מאמר שיטה

הנדסת קולטן אנטיגן כימרי-תאי הרג טבעיים המכוונים לזיהומים פטרייתיים באמצעות מערכת טרנספוזון היפהפייה הנרדמת הלא ויראלית

DOI:

10.3791/67424

⸱

4 באוקטובר 2024

 ,  ,  ,  , 
1Medizinische Klinik und Poliklinik II und Lehrstuhl für Zelluläre Immuntherapie, Medizinische Klinik und Poliklinik II, Universitätsklinikum Würzburg, 2Fraunhofer-Institut für Zelltherapie und Immunologie IZI, Außenstelle Würzburg Zelluläre Immuntherapie

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מתארים פרוטוקול טרנספקציה לייצור תאי הרג טבעיים של קולטני אנטיגן כימריים (CAR-NK) המכוונים לפתוגנים פטרייתיים באמצעות מערכת הטרנספוזון הלא ויראלית של היפהפייה הנרדמת. כדי להעריך הפעלה ספציפית לאנטיגן, תרבית משותפת של התאים המהונדסים עם צינורות נבט אספרגילוס פומיגאטוס ומדדנו הפרשת IFN-γ.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טיפולים תאיים מבוססי קולטן אנטיגן כימרי (CAR) הראו יעילות מרשימה בטיפול בגידולים המטולוגיים. לאחרונה מפותחים טיפולים אלה למחלות זיהומיות, אך מחקרים המתמקדים בזיהומים פטרייתיים נותרו נדירים. כדי לזהות מטרות אופטימליות ולייעל מוצרים תאיים, פיתחנו שיטה להנדסת תאי הרג טבעי של קולטני אנטיגן כימריים (CAR-NK) והערכנו את תגובתם לגירוי על ידי פטריות. מאמר זה מתאר שיטה פשוטה וחזקה ליצירת תאי CAR-NK המותאמים למטרות פטרייתיות באמצעות מערכת הטרנספוזון הלא ויראלית של היפהפייה הנרדמת. תאי NK-92 עוברים טרנספקציה עם הטרנספוזאז ההיפראקטיבי SB100X וקטור כ-DNA מיני-מעגלי (MC) יחד עם טרנספוזון CAR מקודד פלסמיד. יעילות הטרנספקציה מוערכת שבוע לאחר מכן באמצעות ניתוח זרימה ציטומטרי. לפני הבדיקה התפקודית, התאים המבטאים את הטרנסגן מועשרים באמצעות מיון תאים המופעל על ידי מגנטית ועוברים תרבית למשך שבוע נוסף. כדי להעריך הפעלה ספציפית לאנטיגן, התאים המהונדסים עוברים תרבית משותפת עם צינורות נבט אספרגילוס פומיגאטוס למשך 6 שעות לפחות. לאחר מכן, ריכוז האינטרפרון-גמא המופרש (IFN-γ) נמדד באמצעות בדיקת אימונוסורבנט מקושר לאנזים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אספרגילוס פומיגאטוס (A. fumigatus) היא פטרייה נפוצה בכל מקום, כאשר האדם הממוצע שואף בין 100 ל-1,000 קונידיות על בסיס יומי1. בחולים עם חסר חיסוני נרכש או מולד, כגון אלה העוברים כימותרפיה או הסובלים מלוקמיה, A. fumigatus עלול לגרום לאפסרגילוזיס פולשני חמור. מדי שנה, יותר מ-200,000 אנשים ברחבי העולם נדבקים באספרגילוזיס. למרות השימוש בתרופות אנטי-מיקוטיות למניעה וטיפול בנגזרות אזול, שיעור התמותה נותר בין 30% ל-95%2,3. בנוסף, לטיפול תופעות לוואי משמעותיות, ו-7% מהתרביות של A. fumigatus כבר עמידות לאזול4.

טיפול בתאי T מהונדסים על ידי קולטני אנטיגן כימריים (CAR) הראה הצלחה קלינית בטיפול במחלות ממאירות והשיג תוצאות פרה-קליניות מבטיחות במאבק במחלות זיהומיות כגון אספרגילוזיס פולשני 5,6,7,8. תאי Af-CAR-T שתוארו בעבר המכוונים לחלבון בדופן התא של קורי A. fumigatus הראו תוצאות מבטיחות במודלים פרה-קליניים6.

הסיכון המופחת למחלת השתל נגד המארח, תסמונת שחרור ציטוקינים ורעילות עצבית הופך את תאי CAR-NK לחלופה רבת ערך לתאי CAR-T כטיפול "מדף" לזיהומים חריפים9. בנוסף, הוכח כי תאי NK ממלאים תפקיד מכריע בתגובה החיסונית האנטי-פטרייתית. כאשר מגורים עם A. fumigatus, תאי NK מפרישים ציטוקינים כגון IFN-ɣ וכימוקינים כמו CCL-3 ו-CCL-4 ומשחררים גרגירים ציטוטוקסיים10,11.

קו התאים NK-92 הוא מקור פופולרי לתאי NK להנדסה גנטית, ומציע את היתרון של התפשטות והתרחבות מהירה בתנאי תרבית פשוטים יחסית12. מספר מחקרים פרה-קליניים הדגימו את הפוטנציאל הטיפולי של תאי NK-92 המומרים על ידי CAR בטיפול בגידולים המטולוגיים ומוצקים כאחד. ניסויים קליניים רבים נמשכים כדי לחקור את בטיחותם, יעילותם והשימוש הפוטנציאלי בהם כטיפול תאי "מהמדף"13.

השגת יעילות טרנספקציה גבוהה וביטוי טרנסגנים יציב בתאי NK היא מאתגרת. בעוד ששיטות ויראליות מבטיחות יעילות גבוהה, הן טומנות בחובן את הסיכון למוטציות החדרה עם אונקוגנזה עוקבת 9,14. הדור האחרון של וקטורי טרנספוזון של היפהפייה הנרדמת (SB) מציע מערכת בטוחה, חזקה ובת קיימא מבחינה כלכלית להעברת גנים יציבה, תוך התגברות על מגבלות של שיטות העברת גנים נגיפיות וחולפות לא ויראליות15.

לכן, פרוטוקול זה מתווה מתודולוגיה חדשה ליצירת תאי Af-CAR-NK-92, שיכולים לשמש כאופציה טיפולית "מהמדף" לחולים עם אספרגילוזיס פולשני מסכן חיים. היעילות של גישה זו מודגמת על ידי ייצור מוגבר של IFN-ɣ עם גירוי עם קורי A. fumigatus .

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל הניסויים המתוארים כאן חייבים להתבצע בתנאים סטריליים. בפרוטוקול זה, אנו מראים שני תנאים: (I) טרנספקציה מדומה ללא DNA שתשמש כבקרה ו-(II) טרנספקציה של CAR באמצעות Af-CAR6 שתואר קודם לכן. הפלסמיד Af-CAR מכיל רצף קולטן גורם גדילה אפידרמלי קטום (EGFRt) במורד הזרם של ה-CAR, שישמש כסמן טרנספקציה (איור משלים S1). עבור כל מצב, נדרשים 4 × 106 תאים NK-92.

1. תרבית תאי NK-92

  1. יום או יומיים לפני הטרנספקציה, הכינו מדיום תרבית תאים טרי עם ההרכב הבא: 75% (v/v) מדיום אלפא-MEM (עם נוקלאוזידים) + 12.5% (v/v) סרום בקר עוברי מומת בחום (FBS) + 12.5% (v/v) סרום סוסים מומת בחום + 2 מ"מ L-גלוטמין.
  2. השעו מחדש לפחות 107 תאי NK-92 בצפיפות תאים של 5 × 105 תאים/מ"ל.
  3. הוסף IL-2 לתרחיף התא בריכוז של 150 UI/mL.
  4. תרבית התאים באינקובטור לח בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2.
    הערה: ניתן להשתמש ב-IL-2 בריכוז סופי של 5 ננוגרם/מ"ל.

2. טרנספקציה לא ויראלית

  1. בדוק את איכות התאים תחת המיקרוסקופ. השעיה של אשכולות תאים ורקע ברור מעידים על תרבית תאים בריאה.
  2. בצלחת של 6 בארות, הוסף 2 מ"ל של מדיום תרבית תאים לכל באר לכל מצב. מניחים את הצלחת באינקובטור לח בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2.
    הערה: אנטיביוטיקה יכולה להפחית את כדאיות התאים לאחר טרנספקציה. שמור על המדיום ללא אנטיביוטיקה.
  3. ספור את התאים ובדוק את כדאיות התא באמצעות (למשל, צביעת טריפן כחול).
  4. העבירו 8 × 106 תאי NK-92 לצינור תחתון חרוטי של 15 מ"ל. צנטריפוגה ב-200 × גרם למשך 5 דקות עם תאוצה והאטה של 3. השתמש בתוכנית זו עבור כל שלבי הצנטריפוגה הבאים.
  5. במהלך הצנטריפוגה, הכינו שני צינורות תגובה של 1.5 מ"ל. הכניסו את ה-DNA של Af-CAR (8 מיקרוגרם של פלסמיד-DNA ו-4 מיקרוגרם של SB100X Mini Circle, טבלה 1) לתוך אחד הצינורות. שמור על השני נקי מ-DNA כדי להיות פקד מדומה.
  6. כאשר הצנטריפוגה מוכנה, השליכו בעדינות את הסופרנטנט ומלאו את הצינור המכיל את התאים בעד 15 מ"ל של מי מלח פוספט מחוממים מראש (PBS).
  7. צנטריפוגה (שלב 2.4).
  8. במהלך הצנטריפוגה, הכינו צינור מערכת טרנספקציה אחד לכל מצב על ידי הוספת 3 מ"ל של מאגר אלקטרוליטי בכל צינור. הכניסו את הצינור הראשון לתחנת הפיפטה.
  9. כאשר הצנטריפוגה מוכנה, השליכו בעדינות את הסופרנטנט והשעו מחדש את כדור התא ב-200 מיקרוליטר של מאגר השעיה מחדש (100 מיקרוליטר / 4 × 106 תאים).
    הערה: הימנע מהשארת התאים במאגר ההשעיה למשך יותר מ-15-30 דקות, מכיוון שהדבר מוריד את כדאיות התאים ויעילות הטרנספקציה.
  10. הוסף 100 מיקרוליטר של תרחיף התא לכל אחד משני צינורות התגובה. מערבבים בעדינות.
    הערה: הימנע מבועות אוויר במהלך פיפטינג מכיוון שבועות אוויר גורמות לקשתות, מה שמוביל למוות של תאים.
  11. פיפטה את תערובת תאי ה-DNA מצינור התגובה הראשון עם פיפטת מערכת הטרנספקציה והכניסו את הפיפטה אנכית לתוך הצינור המונח בתחנת הפיפטה.
    הערה: ודא שהקצה מתאים כהלכה.
  12. הגדר את הדופק הראשון על 1,650 וולט וזמן הדופק למשך 20 אלפיות השנייה ולחץ על התחל.
  13. לאחר השלמתו, הגדר את הדופק השני על 500 וולט וזמן הדופק למשך 100 אלפיות השנייה. לחץ על התחל.
  14. לאחר השלמתו, הסר לאט את הפיפטה מתחנת הפיפטה והעביר מיד את התאים לבאר אחת של צלחת התרבית המוכנה המכילה 2 מ"ל של מדיום תרבית תאים שחומם מראש (ראה שלב 2.2). הזז בעדינות את הצלחת במעגל כדי להבטיח שהתאים יתפזרו באופן שווה.
  15. עבור דגימת הדמה, קח 100 מיקרוליטר של תרחיף התא מצינור התגובה נטול ה-DNA (ראה שלב 2.9) וחזור על אותו הליך משלב 2.11 לשלב 2.14, באמצעות צינור חדש וקצה פיפטה חדש.
  16. דגרו את הצלחת בחממה לחה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2.
  17. לאחר 30 דקות של דגירה, הוסף IL-2 בריכוז סופי של 150 UI/mL.

3. בדיקת יעילות הטרנספקציה באמצעות ציטומטריית זרימה

  1. לאחר שבוע אחד של טיפוח ופיצול התאים כל יומיים, קח 1-5 × 105 תאים מכל מצב לתוך צינור תחתון עגול מפוליסטירן.
  2. שטפו את התאים על ידי הוספת 1 מ"ל מאגר (PBS + 0.5% (v/v) FBS + 2 מ"מ EDTA); צנטריפוגה והשליכו את הסופרנטנט.
  3. השעו מחדש את כדור התא ב-50 מיקרוליטר של מאגר. הוסף 1 מיקרוליטר של 7-AAD כדי לזהות את התאים המתים.
  4. הוסף 5 מיקרוליטר של נוגדן אנטי-tEGFR-Alexa fluor 647 כדי לצבוע את התאים שהועברו.
  5. יש לדגור למשך 20 דקות בחום של 4 מעלות צלזיוס.
  6. שטפו את התאים (ראו שלב 3.2).
  7. השעו מחדש את כדור התא ב-200 מיקרוליטר של מאגר.
  8. מדוד את הדגימות על ציטומטר זרימה.
    הערה: אם יעילות הטרנספקציה אינה מספקת, המשך בהעשרת תאים המבטאים טרנסגנים.

4. העשרת תאים המבטאים טרנסגנים על ידי מיון תאים מופעל מגנטי (MACS)

הערה: לקבלת תוצאות מיטביות, התחל את הפרוטוקול עם 8-10 × 106 תאים. כל שלבי הצנטריפוגה מבוצעים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.

  1. הכן את המאגר כמתואר בשלב 3.2. מדללים את התאים בריכוז של 1-2 × 106/100 מיקרוליטר עם המאגר בצינור תחתון חרוטי של 15 מ"ל.
  2. הוסף 1 מיקרוליטר של אנטי-EGFRt-ביוטין לכל 1-2 ×-106 תאים, וסובב בעדינות את הצינור כדי להבטיח תמיסה מפוזרת באופן שווה.
  3. דגירה למשך 25 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן מלאו את הצינור בעד 10 מ"ל של חיץ.
  4. צנטריפוגה. השליכו את הסופרנטנט.
  5. הוסף 8 מיקרוליטר/1 ×-106 תאים של מאגר קר.
  6. הוסף 2 מיקרוליטר של חרוזים מגנטיים אנטי ביוטין לכל 1 × 106 תאים .
  7. יש לדגור למשך 15 דקות בחום של 4 מעלות צלזיוס.
  8. לשטוף על ידי מילוי של עד 10 מ"ל במאגר.
  9. צנטריפוגה. השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את התאים ב-500 מיקרוליטר של מאגר.
  10. הנח עמוד LS במגנט MACS ושטוף עם 3 מ"ל מאגר.
  11. ברגע שהמאגר עבר לחלוטין דרך העמודה, הוסף את מתלה התא.
  12. שטפו את העמוד פי 3, כל אחד עם 3 מ"ל חיץ.
  13. הסר את העמוד מהמגנט והנח אותו בצינור תחתון חרוטי נקי של 15 מ"ל.
  14. הוסף 5 מ"ל של מאגר לעמודה. בעזרת הבוכנה, שטפו את התאים החיוביים ל-EGFR במהירות האפשרית.
  15. תרבית התאים למשך מספר ימים; לאחר מכן, בדוק את היעילות על ידי ציטומטריית זרימה.

5. בדיקות פונקציונליות

הערה: לניסוי הקרוב, הכינו והשתמשו במדיום הבא: RPMI + 20% FBS.

  1. יום 1 - זריעה של אספרגילוס פומיגאטוס קונידיה
    1. הכן תרחיף A. fumigatus conidia בריכוז של 2.5 × 105 קונידיום/מ"ל במדיום.
    2. בצלחת תרבית של 96 בארות, פיפטה 100 מיקרוליטר של מתלה הקונידיה לבאר ודגירה בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס למשך 16 שעות.
      הערה: לאחר תקופת הדגירה, הקונידיה תנבט (איור 1).
  2. יום 2 - תרבית משותפת עם תאי CAR NK-92
    1. שטפו את תאי ה-Mock וה-Af-CAR NK-92 פי 2 עם המדיום.
    2. תרבית משותפת עם הפטרייה ביחס אפקטור למטרה של 2:1 על ידי הוספת 5 ×-104 תאים ב-100 מיקרוליטר של מדיום לבאר (איור 2).
    3. לבקרה חיובית, הוסף 1 ננוגרם של PMA ו-100 ננוגרם של יונומיצין לבאר ב-100 מיקרוליטר של מדיום. השתמש בתאים במדיום רק כבקרה שלילית.
    4. דגרו את הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחממת CO2 לחה למשך 6 שעות לפחות.
    5. צנטריפוגה את הצלחת בחום של 300 × גרם למשך 5 דקות.
    6. קציר 100 מיקרוליטר מכל באר; הימנע מלגעת בתחתית. העבירו את הסופרנטנטים לצינורות תגובה.
      הערה: ודא שרק הסופרנטנט הוא פיפט ולא הפטרייה הגדלה. אם יש ספק, הוסף שלב צנטריפוגה נוסף.
    7. בצע IFN-ɣ ELISA בהתאם להוראות היצרן או אחסן את הדגימות בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד לשימוש.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל התהליך של יצירת תאי Af-CAR NK-92, כולל טרנספקציה, התאוששות, העשרה והרחבה, אורך כ-14 יום. לאחר הטרנספקציה, התאים עוברים תרבית ומפוצלים כל יומיים. כדאיות התא עשויה לרדת במהלך הפיצול הראשון יומיים לאחר הטרנספקציה. בדרך כלל, התאים מתאוששים 4 ימים לאחר הטרנספקציה ומתחילים להתרבות, עם זמן הכפלה של 48 שעות.

לאחר ההתאוששות, נמדדות יעילות הטרנספקציה וצפויות להגיע ל-10-20% (תוצאות מייצגות המוצגות באיור 3). העשרה של תאים חיוביים ל-EGFR באמצעות MACS מגדילה את אחוז תאי Af-CAR NK-92 ליותר מ-95% (תוצאות מייצגות מוצגות באיור 4).

תרביות עם יותר מ-95% תאי Af-CAR שימשו לבדיקות פונקציונליות. כאן, תרבית משותפת של התאים עם צינורות נבט A. fumigatus במשך 6 שעות ומדדנו את הפרשת IFN-ɣ כסמן הפעלה. כפי שמוצג באיור 5, תאי Af-CAR הראו הפרשת ציטוקינים משמעותית (ממוצע = 340.6 ± 86.5 pg/mL) בהשוואה לתאי Mock NK-92 (ממוצע = 75.6 ± 19.5 pg/mL), מה שמצביע על הפעלה גבוהה משמעותית של תאי Af-CAR (p-value = 0.03).

figure-results-1
איור 1: צינורות נבט של Aspergillus fumigatus. תמונת מיקרוסקופיה של A. fumigatus לאחר 16 שעות דגירה. צינורות נבט / קורים קטנים נצפים ומפוזרים באופן הומוגני סביב הבאר. סרגל קנה מידה = 400 מיקרומטר. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: תרבית משותפת של צינורות נבט אספרגילוס פומיגאטוס עם תאי NK-92. תמונת מיקרוסקופיה של תרבית משותפת. תאי NK-92 יוצרים אשכולות ונמצאים במגע עם צינורות הנבט A. fumigatus . סרגל קנה מידה = 400 מיקרומטר. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: נצילות טרנספקציה מוערכת על ידי צביעה עבור סמן הטרנספקציה EGFR. ביום החמישי, לאחר אלקטרופורציה, תאי NK-92 נצבעו ב-7-AAD ואנטי-EGFR. התוצאות מוצגות עבור ניסוי מייצג אחד עבור (A) תאי Mock ו-(B) Af-CAR NK-92. העמודה השמאלית מציגה תרשימי נקודות של גודל התא לעומת גרעיניות התא; השער מוצב על תאי NK-92. התאים המתים מוציאים באמצעות תיוג 7-AAD (עמודה שנייה). אחוז תאי EGFR+ החיים מוצג בעמודה השלישית. קיצורים: EGFR = קולטן גורם גדילה אפידרמלי; 7-AAD = 7-אמינואקטינומיצין D; CAR = קולטן אנטיגן כימרי. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4
איור 4: תוצאות צביעת פני התא לאחר העשרה של תאי NK-92 המבטאים את הטרנסגן. מימין, התאים המדומים מוצגים. מימין, תאי Af-CAR-NK מוצגים. ההיסטוגרמות האדומות מייצגות את התאים הלא מוכתמים. ההיסטוגרמות הכחולות מייצגות את התאים המוכתמים המתאימים. השער מוגדר על תאי EGFR+ ; המספרים מציגים את אחוז התאים החיוביים. קיצורים: EGFR = קולטן גורם גדילה אפידרמלי; CAR = קולטן אנטיגן כימרי. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-5
איור 5: הפרשת ציטוקינים של תאי NK המופעלים על ידי צינורות נבט Aspergillus fumigatus . הדיאגרמות מציגות תוצאות של הפרשת IFN-ɣ של תאי Af-CAR ותאי Mock בתרבית משותפת עם פטריות שנמדדו על ידי ELISA לאחר 6 שעות של תרבית משותפת. הנתונים המוצגים הם הממוצע ± SD של שלושה ניסויים שבוצעו באופן עצמאי (n = 3). ערך P מחושב על ידי מבחן ה-t של וולש באמצעות GraphPad Prism 10, * p < 0.05. קיצורים: NK = רוצח טבעי; IFN-ɣ = אינטרפרון גמא; CAR = קולטן אנטיגן כימרי; ELISA = בדיקת אימונוסורבנט מקושר לאנזים. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

שםחברהריכוז מלאיהפניה
טרנספוזאזSB100X מיני מעגלפלסמיד פקטורי1 מיקרוגרם/מיקרוליטר19
טרנספוזוןפלסמיד Af-CARמיוצר בבית1 מיקרוגרם/מיקרוליטר6

טבלה 1: DNA המשמש בפרוטוקול זה.

איור משלים S1: מפת פלסמיד של טרנספוזון Af-CAR: סכמטי של וקטור פלסמיד ותכנון של טרנספוזון CAR. קיצורים: EF1 = מקדם אלפא גורם התארכות-1; ORI = מקור חיידקי של שכפול; LIR = חזרה הפוכה שמאלית; RIR: חזרה הפוכה ימינה; ציטו = ציטופלזמי; Tm = טרנסממברנה. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול המסופק מציע שיטה פשוטה ואמינה ליצירת תאי CAR-NK המכוונים לפתוגנים פטרייתיים באמצעות מערכת הטרנספוזון הלא ויראלית של היפהפייה הנרדמת. שיטה זו מאפשרת החדרה יציבה וקבועה של טרנסגנים גדולים, מה שמאפשר הרחבת תאים כדי להשיג את הכמויות הדרושות לניתוח נוסף14,16.

מספר גורמים מרכזיים יכולים להשפיע על הצלחת הטרנספקציה, כולל מספר התאים והכדאיות, חוזק ומשך הדופק, כמו גם איכות וכמות ה-DNA17. חיוני להעריך את בריאות התאים לפני שמתחילים, ולהבטיח כדאיות של לפחות 90%. הוכח כי חוזק דופק מוגבר יכול לשפר את יעילות הטרנספקציה של אוכלוסיית תאים. עם זאת, גישה זו יכולה גם לגרום לירידה משמעותית בכדאיות התאים. במקרים עם עודף תאים וכמות או איכות מוגבלת של DNA, מספר התאים שקולטים בהצלחה את הפלסמיד עשוי להיות לא מספיק17. עם זאת, ריכוזים גבוהים של DNA הוכחו כרעילים ומפחיתים את כדאיות התאים18.

מחקרים קודמים השיגו יעילות טרנספקציה גבוהה יותר אך התמקדו אך ורק בביטוי חלבון חולף17. לעומת זאת, הפרוטוקול שלנו מבטיח החדרת טרנסגנים יציבה. כדי לטפל ביעילות טרנספקציה נמוכה, יישמנו העשרה של תאים שעברו טרנספטציה חיובית והשגנו כ-95% תאים המבטאים CAR. עם זאת, זה הגדיל את זמן הייצור ל~1 שבוע. אם רוצים זמני ייצור קצרים יותר, ניתן להעביר את ה-DNA של הטרנספוזון כמיני-מעגל, מה שיכול לשפר את יעילות הטרנספקציה ועשוי לבטל את הצורך בשלבההעשרה 19. עם זאת, לא ניתן להפחית את זמן הייצור לשבוע < כדי לאפשר התאוששות והתפשטות תאים.

בהתחשב באופי החריף של אספרגילוזיס פולשני, טיפולים תאיים "מהמדף" יהיו מועילים. האתגרים והעלויות הכרוכים בבידוד תאים מחולים והרחבת תאים ראשוניים הגדילו את הפופולריות של NK-92 כקו תאים נוח לייצור תאי CAR-NK20. תאי NK-92 הם בדרך כלל חזקים ומתרבים במהירות בנוכחות IL-2, מה שמקל על השגת כמויות תאים גדולות בתקופה קצרה יחסית. לאור יתרונות אלה, פיתחנו פרוטוקול להנדסה גנטית של תאי NK-92, המדגים כי ניתן להעביר ולהכין בבטחה מוצרי תא CAR-NK בטוהר גבוה. בעוד שניתן להתאים פרוטוקול זה להכנת תאי CAR-NK ראשוניים, יש לשקול מספר שינויים. אלה כוללים אופטימיזציה של מספר ועוצמת הפולסים, כמות ה-DNA בשימוש והקמת פרוטוקול הרחבה מתאים. כל שינוי בפרוטוקול ידרוש חקירה יסודית כדי להבטיח יעילות. עם זאת, הפרוטוקול שלנו מספק תבנית בסיסית שניתן להתאים לתאי NK ראשוניים בניסויים עתידיים.

לסיכום, פרוטוקול טרנספקציה חדשני זה לייצור תאי Af-CAR-NK יציבים הוא שיטה יעילה וניתנת לשחזור שניתן להשתמש בה כדי להתמקד במחלות אחרות. בנוסף, זה יכול לשמש כשיטה חסכונית לסינון CARs חדשים המכוונים למגוון אנטיגנים.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מ.ה.: ממציא בבקשות פטנט וקיבל פטנטים הקשורים לטכנולוגיית CAR, ברישיון חלקי לתעשייה. מייסד שותף ובעל מניות T-CURX GmbH, וירצבורג. כבוד הדוברים: BMS, Janssen, Kite/Gilead, Novartis. תמיכה במחקר: BMS. מ.ב. מדווח על תמיכה בנסיעות מחברת התרופות "אלי לילי ושות'", שאינה קשורה למחקר זה. לכותבים האחרים אין ניגודי אינטרסים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מימון ותמיכה לפרויקט ניתנו על ידי קרן וילהלם סנדר, פרויקט 2020.017.1 ל-M.H., ו-J.L.; Deutsche Forschungsgemeinschaft (מרכז מחקר שיתופי / Transregio 124 פטריות פתוגניות והמארח האנושי שלהן: רשתות אינטראקציה-FungiNet; פרויקט A8 ל- M.H. ו- H.E.).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
15 מ"ל צינורות תחתונים חרוטייםGreiner Bio-One188271PP, 17/120 מ"מ, CELLTAR, סטרילי
50 מ"ל צינורות תחתונים חרוטייםGreiner Bio-One227270PP, 30/115 מ"מ, CELLTAR,
צלחת תרבית תאים סטרילית 6 ו-96 בארCorning Inc. מדעי החיים83-3736/ 83-3474צלחות באר מרובות שטופלו ב-TC, תחתיות שטוחות, מטופלות לחיבור תאים אופטימלי, מעוקרות על ידי קרינת גמא, לא פירוגני
7-AAD (7-Aminoactinomycin D)BD Biosciences559925צבע חומצת גרעין קל לשימוש להוצאת תאים שאינם ברי קיימא במבחני זרימה ציטומטריים
Alexa Fluor 647 נוגדן EGFR אנטי-אנושיBiolegend352918Clone AY13
אנטי-ביוטין מיקרו-חרוזים UltraPureMiltenyi Biotec130-105-637מיקרו-חרוזים UltraPure מצומדים לאנטי-ביוטין של עכבר חד-שבטי נוגדנים
Aspergillus fumigatusATCC46645
קצות מסנן ביוספרה (20 ו-100 μ L) Sarstedt70.3030.365 / 70.3030.275
Dulbecco′ s פוספט חוצץ מלח (PBS)סיגמא-אולדריץ'D8537  שונה, ללא סידן כלורי ומגנזיום כלוריד, נוזלי, מסונן סטרילי, מתאים לתרבית תאים, אנדוטוקסין, נבדק
ELISA MAX Deluxe סט IFN-וגמא אנושי;Biolegend430104
תמיסת מלח דיסודיום חומצה אתילנדיאמינטטראצטית (EDTA)Sigma-AldrichE7889לביולוגיה מולקולרית, 0.5  M ב-H2O, DNase, RNase, NICKase ופרוטאז, לא זוהה, 0.2 μ מ 'מסונן.
FACS cleanBD Biosciences340345
FACS Flow Sheath Fluid BDBiosciences342003
FACS תמיסת שטיפהBD Bioscience340346
סרום בקר עוברי (FBS)Sigma-AldrichF7524מסונן סטרילי, מתאים לתרבית תאים, מושבת בחום לפני השימוש
Gibco, MEM α, נוקלאוזידיםתרמופישר Scientific22571020פנול אדום, ריבונוקלאוזידים, דאוקסיריבונוקלאוזידים, נתרן ביקרבונט
סרום סוסיםתרמו פישר16050122מדעי מסונן סטרילי, מושבת בחום לפני השימוש
אנושי IL-2 IS, דרגת מחקרMiltenyi Biotec130-097-742דרגת מחקר. ה-ED50 הוא ≤ 0.3 ננוגרם/מ"ל, המקביל לפעילות של ≥ 3 ופעמים; 106 IU/mg.
יונומיציןסיגמא-אולדריץ'I0634-1MGמ-Streptomyces conglobatus, המשמש כבקרה חיובית להפרשת ציטוקינים 
L-גלוטמיןסיגמא-אולדריץ'W368401לתרבית תאים
MACS LS עמודMiltenyi Biotec130-042-401  עמודים ובוכנות, ארוזים סטריליים
NK-92DSMZACC 488
Neon Transfektionssystem 100  μ L-KitThermo Fisher ScientificMPK10096מאגר השעיה R, מאגר אלקטרוליטי E2, 100 ו-mu; L טיפים ניאון, צינורות אלקטרופורציה ניאון
Phorbol-12-myristat-13-acetat (PMA)Sigma-AldrichP1585-1MGמשמש כבקרה חיובית להפרשת ציטוקינים 
צינור פוליסטירן תחתון עגול, 5 מ"לBD BioscienceS-452400המשמש לזרימה ציטומטרית
צינור תגובה, 1.5 מ"לגריינר ביו-וואן7,26,90,001PP, שקוף, מכסה מחובר, עם סיום מוזרק. עובר סטריליזציה לפני השימוש. 
RPMI 1640 בינוני, GlutaMAXתרמו פישר מדעי72400021GlutaMax I,  פנול אדום, HEPES, TipOne 1000 ו-mu בסינון סטרילי
; L XL קצה מסנן בוגרStarLabS1122-1730
<חזק>ציוד
BD FACSחממתBioscience
CO2 C60 Labotect
Heraeus Multifuge 3SRThermo Scientific
HydroFLEX מכונת כביסה מיקרופלייט Tecan
NanoQuant Infinite M200 ProTecan
מערכת טרנספיקציה ניאוןInvitrogen
Pipettes מפריד Eppendorf
Quadro MACS מילטני ביוטק
BD

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fang, W., Latgé, J. -P. Microbe profile: Aspergillus fumigatus: A saprotrophic and opportunistic fungal pathogen. Microbiology (Reading). 164 (8), 1009-1011 (2018).
  2. Brown, G. D., et al. Hidden killers: Human fungal infections. Sci Transl Med. 4 (165), 165rv113(2012).
  3. Sun, K. S., Tsai, C. F., Chen, S. C., Huang, W. C. Clinical outcome and prognostic factors associated with invasive pulmonary aspergillosis: An 11-year follow-up report from Taiwan. PLoS One. 12 (10), e0186422(2017).
  4. Meis, J. F., Chowdhary, A., Rhodes, J. L., Fisher, M. C., Verweij, P. E. Clinical implications of globally emerging azole resistance in Aspergillus fumigatus. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 371 (1709), 20150460(2016).
  5. Seif, M., Einsele, H., Löffler, J. CAR T cells beyond cancer: Hope for immunomodulatory therapy of infectious diseases. Front Immunol. 10, 2711(2019).
  6. Seif, M., et al. CAR T cells targeting Aspergillus fumigatus are effective at treating invasive pulmonary aspergillosis in preclinical models. Sci Transl Med. 14 (664), eabh1209(2022).
  7. Kumaresan, P. R., et al. Bioengineering T cells to target carbohydrate to treat opportunistic fungal infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (29), 10660-10665 (2014).
  8. Kumaresan, P. R., et al. A novel lentiviral vector-based approach to generate chimeric antigen receptor T cells targeting Aspergillus fumigatus. mBio. 15 (4), e0341323(2024).
  9. Lu, H., Zhao, X., Li, Z., Hu, Y., Wang, H. From CAR-T cells to CAR-NK cells: A developing immunotherapy method for hematological malignancies. Front Oncol. 11, 720501(2021).
  10. Robertson, M. J., Ritz, J. Biology and clinical relevance of human natural killer cells. Blood. 76 (12), 2421-2438 (1990).
  11. Ziegler, S., et al. CD56 is a pathogen recognition receptor on human natural killer cells. Sci Rep. 7 (1), 6138(2017).
  12. Esmaeilzadeh, A., Hadiloo, K., Jabbari, M., Elahi, R. Current progress of chimeric antigen receptor (car) t versus car nk cell for immunotherapy of solid tumors. Life Sci. 337, 122381(2024).
  13. Zhang, J., Zheng, H., Diao, Y. Natural killer cells and current applications of chimeric antigen receptor-modified NK-92 cells in tumor immunotherapy. Int J Mol Sci. 20 (2), 317(2019).
  14. Hu, Y., Tian, Z. G., Zhang, C. Chimeric antigen receptor (CAR)-transduced natural killer cells in tumor immunotherapy. Acta Pharmacol Sin. 39 (2), 167-176 (2018).
  15. Hudecek, M., et al. Going non-viral: The Sleeping Beauty transposon system breaks on through to the clinical side. Crit Rev Biochem Mol Biol. 52 (4), 355-380 (2017).
  16. Amberger, M., Ivics, Z. Latest advances for the Sleeping Beauty transposon system: 23 years of insomnia but prettier than ever. BioEssays. 42 (11), 2000136(2020).
  17. Ingegnere, T., et al. Human car nk cells: A new non-viral method allowing high efficient transfection and strong tumor cell killing. Front Immunol. 10, 957(2019).
  18. Stacey, K. J., Ross, I. L., Hume, D. A. Electroporation and DNA-dependent cell death in murine macrophages. Immunol Cell Biol. 71 (Pt 2), 75-85 (1993).
  19. Monjezi, R., et al. Enhanced CAR T-cell engineering using non-viral Sleeping Beauty transposition from minicircle vectors. Leukemia. 31 (1), 186-194 (2017).
  20. Moscarelli, J., Zahavi, D., Maynard, R., Weiner, L. M. The next generation of cellular immunotherapy: Chimeric antigen receptor-natural killer cells. Transplant Cell Ther. 28 (10), 650-656 (2022).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

CAR NKNK 92Aspergillus FumigatusELISA

מאמרים קשורים