פרוטוקול זה מפרט את שיטת הגליקופרוטאומיקה מונחית הגליקומיקה, טכנולוגיית אומיקס משולבת המציעה תובנות מקיפות על הגליקופרוטאום ההטרוגני במיקרו-סביבות גידוליות מורכבות הדרושות להבנה טובה יותר של הגליקוביולוגיה של סרטן.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
גליקופרוטאומיקה מונחית גליקומיקס מאפשרת יצירת פרופיל מקיפה של הגליקופרוטאום במיקרו-סביבות גידוליות מורכבות
במאמר זה
סיכום
תקציר
גליקוזילציה היא שינוי חלבוני נפוץ ומגוון מבחינה מבנית המשפיע על מגוון רחב של תהליכים גידוליים. גליקומיקה וגליקופרוטאומיקה מונחות ספקטרומטריית מסה התפתחו כגישות רבות עוצמה לניתוח גליקנים משוחררים וגליקופפטידים שלמים, בהתאמה, ומציעות הבנה עמוקה יותר של הגליקופרוטאום ההטרוגני במיקרו-סביבה של הגידול (TME). פרוטוקול זה מפרט את שיטת הגליקופרוטאומיקה מונחית הגליקומיקה, טכנולוגיית אומיקס משולבת, המשתמשת תחילה בגליקומיקה מבוססת פחמן נקבובי LC-MS/MS כדי להבהיר את מבני הגליקן ואת התפלגות כמותית שלהם בגליקום של רקמות גידול, אוכלוסיות תאים או נוזלי גוף הנחקרים. זה מאפשר ניתוח גליקומי השוואתי כדי לזהות גליקוזילציה שונה על פני קבוצות חולים, שלבי מחלה, או תנאים, וחשוב מכך, משמש כדי לשפר את ניתוח גליקופרוטאומיקה במורד הזרם של אותן דגימות (ים) על ידי יצירת ספרייה של מבנים גליקניים ידועים, ובכך להפחית את זמן חיפוש הנתונים ואת שיעור זיהוי שגוי של גליקופרוטאין. תוך התמקדות בפרופיל N-glycoproteome, שלבי הכנת הדגימה לשיטת הגליקופרוטאומיקה מונחית הגליקומיקה מפורטים בפרוטוקול זה, ונדונים היבטים מרכזיים של איסוף הנתונים וניתוחם. שיטת הגליקופרוטאומיקה מונחית הגליקומיקס מספקת מידע כמותי על הגליקופרוטאינים הנמצאים ב-TME ואתרי הגליקוזילציה שלהם, תפוסת האתר ומבני גליקן ספציפיים לאתר. תוצאות מייצגות מוצגות מרקמות גידול משובצות פרפין קבועות פורמלין מחולי סרטן המעי הגס, המוכיחות כי השיטה רגישה ותואמת לקטעי רקמה הנפוצים בביובנקים. לכן, גליקופרוטאומיקה מונחית גליקומיקס מציעה מבט מקיף על ההטרוגניות והדינמיקה של הגליקופרוטאום ב-TMEs מורכבים, ומייצרת נתונים ביוכימיים חזקים הדרושים להבנה טובה יותר של הגליקוביולוגיה של סרטן.
מבוא
גליקוזילציה של חלבונים היא סוג נפוץ ומורכב של שינוי משותף ולאחר תרגום של חלבונים המיוצרים על ידי מינים ברחבי עץ החיים הפילוגנטי 1,2,3. הגליקנים הקשורים לחלבון ידועים כמשפיעים על מגוון רחב של תהליכים ביולוגיים החשובים לבריאות האדם, כולל תיווך וויסות של אינטראקציות תאיות ואירועי תקשורת 4,5. גליקוזילציה של חלבון חריג נחשבה כגורם לשינוי ממאיר, התקדמות הגידול והתפשטות 6,7,8. זה מסבך גליקנים בתהליכים גידוליים מרכזיים במיקרו-סביבה ש....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
המחקר אושר על ידי ועדת האתיקה של המחקר האנושי (מדעי הרפואה) באוניברסיטת מקווארי, סידני, אוסטרליה (פרוטוקול 5201800073).
הערה: ניתן ליישם את שיטת הגליקופרוטאומיקה מונחית הגליקומיקה על קבוצה מגוונת של דגימות ביולוגיות החל ממורכבות גליקופרוטאינים נמוכה ועד קיצונית. בגישות גליקופרוטאומיקה נטולות תוויות (שבהן לא מתבצע איגום דגימות), נדרש כ-100-200 מיקרוגרם חלבון כולל מתערובות מורכבות כחומר מוצא כדי להבטיח כיסוי גליקופרוטאום גבוה לאחר העשרה לגליקופפטידים שעשויים להוות רק 1%-10% מאוכלוסיית הפפטידים. בשל אילוצי מקום, מיצוי החלבון הראשוני מתאים או רקמות נותר בחוץ, והקוראים מופנים למשאבים אחרים15
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
תוצאות מייצגות של שיטת הגליקופרוטאומיקה מונחית הגליקומיקס המיושמת על שקופית רקמת FFPE ממטופל הסובל מ- CRC בשלב II מובאות בסעיף זה.
כדי להשיג מספיק חומר מוצא חלבוני לפרוטוקול, תמציות חלבון משתי שקופיות (ערימות z) שולבו מאותו בלוק רקמת FFPE בעקבות פרוטוקול שפורסם ויושמה גישת תיוג TMT כדי להגביר את הרגישות של ניסוי הגליקופרוטאומיקה (ראה שלבים אופציונליים להלן)42.
ראשית, ניתוח של נתוני N-גליקומיקה מבוססי PGC-LC-MS/MS של רקמות FFPE CRC זיהה בסך הכ.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
שלבים קריטיים בפרוטוקול
במאמר פרוטוקול זה, תיארנו שלב אחר שלב את שיטת הגליקופרוטאומיקה מונחית הגליקומיקה, המספקת מבט מקיף על ההטרוגניות והדינמיקה של הגליקופרוטאום ב- TME המורכב.
שלב קריטי בפרוטוקול הוא להבטיח פרוטאוליזה מלאה מבלי לעכל יתר על המידה את תערובת החלבונים. פיצולים לא ספציפיים של חלבונים מגדילים מטבעם את מרחב החיפוש של הפפטידים, מה שמוביל לזמני חיפוש ארוכים יותר ולשיעור זיהוי שגוי גבוה יותר של גליקופפטידים50
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים כי אין ניגוד עניינים.
תודות
THC נתמך על ידי מלגת תוכנית הכשרה בינלאומית למחקר במימון ממשלת אוסטרליה. NB נתמכת על ידי International Macquarie University Research Excellence Scholarships במימון אוניברסיטת מקווארי. AC נתמך על ידי מלגת תוכנית הכשרה מחקר במימון ממשלת אוסטרליה. RK נתמך על ידי מכון הסרטן של ניו סאות 'ויילס (ECF181259). MTA זכתה במלגת העתיד של מועצת המחקר האוסטרלית (FT210100455).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| <חזק>כימיקלים | |||
| אמוניום אצטט | Sigma Aldrich | A1542 | חלופות זמינות |
| אמוניום ביקרבונט, טוהר ≥ 99.0% | Sigma Aldrich | A6141 | חלופות זמינות |
| אצטוניטריל נטול מים (ACN), LC-MS | דרגת Sigma Aldrich | 34851 | חלופות זמינות |
| Sigma Aldrich | F3004 | חלופות זמינות | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich | D0632 | חלופות זמינות |
| אתנול | Sigma Aldrich | E7023 | חלופות זמינות |
| חומצה פורמית, דרגת LC-MS | Sigma Aldrich | 00940 | חלופות זמינות |
| חומצה אצטית קרחונית | Sigma Aldrich | A6283 | חלופות זמינות |
| יודואצטמיד (IAA) | Sigma Aldrich | I1149 | חלופות זמינות |
| מתנול | Sigma Aldrich | M1775 | חלופות זמינות |
| פפטיד-N-גליקוזידאז F (PNGase F) | Promega | V4831 | Elizabethkingia miricola PNGase F (10 U/μ L) מתבטא רקומביננטית ב-Escherichia coli |
| פוליוויניל פירולידון 40 (PVP) | סיגמא אולדריץ' | PVP40 | חלופות זמינות |
| אשלגן הידרוקסיד (KOH) | סיגמא אולדריץ | 484016 | חלופות זמינות |
| טריפסין חזירי בדרגת ריצוף | Promega | V5113 | חלופות זמינות |
| נתרן בורוהידריד (NaBH4) | Sigma Aldrich | 213462 | חלופות זמינות |
| טריאתילאמוניום ביקרבונט (TEAB), | חלופות | Sigma Aldrich | T7408 |
| חומצה טריפלואורואצטית (TFA), | חלופות | ||
| זמינות Sigma Aldrich T6508 בדרגת LC-MS<חזקים>כלים/חומרים | |||
| C18 דיסקים | Empore | 66883-U | |
| C8 דיסקים | Empore | 66882-U | |
| פלטת פוליפרופילן שטוחה 96 בארות | קורנינג | 3364 | |
| אימובילון-PSQ פוליווינילידן דיפלואוריד (PVDF) ממברנה | Millipore | IPVH20200 | גודל נקבוביות: 0.45 μ מ |
| מיקרוצנטריפוגה | Eppendorf | 5452000069 | חלופות זמינות |
| מתאמי מיקרוצנטריפוגה | The Nest Group, Inc., MA | SS18V | MiniSpin צווארון עמודים, מגיע עם עמודי Microspin |
| שרף Oligo R3 | תרמו | 1133903 גודל חלקיקים 30 μ m | |
| Parafilm | Parafilm M | PM996 | |
| חלבון LoBind צינורות 1.5 מ"ל | Eppendorf | 0030108450 | |
| חלבון LoBind צינורות 2.0 מ"ל | Eppendorf | 0030108442 | |
| צינורות נעילה בטוחה 1.5 מ"ל | Eppendorf | 0030120086 | |
| צינורות נעילה בטוחה 2.0 מ"ל | Eppendorf | 0030120094 | |
| שייקר | Eppendorf | 5382000066 | חלופות זמינות |
| מנקב חור יחיד | Swingline | 74005 | |
| רכז SpeedVac | מרטין קרייסט | RVC 2-25 CDplus | חלופות זמינות |
| Supelclean שרף ENVI-Carb SPE | Supelco | 57088 | גודל חלקיקים 120-400 רשת. ניתן להפיק שרף באופן ידני ממחסניות, וניתן לאחסן אותו לטווח ארוך ב-50% (v/v) מתנול במזרק מים MilliQ |
| 5 מ"ל | Sigma Aldrich | Z116866 | חלופות זמינות |
| חממה מבוקרת טמפרטורה | Thermoline | E7.30 | חלופות זמינות |
| אמבט אולטרסאונד | Unisonics | FXP | חלופות זמינות |
| שרף ZIC-HILIC | Merck | 150455 | גודל חלקיקים/נקבוביות, 5 μ m/200 Å. ניתן לחלץ שרף באופן ידני מעמודת LC, וניתן לאחסן אותו לטווח ארוך ב-50% (v/v) מתנול |
| במיקרו-עמודות מיצוי שלב מוצק (SPE) של מים MilliQ | Millipore | ZTC18S096 | לחלופין, מיקרו-עמודות C18-SPE תוצרת בית יכולות להחליף מוצר מסחרי |
| <חזק>LC-MS/MS ניתוח | |||
| 1260 מערכת HPLC נימית אינפיניטית | חלופות | Agilent | |
| עמודת LC אנליטית ארוזה מראש עם שרף ReproSil-Pur C18 AQ | Dr Maisch, Ammerbuch-Entringen, גרמניה | r13.aq.s2570 | גודל חלקיקים/נקבוביות: 3 μ m/120 Å, אורך/קוטר פנימי: 25 ס"מ/75 μm. ניתן להשיג גם עמודות ננו-LC מסחריות C18/ |
| מערכת Dionex UltiMate 3000 RSLCnano LC | חלופות | תרמו | |
| עמודת LC נימית HyperCarb KAPPA PGC | תרמו | הופסק | גודל חלקיקים/נקבוביות, 3 μ m/250 Å; אורך עמוד, 30 מ"מ; קוטר פנימי, 0.180 מ"מ. גיאומטריות גדולות יותר של עמודות HyperCarb PGC-LC, המפיקות נתונים באיכות דומה זמינות מסחרית (למשל, Thermo #35003-031030). עמודת SupelTMCarb LC מבית Merck עם גודל חלקיק/נקבוביות, 2.7 μ m/200 ועם אורכי עמודות וקוטר פנימי שונים זמינים גם כן (למשל, Merck #59994-U). |
| אצטוניטריל | LiChrosolv 100029 | חלופות זמינות | |
| מלכודת ליניארית מרובעת (LTQ) ספקטרומטר מסה של מלכודת יונים Velos Pro (גליקומיקה) | חלופות | תרמו | |
| Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer (glycoproteomics) | Thermo | מערכות MS אחרות ברזולוציה גבוהה עם או בלי ETD (נדרש רק עבור O-glycoproteomics) זמינות גם כן (למשל, Q-Exactive HF-X Hybrid Quadrupole-Orbitrap, Thermo, TIMS-ToF-MS, Bruker או ספקטרומטרי מסה דומים בעלי ביצועים גבוהים מספקים אחרים) | |
| בקבוקוני בורג זכוכית שקופה Total Recovery 0.9 מ"ל | חלופות Thermo | THC11093563 | זמינות |
| התאוששות מוחלטת בקבוקוני בורג זכוכית שקופים כובעים תואמים | Thermo | THC09150869 | חלופות זמינות |
| LC מלכודת ארוז בבית עם שרף ReproSil-Pur C18 AQ | Dr Maisch, Ammerbuch-Entringen, גרמניה | r15.aq.s0202 | גודל חלקיקים/נקבוביות: 5 μ m/120 Å, אורך/קוטר פנימי: 2 ס"מ/100 μm. עמודי LC מסחריים C18 מלכודת זמינים גם כן. |
| Software | |||
| Byonic | Protein Metrics Inc | v2.6.46 ומעלה | מנוע חיפוש מסחרי של גליקופפטיד ו-PTM, המקבל נתונים גולמיים של LC-MS/MS מרוב ספקי MS |
| Byos | Protein Metrics Inc | v3.9-7 ומעלה | תוכנה מסחרית לבדיקה ידנית של מועמדים לגליקופפטיד והערות אוטומטיות של ספקטרום MS/MS גליקן |
| GlycoMod | Expasy | , המסייעת בביאור נתוני גליקומיקה (https://web.expasy.org/glycomod/) | |
| GlycoWorkBench | EUROCarbDB | v2.1 | תוכנת גישה פתוחה, מסייעת בביאור נתוני גליקומיקה וציור קריקטורות גליקן |
| RawMeat | VAST Scientific | v2.1 | תוכנת גישה פתוחה, חילוץ m/z של יוני מבשר גליקן מנתונים ספקטרליים גולמיים |
| Skyline | Brendan X. MacLean | v21.2 ומעלה | תוכנת גישה פתוחה לכימות יחסי של גליקנים |
| Xcalibur | Thermo | v2.2 ומעלה | לעיון בנתוני LC-MS/MS גולמיים |
מקורות
- Gagneux, P., Panin, V., Hennet, T., Aebi, M., Varki, A. Essentials of glycobiology. , Cold Spring Harbor. NY. 265-278 (2022).
- Tjondro, H. C., Loke, I., Chatterjee, S., Thaysen-Andersen, M. Human protein paucimannosylation: Cues from the eukaryotic kingdoms. Biol Rev Camb Philos Soc. 94 (6), 2068-2100 (2019).....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
