מאמר שיטה

ניתוח ציטומטריית מסה של תגובות חיסוניות מערכתיות ומקומיות בקרצינומה של הכבד

DOI:

10.3791/67425

⸱

25 באפריל 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Hepatobiliary and Pancreatic Surgery, The First Affiliated Hospital, Zhejiang University School of Medicine

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר שיטת ניתוח מקיפה של ציטומטריית מסה (ציטומטריה לפי זמן טיסה [CyTOF]) להערכת תגובות חיסוניות מערכתיות ומקומיות בקרצינומה של הכבד (HCC). הגישה שואפת לספק תובנות לגבי הנוף החיסוני של HCC, ולהציע הבנה מעמיקה יותר של המיקרו-סביבה של הגידול והמנגנונים החיסוניים הנלווים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

קרצינומה של הכבד (HCC) היא אחת הצורות הנפוצות והקטלניות ביותר של סרטן הכבד ברחבי העולם. למרות ההתקדמות בטיפול, הפרוגנוזה עבור חולי HCC נותרה גרועה בשל האינטראקציה המורכבת של גורמים גנטיים, סביבתיים ואימונולוגיים המניעים את התקדמותה. הבנת הנוף החיסוני של HCC חיונית לפיתוח טיפולים יעילים, במיוחד בתחום האימונותרפיה, הטומן בחובו הבטחות גדולות לשיפור תוצאות המטופלים. מחקר זה משתמש בטכנולוגיית ציטומטריית מסה (ציטומטריה לפי זמן טיסה [CyTOF]) כדי לחקור תגובות חיסוניות מערכתיות ומקומיות בחולים עם HCC. על ידי ניתוח דגימות דם וגידולים היקפיים, המחקר נועד לזהות אוכלוסיות ייחודיות של תאים חיסוניים, ואת מצבם התפקודי הקשור להתקדמות HCC. הממצאים מספקים סקירה מקיפה של הנוף החיסוני ב-HCC, תוך הדגשת סמנים ביולוגיים פוטנציאליים ומטרות טיפוליות. גישה זו מציעה תובנות חשובות לגבי המנגנונים החיסוניים העומדים בבסיס HCC וסוללת את הדרך לפיתוח אימונותרפיה יעילה יותר לממאירות זו.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

קרצינומה של הכבד (HCC) היא סרטן הכבד הראשוני הנפוץ ביותר ובעיה בריאותית עולמית משמעותית בשל שכיחותה הגבוהה ושיעורי התמותה שלה. על פי ארגון הבריאות העולמי, HCC מדורג כסרטן החמישי בשכיחותו והגורם השני המוביל למקרי מוות הקשורים לסרטן ברחבי העולם2. היא נפוצה במיוחד באזורים עם שיעורים גבוהים של זיהומים כרוניים בהפטיטיס B ו-C, כמו מזרח אסיה ואפריקה שמדרום לסהרה3. גורמי הסיכון העיקריים כוללים דלקת כבד נגיפית, שחמת ותסמונת מטבולית4. HCC דורש טיפול ארוך טווח, מטיל נטל פיזי וכספי משמעותי, ומדגיש את הצורך במניעה יעילה, גילוי מוקדם ואסטרטגיות טיפול חדשניות5.

למערכת החיסון תפקיד מכריע בהתפתחות HCC. הכבד הוא איבר פעיל מבחינה חיסונית עם שפע של תאים חיסוניים, כולל מקרופאגים השוכנים בכבד, תאי הרג טבעיים (NK) ותאי T, החיוניים לניטור וסילוק תאים חריגים6. עם זאת, HCC יכול להתחמק ממעקב חיסוני על ידי ביטוי מולקולות מדכאות חיסון, גיוס תאים מדכאי חיסון ושינוי המיקרו-סביבה של הגידול 7,8. בריחה חיסונית זו לא רק מקדמת צמיחת גידול וגרורות, אלא גם משפיעה על התגובה לאימונותרפיה 9,10.

תגובות חיסוניות מערכתיות ומקומיות במיקרו-סביבת הגידול הן גורמי מפתח המשפיעים על התקדמות הסרטן ועל התוצאות הטיפוליות. תגובות חיסוניות מערכתיות כוללות תאי חיסון במחזור שיכולים לזהות ולתקוף תאי גידול מרוחקים, כגון תאי T היקפיים, תאי NK ומונוציטים שיכולים לכוון לתאי גידול בכל הגוף. תגובות חיסוניות מקומיות מתמקדות בפעילות תאי החיסון בתוך מיקרו-סביבת הגידול, כולל לימפוציטים חודרים לגידול (TILs), מקרופאגים הקשורים לגידול (TAMs) ותאי T רגולטוריים (Tregs). בעוד ש-TIL מפעילים לעתים קרובות השפעות ציטוטוקסיות כנגד תאי גידול, TAMs ו-Tregs תורמים בדרך כלל לסביבה מדכאת חיסון התומכת בצמיחת הגידול11,12. תאי גידול ותאי סטרומה יכולים לעצב מחדש את המיקרו-סביבה של הגידול כדי לקדם דיכוי חיסוני ולהתחמק ממעקב חיסוני. האינטראקציה בין תגובות חיסוניות מערכתיות ומקומיות קובעת את היעילות הכוללת של חסינות נגד גידול11. הבנת אינטראקציה זו יכולה לסייע בפיתוח אסטרטגיות אימונותרפיה יעילות יותר.

ציטומטריית זרימה ואימונוהיסטוכימיה מסורתיות, למרות שנעשה בהן שימוש נרחב במחקרים אימונולוגיים, מציגות מגבלות משמעותיות בכל הנוגע לניתוח נופים חיסוניים מורכבים בשל חוסר יכולתם לבצע ניתוח מקיף וממדי גבוה. ציטומטריית זרימה יעילה ביותר לאיתור סמנים פני השטח והתפקודיים ברמת התא הבודד; עם זאת, יכולתו לניתוח מרובה סמנים בו זמנית מוגבלת, ולעתים קרובות מוגבלת על ידי חפיפה ספקטרלית ואילוצים מעשיים על מספר התגים הפלואורסצנטיים שניתן להשתמש בהם13,14. אימונוהיסטוכימיה, לעומת זאת, מספקת תובנות חשובות לגבי הקשר הרקמה של סמנים ספציפיים, אך היא נפגעת באופן דומה על ידי המספר המוגבל של סמנים הניתנים לניתוח והקשיים האינהרנטיים בהשגת הערכות חזקות, כמותיות וגבוהות ממדים15.

כדי לאפיין ביעילות סביבות חיסוניות מורכבות, טכניקות בממדים גבוהים כמו ציטומטריית מסה (ציטומטריה לפי זמן טיסה [CyTOF]) הן חיוניות. ציטומטריית מסה היא טכנולוגיה מתקדמת המשתמשת בספקטרומטריית מסה כדי לנתח סמני חלבון מרובים בתאים בודדים. הוא מאפשר ניתוח רב-פרמטרי של תאים בודדים ללא בעיות החפיפה הספקטרליות שנראות בציטומטריית זרימה מסורתית16. על ידי שימוש בנוגדנים מתויגים מתכת, הוא יכול למדוד עשרות סמנים בו זמנית, ומציע מבט מקיף ובלתי מוטה על פנוטיפים ותפקודים תאיים17. לדוגמה, גדלה ועמיתיו פיתחו פאנל CyTOF עם יותר מ-40 פרמטרים לניתוח תאים חד-גרעיניים בדם היקפי (PBMC) ורקמת גידול, מה שמדגים את יתרונו באימונופנוטיפ בממדים גבוהים18. ציטומטריית זרימה מסורתית, עם המספר המוגבל של הפרמטרים הניתנים לזיהוי, לא הצליחה לזהות את אוכלוסיות התאים הנדירות הללו המציגות פנוטיפים ייחודיים. לעומת זאת, ציטומטריית מסה אפשרה הערכה מקיפה של המצבים התפקודיים של תאים אלה, וסיפקה אפיון מפורט וחזק יותר. Behbehani et al. השתמשו בציטומטריית מסה כדי לנתח דגימות מח עצם מחולים עם תסמונות מיאלודיספלסטיות (MDS), וזיהו ואפיינו בהצלחה תאי אב המטופויאטיים חריגים נדירים18. היכולת של ציטומטריית מסה לזהות בו זמנית למעלה מ-40 סמנים תוך-תאיים ופני השטח שיפרה משמעותית את הזיהוי של תת-קבוצות תאים בתדר נמוך19. יכולות אלו מתגברות על מגבלות מסורתיות ומספקות תובנות עמוקות יותר לגבי נופי מערכת החיסון, ומניעות התקדמות באימונולוגיה ובפיתוח טיפולי. היכולת לאפיין באופן מקיף פנוטיפים ותפקודים תאיים ברמת התא הבודד מקדמת מאוד את ההבנה של תהליכים אימונולוגיים ומסייעת בפיתוח טיפולים ממוקדים.

ציטומטריית מסה מספקת תובנות מקיפות לגבי אוכלוסיות תאי החיסון המערכתיות והמקומיות ב-HCC על ידי זיהוי בו זמנית של סמני חלבון מרובים. טכנולוגיה זו יכולה להבחין בין סוגים שונים של תאי T בתוך המיקרו-סביבה של הגידול, כגון תאי T אפקטור, תאי T רגולטוריים (Tregs) ותאי T מותשים, ולהבהיר את תפקידיהם הספציפיים בהתקדמות הגידול. על ידי שימוש בציטומטריית מסה, חוקרים יכולים לזהות סמנים חיסוניים הקשורים לפרוגנוזה של HCC20. לדוגמה, תת-קבוצות של תאי T עם ביטוי גבוה של חלבון מוות תאי מתוכנת 1 (PD-1) יכולות לשמש כמנבאים לתגובת המטופל למעכבי מחסום חיסוני21. בנוסף, הוא מקל על גילוי מטרות טיפוליות חדשות על ידי זיהוי מולקולות מדכאות חיסון ספציפיות, ובכך מספק בסיס לאסטרטגיות טיפול מותאמות אישית. היכולת של הטכנולוגיה לזהות סמנים מרובים ורזולוציה של תא בודד הופכים אותה ליתרון במיוחד לחשיפת מטרות טיפוליות חדשות ולתכנון אימונותרפיה משולבת. גישה מתקדמת זו טומנת בחובה פוטנציאל משמעותי לשיפור תוצאות הטיפול בחולי HCC על ידי הצעת הבנה מפורטת של הנוף החיסוני ומתן אפשרות לפיתוח התערבויות טיפוליות מותאמות אישית.

מחקר זה נועד להשתמש בציטומטריית מסה כדי לנתח את פרופילי תאי החיסון המערכתיים והמקומיים של חולים עם HCC. המטרות הן לאפיין את אוכלוסיות תאי החיסון, לתאם מאפיינים אלה עם תוצאות קליניות ותגובות טיפוליות, ולזהות סמנים חיסוניים ספציפיים ותת-קבוצות תאים הקשורים לפרוגנוזה של HCC. על ידי הבהרת התפקידים של תאים חיסוניים שונים בתגובות לטיפול, מחקר זה מבקש לספק בסיס לאסטרטגיות טיפול מותאמות אישית. הממצאים צפויים לייעל את האימונותרפיות הקיימות ולהציע תובנות חשובות לפיתוח טיפולים חדשים, שמטרתם בסופו של דבר לשפר את ההישרדות הכוללת ואיכות החיים של חולי HCC.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השלבים לאיסוף דגימות דם ו-HCC, בידוד תאים חד-גרעיניים בדם היקפי (PBMCs), דיסוציאציה של תא בודד וצביעה מתוארים בתוכנית הבאה. הריאגנטים והחומרים הניסיוניים מופיעים כולם בטבלת החומרים. כל הניסויים בוצעו באישור ועדת האתיקה של בית החולים המסונף הראשון, בית הספר לרפואה, אוניברסיטת ג'ג'יאנג, והבטיחו שאיסוף דגימות הגידול לא יפריע לאבחון הפתולוגי. הסכמה מדעת בכתב התקבלה מכל הנבדקים האנושיים.

1. בידוד PBMCs

  1. קחו דגימת דם מהווריד של חולי HCC והשתמשו בצינור מלא בנוגדי קרישה כדי למנוע את קרישת הדם. דגימות דם נלקחו מ-4 חולים (2 גברים ו-2 נשים) בגילאי 50-60 שנים, עם גיל ממוצע של 55 שנים. עבור כל מטופל, אסוף 10-20 מ"ל של דם היקפי כדי להבטיח נפח מספיק לבידוד PBMCs לאחר מכן תוך מזעור אי הנוחות של המטופל.
  2. שאבו נפח מסוים של דם (למשל, 6 מ"ל) והוסיפו נפח שווה של נוזל הפרדת לימפוציטים בדם היקפי (Ficol-paque או Lymphoprep) לצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל.
    הערה: הנפח הכולל לא יעלה באופן אידיאלי על 12 מ"ל כדי לאפשר מקום לערבוב נכון ולמנוע הצפת יתר; הנפח המרבי המומלץ לצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל הוא 14 מ"ל.
  3. הטה את צינור הצנטריפוגה ב-45 מעלות והוסף לאט את הדם לאורך דופן הצינור, הנח בזהירות את הדם לאט על גבי נוזל הפרדת לימפוציטים בדם היקפי כדי למנוע ערבוב של שתי השכבות.
    הערה: ניתן להשתמש בפיפט כדי להוסיף דם לאט לאורך דופן הצינור.
  4. הנח את צינור הצנטריפוגה בצנטריפוגה והגדר את התאוצה על 8 וההאטה על 3. צנטריפוגה בטמפרטורה של 450 x גרם, 4 מעלות צלזיוס, למשך 30 דקות. לאחר הצנטריפוגה נוצרות 4 שכבות במבחנה, מלמעלה למטה: שכבת פלזמה, שכבת PBMCs (שכבת קרום לבן), שכבת Ficol-Paque ושכבת כדוריות דם אדומות וגרנולוציטים.
  5. בעזרת פיפטה, אספו בזהירות את שכבת ה-PBMCs לתוך צינור צנטריפוגה סטרילי חדש. הוסף פי 3 מהנפח של PBS וצנטריפוגה ב-500 x גרם ב-4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. לאחר הצנטריפוגה נוצרת גלולה בתחתית הצינור.
  6. השליכו את הסופרנטנט באמצעות פיפטה, הוסיפו 1 מ"ל של 2% מלח סרום-פוספט עוברי (FBS-PBS) כדי להשעות מחדש את התאים, ולאחר מכן הוסיפו 3 מ"ל של מאגר ליזה של תאי דם אדומים (RBC). צנטריפוגה ב-500 x גרם ב-4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
  7. ודא שאין תאי דם אדומים בתחתית הצינור, מה שמעיד על כך שתאי הדם האדומים עברו ליזה מלאה. השעו מחדש את התאים ב-2% FBS-PBS והמשיכו ישירות בניסויים הבאים, או הוסיפו תמיסת שימור בהקפאת תאים ואחסנו בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס למשך 2-3 חודשים.
    הערה: כהנחיה כללית, להשעיה מחדש, השתמש ב-0.5 מ"ל של 2% FBS-PBS לכל 1 x 106 תאים. ספירת התאים נקבעת באמצעות המוציטומטר או מונה תאים אוטומטי לאחר צביעה כחולה של טריפן כדי להבחין בין תאים חיים לתאים מתים. יחס זה מסייע להבטיח התאוששות תאים אופטימלית וכדאיות במהלך ההליכים הבאים.

2. בידוד תאי רקמת הגידול

הערה: השיטה לבידוד תאי רקמת הגידול הותאמה מ- Song et al.22.

  1. לאחר כריתת ה- HCC, בהנחיית פתולוג, השתמש באזמל סטרילי כדי לכרות חלק מרקמת הגידול. גוש הרקמות צריך להיות בגודל של כ-1 ס"מ3 . שטפו את כל כתמי השטח עם PBS 1x מקורר מראש. טבלו את הרקמה בצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל המכיל כ-5 מ"ל של מדיום RPMI 1640 המכיל 10% FBS. הניחו את הצינור על קרח והעבירו אותו בחזרה למעבדה להמשך עיבוד.
  2. שטפו היטב את כתמי הדם והסירו ידנית רקמת חיבור שומנית באמצעות מלקחיים כדי להבטיח ניקוי רקמות מלא עם 2% FBS-PBS מקורר מראש. העבירו את הרקמה לכלי שטופל בתרבית רקמות המכיל תמיסת עיכול. אבטח את רקמת הגידול בעזרת מלקחיים וחתך אותה לחתיכות קטנות מ -1 מ"מ3 בעזרת אזמל. העבירו את תמיסת עיכול הרקמות לצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל, והוסיפו עוד תמיסת עיכול רקמות עד שהנפח הכולל הוא כ-15 מ"ל.
  3. מניחים את צינור הצנטריפוגה המכיל את תערובת עיכול הרקמות בשייקר. הטה או שטח אותו ואבטח אותו לעיכול ב-150 סל"ד ו-37 מעלות צלזיוס למשך שעה. מסננים את תמיסת העיכול דרך פילטר של 70 מיקרומטר.
    1. במהלך הליך זה, השתמש בבוכנת מזרק של 1 מ"ל כדי לטחון את שברי הרקמות. שוטפים את המסנן בתמיסת FBS-1640 של 2%. קח את המסנן והעביר אותו לצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל.
  4. צנטריפוגה את המסנן ב-500 x גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. לאחר הצנטריפוגה, השליכו את הסופרנטנט. השעו מחדש בזהירות את הגלולה בכ-10 מ"ל של תמיסת פרקול 36%. לאחר מכן, צנטריפוגה אותו שוב ב-500 x גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
  5. שאפו בעדינות 1 מ"ל של מאגר ליזה RBC עם פיפטה כדי להשעות מחדש את תרחיף התאים. העבירו את המתלה לצינור צנטריפוגה חדש של 15 מ"ל והוסיפו את מאגר הליזיס RBC כדי להגיע לנפח כולל של 10 מ"ל. תנו לתערובת לשבת בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.
    הערה: צינור צנטריפוגה חדש משמש למניעת זיהומים על דופן הצינור להיכנס מחדש לתרחיף התא, ובכך להפחית את הסיכון לירידה בתפוקת התאים.
  6. צנטריפוגה את תרחיף התאים ב-500 x g למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן השעו מחדש את התאים בנפח מתאים של 2% FBS-PBS. כהנחיה כללית, השתמש ב-0.5 מ"ל של 2% FBS-PBS לכל 1 x 106 תאים להשעיה מחדש.
    הערה: ספירת התאים נקבעת על ידי שימוש בהמוציטומטר או במונה תאים אוטומטי לאחר צביעה כחולה של טריפן כדי להבחין בין תאים חיים לתאים מתים. נפח ההשעיה מחדש תלוי בכמות התאים הנדרשת לניסויים הבאים. יחס זה מסייע להבטיח התאוששות תאים אופטימלית וכדאיות במהלך ההליכים הבאים.

3. מכתים ציספלטין

  1. קח 3 x 106 תאים מה-PBMCs שהתקבלו בשלב 1.7 ותאי הגידול שבודדו בשלב 2.6, בהתאמה. לאחר התאוששות התאים, השעו אותם ב-1 מ"ל PBS ללא Ca2+ ו-Mg2+. מוסיפים ציספלטין לריכוז סופי של 0.5 מיקרומטר, מערבבים היטב ודוגרים בטמפרטורת החדר למשך 2 דקות.
    הערה: צביעת ציספלטין מתבצעת כדי להבחין בין תאים מתים לתאים חיים על סמך שלמות הממברנה. תאים מתים עם ממברנות שנפגעו יספגו ציספלטין ויראו אות חיובי, בעוד שתאים חיים נשארים ללא כתמים23. מספר התאים חייב להיות לפחות 1 x 106.
  2. צנטריפוגה את הצינורות ב-500 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, השליכו את הסופרנטנט ואז הוסיפו 1 מ"ל של מאגר צביעת תאים לכל צינור המכיל את תרחיפי התאים שהוכנו בשלב 3.1 כדי לעצור את התגובה. צנטריפוגה ב-500 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, השליכו את הסופרנטנט וודאו שגלולת התא אינה מופצת באופן ליניארי לאורך דופן הצינור לאחר צנטריפוגה.

4. חסימת קולטן FC

  1. הכן מראש תערובת בלוק של 50 מיקרוליטר עבור כל דגימה: שלב 48 מיקרוליטר של מאגר צביעת תאים, ולאחר מכן הוסף 2 מיקרוליטר של תמיסת חסימת Fc (מאגר צביעת תאים: תמיסת חסימת Fc = 9:1).
  2. השעו את התאים משלב 3.2 בתערובת הנ"ל ותנו להם לשבת בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.

5. דגירה של נוגדנים לחלבון ממברנה

  1. עבור כל דגימת תא המתקבלת משלב 4.2, הכינו את תערובת הנוגדנים של חלבון הממברנה על ידי הוספת יחידות של 1.1 מיקרוליטר מכל נוגדן. לאחר מכן, הוסף מאגר צביעת תאים כדי להגיע לנפח סופי של 55 מיקרוליטר. בשלב זה, הנפח הכולל הוא כ -100 מיקרוליטר.
    הערה: התערובת כוללת נוגדנים המכוונים לחלבוני ממברנה מרכזיים, כגון CD163, CCR3, CD141, CD117 ו-CD4524,25. נוגדנים אלה נבחרו בשל הספציפיות שלהם בזיהוי סמני חלבון ממברנה והתקבלו ממקורות זמינים מסחרית (ראה טבלת חומרים לפרטים, כולל מספרי שיבוטים, יצרנים ומספרי קטלוג).
  2. הוסף 50 מיקרוליטר של תערובת נוגדנים מוכנה לכל דגימת צינור, הביא את הנפח הכולל ל-100 מיקרוליטר. סובב בעדינות את הדגימות ודגר אותן בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.
  3. הוסף 2 מ"ל של מאגר צביעת תאים לכל דגימה, צנטריפוגה ב-500 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, והשליך את הסופרנטנט. חזור על שלב זה פעמיים.
  4. השליכו את הסופרנטנט ומערבלו לזמן קצר את הנוזל שנותר עם כדור התא כדי להשהות מחדש ולפזר את התא ביסודיות.

6. צביעת חלבון גרעין

  1. לאחר שהתאים הושעו במלואם, הוסף 500 מיקרוליטר מהתמיסה המעורבת (קיבוע: קיבוע/חדירות = 3:1) לכל דגימה משלב 5.4. מערבבים בעדינות את הדגימות ודוגרים בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
  2. יש לדלל את מאגר החדירות (פי 10) במים נטולי יונים. לאחר הדגירה, יש לצנטריפוגה בחום של 500 גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר ולהשליך את הסופרנטנט. הוסף 1000 מיקרוליטר של מאגר חדירות 1x לכל צינור כדי לשטוף את התאים. צנטריפוגה בטמפרטורת החדר ב-1,000 x גרם למשך 5 דקות, ואז השליכו את הסופרנטנט.
  3. השעו מחדש נוגדנים במאגר חדירות 1x. השליכו את הסופרנטנט, והוסיפו 50 מיקרוליטר מתערובת הנוגדנים לכל צינור של תאים. פיפטה בעדינות את התאים לערבוב, ואז דגירה בטמפרטורת החדר למשך 30-45 דקות.
  4. הוסף 1000 מיקרוליטר של מאגר חדירות 1x לכל צינור, צנטריפוגה בטמפרטורת החדר ב-1,000 x גרם למשך 5 דקות, והשליך את הסופרנטנט.
  5. הוסף 1000 מיקרוליטר של מאגר צביעת תאים לכל צינור כדי להשעות מחדש את התאים, צנטריפוגה בטמפרטורת החדר ב-1,000 x גרם למשך 5 דקות, והשליך את הסופרנטנט.

7. קיבוע תאים

  1. הכן תמיסת פורמלדהיד 1.6% ב-PBS, עם 1 מ"ל הדרוש לכל דגימה.
  2. הוסף 1 מ"ל של תמיסת פורמלדהיד 1.6% לכל דגימה משלב 6.5, מערבולת לערבב היטב ולדגור בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.
    הערה: בעוד שפורמלדהיד משמש בדרך כלל לקיבוע תאים, ניתן להשתמש גם בריאגנטים חלופיים כגון 4% פרפורמלדהיד (PFA) או מתנול. בחירת הקיבוע צריכה להתבסס על הדרישות הספציפיות של הניסוי ועל התכונות הסלולריות שיש להקפיד עליהן.
  3. צנטריפוגה בטמפרטורת החדר ב-800 x גרם למשך 5 דקות והשליכו את הסופרנטנט.

8. צביעת אינטרקלציה גרעינית

  1. הכנת תמיסת אינטרקלציה של תאים: דילול Cell-ID Intercalator-Iridium (Ir) עם מאגר Fix וחדירות לריכוז סופי של 125 ננומטר. הכן 1 מ"ל של התמיסה לכל דגימה.
  2. הוסף 1 מ"ל מתמיסת שילוב התאים המוכנה לכל דגימה קבועה משלב 7.3. מערבבים בעדינות ומערבלים מיד. זה עוזר למזער את היווצרות אגרגטים של תאים.
  3. יש לדגור בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת או בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. צנטריפוגה בחום של 500 גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, והשליכו את הסופרנטנט.

9. הכנת תרחיף תאים

  1. הוסף 1000 מיקרוליטר של מאגר צביעת תאים לצינור משלב 8.3 וצנטריפוגה ב-800 x גרם למשך 5 דקות. השליכו את הסופרנטנט. חזור על שלב זה פעמיים.
  2. הוסף 450 מיקרוליטר ל-900 מיקרוליטר של מים נטולי יונים כדי להשעות מחדש את התאים. ספרו את התאים באמצעות המוציטומטר או מונה תאים אוטומטי לאחר צביעה כחולה של טריפאן. לאחר הספירה, המשך באיסוף וניתוח נתונים באמצעות ציטומטריית מסה.

10. ציטומטריית מסה וניתוח נתונים

  1. רכוש נתוני ציטומטריית מסה באמצעות מערכת CyTOF ושמור אותם כקבצי Flow Cytometry Standard (FCS). הקפידו על כיול ובקרת איכות נאותים של המכשיר כדי להפחית רעשי רקע ואפקטים של אצווה בהתאם להוראות היצרן.
  2. עבד מראש את אוכלוסיית התאים CD45+ בקובץ FCS באמצעות התוכנה המשויכת. הסר פסולת על סמך גודל התא (פיזור קדימה, FSC) וגרעיניות (פיזור צד, SSC). אל תכלול כפולות על ידי שער רציף של עלילות FSC-A/FSC-H או SSC-A/SSC-H. הסר תאים מתים באמצעות צביעת חיות, כגון אי הכללת ציספלטין. גב את אוכלוסיית CD45+ להתמקד בתאי חיסון ולייצא את האוכלוסייה המגודרת להמשך ניתוח.
  3. שנה את הנתונים עם גורם משלים של 5 וזהה את האשכולות העיקריים באמצעות תוכנת אשכולות. בצע אשכולות על סמך אלגוריתם ניתוח התקדמות העץ המורחב של אירועים מנורמלים בצפיפות (SPADE), המקבץ תאים עם פרופילי ביטוי סמנים דומים לאשכולות26. השתמש בהטמעת שכן סטוכסטית היררכית (HSNE) להפחתת מימדים וזיהוי אשכולות מובחנים26.
  4. בצע אשכולות מחדש של האשכולות העיקריים באמצעות חבילת cytofkit בתוכנת R עבור אשכולות ללא פיקוח. זהה תת-אשכולות עם PhenoGraph באמצעות פרמטרי ברירת מחדל.
  5. החל קירוב והקרנה של סעפת אחידה (UMAP) להפחתת מימדיות. בצע ניתוח סטטיסטי באמצעות מבחן Wilcoxon, תוך התחשבות בערך P < 0.05 כמובהק סטטיסטית. דמיין את התוצאות באמצעות ggplot2.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כדי להבהיר את המאפיינים האימונולוגיים הקשורים ל-HCC, נערך ניתוח מקיף של אוכלוסיות תאי חיסון. דגימות רקמה מזווגות של PBMCs ו-HCC נאספו מ-4 חולים עם HCC. פרופיל ציטומטריה מסה בוצע כדי לבחון אוכלוסיות תאי חיסון ברמה הפרוטאומית של תא בודד, באמצעות שני לוחות נוגדנים הן עבור PBMCs והן עבור דגימות רקמת HCC.

לאחר בקרת איכות, 45,326 תאים נכללו בניתוח ציטומטריית המסה. אלגוריתם האשכולות של PhenoGraph, בשיל...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה ממנף את טכנולוגיית ציטומטריית המסה כדי לספק ניתוח מעמיק של תגובות חיסוניות מערכתיות ומקומיות ב-HCC. היישום של ציטומטריית מסה בהקשר זה מאפשר זיהוי בו זמנית של סמנים מרובים ברמת תא בודד, ומציע אפיון אימונופנוטיפי מפורט שהוא חיוני להבנת הנוף החיסוני המורכב של HCC. ציטומטריית מסה חוללה מהפכה במחקרים אימונולוגיים על ידי הקלה על ניתוח תא בודד בממדים גבוהים. טכניקה זו משתמשת בתגי איזוטופים נדירים של מתכת המצומדים לנוגדנים, ומאפשרת מדידה בו זמנית של למעלה מ-40 פרמטרים בריצה אחת. היכולת מ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין להם ניגודי אינטרסים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי התוכנית הלאומית למחקר ופיתוח מפתח של סין (מענק 2019YFA0803000 ל-J.S.), קרן הנוער המצוינת של Zhejiang Scientific (מענק R22H1610037 ל-J.S.), הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מענק 82173078 ל-J.S.), הקרן למדעי הטבע של מחוז ג'ה-ג'יאנג (מענק 2022C03037 ל-J.S).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
1×PBSHyCloneSH30256.01
10×PBSHyCloneSH30256.01
100 mm×20 mm tissue-culture-treated culture dishCorning430167
1000 mL pipette tipsRainin30389218
15 mL centrifuge tubeNEST601052
200 mL pipette tipsRainin30389241
40 mm nylon cell strainer/70-mm nylon cell strainerFalcon352340
50 mL centrifuge tubeNEST602052
70 μm syringe fifilterSangon BiotechF613462-9001
Anti-Human CCR2 Antibody (clone: K036C2)BioLegend357224
Anti-Human CCR3 Antibody (clone: 5E8)BioLegend310724
Anti-Human CCR7 Antibody (clone: G043H7)BioLegend353240
Anti-Human CD103 Antibody (clone: Ber-ACT8)BioLegend350202
Anti-Human CD115 Antibody (clone: 9-4D2-1E4)BioLegend347314
Anti-Human CD117 Antibody (clone: 104D2)BioLegend313201
Anti-human CD11b Antibody (clone: 1CRF44) BD562721
Anti-human CD11c Antibody (clone: B-ly6) BD563026
Anti-Human CD123 Antibody (clone: 6H6)BioLegend306002
Anti-Human CD127 Antibody (clone: A019D5)BioLegend351337
Anti-Human CD13 Antibody (clone: WM19)BioLegend301701
Anti-Human CD138 Antibody (clone: MI15)BioLegend356535
Anti-human CD14 Antibody (clone: HCD14)BioLegend325604
Anti-Human CD141 Antibody (clone: M80)BioLegend344102
Anti-Human CD15 Antibody (clone: QA19A61)BioLegend376302
Anti-human CD16 Antibody (clone: B7311) BD561313
Anti-Human CD161 Antibody (clone: HP-3G10)BioLegend339902
Anti-Human CD163 Antibody (clone: GHI/61)BioLegend333603
Anti-Human CD169 Antibody (clone: 7-239)BioLegend346002
Anti-human CD19 Antibody (clone: HIB19)BioLegend302226
Anti-Human CD1c Antibody (clone: L161)BioLegend331501
Anti-Human CD20 Antibody (clone: 2H7)BioLegend302301
Anti-Human CD206 Antibody (clone: 15-2)BioLegend321151
Anti-Human CD24 Antibody (clone: ML5)BioLegend311129
Anti-Human CD25 Antibody (clone: BC96)BioLegend302624
Anti-human CD3 Antibody (clone: UCHT1) BD555916
Anti-Human CD31 Antibody (clone: W18200D)BioLegend375902
Anti-Human CD32 Antibody (clone: FUN-2)BioLegend303232
Anti-Human CD326 Antibody (clone: CO17-1A)BioLegend369812
Anti-Human CD33 Antibody (clone: WM53)BioLegend303402
Anti-human CD4 Antibody (clone: L200) BD563094
Anti-Human CD45 Antibody (clone: HI30) BD563716
Anti-Human CD45RO Antibody (clone: UCHL1)BioLegend304220
Anti-human CD56 Antibody (clone: 5.1H11)BioLegend362510
Anti-Human CD64 Antibody (clone: S18012C)BioLegend399502
Anti-Human CD66b Antibody (clone: 6/40c)BioLegend392917
Anti-human CD68 Antibody (clone: Y1/82A)BioLegend333808
Anti-Human CD69 Antibody (clone: FN50)BioLegend310902
Anti-Human CD7 Antibody (clone: 4H9/CD7)BioLegend395602
Anti-human CD8 Antibody (clone: RPA-T8) BD557750
Anti-Human CD80 Antibody (clone: W17149D)BioLegend375402
Anti-Human CD86 Antibody (clone: BU63)BioLegend374202
Anti-Human FOXP3 Antibody (clone: 206D)BioLegend320101
Anti-Human HLA_ABC Antibody (clone: W6/32)BioLegend311426
Anti-human HLA-DR Antibody (clone: L243)BioLegend307650
Anti-Human IgD Antibody (clone: IA6-2)BioLegend348211
Anti-Human Ki67 Antibody (clone: Ki-67)BioLegend350501
Anti-Human PD_L2 Antibody (clone: MH22B2)BD567783
Anti-Human PD1 Antibody (clone: EH12.2H7)BioLegend329951
Anti-Human PDL1 Antibody (clone: MIH2)BioLegend393602
Anti-human TCR-γδ Antibody (clone: B1) BD74

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zhang, C. H., Cheng, Y., Zhang, S., Fan, J., Gao, Q. Changing epidemiology of hepatocellular carcinoma in Asia. Liver Int. 42 (9), 2029-2041 (2022).
  2. Renne, S. L., et al. Hepatocellular carcinoma: A clinical and pathological overview. Pathologica. 113 (3), 203-217 (2021).
  3. Sayiner, M., Golabi, P., Younossi, Z. M. Disease burden of hepatocellular carcinoma: A global perspective. Dig Dis Sci. 64 (4), 910-917 (2019).
  4. Zhang, X., et al. Risk factors and prevention of viral hepatitis-related hepatocellular carcinoma. Front Oncol. 11, 686962(2021).
  5. Zou, H., et al. Economic burden and quality of life of hepatocellular carcinoma in greater China: A systematic review. Front Public Health. 10, 801981(2022).
  6. Li, Y., You, Z., Tang, R., Ma, X. Tissue-resident memory t cells in chronic liver diseases: Phenotype, development and function. Front Immunol. 13, 967055(2022).
  7. Shen, K. Y., Zhu, Y., Xie, S. Z., Qin, L. X. Immunosuppressive tumor microenvironment and immunotherapy of hepatocellular carcinoma: Current status and prospectives. J Hematol Oncol. 17 (1), 25(2024).
  8. Oura, K., Morishita, A., Tani, J., Masaki, T. Tumor immune microenvironment and immunosuppressive therapy in hepatocellular carcinoma: A review. Int J Mol Sci. 22 (11), 5801(2021).
  9. Chen, Y., et al. Effect of infiltrating immune cells in tumor microenvironment on metastasis of hepatocellular carcinoma. Cell Oncol. 46 (6), 1595-1604 (2023).
  10. Du, Q., An, Q., Zhang, J., Liu, C., Hu, Q. Unravelling immune microenvironment features underlying tumor progression in the single-cell era. Cancer Cell Int. 24 (1), 143(2024).
  11. Xu, L., et al. Reshaping the systemic tumor immune environment (stie) and tumor immune microenvironment (time) to enhance immunotherapy efficacy in solid tumors. J Hematol Oncol. 15 (1), 87(2022).
  12. Mao, X., et al. Crosstalk between cancer-associated fibroblasts and immune cells in the tumor microenvironment: New findings and future perspectives. Mol Cancer. 20 (1), 131(2021).
  13. Roederer, M. Spectral compensation for flow cytometry: Visualization artifacts, limitations, and caveats. Cytometry. 45 (3), 194-205 (2001).
  14. Sahaf, B., Rahman, A., Maecker, H. T., Bendall, S. C. Biomarkers for immunotherapy of cancer: Methods and protocols. , Springer. New York, New York, NY. (2020).
  15. Turaç, G., et al. Combined flow cytometric analysis of surface and intracellular antigens reveals surface molecule markers of human neuropoiesis. PLoS One. 8 (6), e68519(2013).
  16. Wu, K., et al. Redefining tumor-associated macrophage subpopulations and functions in the tumor microenvironment. Front Immunol. 11, 1731(2020).
  17. Elaldi, R., et al. High dimensional imaging mass cytometry panel to visualize the tumor immune microenvironment contexture. Front Immunol. 12, 666233(2021).
  18. Gadalla, R., et al. Validation of cytof against flow cytometry for immunological studies and monitoring of human cancer clinical trials. Front Oncol. 9, 415(2019).
  19. Ijsselsteijn, M. E., Van Der Breggen, R., Farina Sarasqueta, A., Koning, F., De Miranda, N. A 40-marker panel for high dimensional characterization of cancer immune microenvironments by imaging mass cytometry. Front Immunol. 10, 2534(2019).
  20. Zhang, Q., et al. Mass cytometry-based peripheral blood analysis as a novel tool for early detection of solid tumours: A multicentre study. Gut. 72 (5), 996-1006 (2023).
  21. Zheng, B., et al. Trajectory and functional analysis of pd-1(high) cd4(+)cd8(+) t cells in hepatocellular carcinoma by single-cell cytometry and transcriptome sequencing. Adv Sci. 7 (13), 2000224(2020).
  22. Song, J., et al. Protocol for isolating single cells from human pancreatic cancer tissues and analyzing major immune cell populations using flow cytometry. STAR Protoc. 4 (4), 102679(2023).
  23. Simoni, Y., Chng, M. H. Y., Li, S., Fehlings, M., Newell, E. W. Mass cytometry: A powerful tool for dissecting the immune landscape. Curr Opin Immunol. 51, 187-196 (2018).
  24. Comi, M., et al. Coexpression of cd163 and cd141 identifies human circulating il-10-producing dendritic cells (dc-10). Cell Mol Immunol. 17 (1), 95-107 (2020).
  25. Fan, L., et al. High-dimensional single-cell analysis delineates peripheral immune signature of coronary atherosclerosis in human blood. Theranostics. 12 (15), 6809-6825 (2022).
  26. Sheng, J., et al. Human endogenous retrovirus activation contributes to biliary atresia pathogenesis through re-education of resident macrophages. Biorxiv. , (2022).
  27. Terekhova, M., et al. Single-cell atlas of healthy human blood unveils age-related loss of nkg2c(+)gzmb(-)cd8(+) memory t cells and accumulation of type 2 memory t cells. Immunity. 56 (12), 2836-2854.e9 (2023).
  28. Sathaliyawala, T., et al. Distribution and compartmentalization of human circulating and tissue-resident memory t cell subsets. Immunity. 38 (1), 187-197 (2013).
  29. Lee, S., Vu, H. M., Lee, J. H., Lim, H., Kim, M. S. Advances in mass spectrometry-based single cell analysis. Biology. 12 (3), 395(2023).
  30. Iyer, A., Hamers, A. A. J., Pillai, A. B. Cytof for the masses. Front Immunol. 13, 815828(2022).
  31. Yuan, X., Wang, J., Huang, Y., Shangguan, D., Zhang, P. Single-cell profiling to explore immunological heterogeneity of tumor microenvironment in breast cancer. Front Immunol. 12, 643692(2021).
  32. Serban, G. M., Mănescu, I. B., Manu, D. R., Dobreanu, M. Optimization of a density gradient centrifugation protocol for isolation of peripheral blood mononuclear cells. Acta Marisiensis - Seria Medica. 64 (2), 83-90 (2018).
  33. Shcherbakova, A., et al. Factors affecting cell viability during the enzymatic dissociation of human endocrine tumor tissues. Biology (Basel). 13 (9), 665(2024).
  34. Devine, R. D., Alkhalaileh, H. S., Lyberger, J. M., Behbehani, G. K. Alternative methods of viability determination in single cell mass cytometry. Cytometry A. 99 (10), 1042-1053 (2021).
  35. Gonzalez, V. D., Huang, Y. W., Fantl, W. J. Mass cytometry for the characterization of individual cell types in ovarian solid tumors. Methods Mol Biol. 2424, 59-94 (2022).
  36. Zabransky, D. J., et al. Profiling of syngeneic mouse hcc tumor models as a framework to understand anti-pd-1 sensitive tumor microenvironments. Hepatology. 77 (5), 1566-1579 (2023).
  37. Levine, L. S., et al. Single-cell analysis by mass cytometry reveals metabolic states of early-activated cd8(+) t cells during the primary immune response. Immunity. 54 (4), 829-844.e5 (2021).
  38. Lv, B., et al. Immunotherapy: Reshape the tumor immune microenvironment. Front Immunol. 13, 844142(2022).
  39. Zhou, Z., et al. Deciphering the tumor immune microenvironment from a multidimensional omics perspective: Insight into next-generation car-t cell immunotherapy and beyond. Mol Cancer. 23 (1), 131(2024).
  40. Hsieh, W. C., et al. Spatial multi-omics analyses of the tumor immune microenvironment. J Biomed Sci. 29 (1), 96(2022).
  41. Wang, Z., et al. Gdf15 induces immunosuppression via cd48 on regulatory t cells in hepatocellular carcinoma. J Immunother Cancer. 9 (9), e002787(2021).
  42. Krams, S. M., Schaffert, S., Lau, A. H., Martinez, O. M. Applying mass cytometry to the analysis of lymphoid populations in transplantation. Am J Transplant. 17 (8), 1992-1999 (2017).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Immune ProfilingCyTOF AnalysisPeripheral BloodTumor Immune ResponseSingle Cell AnalysisImmune Cell SubsetsBiomarker DiscoverySPADE Clustering

מאמרים קשורים