר ותבנית התפלגות האתר שלהם (מיקרו-הטרוגניות) עם מידע מבני גליקני מוגבל (לעתים קרובות מוגבל להרכב גליקן)15,16,21. לפיכך, גליקומיקה וגליקופרוטאומיקה הן גישות משלימות לסקירת הפרטים הביוכימיים של הגליקופרוטאום22.

מספר עצום של עיצובים מתודולוגיים ואסטרטגיות אנליטיות עבור גליקומיקה וגליקופרוטאומיקה פותחו ויושמו במעבדות שונות בהתאם לגליקואנליטית המעניינת (למשל, N-/O-/C-linked, גליקן/גליקופפטיד/גליקופרוטאין, מסומן/לא מסומן), אופי הדגימה (למשל, תאים, רקמות, נוזלי גוף), כמות (רמות ננוגרם/מיקרוגרם/מיליגרם חלבון) והמכשיר האנליטי הזמין23, 24,25,26,27,28,29,30,31,32. למרות היתרונות המוכרים של השימוש המקביל בהם, גליקומיקס וגליקופרוטאומיקה אינם מיושמים בדרך כלל יחד אלא כגישות עצמאיות במחקרים גליקוביולוגיים ומחקרי סרטן בשל הביקוש הגבוה שלהם למומחיות אנליטית ומכשור מיוחד.

מתוך הכרה בפער טכנולוגי זה, הצגנו לפני יותר מעשור את שיטת הגליקופרוטאומיקה בסיוע גליקומיקה, המסוגלת לשלב נתוני גליקומיקה וגליקופרוטאומיקה המתקבלים מדגימות ביולוגיות מורכבות33. בקיצור, טכנולוגיית הגליקופרוטאומיקה בסיוע גליקומי (או מונחה גליקומיקה כמו בפרוטוקול זה) יוצרת פרופילים של N- ו / או O-גליקנים באמצעות שיטת פחמן נקבובי מבוסס (PGC) LC-MS/MS34,35, אשר משמשים לאחר מכן לניתוח נתונים שלמים N- ו / או O-glycopeptide המתקבלים מאותן דגימות על ידי הגדרת גבולות מרחב החיפוש גליקן36. PGC-LC-MS/MS היא שיטה גליקומית חזקה במיוחד מכיוון שהיא מספקת תובנה כמותית לגבי הגליקום עם רגישות גבוהה ורזולוציה מבנית, ומניבה מידע על טופולוגיה (רצף חד-סוכרי ותבנית הסתעפות) וקשרים גליקוזידים של גליקנים אפילו בתוך תערובות מורכבות 35,37,38. תהליך העבודה של הגליקופרוטאומיקה כולל ייצור פפטידים, תיוג פפטידים אופציונלי, ריבוב ופרה-פרפרקציה, כמו גם העשרה לפני ניתוח LC-MS/MS בשלב ההפוך שבאופן אידיאלי משתמש בשיטות פיצול שונות, כולל אנרגיית התנגשות מדורגת / דיסוציאציה התנגשות באנרגיה גבוהה יותר (sceHCD, עבור N-גליקופפטידים) ודיסוציאציה של העברת אלקטרונים/התנגשות באנרגיה גבוהה יותר (EThcD, עבור O-גליקופפטידים) לזיהוי אנליטי. עבור ניתוח N-glycoproteome, de-N-glycoproteomics מקבילים יכולים להנחות את ניתוח הנתונים N-glycopeptide שלם על ידי הגדרת מרחב החיפוש חלבון/פפטיד ועל ידי מתן פרטים נוספים על אתרי N-glycosylation הכבושים וקצב התפוסה שלהם באתר, בעוד הניתוח המקביל של פפטידים שלא השתנו מגלה כל שינוי ברמת החלבון בין התנאים הנחקרים.

מאמר זה מספק פרוטוקול מפורט וקל למעקב שלב אחר שלב עבור שיטת הגליקופרוטאומיקה מונחית הגליקומיקס (ראו איור 1 לסקירה כללית של זרימת העבודה). הפרוטוקול מספק פרטים ניסיוניים של שלבי הכנת הדגימה וניסויי גליקומיקס וגליקופרוטאומיקה מבוססי LC-MS/MS ומציג תוצאות מייצגות המדגימות את יישום השיטה על חלקי רקמה משובצים פרפין קבוע פורמלין (FFPE) של גידולים שנכרתו מחולי סרטן המעי הגס (CRC), ומאפשר תובנות לגבי הגליקוביולוגיה של TME בסוג דגימה יקר ערך המאוחסן בביובנקים של סרטן ברחבי העולם. ניתוח ואינטגרציה של נתוני גליקומיקה וגליקופרוטאומיקה נדונים גם הם בקצרה.

figure-introduction-1
איור 1: סקירה כללית של שיטת הגליקופרוטאומיקה מונחית הגליקומיקה. הסקירה מציגה שלבים ניסיוניים מפורטים בתהליכי עבודה גליקומיים (משמאל) וגליקופרוטאומיקה (מימין), עם סקירה כללית של המידע המתקבל (מודגש) וכיצד שתי הגישות משולבות באמצעות ניתוח נתונים ופרשנות משופרים. הוספה: מיקרו-עמודות SPE תוצרת בית המשמשות לתהליכי העבודה של גליקומיקה (i) ו- (ii-iii) גליקופרוטאומיקה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחקר אושר על ידי ועדת האתיקה של המחקר האנושי (מדעי הרפואה) באוניברסיטת מקווארי, סידני, אוסטרליה (פרוטוקול 5201800073).

הערה: ניתן ליישם את שיטת הגליקופרוטאומיקה מונחית הגליקומיקה על קבוצה מגוונת של דגימות ביולוגיות החל ממורכבות גליקופרוטאינים נמוכה ועד קיצונית. בגישות גליקופרוטאומיקה נטולות תוויות (שבהן לא מתבצע איגום דגימות), נדרש כ-100-200 מיקרוגרם חלבון כולל מתערובות מורכבות כחומר מוצא כדי להבטיח כיסוי גליקופרוטאום גבוה לאחר העשרה לגליקופפטידים שעשויים להוות רק 1%-10% מאוכלוסיית הפפטידים. בשל אילוצי מקום, מיצוי החלבון הראשוני מתאים או רקמות נותר בחוץ, והקוראים מופנים למשאבים אחרים15. Glycomics צורכת באופן שמרני ~ 10-20 מיקרוגרם חלבון לכל ניתוח עבור פרופיל גליקום עמוק, משאיר את רוב תמצית החלבון עבור glycoproteomics. אם לא צוין אחרת, הוזכרו ריכוזים סופיים, ויש להמיס כימיקלים במים ברמה גבוהה במיוחד כדי ליצור תמיסות מימיות בפרוטוקול שלהלן.

1. הכנת חלבון

  1. קבע את ריכוז החלבון של התמציות באמצעות שיטה מבוססת (למשל, חומצה ביכוניצית או בדיקות חלבון ברדפורד). התאם את ריכוז החלבון ל-10 מיקרוגרם/מיקרוליטר ב-50 mM TEAB (pH 8.5).
  2. צמצם קשרים דיסולפידים על ידי דגירה של דגימות עם DTT של 10 mM למשך 45 דקות ב- 56 ° C. קבוצות תיול חופשיות Alkylate על ידי דגירה לאחר מכן דגימות עם 40 mM IAA בחושך במשך 30 דקות ב 20-25 ° C. להרוות את תגובת האלקילציה עם עודף DTT (~ 40 mM).
  3. לפצל כל דגימת חלבון. יש לאפשר כ-10-20 מיקרוגרם חלבון סה"כ עבור גליקומיקה ו-100-200 מיקרוגרם חלבון כולל עבור תהליך העבודה של הגליקופרוטאומיקה.
    הערה: בנוסף לדגימות החלבון המעניינות, כלול מודל ידוע של גליקופרוטאין (למשל, פטואין בקר) או תערובת חלבונים (למשל, ליזט קו תאים, פלזמה) כדי להעריך את היעילות והשחזור של ההליכים ולנטר את ביצועי LC-MS/MS.

2. זרימת עבודה N-glycomics

  1. אימוביליזציה של חלבונים על קרום PVDF
    1. השתמש בניקוב בעל חור יחיד כדי לחתוך את קרום PVDF בהתאמה למספר דגימות החלבון שיש לזהות.
    2. הרטיבו את הקרומים שנכרתו באתנול או מתנול, ולאחר מכן העבירו את הממברנות לצלחת שטוחה בעלת 96 בארות.
    3. ברגע שהממברנות כמעט יבשות, יש להפקיד את דגימות החלבון בנפח מקסימלי של 2.5 μL לכל נקודה כדי למזער את שטח הפנים של דגימת החלבון שהושקעה. יש לזהות מחדש דגימות במידת הצורך, כך שהכמות הכוללת של חלבון משותק במקום היא ~ 10-20 מיקרוגרם. לשם כך, הניחו לכתם להתייבש לפני שתחזרו על הליך האיתור.
      הערה: במהלך האיתור, ייתכן שיהיה צורך בהרטבה חוזרת של הממברנה עם אתנול או מתנול כדי למנוע מהממברנות להתייבש עד לסיום.
    4. אוויר לייבש את הממברנות ב 20-25 מעלות צלזיוס לפחות 3 שעות, רצוי לילה. יש להימנע מכל זיהום של הממברנות בזמן הייבוש.
      הערה: כשלב בקרת איכות אופציונלי, ניתן להמחיש את החלבונים המזוהים על הממברנות על ידי צביעה בתמיסת Direct Blue 71 כפי שתואר קודם לכן34.
  2. שחרור N-גליקנים הקשורים לחלבון
    1. הוסף 100 μL של 1% (w/v) PVP40 מתנול לכל באר המכילה את הממברנות המנוקדות. יש לוודא שהצד של הממברנה שעליו זוהתה דגימת החלבון פונה כלפי מעלה לאורך כל הכנת הדגימה.
    2. נערו את הצלחת בתמיסת PVP40 למשך 5 דקות בטמפרטורה של 20-25°C ולאחר מכן השליכו את תמיסת PVP40.
      הערה: פתרון PVP40 חוסם את קרומי PVDF ואת הבארות כדי למנוע קשירה לא ספציפית של PNGase F (וכל exoglycosidases שניתן ליישם כדי להשיג מידע ספציפי לקישור בניסויים מקבילים; ראה דיון להלן) בשלבים הבאים.
    3. שטפו כל באר המכילה את כתמי החלבון החסומים ב-100 מיקרוליטר מים טהורים במיוחד ונערו את הצלחת למשך 5 דקות. חזור על שלב זה 3x. יש לוודא שהמים מושלכים לחלוטין לאחר כל כביסה.
    4. הוסף 15 μL של תמיסת PNGase F (0.5 U/μL, מדולל במים טהורים במיוחד מתמיסת מלאי 10 U/μL) לכל באר, בהנחה שהושקעו 15 מיקרוגרם חלבון לדגימה.
    5. הוסיפו מים לבארות הריקות שמסביב כדי למנוע התייבשות דגימה במהלך שלבי הדגירה הבאים, והשתמשו בסרט שקוף כדי לאטום את הצלחת בזהירות. לדגור את הצלחת לפחות 8 שעות ב 37 ° C.
    6. הפעילו את הצלחת למשך 5 דקות כדי לסייע לטיפות שהתאדו בצד הבארות להיאסף בתחתית הצלחת.
    7. העבר את דגימות N-גליקן ששוחררו בזהירות לצינורות מיקרוצנטריפוגות בודדים (1.5 מ"ל). לשטוף את בארות הדגימה 2x עם 20 μL של מים טהורים במיוחד, ולחלק, ולשאוף מספר פעמים. ערבבו כל דגימה שנותרה מכל באר לתוך צינורות המיקרו-צנטריפוגות המכילות את דגימות ה-N-גליקן.
      הערה: הימנע משימוש בצינורות בעלי קשירה נמוכה להכנת דגימת N-glycomics, מכיוון שהגליקנים ההידרופיליים עלולים להיקשר באופן בלתי הפיך לצינורות המצופים.
    8. הוסף 10 μL של 100 mM אמוניום אצטט pH 5.0 ולדגור את הדגימות במשך 1 שעה ב 20-25 ° C.
      הערה: שלב זה מבצע הידרוקסילציה של שאריות N-אצטילגלוקוזאמין על הקצה המקטין של N-גליקנים ששוחררו, ומאפשר הפחתה ממצה בשלב הבא. התאם 100 mM אמוניום אצטט ל- pH 5.0 מכיוון ששיעורי המרה גבוהים של גליקוזילאמין להידרוקסיל בקצה ההפחתה של N- גליקנים מנותקים תלויים בחומציות החלשה של התמיסה.
    9. יבשו את דגימות ה-N-גליקן במערכת רכזי ואקום.
  3. הפחתת N-גליקנים משוחררים
    1. הוסף 20 μL של 1 M NaBH טרי מוכן4 ב 50 mM KOH לדגימות N-גליקן מיובשות ומערבבים היטב.
      הערה: NaBH4 צריך להיות מוכן טרי ב- KOH ביום השימוש בו.
    2. סגור היטב את המכסים של כל צינור ודגר את הדגימות במשך 3 שעות ב 50 ° C.
      הערה: N-גליקנים עוברים חיזור, אשר ממיר את α- ו- β- אנומרים של הקצה המקטין לצורת alditol יחידה, מה שמוביל לשיא כרומטוגרפי יחיד בניתוח PGC-LC-MS/MS.
    3. לאחר הדגירה, סובבו את צינורות הדגימה במיקרוצנטריפוגה כדי להביא את הנוזל לתחתית הצינורות.
    4. הוסף 100 μL של מים טהורים במיוחד לכל דגימה. הוסף 2 μL של חומצה אצטית קרחונית כדי לנטרל את דגימות N-גליקן אלקליין. סובבו את צינורות הדגימה במיקרוצנטריפוגה כדי להביא דגימות לתחתית הצינורות.
      הערה: חומצה אצטית קרחונית מנטרלת את הדגימות הבסיסיות מה שמוביל להיווצרות גז מימן (H2) ולאחר מכן תוססות במהלך התגובה.
  4. התפלת N-גליקנים באמצעות PGC-C18-SPE
    1. הכינו מיקרו-עמודות PGC-C18-SPE תוצרת בית כמתואר להלן.
      1. באמצעות מזרק מתאים, חבר והעבר דיסקים C18 לקצוות פיפטה מתאימים (10 μL).
        הערה: כאן, ניתן להשתמש גם במיקרו-עמודות C18-SPE מסחריות.
      2. פיפטה 10 μL slurry של שרף PGC מרחף 50% (v/v) מתנול לתוך מיקרו-עמודות C18-SPE. מקם את עמודות המיקרו בצינורות של 2 מ"ל המצוידים במתאמי מיקרוצנטריפוגה. סובבו את הצינורות כדי ליצור מיקרו-עמודות PGC-C18-SPE בגובה עמוד של ~0.5 ס"מ (ראו איור 1i). הכינו מיקרו-עמודה PGC-C18-SPE אחת לכל דגימה.
        הערה: השימוש במתאמים מבטיח שהמיקרו-עמודות יהיו תלויות במרכז הצינור.
      3. לשלבי השטיפה וטעינת הדגימות הבאים, הגדר צנטריפוגה על ספסל ל -6,000 סל"ד (~ 2,000 x גרם) וסחרור במשך 60 שניות כדי להקל על השלבים הניידים לעבור דרך עמודות המיקרו PGC-C18-SPE. שטפו וריככו כל מיקרו-עמודה PGC-C18-SPE ברצף עם 50 μL 0.1% (v/v) TFA ב-ACN שלוש פעמים ולאחר מכן 50 μL 0.1% (v/v) TFA שלוש פעמים.
        הערה: ניתן להכין את המיקרו-עמודות PGC-SPE שעות מראש, אך יש לאחסן אותן בטמפרטורת החדר לפני השימוש.
    2. החל את דגימות N-גליקן על מיקרו-עמודות PGC-C18-SPE בנפח טעינה של עד 40 μL וסחרור ב-6,000 סל"ד (~2,000 x גרם) במשך 60 שניות לאחר כל הוספה. חזור על שלב הטעינה עד שכל דגימת N-גליקן תוחל על המיקרו-עמודה.
      הערה: בעוד שהשברים הזורמים אינם אמורים להכיל גליקנים, אנו ממליצים לשמור שברים אלה עד שנתוני הגליקומיקס יתקבלו בהצלחה במקרה של שמירה חלקית במיקרו-עמודות PGC-C18-SPE.
    3. שטפו את המיקרו-עמודות PGC-C18-SPE ב-20 מיקרוליטר מים טהורים במיוחד. העבר את המיקרו-עמודות PGC-C18-SPE לצינורות מיקרוצנטריפוגות חדשים בנפח 1.5 מ"ל כהכנה לפליטת N-גליקן.
    4. הצהירו את ה-N-גליקנים על ידי הוספת 40 μL של 0.1% TFA ב-50% (שניהם v/v) ACN לכל מיקרו-עמודה PGC-C18-SPE, ולאחר מכן סיבוב. חזור על הליך זה ושלב את ה- eluate.
      הערה: חשוב לעקוב אחר המיקרו-עמודות לאחר כל סיבוב כדי לוודא שהפתרון סובב לחלוטין, מכיוון שזה יקל על הדבקה יעילה.
    5. יבשו את ה-N-גליקנים המותפלים במערכת רכזי ואקום.
  5. רכישת PGC-LC-MS/MS
    1. הכינו ממיסים LC כמתואר להלן.
      1. ממס A: הכן 100 מ"ל של 100 mM אמוניום ביקרבונט (NH4HCO3) תמיסת מלאי במים טהורים במיוחד. סנן את תמיסת המלאי דרך דיסק מסנן ניילון 0.2 מיקרומטר באמצעות יחידת סינון ואקום להסרת חלקיקים. לאחר מכן, הכן 1 ליטר של 10 mM NH4HCO3 פתרון (ממס A) על ידי דילול 100 מ"ל של 100 mM NH4HCO3 תמיסת מלאי ב 900 מ"ל של מים טהורים במיוחד. סוניק ממס A למשך 15 דקות כדי לנטרל את התמיסה. ממס A ניתן לאחסן במשך שבוע אחד ב 20-25 ° C, בעוד 100 mM NH4HCO3 פתרון מלאי ניתן לאחסן במשך חודש אחד ב 4 ° C.
      2. ממס B: הכן 1 ליטר של 10 mM NH4HCO3 in 70% (v/v) ACN במים אולטרה-טהורים (ממס B) על-ידי הוספת 100 מ"ל של 100 mM תמיסת מלאי NH4HCO3 (ראה שלב קודם 2.5.1.2) ל-700 מ"ל ACN ודלל לנפח כולל של 1 ליטר במים טהורים במיוחד. סוניק את ממס B למשך 15 דקות כדי לנטרל את הגז. ממס B ניתן לאחסן במשך 2 שבועות ב 20-25 מעלות צלזיוס.
    2. מרחפים מחדש את ה-N-גליקנים המותפלים ב-10 מיקרוליטר מים אולטרה-טהורים ומערבבים היטב. סובבו את הדגימות במהירות של 14,000 x גרם במשך 5 דקות, ולאחר מכן העבירו בזהירות את הסופרנאטנט לבקבוקוני דגימת טרשת נפוצה, תוך השארת כ-0.5 μL מאחור כדי למנוע העברת חלקיקים ופסולת גלויים או בלתי נראים שיפגעו במערכת LC-MS/MS.
    3. הזריקו והפרידו את ה-N-גליקנים על עמוד נימי PGC-LC שחומם ל-50°C באמצעות שיפוע ליניארי (או מתאים אחר) של 60 דקות של 0%-70% (v/v) ממס B בממס A במערכת HPLC. ודא שמערכת HPLC מחוברת לספקטרומטר המסות ופועלת בקצב זרימה קבוע של 20 μL/min (כוונן את קצב הזרימה כך שיתאים לגיאומטריה של עמודת PGC-LC).
    4. זהה את ה- N-גליקנים המופרדים באמצעות ספקטרומטר מסה מרובעת מלכודת יונים ליניארית (או מערכת MS מתאימה אחרת ברזולוציה נמוכה או גבוהה) המותקנת עם מקור יונים אלקטרוספריי ופועלת במצב קוטביות יונים שלילית.
    5. הגדר את טווח סריקת הרכישה של MS1 ל- m/z 150-2,000 עם רוחב שיא של סריקת זום של m/z 0.25 חצי רוחב מלא (FWHM) ב- m/z 200. הגדר את מתח המקור ל- 3.2 kV. עבור סריקות MS1, הגדר את בקרת ההגברה האוטומטית (AGC) ל- 5 x 104 יונים עם זמן צבירה מרבי של 50 אלפיות השנייה (או הגדרות מתאימות אחרות).
      הערה: ה-m/z ההתחלתי הנמוך אמור לכלול זיהוי של חד-סוכרים ודי-סוכרים שלעתים קרובות תורמים לגליקום N ו-O.
    6. עבור MS/MS, הגדר את הרזולוציה ל- m/z 0.25 FWHM ב - m/z 200, את ה- AGC ל- 2 x 104 ions, ואת זמן ההצטברות המרבי ל- 300 אלפיות השנייה. אפשר רכישה תלוית נתונים (DDA) ובחר את חמשת המבשרים הנפוצים ביותר בכל סריקה מלאה MS1 לפיצול באמצעות הפעלת תהודה (מלכודת יונים) דיסוציאציה הנגרמת על ידי התנגשות (CID) באנרגיית התנגשות מנורמלת (NCE) של 33%. בטלו את הבחירה בהדרה דינמית כדי למנוע החמצה קרובה של איזומרים איזובריים מסוג N-גליקן.
  6. ניתוח נתונים של נתוני גליקומיקה LC-MS/MS
    1. עיין בנתונים הגולמיים של LC-MS/MS שנוצרו באמצעות תוכנה מתאימה כדי להבטיח איכות נתונים גבוהה לאחר אישור רוחב שיא LC צר, הפרדת איזומרים N-גליקן יעילה, דיוק MS גבוה, רזולוציה ואות לרעש, ויעילות פיצול CID-MS/MS גבוהה.
    2. זהה ידנית את ה-N-גליקנים בדגימה בהתבסס על מסת המבשר המונואיזוטופית שלהם, תבנית הפיצול CID-MS/MS וזמן השמירה היחסי והמוחלט של PGC-LC.
      הערה: RawMeat v2.1, GlycoMod ו-GlycoWorkBench v2.1 יכולים לסייע בתהליך הזיהוי כמתואר26. אילוצים ביוסינתטיים ידועים וקרבה מבנית בין האנליטים שנצפו יכולים גם להוסיף ביטחון נוסף ב-N-גליקנים26 שזוהו. לחלופין, זיהוי גליקן חצי אוטומטי וביאור ספקטרלי יכולים להיעשות באמצעות תוכנה מסחרית.
    3. לכימות יחסי של N-גליקן, צור רשימת מעבר המכילה את קודמן המונואיזוטופי m/z של כל איזומרי N-גליקן שזוהו והשתמש בתוכנה מסחרית כדי לקבוע את ערכי השטח מתחת לעקומה (AUC) בהתבסס על כרומטוגרמות יונים שחולצו (EICs) של כל יוני מבשר N-גליקן כמתואר26.

3. זרימת עבודה N-glycoproteomics

  1. עיכול תערובת חלבונים
    1. עיכול 100-200 מיקרוגרם של תמצית חלבון מופחתת ואלקילציה (מחלק 1) על ידי הוספת טריפסין (1:50 אנזים:יחס חלבון, w/w) ו / או פרוטאזות אחרות לפי בחירה לכל דגימה.
      הערה: שלא כמו להכנת דגימת גליקומיקס, יש להשתמש, במידת האפשר, בצינורות מיקרוצנטריפוגות בעלי קישור נמוך לשלבי הכנת דגימת הגליקופרוטאומיקה להתאוששות פפטידית מרבית.
    2. לדגור את הדגימות במשך 8-12 שעות ב 37 ° C. ודא כי ה- pH הוא ~ 8.5 מאז פתרון אלקליין קל משפר את יעילות העיכול טריפסין.
      הערה: עדיף פרוטאזות ספציפיות המייצרות תבניות מחשוף צפויות ומשאירות את רוב N-גליקופפטידים עם סקוון יחיד (אתר גליקוזילציה), כגון טריפסין ו-Lys-C. הימנעו מדגירה מוגזמת של הדגימות כדי להפחית פיצולים לא ספציפיים של חלבונים על ידי טריפסין או פרוטאזות אחרות.
    3. עצור את העיכול על ידי החמצה (כדי למנוע מחשופים לא ספציפיים הנגרמים על ידי עיכול ממושך) על ידי תוספת של 1% (v/v) TFA.
  2. התפלת פפטיד באמצעות אוליגו R3-C18-SPE
    1. הכינו מיקרו-עמודות תוצרת בית של Oligo R3-C18-SPE כמתואר להלן.
      1. באמצעות מזרק מתאים, חבר והעבר דיסקים C18 לקצוות פיפטה 10 μL.
        הערה: כאן, ניתן להשתמש גם במיקרו-עמודות C18-SPE מסחריות.
      2. הפקידו תרחיף של שרף אוליגו R3 תלוי ב-ACN מסודר לתוך מיקרו-עמודות C18-SPE. מקם את המיקרו-עמודות בצינורות של 2 מ"ל המצוידים במתאמי מיקרוצנטריפוגות כדי להבטיח שהמיקרו-עמודות תלויות במרכז הצינור ומסתובבות כדי ליצור מיקרו-עמודות Oligo R3-C18-SPE עם גובה עמוד של ~1 ס"מ (ראה איור 1ii). הכן מיקרו-עמודה אחת של Oligo R3-C18-SPE עבור כל דגימה.
    2. לשלבי השטיפה וטעינת הדגימה הבאים, התאם צנטריפוגה עליונה לספסל ל-6,000 סל"ד (~2,000 x גרם) וסחרור במשך 60 שניות כדי לאפשר לשלבים הניידים לעבור דרך המיקרו-עמודות של Oligo R3-C18-SPE. שטפו וריככו כל מיקרו-עמודה של Oligo R3-C18-SPE ברצף עם 50 μL של ACN מסודר, 3x ולאחר מכן 50 μL של 0.1% (v/v) TFA, פי 3.
      הערה: ניתן להכין מראש את המיקרו-עמודות של Oligo R3-C18-SPE ולאחסן אותן במשך שעות בטמפרטורת החדר לפני השימוש.
    3. מקם את המיקרו-עמודות הממוזגות של Oligo R3-C18-SPE בצינורות חדשים של 1.5 מ"ל יחד עם מתאמי מיקרוצנטריפוגות. יש למרוח את תערובות הפפטידים-מעוכלות טריפטיות על מיקרו-עמודות Oligo R3-C18-SPE ולסובב במהירות של 2,000 x גרם במשך 60 שניות. ייתכן שיידרשו סבבי טעינה מרובים עבור נפחי דגימה הגדולים מ- 50 μL.
    4. שטף את המיקרו-עמודות של Oligo R3-C18-SPE עם 50 μL של 0.1% (v/v) TFA, פי 3. העבר את המיקרו-עמודות של Oligo R3-C18-SPE לצינורות חדשים של 1.5 מ"ל כהכנה לפליטת הפפטידים המותפלים.
    5. יש להקפיד על הפפטידים המותפלים על ידי מריחת 50 μL של 0.1% TFA ב-50% (שניהם v/v) ACN, ולאחר מכן 50 μL של 0.1% TFA ב-70% (שניהם v/v) ACN על כל מיקרו-עמודה של Oligo R3-C18-SPE. סובב לאחר כל שלב.
      הערה: חשוב לעקוב אחר המיקרו-עמודות לאחר כל סיבוב כדי לוודא שהפתרון סובב לחלוטין, מכיוון שזה יקל על הדבקה יעילה.
    6. אספו, שלבו וייבשו את הפפטידים שהתפלו במערכת רכזי ואקום.
      הערה: אם אתם מבצעים פרוטאומיקה מקבילית ודה-N-גליקופרוטאומיקה (ראו דיון), פצלו את דגימות הפפטידים, והניחו בצד שברים נפרדים לפני הייבוש.
  3. העשרת N-גליקופפטיד באמצעות ZIC-HILIC-C8-SPE
    1. הכינו מיקרו-עמודות ZIC-HILIC-C8-SPE תוצרת בית כמתואר להלן.
      1. באמצעות מזרק מתאים, חבר והעבר דיסקים C8 לקצוות פיפטה 10 μL.
      2. הפקידו תרחיף של שרף ZIC-HILIC המרחף במתנול לתוך מיקרו-עמודות C8-SPE. מקם את המיקרו-עמודות בצינורות של 2 מ"ל המצוידים במתאמי מיקרוצנטריפוגות כדי להבטיח שהמיקרו-עמודות תלויות במרכז הצינור ומסתובבות ליצירת מיקרו-עמודות ZIC-HILIC-C8-SPE עם גובה עמוד של ~1 ס"מ (ראה איור 1iii). הכן מיקרו-עמודה אחת של ZIC-HILIC-C8-SPE עבור כל דגימה.
    2. לשלבי השטיפה וההעמסה הבאים של הדגימה, התאימו צנטריפוגה עליונה לספסל ל-6,000 סל"ד (~2,000 x גרם) וסחררו במשך 60 שניות כדי לאפשר לשלבים הניידים לעבור דרך המיקרו-עמודות ZIC-HILIC-C8-SPE. שטפו וריככו כל מיקרו-עמודה ZIC-HILIC-C8-SPE ברצף עם 50 μL מתנול, 3x, ולאחר מכן 50 μL של מים טהורים במיוחד, 3x, ולבסוף 50 μL של 1% TFA ב-80% (שניהם v/v) ACN, 3x.
      הערה: ניתן להכין את המיקרו-עמודות ZIC-HILIC-C8-SPE שעות מראש, אך יש לאחסן אותן בטמפרטורת החדר לפני השימוש.
    3. יש להשהות מחדש את תערובות הפפטידים המיובשים המיועדות להעשרת N-גליקופפטיד ב-50 μL של 1% TFA ב-80% (v/v) ACN ולערבב היטב.
      הערה: אם קשה להמיס פפטידים מחדש בממס ההעמסה HILIC, ניתן תחילה להמיס מחדש את הפפטידים ב-10% (v/v) TFA ולאחר מכן לדלל אותם במהירות ב-ACN כדי להגיע לריכוזים של ממס ההעמסה HILIC. הימנע מחימום הדגימה בריכוז TFA גבוה כדי למנוע גרימת הידרוליזה.
    4. מקם את המיקרו-עמודות הממוזגות ZIC-HILIC-C8-SPE בצינורות חדשים של 1.5 מ"ל יחד עם מתאמי מיקרוצנטריפוגות. החל את תערובות הפפטידים, המרחפים מחדש, על מיקרו-עמודות ZIC-HILIC-C8-SPE וסחרור במהירות של 2,000 x גרם במשך 60 שניות. ייתכן שיידרשו סבבי טעינה מרובים עבור נפחי דגימה הגדולים מ- 50 μL.
    5. אסוף את המקטעים הזורמים והחל מחדש שברים על אותה מיקרו-עמודה ZIC-HILIC-C8-SPE. חזור על היישום מחדש 2x ושמור על צינורות הזרימה.
    6. שטף את המיקרו-עמודות ZIC-HILIC-C8-SPE 2x עם 50 μL של 1% TFA ב-80% (שניהם v/v) ACN, spin, ושלב זרימה זו עם הזרימה משלב 3.3.4.
      הערה: מקטע הזרימה המשולב מכיל בדרך כלל ~90% מכלל החומר הפפטידי, ולמעשה יוצר את החלק הפפטידי שלא עבר שינוי, ולכן ניתן להשתמש בו לאנליזה נפרדת במורד הזרם (במקום לבצע ניסוי נפרד מסוג פרוטאומיקה).
    7. העבר את המיקרו-עמודות ZIC-HILIC-C8-SPE לצינורות מיקרוצנטריפוגות חדשים באורך 1.5 מ"ל בעלי קשירה נמוכה. יש להקפיד על N-גליקופפטידים שנותרו ברצף עם 50 μL של 0.1% (v/v) TFA, ולאחר מכן 50 μL של 25 mM אמוניום ביקרבונט, ולאחר מכן 50 μL של 50% (v/v) ACN. סובב במהירות של 2,000 x גרם במשך 60 שניות לאחר כל שלב.
      הערה: האלואט מכיל בדרך כלל ~10% מכלל החומר הפפטידי, שרובו צריך להיות N-גליקופפטידים אם מושגת יעילות העשרה גבוהה. חשוב לעקוב אחר המיקרו-עמודות לאחר כל סיבוב כדי לוודא שהפתרון סובב לחלוטין, מכיוון שזה יקל על הדבקה יעילה.
    8. לאסוף, לשלב ולייבש את N-גליקופפטידים מועשרים (אם נדרש) את זרימת הפפטיד ללא שינוי דרך שברים במערכת ריכוז ואקום.
  4. LC-MS/MS בשלבים הפוכים של N-גליקופפטידים שלמים
    1. הכינו ממיסים LC כמתואר להלן.
      1. ממס A: יש להכין 1 ליטר של 0.1% (v/v) חומצה פורמית במים טהורים במיוחד. סוניק במשך 15 דקות כדי לנטרל את הממס. ממס A ניתן לאחסן במשך חודש אחד ב 20-25 מעלות צלזיוס.
      2. ממס B: הכינו 1 ליטר של 0.1% חומצה פורמית ב-99.9% (שניהם v/v) ACN. סוניק במשך 15 דקות כדי degas. ממס B ניתן לאחסן במשך חודש אחד ב 20-25 מעלות צלזיוס.
    2. יש להשהות מחדש את שברי הפפטיד המיובשים בחומצה פורמית של 0.1% (v/v) לריכוז של כ-0.2-0.5 מיקרוגרם פפטיד / μL ולערבב היטב. סובבו את הדגימות במהירות של 14,000 x גרם במשך 5 דקות, ולאחר מכן העבירו בזהירות את הסופרנאטנט לבקבוקוני דגימת טרשת נפוצה, תוך השארת כ-0.5 מיקרוליטר מאחור כדי למנוע העברת חלקיקים ופסולת לא רצויים.
    3. עבור כל דגימה, הזריקו ~0.5-1 מיקרוגרם פפטיד כולל על עמודת מלכודת C18-LC והפרידו את הפפטידים על עמודה אנליטית C18-LC בקצב זרימה קבוע של 250 nL/min באמצעות מערכת UPHLC המחוברת לספקטרומטר המסות עם שיפוע של 2%-30% ממס B במשך 100 דקות, 30%-50% B במשך 18 דקות, 50%-95% B במשך דקה אחת, ו-9 דקות ב-95% (כל v/v) B בממס A (או התקנה מתאימה אחרת).
    4. זהה את הפפטידים באמצעות ספקטרומטר מסה ברזולוציה גבוהה המחובר למערכת nanoLC המצוידת במקור יונים ננו-אלקטרוספריי ופועלת במצב קוטביות יונים חיובית.
    5. עבור MS1, השתמש בטווח סריקת רכישה של m/z 350-1,800, ברזולוציה גבוהה של 60,000-120,000 FWHM ב- m/z 200 ובמתח מקור של ~2.5 kV. הגדר את AGC ל- 3 x 106 יונים עם זמן הצטברות מרבי של 50 אלפיות השנייה (או הגדרות מתאימות אחרות).
    6. עבור MS/MS, בחר את 20 היונים המקדימים הנפוצים ביותר מכל סריקה מלאה של MS1 לפיצול באמצעות מצב DDA המשתמש ב- HCD-MS/MS עם NCE קבוע של 35% או sceHCD עם NCE של 25%, 35% ו- 45%. חשוב לציין, קבע את ערך m/z התחתון ל- 110 (לדוגמה, טווח סריקה m/z 110 - 1,800) כדי לצפות בכל יוני האוקסוניום בעלי המסה הנמוכה בכל ספקטרום מקטעים.
    7. בחר קודמנים הנושאים יותר מ- 2 מטענים (Z ≥ 2) לפיצול. קבל (SCE)HCD-MS/MS ספקטרום ברזולוציה של 30,000-45,000 FWHM ב- M/Z 200 עם AGC של 1 x 105 יונים וזמן צבירה של 90 אלפיות השנייה באמצעות חלון בידוד מקדים של ± 1.0 Th. אפשר הדרה דינמית של 30 שניות לאחר בידוד יחיד ופיצול של יון מקדים נתון.
      הערה: אם ETD זמין, שקול גם לרכוש EThcD-MS/MS של דגימות N-גליקופפטיד שלמות באמצעות הפעלת יונים תלויי מוצר. בצע שלב זה כאשר יוני אוקסוניום גליקן אבחוניים (לדוגמה, m/z 138.0545, 204.0867 ו- 366.1396) הם בין 20 יוני המקטעים המובילים בכל ספקטרום HCD-MS/MS39. זהה את מקטעי EThcD-MS/MS ברזולוציה של 30,000-45,000 FWHM ב- m/z 200 עם AGC של 4 x 105 יונים, זמן הזרקה של 250 ms, HCD NCE של 15%, ורוחב בידוד מקדים של 1.6 Th.
  5. ניתוח נתונים של נתוני גליקופרוטאומיקה LC-MS/MS
    1. אשר את העשרת הנתונים הגולמיים של LC-MS/MS עם N-גליקופפטידים על-ידי בדיקה שרוב ספקטרום HCD-MS/MS מכיל יוני גליקן אוקסוניום (לדוגמה, m/z 138.0545, 204.0867 ו- 366.1396) וכן (עבור אסטרטגיות תיוג) כוללים הפרדה בסיסית של יוני כתב TMT בעלי מסה נמוכה, יעילות פיצול גבוהה בספקטרום MS/MS ורוחב שיא LC צר, ודיוק MS גבוה, רזולוציה ואות לרעש.
    2. באמצעות מנוע חיפוש (קיימים מספר מנועים; ראה להלן), חפש בנתוני MS/MS N-glycopeptides שלמים מול מסד נתונים מתאים של חלבונים/פפטידים, המכוון לדגימה הנחקרת (למשל, המתקבלת מניסוי de-N-glycoproteomics) או כנגד כל החלבונים האנושיים של UniProtKB שנסקרו. התאם את החיפוש נגד פפטיד N-גליקוזילציה על ידי חיפוש פפטידים עם Asn מקומי sequon. חשוב לציין, בחר מסד נתונים N-גליקן מבוסס גליקומיקה, כלומר גליקנים שזוהו מנתוני גליקומיקה בשלב 2, כדי להגביל את מרחב החיפוש לגליקנים הידועים כקיימים בדגימות.
      הערה: חיפושים מקבילים באמצעות מסד נתונים רחב ומוגדר מראש של N-גליקן עשויים להיחשב כשוללים את קיומם של הרכבים נוספים של N-גליקן בנתונים.
    3. התאם את משתני החיפוש הנותרים בהתאם למדגם הנחקר, נהלי הטיפול הספציפיים בדגימה שבוצעו, והגדרות הטרשת הנפוצה המועסקות והמכשור המשומש. הגדרות חיפוש נפוצות עבור חיפוש הנתונים N-glycoproteomics כוללות:
      סיבולת קודמת ומסת מוצר: 10 עמודים לדקה ו- 20 עמודים לדקה
      ספציפיות פרוטאז: ספציפית לחלוטין ו/או ספציפית למחצה (N-ragged)
      החמצות מותרות: 2
      שינויים קבועים: Cys carbamidomethylation (+57.021 Da)
      שינויים משתנים: חמצון Met (+15.994 Da) (נפוץ 1)
      שינויים משתנים מותרים לכל פפטיד: 1 או 2
      שינויים גליקניים: מסד נתונים גליקני מבוסס גליקומיקס (נדיר 1)
      מסד נתונים של חלבונים ומזהמים: מופעל
    4. סנן את כל החיפושים לשיעור גילוי שווא של <1% (FDR) ברמת החלבון וברמת הפפטידים. שקול רק N-גליקופפטידים המזוהים עם ביטחון גבוה (למשל, ציוני PEP 2D < 0.001) ובצע ביאור/אוצרות ידניים של הפלט המסונן כדי להפחית עוד יותר את שיעור הזיהוי השגוי של N-גליקופפטיד כפי שנדון 36,40,41.
      הערה: גליקופפטידים עם N-גליקנים וגליקופפטידים סיאלילציה ורב-פוקוסילציה הנושאים שינויים משתנים אחרים בנוסף לגליקנים (כלומר, חמצון Met ו-Asn/Gln deamidation) מועדים במיוחד לפרשנות שגויה על ידי מנועי החיפוש41. יש להקדיש תשומת לב מיוחדת כדי לאמת מועמדים כאלה לפני הדיווח.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תוצאות מייצגות של שיטת הגליקופרוטאומיקה מונחית הגליקומיקס המיושמת על שקופית רקמת FFPE ממטופל הסובל מ- CRC בשלב II מובאות בסעיף זה.

כדי להשיג מספיק חומר מוצא חלבוני לפרוטוקול, תמציות חלבון משתי שקופיות (ערימות z) שולבו מאותו בלוק רקמת FFPE בעקבות פרוטוקול שפורסם ויושמה גישת תיוג TMT כדי להגביר את הרגישות של ניסוי הגליקופרוטאומיקה (ראה שלבים אופציונליים להלן)42.

ראשית, ניתוח של נתוני N-גליקומיקה מבוססי PGC-LC-MS/MS של רקמות FFPE CRC זיהה בסך הכ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שלבים קריטיים בפרוטוקול
במאמר פרוטוקול זה, תיארנו שלב אחר שלב את שיטת הגליקופרוטאומיקה מונחית הגליקומיקה, המספקת מבט מקיף על ההטרוגניות והדינמיקה של הגליקופרוטאום ב- TME המורכב.

שלב קריטי בפרוטוקול הוא להבטיח פרוטאוליזה מלאה מבלי לעכל יתר על המידה את תערובת החלבונים. פיצולים לא ספציפיים של חלבונים מגדילים מטבעם את מרחב החיפוש של הפפטידים, מה שמוביל לזמני חיפוש ארוכים יותר ולשיעור זיהוי שגוי גבוה יותר של גליקופפטידים50

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי אין ניגוד עניינים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

THC נתמך על ידי מלגת תוכנית הכשרה בינלאומית למחקר במימון ממשלת אוסטרליה. NB נתמכת על ידי International Macquarie University Research Excellence Scholarships במימון אוניברסיטת מקווארי. AC נתמך על ידי מלגת תוכנית הכשרה מחקר במימון ממשלת אוסטרליה. RK נתמך על ידי מכון הסרטן של ניו סאות 'ויילס (ECF181259). MTA זכתה במלגת העתיד של מועצת המחקר האוסטרלית (FT210100455).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>כימיקלים
אמוניום אצטט Sigma AldrichA1542חלופות זמינות
אמוניום ביקרבונט, טוהר ≥ 99.0%Sigma AldrichA6141חלופות זמינות
אצטוניטריל נטול מים (ACN), LC-MSדרגת Sigma Aldrich34851חלופות זמינות
Sigma AldrichF3004חלופות זמינות
Dithiothreitol (DTT)Sigma AldrichD0632חלופות זמינות
אתנולSigma AldrichE7023חלופות זמינות
חומצה פורמית, דרגת LC-MSSigma Aldrich00940חלופות זמינות
חומצה אצטית קרחוניתSigma AldrichA6283חלופות זמינות
יודואצטמיד (IAA)Sigma AldrichI1149חלופות זמינות
מתנולSigma AldrichM1775חלופות זמינות
פפטיד-N-גליקוזידאז F (PNGase F)PromegaV4831Elizabethkingia miricola PNGase F (10 U/μ L) מתבטא רקומביננטית ב-Escherichia coli 
פוליוויניל פירולידון 40 (PVP)סיגמא אולדריץ'PVP40חלופות זמינות
אשלגן הידרוקסיד (KOH)סיגמא אולדריץ484016חלופות זמינות
טריפסין חזירי בדרגת ריצוף PromegaV5113חלופות זמינות
נתרן בורוהידריד (NaBH4)Sigma Aldrich213462חלופות זמינות
טריאתילאמוניום ביקרבונט (TEAB),חלופותSigma AldrichT7408
חומצה טריפלואורואצטית (TFA),חלופות
זמינות Sigma Aldrich T6508 בדרגת LC-MS<חזקים>כלים/חומרים
C18 דיסקיםEmpore66883-U
C8 דיסקיםEmpore66882-U
פלטת פוליפרופילן שטוחה 96 בארות קורנינג3364
אימובילון-PSQ פוליווינילידן דיפלואוריד (PVDF) ממברנהMilliporeIPVH20200גודל נקבוביות: 0.45 μ מ 
מיקרוצנטריפוגהEppendorf5452000069חלופות זמינות
מתאמי מיקרוצנטריפוגה The Nest Group, Inc., MASS18VMiniSpin צווארון עמודים, מגיע עם עמודי Microspin
שרף Oligo R3תרמו1133903 גודל חלקיקים 30 μ m
ParafilmParafilm MPM996
חלבון LoBind צינורות 1.5 מ"לEppendorf0030108450
חלבון LoBind צינורות 2.0 מ"לEppendorf0030108442
צינורות נעילה בטוחה 1.5 מ"לEppendorf0030120086
צינורות נעילה בטוחה 2.0 מ"לEppendorf0030120094
שייקרEppendorf5382000066חלופות זמינות
מנקב חור יחידSwingline74005
רכז SpeedVacמרטין קרייסטRVC 2-25 CDplusחלופות זמינות
Supelclean שרף ENVI-Carb SPESupelco57088גודל חלקיקים 120-400 רשת. ניתן להפיק שרף באופן ידני ממחסניות, וניתן לאחסן אותו לטווח ארוך ב-50% (v/v) מתנול במזרק מים MilliQ
5 מ"לSigma AldrichZ116866חלופות זמינות
חממה מבוקרת טמפרטורהThermolineE7.30חלופות זמינות
אמבט אולטרסאונדUnisonicsFXPחלופות זמינות
שרף ZIC-HILICMerck150455גודל חלקיקים/נקבוביות, 5 μ m/200 Å. ניתן לחלץ שרף באופן ידני מעמודת LC, וניתן לאחסן אותו לטווח ארוך ב-50% (v/v) מתנול
במיקרו-עמודות מיצוי שלב מוצק (SPE) של מים MilliQ MilliporeZTC18S096לחלופין, מיקרו-עמודות C18-SPE תוצרת בית יכולות להחליף מוצר מסחרי
<חזק>LC-MS/MS ניתוח
1260 מערכת HPLC נימית אינפיניטית חלופותAgilent
עמודת LC אנליטית ארוזה מראש עם שרף ReproSil-Pur C18 AQDr Maisch, Ammerbuch-Entringen, גרמניהr13.aq.s2570גודל חלקיקים/נקבוביות: 3 μ m/120 Å, אורך/קוטר פנימי: 25 ס"מ/75 μm. ניתן להשיג גם עמודות ננו-LC מסחריות C18/ 
מערכת Dionex UltiMate 3000 RSLCnano LC חלופותתרמו
עמודת LC נימית HyperCarb KAPPA PGC תרמוהופסקגודל חלקיקים/נקבוביות, 3 μ m/250 Å; אורך עמוד, 30 מ"מ; קוטר פנימי, 0.180 מ"מ. גיאומטריות גדולות יותר של עמודות HyperCarb PGC-LC, המפיקות נתונים באיכות דומה זמינות מסחרית (למשל, Thermo #35003-031030). עמודת SupelTMCarb LC מבית Merck עם גודל חלקיק/נקבוביות, 2.7 μ m/200 ועם אורכי עמודות וקוטר פנימי שונים זמינים גם כן (למשל, Merck #59994-U). 
אצטוניטרילLiChrosolv 100029חלופות זמינות
מלכודת ליניארית מרובעת (LTQ) ספקטרומטר מסה של מלכודת יונים Velos Pro (גליקומיקה) חלופותתרמו
Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer (glycoproteomics)Thermoמערכות MS אחרות ברזולוציה גבוהה עם או בלי ETD (נדרש רק עבור O-glycoproteomics) זמינות גם כן (למשל, Q-Exactive HF-X Hybrid Quadrupole-Orbitrap, Thermo, TIMS-ToF-MS, Bruker או ספקטרומטרי מסה דומים בעלי ביצועים גבוהים מספקים אחרים)
בקבוקוני בורג זכוכית שקופה Total Recovery 0.9 מ"לחלופות ThermoTHC11093563זמינות
התאוששות מוחלטת בקבוקוני בורג זכוכית שקופים כובעים תואמיםThermoTHC09150869חלופות זמינות
LC מלכודת ארוז בבית עם שרף ReproSil-Pur C18 AQ Dr Maisch, Ammerbuch-Entringen, גרמניהr15.aq.s0202גודל חלקיקים/נקבוביות: 5 μ m/120 Å, אורך/קוטר פנימי: 2 ס"מ/100 μm. עמודי LC מסחריים C18 מלכודת זמינים גם כן. 
Software
ByonicProtein Metrics Incv2.6.46 ומעלהמנוע חיפוש מסחרי של גליקופפטיד ו-PTM, המקבל נתונים גולמיים של LC-MS/MS מרוב ספקי MS
ByosProtein Metrics Incv3.9-7 ומעלהתוכנה מסחרית לבדיקה ידנית של מועמדים לגליקופפטיד והערות אוטומטיות של ספקטרום MS/MS גליקן
GlycoModExpasy, המסייעת בביאור נתוני גליקומיקה (https://web.expasy.org/glycomod/)
GlycoWorkBenchEUROCarbDBv2.1תוכנת גישה פתוחה, מסייעת בביאור נתוני גליקומיקה וציור קריקטורות גליקן
RawMeatVAST Scientificv2.1תוכנת גישה פתוחה, חילוץ m/z של יוני מבשר גליקן מנתונים ספקטרליים גולמיים
SkylineBrendan X. MacLeanv21.2 ומעלהתוכנת גישה פתוחה לכימות יחסי של גליקנים
XcaliburThermov2.2 ומעלהלעיון בנתוני LC-MS/MS גולמיים
' זמינות בדרגת LC-MS זמינות זמינות בדרגת LCMS זמינות עמוד תוכנת גישה פתוחה

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gagneux, P., Panin, V., Hennet, T., Aebi, M., Varki, A. Essentials of glycobiology. , Cold Spring Harbor. NY. 265-278 (2022).
  2. Tjondro, H. C., Loke, I., Chatterjee, S., Thaysen-Andersen, M. Human protein paucimannosylation: Cues from the eukaryotic kingdoms. Biol Rev Camb Philos Soc. 94 (6), 2068-2100 (2019).
  3. West, C. M., Malzl, D., Hykollari, A., Wilson, I. B. H. Glycomics, glycoproteomics, and glycogenomics: An inter-taxa evolutionary perspective. Mol Cell Proteomics. 20, 100024(2021).
  4. Varki, A. Biological roles of glycans. Glycobiology. 27 (1), 3-49 (2016).
  5. Reily, C., Stewart, T. J., Renfrow, M. B., Novak, J. Glycosylation in health and disease. Nat Rev Nephrol. 15 (6), 346-366 (2019).
  6. Leite-Gomes, E., et al. Bringing to light the risk of colorectal cancer in inflammatory bowel disease: Mucosal glycosylation as a key player. Inflamm Bowel Dis. 28 (6), 947-962 (2022).
  7. He, K., et al. Decoding the glycoproteome: A new frontier for biomarker discovery in cancer. J Hematol Oncol. 17 (1), 12(2024).
  8. Mereiter, S., Balmana, M., Campos, D., Gomes, J., Reis, C. A. Glycosylation in the era of cancer-targeted therapy: Where are we heading. Cancer Cell. 36 (1), 6-16 (2019).
  9. Seeberger, P. H., et al. What comes next in glycobiology. Cell. 187 (11), 2628-2632 (2024).
  10. Abrahams, J. L., et al. Recent advances in glycoinformatic platforms for glycomics and glycoproteomics. Curr Opin Struct Biol. 62, 56-69 (2020).
  11. Thaysen-Andersen, M., Packer, N. H., Schulz, B. L. Maturing glycoproteomics technologies provide unique structural insights into the N-glycoproteome and its regulation in health and disease. Mol Cell Prot. 15 (6), 1773-1790 (2016).
  12. Gaunitz, S., Nagy, G., Pohl, N. L., Novotny, M. V. Recent advances in the analysis of complex glycoproteins. Anal Chem. 89 (1), 389-413 (2017).
  13. Chernykh, A., Kawahara, R., Thaysen-Andersen, M. Towards structure-focused glycoproteomics. Biochem Soc Trans. 49 (1), 161-186 (2021).
  14. Hu, H., Khatri, K., Zaia, J. Algorithms and design strategies towards automated glycoproteomics analysis. Mass Spectrom Rev. 36 (4), 475-498 (2017).
  15. Bagdonaite, I., et al. Glycoproteomics. Nat Rev Meth Primers. 2 (1), 48(2022).
  16. Peng, W., et al. MS-based glycomics and glycoproteomics methods enabling isomeric characterization. Mass Spectrom Rev. 42 (2), 577-616 (2023).
  17. Aoki-Kinoshita, K. F., et al. Essentials of glycobiology. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. NY. 705-718 (2022).
  18. Thomas, D. R., Scott, N. E. Glycoproteomics: Growing up fast. Curr Opin Struct Biol. 68, 18-25 (2021).
  19. Thaysen-Andersen, M., Kolarich, D., Packer, N. H. Glycomics & glycoproteomics: From analytics to function. Mol Omics. 17 (1), 8-10 (2021).
  20. Trbojevic-Akmacic, I., et al. High-throughput glycomic methods. Chem Rev. 122 (20), 15865-15913 (2022).
  21. Oliveira, T., Thaysen-Andersen, M., Packer, N. H., Kolarich, D. The hitchhiker's guide to glycoproteomics. Biochem Soc Trans. 49 (4), 1643-1662 (2021).
  22. Rudd, P. M., et al. Essentials of glycobiology. , Cold Spring Harbor. NY. 689-704 (2022).
  23. Madunić, K., et al. Colorectal cancer cell lines show striking diversity of their O-glycome reflecting the cellular differentiation phenotype. Cell Mol Life Sci. 78 (1), 337-350 (2021).
  24. Parker, R., et al. Mapping the SARS-CoV-2 spike glycoprotein-derived peptidome presented by HLA class II on dendritic cells. Cell Rep. 35 (8), 109179(2021).
  25. Zhao, P., et al. Virus-receptor interactions of glycosylated SARS-CoV-2 spike and human ACE2 receptor. Cell Host Microbe. 28 (4), 586-601.e6 (2020).
  26. Chatterjee, S., et al. Serum N-glycomics stratifies bacteremic patients infected with different pathogens. J Clin Med. 10 (3), 516(2021).
  27. Osimanjiang, W., et al. Analysis of N- and O-linked glycosylation: Differential glycosylation after rat spinal cord injury. J Neurotrauma. 37 (18), 1954-1962 (2020).
  28. Chatterjee, S., et al. Trends in oligomannosylation and α1,2-mannosidase expression in human cancers. Oncotarget. 12 (21), 2188-2205 (2021).
  29. Chang, D., Klein, J. A., Nalehua, M. R., Hackett, W. E., Zaia, J. Data-independent acquisition mass spectrometry for site-specific glycoproteomics characterization of SARS-CoV-2 spike protein. Anal Bioanal Chem. 413 (29), 7305-7318 (2021).
  30. Pan, J., et al. Glycoproteomics-based signatures for tumor subtyping and clinical outcome prediction of high-grade serous ovarian cancer. Nat Commun. 11 (1), 6139(2020).
  31. Venkatakrishnan, V., et al. Glycan analysis of human neutrophil granules implicates a maturation-dependent glycosylation machinery. J Biol Chem. 295 (36), 12648-12660 (2020).
  32. Sethi, M. K., et al. In-depth matrisome and glycoproteomic analysis of human brain glioblastoma versus control tissue. Mol Cell Proteom. 21 (4), 100216(2022).
  33. Parker, B. L., et al. Site-specific glycan-peptide analysis for determination of N-glycoproteome heterogeneity. J Proteome Res. 12 (12), 5791-5800 (2013).
  34. Jensen, P. H., Karlsson, N. G., Kolarich, D., Packer, N. H. Structural analysis of N- and O-glycans released from glycoproteins. Nat Protoc. 7 (7), 1299-1310 (2012).
  35. Hinneburg, H., et al. Post-column make-up flow (pcmf) enhances the performance of capillary-flow PGC-LC-MS/MS-based glycomics. Anal Chem. 91 (7), 4559-4567 (2019).
  36. Chau, T. H., et al. Glycomics-assisted glycoproteomics enables deep and unbiased N-glycoproteome profiling of complex biological specimens. Meth Mol Biol. 2628, 235-263 (2023).
  37. Madunic, K., Wagt, S., Zhang, T., Wuhrer, M., Lageveen-Kammeijer, G. S. M. Dopant-enriched nitrogen gas for enhanced electrospray ionization of released glycans in negative ion mode. Anal Chem. 93 (18), 6919-6923 (2021).
  38. Zhang, T., Wang, W., Wuhrer, M., De Haan, N. Comprehensive O-glycan analysis by porous graphitized carbon nanoliquid chromatography-mass spectrometry. Anal Chem. 96 (22), 8942-8948 (2024).
  39. Wu, S. W., Pu, T. H., Viner, R., Khoo, K. H. Novel LC-MS2 product dependent parallel data acquisition function and data analysis workflow for sequencing and identification of intact glycopeptides. Anal Chem. 86 (2), 5478-5486 (2014).
  40. Kawahara, R., et al. The complexity and dynamics of the tissue glycoproteome associated with prostate cancer progression. Mol Cell Proteom. 20, 100026(2021).
  41. Chau, T. H., Chernykh, A., Kawahara, R., Thaysen-Andersen, M. Critical considerations in N-glycoproteomics. Curr Opin Chem Biol. 73, 102272(2023).
  42. Carnielli, C. M., et al. Comprehensive glycoprofiling of oral tumors associates N-glycosylation with lymph node metastasis and patient survival. Mol Cell Proteom. 22 (7), 100586(2023).
  43. Sethi, M. K., et al. In-depth N-glycome profiling of paired colorectal cancer and non-tumorigenic tissues reveals cancer-, stage- and EGFR-specific protein N-glycosylation. Glycobiology. 25 (10), 1064-1078 (2015).
  44. Magdeldin, S., Yamamoto, T. Toward deciphering proteomes of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues. Proteomics. 12 (7), 1045-1058 (2012).
  45. Ostasiewicz, P., Zielinska, D. F., Mann, M., Wiśniewski, J. R. Proteome, phosphoproteome, and N-glycoproteome are quantitatively preserved in formalin-fixed paraffin-embedded tissue and analyzable by high-resolution mass spectrometry. J Proteome Res. 9 (7), 3688-3700 (2010).
  46. Tian, Y., Gurley, K., Meany, D. L., Kemp, C. J., Zhang, H. N-linked glycoproteomic analysis of formalin-fixed and paraffin-embedded tissues. J Proteome Res. 8 (4), 1657-1662 (2009).
  47. Cozzolino, F., et al. New label-free methods for protein relative quantification applied to the investigation of an animal model of huntington disease. PLoS One. 15 (9), e0238037(2020).
  48. Sethi, M. K., et al. Quantitative proteomic analysis of paired colorectal cancer and non-tumorigenic tissues reveals signature proteins and perturbed pathways involved in CRC progression and metastasis. J Proteomics. 126, 54-67 (2015).
  49. Rosati, D., et al. Differential gene expression analysis pipelines and bioinformatic tools for the identification of specific biomarkers: A review. Comput Struct Biotechnol J. 23, 1154-1168 (2024).
  50. Niu, B., et al. Nonspecific cleavages arising from reconstitution of trypsin under mildly acidic conditions. PLoS One. 15 (7), e0236740(2020).
  51. Delafield, D. G., Li, L. Recent advances in analytical approaches for glycan and glycopeptide quantitation. Mol Cell Proteom. 20, 100054(2021).
  52. Viner, R. I., Snovida, S., Bodnar, E., Perreault, H., Saba, J. A novel workflow for glycopeptide analysis using cellulose-based separation cartridges, TMT-labeling and LTQ Orbitrap ETD. J Biomol Tech. 21 (3 Suppl), S25(2010).
  53. Kawahara, R., et al. Community evaluation of glycoproteomics informatics solutions reveals high-performance search strategies for serum glycopeptide analysis. Nat Meth. 18 (11), 1304-1316 (2021).
  54. Polasky, D. A., Nesvizhskii, A. I. Recent advances in computational algorithms and software for large-scale glycoproteomics. Curr Opin Chem Biol. 72, 102238(2023).
  55. Polasky, D. A., Yu, F., Teo, G. C., Nesvizhskii, A. I. Fast and comprehensive N- and O-glycoproteomics analysis with MSFragger-Glyco. Nat Meth. 17 (11), 1125-1132 (2020).
  56. Goodson, H., et al. Α-mannosylated HLA-II glycopeptide antigens dominate the immunopeptidome of immortalised cells and tumour tissues. Glycobiology. 34 (11), cwae057(2024).
  57. Shajahan, A., Heiss, C., Ishihara, M., Azadi, P. Glycomic and glycoproteomic analysis of glycoproteins-a tutorial. Anal Bioanal Chem. 409 (19), 4483-4505 (2017).
  58. Rosenbalm, K. E., Tiemeyer, M., Wells, L., Aoki, K., Zhao, P. Glycomics-informed glycoproteomic analysis of site-specific glycosylation for SARS-CoV-2 spike protein. STAR Prot. 1 (3), 100214-100214 (2020).
  59. Zhao, P., et al. Virus-receptor interactions of glycosylated SARS-CoV-2 spike and human ACE2 receptor. Cell Host Microbe. 28 (4), 586-601.e6 (2020).
  60. Chandler, K. B., et al. Multi-isotype glycoproteomic characterization of serum antibody heavy chains reveals isotype- and subclass-specific N-glycosylation profiles. Mol Cell Proteomics. 18 (4), 686-703 (2019).
  61. Haab, B. B., Klamer, Z. Advances in tools to determine the glycan-binding specificities of lectins and antibodies. Mol Cell Proteom. 19 (2), 224-232 (2020).
  62. Zhang, L., Luo, S., Zhang, B. The use of lectin microarray for assessing glycosylation of therapeutic proteins. MAbs. 8 (3), 524-535 (2016).
  63. Goumenou, A., Delaunay, N., Pichon, V. Recent advances in lectin-based affinity sorbents for protein glycosylation studies. Front Mol Biosci. 8, 746822(2021).
  64. Parker, B. L., et al. Terminal galactosylation and sialylation switching on membrane glycoproteins upon TNF-alpha-induced insulin resistance in adipocytes. Mol Cell Proteomics. 15 (1), 141-153 (2016).
  65. Blazev, R., et al. Integrated glycoproteomics identifies a role of N-glycosylation and galectin-1 on myogenesis and muscle development. Mol Cell Proteomics. 20, 100030(2021).
  66. Thaysen-Andersen, M., et al. Human neutrophils secrete bioactive paucimannosidic proteins from azurophilic granules into pathogen-infected sputum. J Biol Chem. 290 (14), 8789-8802 (2015).
  67. Loke, I., Ostergaard, O., Heegaard, N. H. H., Packer, N. H., Thaysen-Andersen, M. Paucimannose-rich N-glycosylation of spatiotemporally regulated human neutrophil elastase modulates its immune functions. Mol Cell Proteom. 16 (8), 1507-1527 (2017).
  68. Loke, I., Packer, N. H., Thaysen-Andersen, M. Complementary LC-MS/MS-based N-glycan, N-glycopeptide, and intact N-glycoprotein profiling reveals unconventional ASN71-glycosylation of human neutrophil cathepsin g. Biomolecules. 5 (3), 1832-1854 (2015).
  69. Tjondro, H. C., et al. Hyper-truncated Asn355- and Asn391-glycans modulate the activity of neutrophil granule myeloperoxidase. J Biol Chem. 296, 100144(2021).
  70. Kawahara, R., et al. Glycoproteome remodeling and organelle-specific N-glycosylation accompany neutrophil granulopoiesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 120 (36), e2303867120(2023).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

izedLC MS MS

מאמרים קשורים