הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

בדיקה כמותית מבוססת PCR למדידת איתות קיפוד קולי במודל תאי של Ciliogenesis

1.3K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/67407

⸱

31 בינואר 2025

 , 
1CellBio Lab, Institute of Health Sciences, Presidency University

במאמר זה

סיכום

המחקר מדגים בדיקה כמותית מבוססת PCR להפעלת מסלול איתות של קיפוד קולי (SHH) בתיווך ריסים ראשוניים באמצעות אגוניסט SHH במודל תאי של ריסים.

תקציר

סיליופתיה מתייחסת לאוסף של מחלות והפרעות אנושיות רב-מערכתיות ופוליגניות המתעוררות עקב סטייה במבנה או בתפקוד של ריסים נעים או לא נעים (ראשוניים) שהם בליטות תאים מבוססות מיקרו-צינוריות. ריסים ראשוניים (PC) נמצאים ברוב רקמות האפיתל והאנדותל האנושיות ומשמשים כמרכז להעברת אותות פיזיולוגיים, כולל איתות קיפוד קולי (SHH). מצבים שונים דורשים בחינת תפקודו של PC, שניתן להשיג על ידי מדידת מסלול איתות SHH הקנוני המתווך כמעט אך ורק על ידי PC. כאן, פותחה טכניקה מבוססת PCR כמותית (qPCR) למדידת רמת השעתוק של גנים במסלול SHH בתאי hTERT-RPE1 (או RPE1) שקטים המכילים בעיקר PC. שקט בתאי RPE1 מושג על ידי רעב בסרום למשך 48 שעות, בעוד שהפעלת מסלול ה-SHH מקודמת על ידי אגוניסט ספציפי. בדיקה זו המבוססת על תרבית תאים קלה למעקב ורגישה. הדגמה מוצלחת של בדיקה זו בתאי RPE1 ריסניים מצביעה על הפוטנציאל העצום שלה כבדיקה חוץ גופית לבחינת התפקוד התקין של PC על שינוי גנטי או אפיגנטי של גן אחד או יותר, שעשוי להיות קשור לריסים שונים.

מבוא

סיליום הוא בליטה מבוססת מיקרו-צינורות ועטופה קרום מפני התא, המורכבת על גוף בסיס1. אצל בעלי חוליות נצפים שני סוגים של ריסים, כלומר תנועתיים ולא תנועתיים. ריסים תנועתיים ממוקמים ברקמות מיוחדות ומעניקים תנועתיות. ריסים ראשוניים לא תנועתיים (PC) קיימים ברוב תאי החולייתנים, ומבצעים פונקציות חושיות ומעבירים אותות קריטיים מהסביבה החוץ-תאית לחלק הפנימי של התאים2. לאחר ההרכבה, התארכות הריסים נעזרת במכונות הובלה תוך-דגליות (IFT), שהיא מערכת הובלה דו-כיוונית הנושאת מטען המונע על ידי קינזינים (תנועה אנטרוגרדית) וחלבונים מוטוריים של dynein-II (תנועה לאחור)3,4. פגמים מבניים או תפקודיים בריסים תנועתיים או ראשוניים עלולים להוביל לשפע של מחלות אנושיות רב מערכתיות הידועות בשם ריסים 5,6.

PC משמש כמרכז לתהליכי איתות התפתחותיים שונים, כגון חסרי כנפיים (Wnt), קולטנים מצומדים לחלבון G (GPCR), קולטן-טירוזין קינאזות (RTKs), גורם גדילה טרנספורמטיבי β (TGFβ) וגורם גדילה נגזר טסיות דם (PDGF) איתות 7,8. ביונקים, איתות קיפוד קולי (SHH) הוא קריטי, אשר מומר כמעט אך ורק על ידי PC בתאים המכילים PC 9,10,11. מבנה או תפקוד חריגים של PC מובילים למסלולי איתות מוחלשים הקשורים למחלות כמו מומי לב מולדים, מחלת כליות פוליציסטית, הפרעות גולגולת, ניוון רשתית, וכמה מחלות נדירות כגון תסמונת ברדט-בידל (BBS), תסמונת ג'וברט (JBTS), תסמונת אלסטרום, דיספלזיה חנוקה של בית החזה (JATD)12,13,14,15. רוב אלה הן מחלות פוליגניות של רקמות אפיתל או אנדותל, מה שהופך את האתגרים באבחון מוקדם וטיפול במחלות אלו. קביעת האופן שבו מוטציות כאלה תורמות לאיתות מוחלש בתיווך PC במודל תרבית תאים עשויה לא רק לספק תובנה לגבי המורכבות המולקולרית של מסלול האיתות הזה, אלא גם להקל על האבחון של ריסים שונים ועשויה להציע התערבויות טיפוליות. עם רעיון זה, פותחה בדיקה מבוססת PCR כמותית (qPCR) כדי לקבוע שינוי במסלול איתות SHH בתיווך PC בתאי אפיתל פיגמנט רשתית אנושיים (hTERT) (hTERT-RPE1, המכונה כאן RPE1). תאי RPE1 הם תאים אנושיים כמעט דיפלואידים, שאינם מותמרים ונמצאים בשימוש נרחב כמודל תאי לריסים מכיוון שכ-75%-80% מהתאים הללו מרכיבים PC לאחר רעב בסרום (תאים מדגרים במדיום נטול סרום) למשך 24-48 שעות, בהשוואה ל-15%-18% ריס בלבד בתרבית גידול אסינכרוני של תאי RPE116.

איתות קיפוד (HH) נשמר בקרב בעלי חוליות להתפתחות עוברית17. ביונקים ניתן לראות שלושה סוגים שונים של איתות קיפוד: סוניק (SHH), הודי (IHH) ומדבר (DHH), מתוכם SHH ו-IHH מראים פונקציות חופפות ברמת הרקמה11. איתות SHH ממלא תפקידי מפתח במהלך ההתפתחות העוברית על ידי ויסות דפוס הגפיים ומפרט סוג התא במערכת העצבים ושמירה על הומאוסטזיס של רקמות בוגרות 10,11,18. למרות שאיתות SHH הוא מורכב, ישנן ראיות הולכות וגדלות המצביעות על כך שאיתות SHH קנוני מסתמך על PC 7,11,19, המתווך על ידי פונקציות קולקטיביות של גורמי שעתוק Gli (Gli1, Gli2 ו-Gli3). הוצע כי איתות HH ו-PC התפתחו יחד, כאשר רכיבי איתות קריטיים מרוכזים בנפח הקומפקטי בקצה הסיליום כדי לאפשר תגובות יעילות ליחסי ליגנד נמוכים11.

בהיעדר ליגנדים SHH, Patched1 (Ptch1), הממוקם על קרום ה-PC, מעכב את הפעילות של Smoothened (Smo) באמצעות מנגנון לא מובן היטב שככל הנראה כרוך בהובלת שומנים, ובכך שומר על המסלול מדוכא 7,20. ה-GPR161 הריסי הפעיל מבחינה מכוננת, שהוא קולטן חלבון מצומד G ומווסת שלילי של המערכת, מבטיח שהדיכוי נשמר על ידי שמירה על רמות גבוהות של AMP מחזורי ריסני (cAMP) המגביר את הפעילות של חלבון קינאז A (PKA)21, ועל ידי שמירה על לוקליזציה ריסנית של PKA7. פעילות PKA, יחד עם קזאין קינאז 1 (CK1) וגליקוגן סינתאז קינאז 3 β (GSK3β), מזרחן שאריות מרובות של חלבוני Gli, Gli2 ו-Gli3, בתוך PC. Gli2 ו-Gli3 יכולים לשמש גם כמפעילים וגם כמדכאים של שעתוק של גני מטרה. זרחון בתיווך PKA גורם לעיכוב של תפקוד המפעיל של Gli2, בעוד ש-Gli3 זרחני נחתך על ידי פרוטאזות כדי לייצר את צורת המדכא Gli3R22. בסך הכל, הביטוי של גני המטרה של SHH מדוכא בתנאים כאלה.

כאשר ליגנד SHH קיים, Ptch1 נקשר אליו, ו-GPR161 עוזב את PC, ו-Smo, בהיותו זרחן על ידי קולטן מצומד חלבון G (GPCR) קינאז 2 (GPRK2) ו-CK1, מועבר ל-PC, יחד עם β-arrestin ומנוע המיקרו-צינוריות KIF3A23. בתיאום, לוקליזציה של Gli2/3, מדכא התמזגות (SUFU) ו-Kif7 בקצה הריסי מקודמת וקשורה לירידה במחשוף Gli2/3, ובכך מגדילה את תפקוד המפעיל של Gli2/324,25. לאחר הפעלתו, Gli2/3 גורם לביטוי של Gli1, שיכול לתפקד רק כמפעיל, ובכך מגביר את התגובה של מסלול SHH22. הקישור של SHH ל-Ptch1 מקל על ידי הקשור ל-CAM/מווסת על ידי אונקוגנים (CDO), אחיו של CDO (BOC), ספציפי לעצירת גדילה 1 (GAS1), וחלבון 2 הקשור לקולטן ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה (LRP2). לעומת זאת, חלבון אינטראקציה עם קיפוד (HHIP) יכול לבודד SHH על ידי אינטראקציה ישירה איתו וגם מתחרה ב-Ptch1 מאינטראקציה עם SHH26. חשוב לציין, GLI1, HHIP ו-PTCH1 מתועתקים עם הפעלת מסלול SHH, בעוד שהשניים האחרונים משתתפים בוויסות השלילי של מסלול SHH.

מחקרים קודמים הראו כי ניתן למדוד את רמות התעתיק של גני המטרה של SHH כדי להעריך את מסלול ה-SHH, אם כי הוא עשוי להשתנות באופן משמעותי בסוגי תאים שונים27,28. ניתן לייחס שונות כזו בתגובת מסלול SHH לשילובים שונים של איתות SHH בתיווך PC ואיתות SHH המתווך על ידי קרום התא, ככל הנראה בהיעדר PC. SAG הוא אגוניסט Smo המשמש בשיטה זו כדי לחקות את הפעלת איתות SHH בתאי RPE1 רעבים לסרום שהם בעיקר ריסניים. רמות התעתיק של גני המטרה של SHH כגון HHIP, GLI1 ו-PTCH1 וגן שאינו מטרה SMO נמדדו באמצעות qPCR בתאי ביקורת ותאי ביקורת שטופלו ב-SAG והושוו כדי לקבוע את הפעלת מסלול ה-SHH. הדגמה מוצלחת של בדיקה רגישה מבוססת תרבית תאים זו למדידת איתות SHH בתיווך PC מרמזת על יישומה המבטיח במחקר ביו-רפואי הקשור לתפקוד ריסים ראשוניים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. תרבית תאים

  1. העברת בקבוק תרבית תאי T-25 כמעט מתלכד של תאי RPE1 בדילול של 1:5 של התרבית המקורית לתוך בקבוק תרבית תאי T-25 טרי המכיל 5 מ"ל של מדיום הנשר המותאם (DMEM) של Dulbecco בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS), תערובת פניצילין-סטרפטומיצין 1% (ריכוז סופי - 100 U/mL פניצילין G ו-100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין). מדיום זה מכונה המדיום השלם. לגדל תאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בנוכחות 5% CO2.
    הערה: תאי RPE1 הם תאים שאינם מותמרים המשמשים בדרך כלל לחקר הוויסות המולקולרי של הרכבה ופירוק של PC בתרבית תאים. כ-80% מתאי RPE1 מרכיבים את המחשב לאחר הרעבה בסרום, אשר מתפרק שוב עם הוספה מחדש של סרום16.
  2. הכן את כיסויי הזכוכית העגולים בגודל 12 מ"מ על ידי דגירה שלהם ב-50 מ"ל של 1 N HCl בכוס זכוכית מכוסה למשך הלילה מבלי לרעוד ב-60 מעלות צלזיוס באמבט מים או בחממה.
  3. למחרת, בעזרת פיפטה של 25 מ"ל, פיפטה החוצה את תמיסת החומצה והשליכו אותה כראוי למיכל סכנה כימית. לאחר מכן, שטפו את הכיסויים פי 3 ב-100 מ"ל מים מזוקקים על ידי דגירה למשך 15 דקות עם ניעור מדי פעם, ולאחר מכן פיפטינג החוצה.
  4. חזור על שלבי הכביסה עם 70% אתנול ו-95% אתנול. יבש את הכיסויים על ידי הנחתם בנפרד על נייר סופג מעבדה בארון בטיחות ביולוגית. לאחר הייבוש, יש לעקר בקרינת UV למשך 60 דקות.

2. צמיחת תאים, רעב בסרום וטיפול ב-SAG

  1. השעו מחדש את התאים בבקבוק T-25 בתווך שלם שחומם מראש לאחר עקירת התאים על ידי הפעילות האנזימטית של תמיסת טריפסין-EDTA 0.25% מחוממת מראש. קבע את צפיפות התאים של התרחיף על ידי ספירת תאים באמצעות המוציטומטר.
  2. הכינו שני כלי תרבית תאים בגודל 35 מ"מ והניחו בכל אחד מהם שני כיסויים סטריליים בגודל 12 מ"מ. מעבר 2 x 105 תאי RPE1 הגדלים באופן אסינכרוני בכל צלחת 35 מ"מ המכילה כיסויים ומגדלים את התאים ב-2 מ"ל של מדיום שלם למשך 24 שעות.
  3. לאחר 24 שעות, הסר את המדיום של תאי RPE1 הגדלים ושטוף את התאים 1x עם 1 מ"ל מחומם מראש של מאגר DPBS. הוסף 2 מ"ל של חומר DMEM מחומם מראש המכיל 1% פניצילין-סטרפטומיצין אך נטול FBS (מדיום נטול סרום) לכל מנה ודגר את התאים למשך 24 שעות ב-37 מעלות צלזיוס בנוכחות 5% CO2.
  4. לאחר 24 שעות, החלף את המדיום במדיום נטול הסרום המכיל SAG לריכוז סופי של 250 ננומטר או DMSO כממס הבקרה ודגר על התאים למשך 24 שעות נוספות. דיאגרמה מצוירת של פרוטוקול תרבית התאים מוצגת באיור 1A.

3. איסוף תאים

  1. העבירו את הכיסויים לצלחת של 24 בארות עם כיסוי אחד בכל באר. הוסף 0.5 מ"ל מתנול צונן לכל באר ודגר את הצלחת בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות כדי לתקן את התאים על החלקות הכיסוי. מיד לאחר מכן, שטפו את הכיסויים 3x עם 0.5 מ"ל של מאגר כביסה (1x PBS המכיל 0.5 מ"מ MgCl2 ו-0.05% Triton-X 100).
  2. השליכו את המדיה והוסיפו 0.5 מ"ל של מגיב טריזול ישירות לכל מנה. תן לזה להתפזר באופן שווה ולשמור למשך 5 דקות. פיפטה למעלה ולמטה כמה פעמים כדי ליצור תערובת הומוגנית ולאסוף אותה בצינורות מיקרו-צנטריפוגה נטולי נוקלאז של 1.5 מ"ל.

4. הכנת סך RNA ו- cDNA

  1. הוסף 0.1 מ"ל כלורופורם לכל צינור המכיל תאים שעברו ליזה ודגר למשך 2-3 דקות. צנטריפוגה כל דגימה למשך 15 דקות ב-12,000 x גרם ב-4 מעלות צלזיוס. העבירו את השלב המימי המכיל את ה-RNA לצינורות מיקרו-צנטריפוגות טריים.
  2. מוסיפים 0.25 מ"ל איזופרופנול לשלב המימי ודוגרים למשך 10 דקות. צנטריפוגה למשך 10 דקות ב-12,000 x גרם ב-4 מעלות צלזיוס. משקעי ה-RNA יוצרים כדור לבן דמוי ג'ל. בעזרת מיקרופיפטה, השליכו את הסופרנטנט.
  3. השעו מחדש את כדור ה-RNA ב-0.5 מ"ל של אתנול 75% מדולל טרי. מערבל את הדגימות בקצרה, ולאחר מכן צנטריפוגה למשך 5 דקות ב-7500 x גרם ב-4 מעלות צלזיוס. השליכו את הסופרנטנט בעזרת מיקרופיפטה.
  4. יבש את כדור ה-RNA באוויר למשך 10 דקות והשהה מחדש ב-25 מיקרוליטר של מים נטולי נוקלאז. קבע את ריכוז ה-RNA הכולל על ידי מדידת הספיגה ב-260 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר מיקרו-נפח.
  5. השתמש ב-1-3 מיקרוגרם של RNA כולל משתי הדגימות כדי להכין cDNA בהתאם להוראות היצרן לערכת סינתזה של cDNA. אחסן cDNA ב-20 מעלות צלזיוס.

5. PCR כמותי

  1. הגדר את תגובות ה-qPCR (במשולש, טבלה 1) באמצעות cDNA מדולל 1:5 מכל דגימה עם ערכות פריימר של GLI1, PTCH1, HHIP, SMO ו-β-ACTIN (כגן משק בית; טבלה 2) גנים עם תערובת מאסטר qPCR המכילה DNA פולימראז מתאים, dNTPs וחוצץ, בצלחת PCR מתאימה מרובת בארות ורגישה לפלואורסצנטיות.
  2. כסו את הצלחת בסילר מתאים, הניחו אותה במכשיר qPCR מתאים, והריצו תוכנית qPCR סטנדרטית עם 40 מחזורי הגברה ושלב ניתוח עקומת התכה בסוף התוכנית. תוכנית ה-qPCR המתוקננת של 40 מחזורים, כולל ניתוח עקומת התכה, מוצגת באופן סכמטי באיור 1B.
  3. לאחר השלמת תוכנית ה-qPCR, בדוק את עקומת ההיתוך של כל אמפליקון עבור שיא בודד בטמפרטורה הרצויה.
    הערה: בתום מחזורי ההגברה, ניתוח עקומת ההיתוך הנלווה מודד את טמפרטורת ההיתוך של האמפליקון על ידי העלאת הטמפרטורה של כל באר מ-65 מעלות צלזיוס ל-95 מעלות צלזיוס, עם תוספת של 0.5 מעלות צלזיוס לכל שלב של משך של 5 שניות.
  4. ייצא את נתוני ההגברה לגיליון אלקטרוני וחשב את הביטוי היחסי (שיטת 2−ΔΔCT) של כל תעתיק על ידי נורמליזציה מול זה של הגן β-ACTIN עבור כל דגימה. שרטט את הגרף וחשב את המובהקות הסטטיסטית של השינויים בביטוי היחסי של כל תעתיק באמצעות מבחן T לא מזווג.

6. צביעה חיסונית ורכישת תמונה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי

  1. דגרו את התאים הקבועים על תלושי כיסוי ב-200 מיקרוליטר של מאגר חוסם (2% BSA ו-0.1% TritonX-100 ב-1x PBS) למשך 30 דקות.
  2. דגרו את התאים עם תערובת של נוגדנים ראשוניים (בדרך כלל נגד α-טובולין אצטיל של אקסונם PC ונוגדנים נגד ארנב כנגד קרום הריסים והצנטריול, בהתאמה) מדוללים במאגר חוסם (ראה טבלת חומרים לדילול סופי) למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס בתא לח.
    1. הכינו תא לח על ידי הנחת מגבת נייר רטובה במחצית התחתונה של קופסת קצה פיפטה ריקה בנפח 1 מ"ל. הנח רצועה של סרט שקוף על משטח המתלה ואתר טיפה (20-25 מיקרוליטר) של תמיסת הנוגדנים על הסרט, אחת לכל כיסוי. הניחו כיסוי על הטיפות כך שהתאים יהיו שקועים, וסגרו את מכסה קופסת הקצה.
  3. למחרת, הפוך שוב את הכיסויים והחזיר אותם לכלי 24 הבארות. שטפו את הכיסויים עם מאגר הכביסה ולאחר מכן דגרו אותם ב-150 מיקרוליטר של תערובת נוגדנים משנית עם דילול מתוקנן מראש של נוגדנים (כאן, אנטי עכבר מצומד בצבע ירוק-פלואורסצנטי ואנטי ארנב מצומד בצבע אדום-פלואורסצנטי מדולל במאגר חוסם) וריאגנטים לצביעה של DNA גרעיני למשך שעה בטמפרטורת החדר. שטפו את הכיסויים פי 3.
  4. אתר טיפה (בערך 3-5 מיקרוליטר) של תמיסת ההרכבה המכילה מגיב אנטי-דהייה על שקופית מיקרוסקופ זכוכית. הנח כיסוי, כשצד התא פונה כלפי מטה, על תמיסת ההרכבה. נגב עודפי נוזלים על ידי לחיצה עדינה על מגבון נקי. מרחו לק שקוף לאורך קצה הכיסוי כדי לאטום אותו על השקופית.
  5. שים שקופית על המיקרוסקופ (ראה טבלת חומרים) המחוברת עם במה ממונעת ומצלמה המסוגלת להדמיה דיגיטלית. השתמש ביעד טבילה של שמן 60x Plan Apo (עם צמצם מספרי של 1.4) כדי לרכוש את התמונות של תאי RPE1 רעבים לסרום בטמפרטורת הסביבה, כדי לדמיין PC בתאים, כפי שמסומן על ידי הנוגדנים שהוזכרו.
  6. רכוש תמונות של הדגימות השונות על כיסויים נפרדים תוך שימוש בזמן חשיפה זהה עבור פלואורופורים שונים לאורך ציר ה-Z באמצעות חבילת תוכנת הדמיית מיקרוסקופיה דיגיטלית. ספרו את מספר התאים המכילים PC מ-500 תאים לפחות כדי לקבוע את אחוז הריסון במצב של 48 שעות רעב לסרום.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

הפעלת מסלול העברת אותות SHH בתיווך PC היא דרך להבין את התפקוד התקין של PC7. כאן, הביטוי היחסי של גני המטרה של מסלול SHH נמדד באמצעות בדיקת RT-qPCR עם הפעלה מתווכת SAG של מסלול SHH בתאי RPE1 שרובם ריסניים. תפוקות השעתוק הישירות של מסלול SHH GLI1 ו-PTCH1 משמשות לעתים קרובות כדי לאמוד את הפעילות של מסלול זה11. פרוטוקול זה כולל גם את תעתיק HHIP, המווסת על ידי מסלול SHH. מכיוון ש-SMO אינו מטרה ישירה של מסלול SHH, רמת התעתיק של SMO לא אמורה להשתנות עם הפעלת מסלול SHH ולכן משמשת כ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

בחינת הפונקציונליות של PC היא צעד מכריע להבנת הדינמיקה של ריס ומחלות או הפרעות הקשורות לתפקוד לקוי של PC. מלבד בחינת ריסים על ידי צביעה חיסונית עבור סמנים ריסניים או רכיבים מבניים ריסניים מתויגים פלואורופור, תפקודו של PC נקבע בדרך כלל על ידי בדיקת הפעלת מסלול SHH הקנוני על ידי מדידת הטרנסלוקציה הרירית של Smo ברקמות ובתאים באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית27,31. הבדיקה המבוססת על RT-qPCR המתוארת כאן מזהה שינויים באיתות SHH בתיווך P...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

תודות

עבודה זו נתמכת על ידי מלגת Ramalingaswami ל-SM על ידי המחלקה לביוטכנולוגיה (DBT), ממשלת הודו, ומענק מחקר ממועצת המחקר המדעי וההנדסי (SERB), ממשלת הודו ל-SM (CRG/2020/004042). מלגת PH ממומנת על ידי ועדת המענקים האוניברסיטאית (UGC), ממשלת הודו. המחברים מודים מקרב לב לד"ר צ'נדרמה מוקהרג'י ולמר אביק מוקהרג'י ממעבדת RNABio של המכון למדעי הבריאות, אוניברסיטת הנשיאות על הגישה למכשיר ה-qPCR וההכשרה במכשיר בהתאמה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
סיגמאD2650מסונן סטרילי
, IgG נגד עכבר (H+L) Alexa Fluor 488ThermoFisher ScientificA21202
חמור, IgG נגד ארנב (H+L) Alexa Fluor 568ThermoFisher ScientificA10042
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Gibco, ThermoFisher Scientific41965039
תמיסת מלח חוצצת פוספט של Dulbecco (DPBS)Gibco, ThermoFisher Scientific14190144
סרום בקר עוברי (FBS)HimediaRM1112
מיקרוסקופ פלואורסצנטי מצויד ב-60Xאובייקטיבי Carl Zeiss Axio observer colibri 5
תאי hTERT-RPE1ATCCCRL-4000
iScript cDNA ערכת סינתזהBio-Rad Laboratories1708891
עכבר, נוגדן טובולין חד שבטי נגד אצטילציהMilipore Sigma-AldrichT7451דילול סופי 1:1000
פניצילין-סטרפטומיצין, 100XGibco, ThermoFisher Scientific15140122
מכונת PCR Quantitaive, CFX 96Bio-Rad Laboratories
Rabbit, נוגדן Arl13B פוליקלונליProteinTech17711-1-APדילול סופי 1:250
ארנב, נוגדן Cep135 רב-שבטיProteinTech24428-1-APדילול סופי 1:500
SlowFade זהב נוגדןThermoFisher ScientificS36940
מוחלק אגוניסט (SAG) AbmoleM4865פתרון מלאי: ב-DMSO, 5 מ"מ
SsoAdvanced אוניברסלי SYBR Green SupermixBio-Rad Laboratories
ReagentInvitrogen
Gibco, ThermoFisher Scientific12605028
DMSO, חמור 1725271-TRIzol 15596026-TrypLE

מקורות

  1. Nigg, E. A., Raff, J. W. Centrioles, centrosomes, and cilia in health and disease. Cell. 139 (4), 663-678 (2009).
  2. Halder, P., Khatun, S., Majumder, S. Freeing the brake: Proliferation needs primary cilium to disassemble. J Biosci. 45, 117(2020).
  3. Eguether, T., Cordelieres, F. P., Pazour, G. J. Intraflagellar transport is deeply integrated in hedgehog signaling. Mol Biol Cell. 29 (10), 1178-1189 (2018).
  4. Ishikawa, H., Marshall, W. F. Intraflagellar transport and ciliary dynamics. Cold Spring Harb Perspect Biol. 9 (3), a021998(2017).
  5. Hildebrandt, F., Benzing, T., Katsanis, N. Ciliopathies. N Engl J Med. 364 (16), 1533-1543 (2011).
  6. Reiter, J. F., Leroux, M. R. Genes and molecular pathways underpinning ciliopathies. Nat Rev Mol Cell Biol. 18 (9), 533-547 (2017).
  7. Hilgendorf, K. I., Myers, B. R., Reiter, J. F. Emerging mechanistic understanding of cilia function in cellular signalling. Nat Rev Mol Cell Biol. 25 (7), 555-573 (2024).
  8. Bansal, R., et al. Hedgehog pathway activation alters ciliary signaling in primary hypothalamic cultures. Front Cell Neurosci. 13, 266(2019).
  9. Gigante, E. D., Caspary, T. Signaling in the primary cilium through the lens of the hedgehog pathway. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 9 (6), e377(2020).
  10. Anvarian, Z., Mykytyn, K., Mukhopadhyay, S., Pedersen, L. B., Christensen, S. T. Cellular signalling by primary cilia in development, organ function and disease. Nat Rev Nephrol. 15 (4), 199-219 (2019).
  11. Bangs, F., Anderson, K. V. Primary cilia and mammalian hedgehog signaling. Cold Spring Harb Perspect Biol. 9 (5), a028175(2017).
  12. Brown, J. M., Witman, G. B. Cilia and diseases. Bioscience. 64 (12), 1126-1137 (2014).
  13. Hanaki, K., et al. Alstrom syndrome: A review focusing on its diverse clinical manifestations and their etiology as a ciliopathy. Yonago Acta Med. 67 (2), 93-99 (2024).
  14. Merrill, A. E., et al. Ciliary abnormalities due to defects in the retrograde transport protein dync2h1 in short-rib polydactyly syndrome. Am J Hum Genet. 84 (4), 542-549 (2009).
  15. Dagoneau, N., et al. Dync2h1 mutations cause asphyxiating thoracic dystrophy and short rib-polydactyly syndrome, type iii. Am J Hum Genet. 84 (5), 706-711 (2009).
  16. Majumder, S., Fisk, H. A. Vdac3 and mps1 negatively regulate ciliogenesis. Cell Cycle. 12 (5), 849-858 (2013).
  17. Briscoe, J., Therond, P. P. The mechanisms of hedgehog signalling and its roles in development and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (7), 416-429 (2013).
  18. Placzek, M., Briscoe, J. Sonic hedgehog in vertebrate neural tube development. Int J Dev Biol. 62 (1-2-3), 225-234 (2018).
  19. Wong, S. Y., et al. Primary cilia can both mediate and suppress hedgehog pathway-dependent tumorigenesis. Nat Med. 15 (9), 1055-1061 (2009).
  20. Deshpande, I., et al. Smoothened stimulation by membrane sterols drives hedgehog pathway activity. Nature. 571 (7764), 284-288 (2019).
  21. Mukhopadhyay, S., et al. The ciliary g-protein-coupled receptor gpr161 negatively regulates the sonic hedgehog pathway via camp signaling. Cell. 152 (1-2), 210-223 (2013).
  22. Niewiadomski, P., et al. Gli protein activity is controlled by multisite phosphorylation in vertebrate hedgehog signaling. Cell Rep. 6 (1), 168-181 (2014).
  23. Kovacs, J. J., et al. Beta-arrestin-mediated localization of smoothened to the primary cilium. Science. 320 (5884), 1777-1781 (2008).
  24. He, M., et al. The kinesin-4 protein kif7 regulates mammalian hedgehog signalling by organizing the cilium tip compartment. Nat Cell Biol. 16 (7), 663-672 (2014).
  25. Wen, X., et al. Kinetics of hedgehog-dependent full-length gli3 accumulation in primary cilia and subsequent degradation. Mol Cell Biol. 30 (8), 1910-1922 (2010).
  26. Griffiths, S. C., et al. Hedgehog-interacting protein is a multimodal antagonist of hedgehog signalling. Nat Commun. 12 (1), 7171(2021).
  27. Gomez, A. E., Christman, A. K., Van De Weghe, J. C., Finn, M., Doherty, D. Systematic analysis of cilia characteristics and hedgehog signaling in five immortal cell lines. PLoS One. 17 (12), e0266433(2022).
  28. Schmidt, S., et al. Primary cilia and shh signaling impairments in human and mouse models of parkinson's disease. Nat Commun. 13 (1), 4819(2022).
  29. Dutta, A., et al. Increase in primary cilia number and length upon vdac1 depletion contributes to attenuated proliferation of cancer cells. Exp Cell Res. 429 (2), 113671(2023).
  30. De, K., et al. Hyperphosphorylation of cdh1 in glioblastoma cancer stem cells attenuates apc/c(cdh1) activity and pharmacologic inhibition of apc/c(cdh1/cdc20) compromises viability. Mol Cancer Res. 17 (7), 1519-1530 (2019).
  31. Yang, S., Zheng, X. The immunofluorescence-based detection of hedgehog pathway components in primary cilia of cultured cells. Methods Mol Biol. 2374, 89-94 (2022).
  32. Wang, W., et al. The mir-669a-5p/g3bp/hdac6/akap12 axis regulates primary cilia length. Adv Sci (Weinh). 11 (6), e2305068(2024).
  33. Alanazi, A., et al. Identifying the roles of mir-17 in ciliogenesis and cell cycle. Front Cell Dev Biol. 12, 1397931(2024).
  34. Bustin, S. A., et al. The miqe guidelines: Minimum information for publication of quantitative real-time pcr experiments. Clin Chem. 55 (4), 611-622 (2009).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

Ciliogenesis AssayRPE1SmoothenedRNACiliopathy
בדיקה כמותית מבוססת PCR למדידת איתות קיפוד קולי במודל תאי של Ciliogenesis
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.