פרוטוקול זה מתאר שיטת ניתוח מקיפה של ציטומטריית מסה (ציטומטריה לפי זמן טיסה [CyTOF]) להערכת תגובות חיסוניות מערכתיות ומקומיות בקרצינומה של הכבד (HCC). הגישה שואפת לספק תובנות לגבי הנוף החיסוני של HCC, ולהציע הבנה מעמיקה יותר של המיקרו-סביבה של הגידול והמנגנונים החיסוניים הנלווים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
ניתוח ציטומטריית מסה של תגובות חיסוניות מערכתיות ומקומיות בקרצינומה של הכבד
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
קרצינומה של הכבד (HCC) היא אחת הצורות הנפוצות והקטלניות ביותר של סרטן הכבד ברחבי העולם. למרות ההתקדמות בטיפול, הפרוגנוזה עבור חולי HCC נותרה גרועה בשל האינטראקציה המורכבת של גורמים גנטיים, סביבתיים ואימונולוגיים המניעים את התקדמותה. הבנת הנוף החיסוני של HCC חיונית לפיתוח טיפולים יעילים, במיוחד בתחום האימונותרפיה, הטומן בחובו הבטחות גדולות לשיפור תוצאות המטופלים. מחקר זה משתמש בטכנולוגיית ציטומטריית מסה (ציטומטריה לפי זמן טיסה [CyTOF]) כדי לחקור תגובות חיסוניות מערכתיות ומקומיות בחולים עם HCC. על ידי ניתוח דגימות דם וגידולים היקפיים, המחקר נועד לזהות אוכלוסיות ייחודיות של תאים חיסוניים, ואת מצבם התפקודי הקשור להתקדמות HCC. הממצאים מספקים סקירה מקיפה של הנוף החיסוני ב-HCC, תוך הדגשת סמנים ביולוגיים פוטנציאליים ומטרות טיפוליות. גישה זו מציעה תובנות חשובות לגבי המנגנונים החיסוניים העומדים בבסיס HCC וסוללת את הדרך לפיתוח אימונותרפיה יעילה יותר לממאירות זו.
מבוא
קרצינומה של הכבד (HCC) היא סרטן הכבד הראשוני הנפוץ ביותר ובעיה בריאותית עולמית משמעותית בשל שכיחותה הגבוהה ושיעורי התמותה שלה. על פי ארגון הבריאות העולמי, HCC מדורג כסרטן החמישי בשכיחותו והגורם השני המוביל למקרי מוות הקשורים לסרטן ברחבי העולם2. היא נפוצה במיוחד באזורים עם שיעורים גבוהים של זיהומים כרוניים בהפטיטיס B ו-C, כמו מזרח אסיה ואפריקה שמדרום לסהרה3. גורמי הסיכון העיקריים כוללים דלקת כבד נגיפית, שחמת ותסמונת מטבולית4. HCC דורש טיפול ארוך טווח, מטיל נטל פיזי וכספי משמעותי, ומדגיש את הצורך במניעה יעילה, גילוי מוקדם ואסטרטגיות טיפול חדש....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
השלבים לאיסוף דגימות דם ו-HCC, בידוד תאים חד-גרעיניים בדם היקפי (PBMCs), דיסוציאציה של תא בודד וצביעה מתוארים בתוכנית הבאה. הריאגנטים והחומרים הניסיוניים מופיעים כולם בטבלת החומרים. כל הניסויים בוצעו באישור ועדת האתיקה של בית החולים המסונף הראשון, בית הספר לרפואה, אוניברסיטת ג'ג'יאנג, והבטיחו שאיסוף דגימות הגידול לא יפריע לאבחון הפתולוגי. הסכמה מדעת בכתב התקבלה מכל הנבדקים האנושיים.
1. בידוד PBMCs
- קחו דגימת דם מהווריד של חולי HCC והשתמשו בצינור מלא בנוגדי קרישה כדי למנוע את קרישת הדם. דגימות דם נלקחו מ-4 חולים (2 גברים ו-2 נשים) בגילאי 50-60 שנים, עם גיל ממוצע של 55 שנים. עבור כ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
כדי להבהיר את המאפיינים האימונולוגיים הקשורים ל-HCC, נערך ניתוח מקיף של אוכלוסיות תאי חיסון. דגימות רקמה מזווגות של PBMCs ו-HCC נאספו מ-4 חולים עם HCC. פרופיל ציטומטריה מסה בוצע כדי לבחון אוכלוסיות תאי חיסון ברמה הפרוטאומית של תא בודד, באמצעות שני לוחות נוגדנים הן עבור PBMCs והן עבור דגימות רקמת HCC.
לאחר בקרת איכות, 45,326 תאים נכללו בניתוח ציטומטריית המסה. אלגוריתם האשכולות של PhenoGraph, בשיל.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
מחקר זה ממנף את טכנולוגיית ציטומטריית המסה כדי לספק ניתוח מעמיק של תגובות חיסוניות מערכתיות ומקומיות ב-HCC. היישום של ציטומטריית מסה בהקשר זה מאפשר זיהוי בו זמנית של סמנים מרובים ברמת תא בודד, ומציע אפיון אימונופנוטיפי מפורט שהוא חיוני להבנת הנוף החיסוני המורכב של HCC. ציטומטריית מסה חוללה מהפכה במחקרים אימונולוגיים על ידי הקלה על ניתוח תא בודד בממדים גבוהים. טכניקה זו משתמשת בתגי איזוטופים נדירים של מתכת המצומדים לנוגדנים, ומאפשרת מדידה בו זמנית של למעלה מ-40 פרמטרים בריצה אחת. היכולת מ.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים שאין להם ניגודי אינטרסים.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי התוכנית הלאומית למחקר ופיתוח מפתח של סין (מענק 2019YFA0803000 ל-J.S.), קרן הנוער המצוינת של Zhejiang Scientific (מענק R22H1610037 ל-J.S.), הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מענק 82173078 ל-J.S.), הקרן למדעי הטבע של מחוז ג'ה-ג'יאנג (מענק 2022C03037 ל-J.S).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 1×PBS | HyClone | SH30256.01 | |
| 10×PBS | HyClone | SH30256.01 | |
| 100 mm×20 mm tissue-culture-treated culture dish | Corning | 430167 | |
| 1000 mL pipette tips | Rainin | 30389218 | |
| 15 mL centrifuge tube | NEST | 601052 | |
| 200 mL pipette tips | Rainin | 30389241 | |
| 40 mm nylon cell strainer/70-mm nylon cell strainer | Falcon | 352340 | |
| 50 mL centrifuge tube | NEST | 602052 | |
| 70 μm syringe fifilter | Sangon Biotech | F613462-9001 | |
| Anti-Human CCR2 Antibody (clone: K036C2) | BioLegend | 357224 | |
| Anti-Human CCR3 Antibody (clone: 5E8) | BioLegend | 310724 | |
| Anti-Human CCR7 Antibody (clone: G043H7) | BioLegend | 353240 | |
| Anti-Human CD103 Antibody (clone: Ber-ACT8) | BioLegend | 350202 | |
| Anti-Human CD115 Antibody (clone: 9-4D2-1E4) | BioLegend | 347314 | |
| Anti-Human CD117 Antibody (clone: 104D2) | BioLegend | 313201 | |
| Anti-human CD11b Antibody (clone: 1CRF44) | BD | 562721 | |
| Anti-human CD11c Antibody (clone: B-ly6) | BD | 563026 | |
| Anti-Human CD123 Antibody (clone: 6H6) | BioLegend | 306002 | |
| Anti-Human CD127 Antibody (clone: A019D5) | BioLegend | 351337 | |
| Anti-Human CD13 Antibody (clone: WM19) | BioLegend | 301701 | |
| Anti-Human CD138 Antibody (clone: MI15) | BioLegend | 356535 | |
| Anti-human CD14 Antibody (clone: HCD14) | BioLegend | 325604 | |
| Anti-Human CD141 Antibody (clone: M80) | BioLegend | 344102 | |
| Anti-Human CD15 Antibody (clone: QA19A61) | BioLegend | 376302 | |
| Anti-human CD16 Antibody (clone: B7311) | BD | 561313 | |
| Anti-Human CD161 Antibody (clone: HP-3G10) | BioLegend | 339902 | |
| Anti-Human CD163 Antibody (clone: GHI/61) | BioLegend | 333603 | |
| Anti-Human CD169 Antibody (clone: 7-239) | BioLegend | 346002 | |
| Anti-human CD19 Antibody (clone: HIB19) | BioLegend | 302226 | |
| Anti-Human CD1c Antibody (clone: L161) | BioLegend | 331501 | |
| Anti-Human CD20 Antibody (clone: 2H7) | BioLegend | 302301 | |
| Anti-Human CD206 Antibody (clone: 15-2) | BioLegend | 321151 | |
| Anti-Human CD24 Antibody (clone: ML5) | BioLegend | 311129 | |
| Anti-Human CD25 Antibody (clone: BC96) | BioLegend | 302624 | |
| Anti-human CD3 Antibody (clone: UCHT1) | BD | 555916 | |
| Anti-Human CD31 Antibody (clone: W18200D) | BioLegend | 375902 | |
| Anti-Human CD32 Antibody (clone: FUN-2) | BioLegend | 303232 | |
| Anti-Human CD326 Antibody (clone: CO17-1A) | BioLegend | 369812 | |
| Anti-Human CD33 Antibody (clone: WM53) | BioLegend | 303402 | |
| Anti-human CD4 Antibody (clone: L200) | BD | 563094 | |
| Anti-Human CD45 Antibody (clone: HI30) | BD | 563716 | |
| Anti-Human CD45RO Antibody (clone: UCHL1) | BioLegend | 304220 | |
| Anti-human CD56 Antibody (clone: 5.1H11) | BioLegend | 362510 | |
| Anti-Human CD64 Antibody (clone: S18012C) | BioLegend | 399502 | |
| Anti-Human CD66b Antibody (clone: 6/40c) | BioLegend | 392917 | |
| Anti-human CD68 Antibody (clone: Y1/82A) | BioLegend | 333808 | |
| Anti-Human CD69 Antibody (clone: FN50) | BioLegend | 310902 | |
| Anti-Human CD7 Antibody (clone: 4H9/CD7) | BioLegend | 395602 | |
| Anti-human CD8 Antibody (clone: RPA-T8) | BD | 557750 | |
| Anti-Human CD80 Antibody (clone: W17149D) | BioLegend | 375402 | |
| Anti-Human CD86 Antibody (clone: BU63) | BioLegend | 374202 | |
| Anti-Human FOXP3 Antibody (clone: 206D) | BioLegend | 320101 | |
| Anti-Human HLA_ABC Antibody (clone: W6/32) | BioLegend | 311426 | |
| Anti-human HLA-DR Antibody (clone: L243) | BioLegend | 307650 | |
| Anti-Human IgD Antibody (clone: IA6-2) | BioLegend | 348211 | |
| Anti-Human Ki67 Antibody (clone: Ki-67) | BioLegend | 350501 | |
| Anti-Human PD_L2 Antibody (clone: MH22B2) | BD | 567783 | |
| Anti-Human PD1 Antibody (clone: EH12.2H7) | BioLegend | 329951 | |
| Anti-Human PDL1 Antibody (clone: MIH2) | BioLegend | 393602 | |
| Anti-human TCR-γδ Antibody (clone: B1) | BD | 74 |
מקורות
- Zhang, C. H., Cheng, Y., Zhang, S., Fan, J., Gao, Q. Changing epidemiology of hepatocellular carcinoma in Asia. Liver Int. 42 (9), 2029-2041 (2022).
- Renne, S. L., et al. Hepatocellular carcinoma: A clinical and pathological overview. Pathologica. 113 (3), 203-2....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
