הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

ניסוח ננו-חומרים מבוססי אבץ באמצעות תמצית קליפת Eucommia ulmoides ופוטנציאל ריפוי הפצעים שלהם

1.1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/67416

⸱

27 בדצמבר 2024

 ,  ,  , 
1Biological Experiment Center, School of Life Sciences, Central South University, 2Department of Cell Biology, School of Life Sciences, Central South University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לסינתזה של ננו-חלקיקי תחמוצת האבץ (ZnO) באמצעות תמצית מימית עשירה בפוליאיזופרן המתקבלת מקליפת עץ Eucommia ulmoides . פוטנציאל ריפוי הפצעים המוצג על ידי ננו-חלקיקי ZnO המסונתזים על תאי אנדותל וריד טבורי אנושי (HUVECs) הוערך באמצעות בדיקת שריטות, שיטה פשוטה, חסכונית ויעילה.

תקציר

התמצית המימית מקליפת Eucommia ulmoides משמשת כמקור עשיר לתרכובות ביו-אקטיביות עם יתרונות בריאותיים רבים. הפרוטוקול כאן נועד לחקור את ההכנה של ננו-חלקיקי תחמוצת אבץ (ZnO) באמצעות תמצית מימית עשירה בפוליאיזופרן בתיווך קליפת עץ Eucommia ulmoides . בינתיים, הפרוטוקול המוצע קשור להכנת חומר לריפוי פצעים על ידי הקלת התהליך. בנוסף, פוטנציאל ריפוי הפצעים של הננו-חלקיקים המסונתזים (Eu-ZnO-NPs) הוערך באמצעות בדיקת שריטות פשוטה על חד-שכבת תאי אנדותל וריד טבורי אנושי (HUVEC). לאחר 24 שעות של טיפול ב-Eu-ZnO-NPs, הוערכה התפשטות התאים והנדידה של תאי HUVEC. בסוף המחקר נצפו התפשטות ונדידת תאים בשכבה חד-שכבתית שרוטה שטופלה בריכוזים שונים של Eu-ZnO-NPs, בעוד ששיעורי נדידה והתפשטות תאים גרועים נצפו בתאי ביקורת. מבין הריכוזים שנבחרו, 20 מיקרוגרם/מ"ל ננו-חומרים Eu-ZnO הראו נדידת תאים טובה יותר ופוטנציאל ריפוי פצעים משופר.

מבוא

צמחי מרפא ותרכובות שמקורן בצמחים הוכחו כבעלי יתרונות בריאותיים רבים1. ארגון הבריאות העולמי (WHO) דיווח כי 80% מאוכלוסיית העולם תלויה בצמחי מרפא מסורתיים לטיפול רפואי ראשוני. סין מוכרת ופופולרית בזכות שיטות הרפואה הסינית המסורתית שלה. צמחי מרפא סיניים דווחו כמטפלים במחלות שונות ומנוצלים לפוטנציאל הביולוגי שלהם. צמחי מרפא משמשים כמאגרים לתרכובות ביו-אקטיביות ותפקידים טיפוליים מרובים. צמחי מרפא שימשו גם לטיפול בפצעים. ישנם מספר סוגים של גישות המיושמות לטיפול בפצעים כרוניים2. חקירה שנערכה לאחרונה גילתה כי צמחי מרפא היו מעורבים בתהליך ריפוי הפצעים על ידי מתן תנאים נוחים לריפוי, ללא זיהומים, והידוק התחדשות רקמות3. בינתיים, התכונות האנטיבקטריאליות והאנטי פטרייתיות של תרכובות ביו-אקטיביות הקיימות בצמחי מרפא יכולות לסייע בריפוי פצעים ולהדק את יעילות ריפוי הפצעים4.

ננו-חומרים מבוססי מתכת זוכים לתשומת לב בשל תכונותיהם התואמות ביולוגית והמתכלות. Eucommia ulmoides, המכונה בדרך כלל עץ הגומי הסיני, הוא מין מקומי של סין. העלים והקליפה של העץ משמשים בשיטות רפואיות. והכי חשוב, מיני הצמחים טופחו במחוזות המרכזיים והמערביים של סין5. Peng et al.6דיווחו כי עלים, קליפות ופרחים אבקניים היו אכילים עם פוטנציאל טיפולי. בנוסף, E. ulmoides משמשים כמקור הטוב ביותר לליגננים, פנילפרופנואידים, אירידואידים, פלבנואידים, חומצות אמינו ויסודות קורט. יתר על כן, הקליפה שימשה ליישומים ביו-רפואיים שונים כגון שליטה בלחץ הדם, הורדת שומן וקידום אנטי-אוסטרופורוזיס ופעילות היפוגליקמית7. לפיכך, ללא ספק, הוכח כי לתמצית קליפת E . ulmoides יש היסטוריה ארוכה ברפואה הסינית המסורתית. דיווחים קודמים הציעו כי פולימר פוליאיזופרן טבעי עשיר בקליפות של Eucommia ulmoides8. בהתבסס על המידע לעיל, העבודה הנוכחית שואפת לייצר ננו-חומרים באמצעות תמציות קליפת Eucommia ulmoides . השילוב של אבץ עם תמצית קליפת עץ הוא בחירה אטרקטיבית להכנת ננו-חומרים. בסך הכל, המטרה הסופית של המחקר הנוכחי הייתה לייצר ננו-חומר היברידי חדש ליישומי ריפוי פצעים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הערה: לפני הכנת התמצית, חומר הקליפה שהתקבל נשטף פעמיים במים נטולי יונים ויובש במקום מוצל. הקליפות המיובשות בצל אוחסנו במיכל אטום.

1. הכנת תמצית קליפת עץ Eucommia ulmoides

  1. קוצצים את הקליפה שנאספה מעץ Eucommia ulmoides לחתיכות קטנות בעזרת מספריים.
  2. שוטפים את חומרי הקליפה הקצוצים פעמיים במים מזוקקים כפולים.
  3. יבש את חתיכות הקליפה מתחת ל-37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות בתנאים מוצלים.
    1. התאם את משך תהליך הייבוש על סמך כמות הקליפה המשמשת למחקר. ודא שהקליפות מיובשות לחלוטין לפני שחותכים את הקליפות לחתיכות קטנות. יש להימנע מאור שמש ישיר.
  4. מעבירים 20 גרם קליפות מיובשות בצל לבקבוק חרוטי המכיל 220 מ"ל מים מזוקקים כפולים סטריליים ומחממים ב-130 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
    1. צבע תמיסת התגובה משתנה לצהוב בהיר. השינויים בצבע התמיסה מתרחשים לאחר 10 דקות. הניחו לתמיסה להתחמם למשך 10 דקות נוספות. התאם את נפח המים המזוקקים הכפולים על סמך כמות הדגימה.
  5. אחסן את התמצית הגולמית המכילה פוליאיזופרן ב-4 מעלות צלזיוס לשימוש נוסף. היווצרות מבנה דמוי חוט מעידה על נוכחות של פוליאיזופרן בתמציות.

2. ביוסינתזה של ננו-חלקיקי ZnO בתיווך קליפה של E. ulmoides

  1. הוסף 1 M אבץ חנקתי דיהידראט Zn (NO3)2 עד 50 מ"ל מים נטולי יונים בבקבוק חרוטי של 500 מ"ל. מערבבים ללא הרף באמצעות ערבוב מגנטי (60 סל"ד). ל-Zn (NO3)2 לוקח 30 דקות להתמוסס לחלוטין.
  2. יש להוסיף 15 מ"ל של תמצית קליפת E . ulmoides טיפתית ל-20 מ"ל של תמיסת אבץ חנקתי דיהידרט (Zn (NO3)2) של 1 M.
  3. מניחים את תערובת התגובה המכוסה על מערבל מגנטי, מפעילים את המערבל וסובבים במהירות (60 סל"ד) למשך 3 שעות.
  4. הוסף תמיסת 1 N נתרן הידרוקסיד NaOH (3 מ"ל) טיפתית לתערובת התגובה כדי להתאים את ה-pH ל-9. מוסיפים NaOH עד שתערובת התמיסה הופכת לבנה חלבית וה-pH אינו עולה על 9. התמיסה הופכת לצבע לבן חלבי כאשר נוצרים ננו-חלקיקי ZnO.
    1. ההכנה של 1 M של נפח תמיסת אבץ חנקתי דיהידראט Zn (NO3)2 עשויה להשתנות בהתאם לצרכי הניסוי. הקפידו להשתמש בתמציות הקליפה הטריות שהוכנו. אם ה-pH עולה על 10, זה יגרום לצבירת ננו-חלקיקים.
  5. העבירו את ה-Eu-ZnO-NPs המסונתזים לצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל וצנטריפוגה ב-100 x גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
    הערה: ניתן להימנע מהזיהומים על ידי כביסה מיידית.
  6. אוספים את ה-Eu-ZnO-NPs השטופים בצלחת זכוכית ומייבשים אותם בטמפרטורה של 45-50 מעלות צלזיוס למשך שעה בתנור אוויר חם.
    הערה: אם ה-Eu-ZnO-NPs נשמרים יותר מ-30 דקות יכול להשפיע על האופי הפיזיקוכימי של הננו-חלקיקים

3. אישור גודל באמצעות TEM

  1. הכן 1 מ"ג/מ"ל של ננו-חלקיקים ב-DDH2O וטען 5 מיקרוליטר של דגימת Eu-ZnO-NP ברשת הנחושת והמתן עד שיתייבש לחלוטין. מערבולת הדגימה לפני הטעינה על רשת הנחושת.
  2. טען את רשת הנחושת המכילה Eu-ZnO-NPs על מחזיק הדגימה TEM ורכוש תמונות בהגדלות של פי 50 ו-100x.
    הערה: יש לאסוף רשתות באמצעות פינצטה במהלך שלב זה.

4. הערכת ציטוטוקסיות

  1. זרע 1 × 104 HUVECs בכל באר של צלחת 96 בארות והנח אותה בחממה של 5% CO2 37 מעלות צלזיוס.
  2. הוסף 10 מיקרוליטר בריכוזים שונים 0, 10, 20, 30, 40 ו-50 מיקרוגרם/מ"ל של Eu-ZnO-NPs לתאים המתכנסים של 90% ודגר אותו למשך 24 שעות.
  3. לאחר הדגירה, הסר את המדיום הישן מבלי להפריע לתאים, הוסף 10 מיקרוליטר של תמיסת CCK-8 לכל באר המכילה 90 מיקרוליטר של מדיום DMEM טרי, ודגירה בחממה של 5% CO2, 37 מעלות צלזיוס.
  4. למדוד את הספיגה של תאים שטופלו בתמיסת CCK8 ב-450 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר.
    הערה: הספיגה נמדדה מיד תוך 15 דקות כדי למנוע את השינויים בספיגה.

5. הכנת תאי HUVEC לבדיקת שריטות

  1. זרעו כמות מתאימה (1 × 105) של HUVECs ב-12 צלחות תרבית באר המכילות את מדיום הנשר המותאם של Dulbecco עם 10% סרום בקר עוברי (FBS) ו-1% עט סטרפטוקוקוס ודגרו אותו בחממה של 5% CO2 37 מעלות צלזיוס.
    1. לפני ביצוע בדיקת השריטה, בדוק את המפגש באמצעות המיקרוסקופ ההפוך.
      הערה: לביצוע בדיקת השריטה ישמשו 6 צלחות באר או 12 צלחות בהתאם לדרישות, וצפיפות התאים תשתנה עבור לוחות תרבית שונים. השימוש ב-70%-80% תאים קונפלואנטים הוא אידיאלי ומומלץ לבדיקת שריטות. נפח מדיום ה-DMEM עשוי להשתנות בהתאם ללוחות התרבות ששימשו במחקר. לדוגמה, 6 צלחות באר דורשות 1-1.5 מ"ל של מדיום תרבית, ו-12 צלחות באר דורשות 0.5-1.0 מ"ל של מדיום גידול.
  2. בצע שריטה בעדינות באמצעות קצה פיפטה סטרילי של 200 מיקרוליטר בפצע הייצוגי ברוחב פצע של 200 מיקרומטר.
  3. ודא שהקצה המשמש ליצירת שריטות בשכבת התא יוצר מגע עם פני התאים.
    הערה: בכל פעם שנוצרת שריטה, השתמש בקצה הסטרילי.
  4. הסר את המדיום השלם ושטוף את שכבת ה-HUVEC באמצעות 1 מ"ל של 1x PBS כדי להסיר את התאים המנותקים.
    הערה: ודא שהתאים החד-שכבתיים המנותקים מוסרים לחלוטין מהבארות המתאימות. ודא שלא נגרם נזק באזור שנוצר כתוצאה מהפצע.
  5. כדי להעריך את פוטנציאל ריפוי הפצעים של Eu-ZnO-NPs מסונתזים, הוסף ריכוזים של 0 (בקרה), 10 ו-20 מיקרוגרם/מ"ל של ננו-חלקיקי Eu-ZnO בשילוב עם מדיום שלם עם 10% FBS לבארות. שמור על לוחות הניסוי ב-37 מעלות צלזיוס בחממה של 5% CO2 .
    הערה: אל תפריע לשכבת התא החד-שכבתית תוך הוספת המדיום הטרי והשלם. ודא שהתאים החד-שכבתיים יישארו ללא הפרעה במהלך הדגירה.
  6. רכוש מיקרופוטו ב-0 שעות ו-24 שעות באמצעות מיקרוסקופ הפוך. השתמש בכלי ההערות כדי למדוד את סגירת הפצע במרווחי זמן שונים.
    1. חשב את אחוז סגירת הפצע באמצעות הנוסחה הבאה: סגירת פצע (%) = [(נדידת תאים (במיקרומטר) ב-0 שעות - נדידת תאים (במיקרומטר) ב-24 שעות)/ נדידת תאים (במיקרומטר) ב-0 שעות] x 100.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

המחקר הנוכחי נועד לסנתז ננו-חלקיקים באמצעות קליפות עץ Eucommia ulmoides . חומר הקליפה יובש לחלוטין בסביבה מוצלת (איור 1). חומרי הקליפה שימשו להכנת התמצית הגולמית המימית של המים החמים על ידי חימום הדגימות ב-130 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. שינוי קל בטמפרטורה ובמשך הזמן עלול לשבש את הפיטותרכובות ולהפוך אותן ללא מתאימות להכנת התמצית המימית. תמציות הקליפה הגולמית המימית של E. ulmoides הוכנו ושימשו לסינתזה של ננו-חלקיקים (איור 2). ניתן להשתמש בתמצית ה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מאמינים כי יש לקליפת ה-E. ulmoides, לזרעים ולעלים יתרונות בריאותיים רבים. התוצאות שלנו הראו כי הסינתזה של ננו-חלקיקי EU-ZnO הושגה באמצעות גישה פשוטה וחסכונית. התמצית המימית שימשה לסינתזה של הננו-חלקיקים. חימום חומר הקליפה בטמפרטורות גבוהות עלול לגרום לפירוק של חלק מהפיטו-מרכיבים ולהפחית את יעילות המיצוי. הפיטו-מרכיבים הקיימים בתמצית הצמחים המימית יכולים להפחית את יוני המתכת ליצירת ננו-חלקיקים. אבץ חנקתי דיהידרט משמש להכנת ננו-חלקיקי ZnO בשל תכונותיהם התואמות ביולוגית והיציבות בי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף

תודות

המחברים רוצים להודות מקרב לב למחלקה לביולוגיה של התא, אוניברסיטת סנטרל סאות', צ'אנגשה, סין, על אספקת מתקני המכשור.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
12 בארצלחת NEST703011משמש לתרבית תאים ובדיקה
צנטריפוגהSCILOGEXSC1406משמש להפרדת הננו-חלקיקים מהתערובת הקולואידית
צינור צנטריפוגה – 15 מ"לBIOFILCFT-312150לצנטריפוגה של התמיסה המסונתזת 
צינור צנטריפוגה – 5 מ"לBiosharp BS-50-CM-Sלאחסון הננו-חלקיקים
CO2 חממהThermo scientific3010לתרבית תאי HUVEC
מים DenoisedMilliporeלא ישים להכנת התמצית 
DMEM בינוניCytivaSH30243.01משמש לעבודת תרבית תאים
משפךתרמו מדעי42600060להחזיק את נייר הסינון במהלך הסינון
כוסות זכוכיתבורוסיליקט 1102-50משמש להכנת התמצית המימית
תנור אוויר חםג'נטיםלא ישים משמש לייבוש הננו-חלקיקים ואיסוף בצורת אבקה
בוחש מגנטיKYLIN-BELLGL-5250-Aמשמש לסינתזה של ננו-חלקיקים
מיקרוסקופNikon EclipseTs2משמש לצילום מיקרו-צילומים 
צלחת פטריNEST753001משמש לאיסוף הננו-חלקיקים 
פיפטה 1 מ"למדעי המעבדה YEA17AD0055580לקחת/הוספה של הנפח הספציפי של התמיסה/תמצית
קצות פיפטה 1 מ"לSAINING 3014200-Tכדי לקחת/להוסיף את הנפח הספציפי של תמיסה/תמצית
PTFE מיקסר מגנטי מוטות ערבובLANRAN לא ישים משמש לתהליך סינתזה של ננו-חומרים
נתרן הידרוקסידSigma Alrich71690משמש להתאמת pH במהלך הסינתזה
מעדנייתמספריים אל חלד6034משמש לקיצוץ חומרי הקליפה
בקבוק תרבית רקמות T25NEST707001משמש לשמירה על התאים 
איזון שקילה רדוואג AS220R2משמש לשקילת הכימיקלים 
נייר סינון Whatman מס '1NewstarGB / T1914-2017משמש לסינון התמצית לסינתזה
אבץ חנקתי סיגמא אלריך13778-30-8משמש כמבשר לננו-חלקיק' סינתזה

מקורות

  1. Williamson, E. M., Liu, X., Izzo, A. A. Trends in use, pharmacology, and clinical applications of emerging herbal nutraceuticals. Br. J. Pharmacol. 177 (6), 1227-1240 (2020).
  2. Cedillo-Cortezano, M., Martinez-Cuevas, L. R., López, J. A. M., Barrera López, I. L., Escutia-Perez, S., Petricevich, V. L. Use of medicinal plants in the process of wound healing: a literature review. Pharmaceuticals. 17 (3), 303(2024).
  3. Budovsky, A., Yarmolinsky, L., Ben-Shabat, S. Effect of medicinal plants on wound healing. Wound Repair Regen. 23 (2), 171-183 (2015).
  4. Yazarlu, O., et al. Perspective on the application of medicinal plants and natural products in wound healing: A mechanistic review. Pharmacol Res. 174, 105841(2021).
  5. Zhu, M. Q., Sun, R. C. Eucommia ulmoides Oliver: a potential feedstock for bioactive products. J Agric Food Chem. 66 (22), 5433-5438 (2018).
  6. Peng, M., Zhou, Y., Liu, B. Biological properties and potential application of extracts and compounds from different medicinal parts (bark, leaf, staminate flower, and seed) of Eucommia ulmoides: A review. Heliyon. 10 (6), e27870(2024).
  7. Xing, Y. Y., et al. Inhibition of rheumatoid arthritis using bark, leaf, and male flower extracts of Eucommia ulmoides. Evid Based Complement Alternat Med. 2020, 3260278(2020).
  8. Guo, M., et al. Quantitative detection of natural rubber content in Eucommia ulmoides by portable pyrolysis-membrane inlet mass spectrometry. Molecules. 28 (8), 3330(2023).
  9. Yusof, H. M., Rahman, N. A., Mohamad, R., Zaidan, U. H., Samsudin, A. A. Biosynthesis of zinc oxide nanoparticles by cell-biomass and supernatant of Lactobacillus plantarum TA4 and its antibacterial and biocompatibility properties. Sci Rep. 10, 19996(2020).
  10. Gosens, I., et al. Impact of agglomeration state of nano-and submicron sized gold particles on pulmonary inflammation. Part Fibre Toxicol. 7 (1), 37(2010).
  11. Zare, Y. Study of nanoparticles aggregation/agglomeration in polymer particulate nanocomposites by mechanical properties. Compos A Appl Sci Manuf. 84, 158-164 (2016).
  12. Kim, M. G., et al. Effects of calcination temperature on the phase composition, photocatalytic degradation, and virucidal activities of TiO2 nanoparticles. ACS Omega. 6 (16), 10668-10678 (2021).
  13. Aydin Acar, C., Gencer, M. A., Pehlivanoglu, S., Yesilot, S., Donmez, S. Green and eco-friendly biosynthesis of zinc oxide nanoparticles using Calendula officinalis flower extract: Wound healing potential and antioxidant activity. Int Wound J. 21 (1), e14413(2024).
  14. Sana, S. S., et al. Crotalaria verrucosa leaf extract mediated synthesis of zinc oxide nanoparticles: assessment of antimicrobial and anticancer activity. Molecules. 25 (21), 4896(2020).
  15. Zhang, H., Liang, Z., Zhang, J., Wang, W. P., Zhang, H., Lu, Q. Zinc oxide nanoparticle synthesized from Euphorbia fischeriana root inhibits the cancer cell growth through modulation of apoptotic signaling pathways in lung cancer cells. Arab J Chem. 13 (7), 6174-6183 (2020).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

ננו-חלקיקים של תחמוצת אבץתמצית Eucommia Ulmoidesסינתזה של ננו-חומריםמבחן שריטה (Scratch Assay)תאי אנדותליום אנושייםנדידת תאיםתמצית פוליאיזופרןהערכת ציטוטוקסיותערבוב מגנטי
ניסוח ננו-חומרים מבוססי אבץ באמצעות תמצית קליפת Eucommia ulmoides ופוטנציאל ריפוי הפצעים שלהם
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.