מאמר שיטה

התקדמות בתאי הרג טבעיים המבטאים קולטני אנטיגן כימריים פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם

DOI:

10.3791/67438

⸱

14 בפברואר 2025

 , 
1Department of Medicine, Division of Regenerative Medicine, University of California, San Diego, 2Sanford Stem Cell Institute, University of California, San Diego

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מציגים שיטה להבדיל ולהרחיב תאי הרג טבעיים המבטאים קולטן אנטיגן כימרי (CAR) אנושי שמקורו ב-iPSC עם הרג משופר כנגד ממאירויות שונות. פרוטוקול זה מדגים את ההתמיינות וההרחבה של תאי CAR-NK שמקורם ב-iPSC אופטימליים של הרג טבעי (NK) ומדידת פעילות אנטי-גידולית כנגד קווי תאי גידול שונים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תאי הרג טבעיים (NK) הם תאי חיסון מולדים הממלאים תפקיד מכריע בהגנה של הגוף מפני גידולים וזיהומים נגיפיים. הדור של קולטן אנטיגן כימרי (CAR) שמקורו בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (iPSC) המבטא תאי NK התגלה כדרך מבטיחה לאימונותרפיה "מהמדף" של סרטן. כאן, השתמשנו במבנה CAR מותאם לתאי NK הכולל את התחום הטרנסממברני של NKG2D, תחום הגירוי המשותף 2B4 ותחום האיתות CD3ζ, שהוכח כמעורר פעילות אנטי-גידולית חזקה בתיווך תאי NK ספציפיים לאנטיגן. השימוש ב-iPSCs ליצירת תאי CAR NK מציע מספר יתרונות, כולל ביטוי הומוגני של CAR, מדרגיות, יכולת שחזור ופוטנציאל ליישום קליני. פרוטוקול מפורט זה שלב אחר שלב מהנדסת תאים להתמיינות מאפשר יצירת תאי NK המבטאים תאי NK המבטאים iPSC שמקורם בתאי NK, ומספק אימונותרפיה סטנדרטית וממוקדת לסרטן עם פעילות אנטי-גידולית משופרת ומדגיש את הפוטנציאל שלהם כאופציה טיפולית מבטיחה לממאירות שונות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תאי NK, סוג של לימפוציטים בתוך מערכת החיסון המולדת, הם חיוניים בהגנה המוקדמת מפני גידולים ותאים נגועים בנגיף 1,2,3. בניגוד לתאי T, תאי NK אינם דורשים הצגת אנטיגן באמצעות מולקולות קומפלקס תאימות היסטולוגית (MHC). במקום זאת, לתאי NK יש רפרטואר של קולטנים מפעילים ומעכבים המווסתים את פעילותם3. פעילות ציטוטוקסית בתיווך תאי NK משתמשת במנגנונים שונים, כולל שחרור פרפורין וגראנזימים, מעורבות קולטני מוות וייצור ציטוקינים פרו-דלקתיים כגון IFN-γ ו-TNF-α. אופן פעולה ייחודי זה מציב את תאי NK כמועמד אטרקטיבי לאימונותרפיה של סרטן, במיוחד בטיפול בסרטן מוצק שבו התחמקות חיסונית מהווה מכשול משמעותי 1,2,3,4.

קרצינומה של הכבד (HCC) היא אחת הצורות הנפוצות והקטלניות ביותר של סרטן הכבד ברחבי העולם5. גישות טיפוליות מסורתיות, כולל ניתוח, כימותרפיה והקרנות, מספקות בדרך כלל תועלת קלינית מוגבלת ומביאות לשיעורי הישנות גבוהים 6,7. ההתקדמות האחרונה באימונותרפיה ובטיפול ממוקד השפיעה באופן משמעותי על הטיפול ב-HCC 8,9. מעכבי נקודות ביקורת חיסוניות, כמו ניבולומאב ופמברוליזומאב, הראו תוצאות מבטיחות על ידי שיפור תגובת תאי החיסון נגד תאים סרטניים10,11. טיפולים אלה הובילו לשיפור בשיעורי ההישרדות ולאיכות חיים טובה יותר עבור חלק מהחולים. עם זאת, הם יכולים גם לגרום לתופעות לוואי הקשורות למערכת החיסון, שעלולות להגביל את השימוש בהם בחולים מסוימים12. טיפולים ממוקדים, כגון סורפניב ולנווטיניב, מעכבים באופן ספציפי מסלולים המקדמים צמיחת תאים סרטניים ואנגיוגנזה13. טיפולים אלה ידועים כיעילים לשליטה בהתקדמות המחלה ולהאריך את ההישרדות 8,14. עם זאת, עמידות לטיפולים ממוקדים מתפתחת בדרך כלל, ותופעות הלוואי של הטיפול שכיחות15,16. בין האפיקים המבטיחים באסטרטגיות אימונותרפיות לסרטן, הופעתם של תאי CAR T קולטני אנטיגן כימריים (CAR) חוללה מהפכה בטיפול בסרטן, במיוחד בטיפול בגידולים המטולוגיים כגון לימפומה ומיאלומה נפוצה 17,18,19.

תאי NK המבטאים CAR, המשלבים את הפעילות הציטוטוקסית המולדת של תאי NK עם מיקוד מדויק של טכנולוגיית CAR, מייצגים גישה חדשנית ובעלת פוטנציאל טרנספורמטיבי לגידולים מוצקים כגון HCC 20,21,22,23,24. תאים מהונדסים על ידי CAR יכולים לזהות ולהרוג באופן ספציפי תאי גידול המבטאים את אנטיגן המטרה תוך שמירה על רקמות נורמליות, ובכך להפחית את הסיכון להשפעות מחוץ למטרה הקשורות לטיפולים קונבנציונליים 25,26,27. תאי CAR-NK המיוצרים מתאי NK המבודדים מדם היקפי או מדם טבורי מיוצרים בדרך כלל על ידי התמרת תאי NK עם מבני CAR המורכבים מתחום זיהוי אנטיגן חוץ-תאי, תחום טרנסממברני ותחומי איתות תוך-תאיים הנחוצים להפעלה והתפשטות 28,29,30.

ניתן לטפל באתגר של הנדסת אוכלוסייה יציבה והומוגנית של תאי NK מהונדסים תפקודית לטיפול קליני על ידי שימוש בתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs)31,32. הנדסה של iPSCs אנושיים עם CARs מותאמים לתאי NK מספקת אות הפעלה והתפשטות משופר של תאי NK ומספקת אוכלוסייה בלתי נדלית והומוגנית של תאי NK המבטאים CAR כ"טיפול מדף" סטנדרטי20,33. בפרוטוקול זה, שינוי גנטי של iPSCs ליצירת תאי NK שמקורם ב-iPSC המבטאים CAR כרוך בשילוב מבנה CAR מותאם לתאי NK הכולל תחומי טרנסממברנה ואיתות שמקורם בתאי NK (NKG2D-2B4-CD3ζ) ואנטי-גליפיקן-3 (GPC3) scFv כפי שתואר במחקרים הקודמים שלנו23. לאחר מכן, ה-iPSCs המהונדסים גנטית מתמיינים ומורחבים באמצעות פרוטוקול התמיינות תאי NK שפותח בעבר34. לתאי NK מהונדסים אלה שמקורם ב-iPSC יש את היכולת לזהות ולחסל HCC ותאי גידול אחרים המבטאים אנטיגנים ספציפיים הקשורים לגידול, כגון Glypican 3 (GPC3), המתבטא יתר ב-HCC ובממאירויות אחרות 35,36,37,38.

היישום של תאי CAR-NK שמקורם ב-iPSC לטיפול בסוגי סרטן מגוונים טומן בחובו הבטחה משמעותית 30,39,40; רבים מתאי CAR-NK שמקורם ב-iPSC נמצאים כעת בניסויים קליניים 41,42,43. כדי להקל על ההתקדמות בתחום זה, פרוטוקול זה מאפשר ייצור יעיל של תאי CAR-NK מהונדסים שמקורם ב-iPSC, מהנדסת תאים ועד התמיינות לתאי NK בוגרים והרחבה במבחנה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. שיטת תרבית ללא מזין של iPSCs אנושיים

הערה: הפשירו את ה-iPSCs האנושיים הקפואים והלא מובחנים ותרבו אותם באמצעות mTeSR 1-plus על צלחות מצופות מראש של Matrigel (להלן מטריצת ממברנת הבסיס [BMM]), כפי שתואר קודם לכן23,34. חשוב מאוד לוודא שה-iPSCs אינם מובחנים לפני ואחרי ההנדסה. יש לתרבת iPSCs שזה עתה הופשרו במשך כ-2-3 מעברים כדי להציג מורפולוגיה פלוריפוטנטית התואמת את תאי הגזע הפלוריפוטנטיים האנושיים. ההוראות הבאות משמשות להעברת תאים מבאר אחת של צלחת בת 6 בארות.

  1. לפני העברת iPSCs, יש לצפות את צלחת 6 הבארות החדשה ב-1x BMM (1 מ"ל/באר) ולדגור באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך 2-4 שעות לפני השימוש.
  2. הכן של 1x BMM מסיס.
    1. הפשירו בקבוקון מלאי של 5 מ"ל של BMM ב-4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
    2. בחר במהירות BMM באמצעות קצות מקוררים מראש לתוך צינורות מיקרו-צנטריפוגה מקוררים מראש.
    3. יש לאחסן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס למשך עד 6 חודשים.
    4. כדי להכין פתרון עבודה 1x BMM, השהה מחדש BMM אחד ביחס של 1:100 למדיום DMEM/F12 קר. ניתן לאחסן את פתרון העבודה 1x BMM בטמפרטורה של -4 מעלות צלזיוס למשך שבועיים.
    5. מצפים את הצלחת בנפח מספיק כדי לכסות את פני השטח (למשל, השתמש ב-1 מ"ל לבאר של צלחת 6 בארות).
    6. יש לדגור באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך 2-4 שעות לפני השימוש.
  3. יש להפשיר בקבוקון של iPSCs קפואים (בדרך כלל 1 × 106 תאים לבקבוקון) באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
  4. הוסיפו בהדרגה את ה-iPSCs המופשרים לתוך צינור חרוטי של 15 מ"ל המכיל 5 מ"ל של מדיום mTeSR Plus שחומם מראש, מה שמאפשר לתאים להתאקלם על ידי הוספתם טיפה אחר טיפה כדי למזער את ההלם התאי.
  5. צנטריפוגה את התאים ב -300 × גרם למשך 5 דקות.
  6. שאפו את הסופרנטנט ושטפו את התאים פעם אחת עם 5 מ"ל PBS.
  7. השעו מחדש את התאים במדיום mTeSR Plus וצלחו אותם בצפיפות של כ-200,000 תאים/3 מ"ל/באר בצלחת 6 בארות BMM מצופה מראש.
  8. תאי גזע iPSC של מעבר.
    1. לאחר שה-iPSCs מגיעים למפגש של 70-80%, שאפו את המדיה ובצעו מעבר של תא בודד עם TrypLE למשך 5 דקות ב-37 מעלות צלזיוס (1 מ"ל/באר בצלחת של 6 בארות).
    2. לאחר 5 דקות, הוסף 3 מ"ל של 1x PBS כדי לעצור את תגובת הדיסוציאציה ולשטוף את התאים פעם אחת עם 3 מ"ל PBS.
    3. צנטריפוגה את התאים ב -300 × גרם למשך 5 דקות. לאחר הכביסה, השעו מחדש את תאי ה-iPSC החד-תאיים במדיום mTeSR Plus, ולאחר מכן צלחו על צלחת 6 בארות מצופה מראש של BMM.
      הערה: נפח המדיה הכולל הנדרש הוא 3 מ"ל/באר בצלחת של 6 בארות. יש להחליף את המדיה כל 2-3 ימים, ויש לחזור על שלב 1.8 כאשר התאים הופכים ל-70-80% מתכנסים במשך 1-2 מעברים לפחות לפני הנדסת ה-iPSCs.
  9. בדוק באופן קבוע את הפלוריפוטנטיות של iPSCs. צבעו את ה-iPSCs עם נוגדן מצומד TRA-1-81 ו-PE-Cy7 מצומד לשלב אנטיגן 4 (SSEA-4) מצומד במשך 30 דקות על קרח, ולאחר מכן נתח אותם באמצעות ציטומטריית זרימה כפי שתואר קודם לכן23,41.
    הערה: תאי ה-iPSC ששימשו בניסוי הזה מותאמים ל-TrypLE. iPSCs שלא עברו בעבר עם TrypLE דורשים בדרך כלל 8-10 מעברים כדי להיות מותאמים באופן מלא ל-TrypLE, מה שמבטיח ייצור של גופי עוברי ספין (EBs) באיכות גבוהה.

2. הנדסת iPSCs אנושיים לביטוי אנטי-GPC3 CAR באמצעות וקטור piggyBac

  1. מצפים צלחת חדשה של 6 בארות ב-BMM ודוגרים בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת לפחות (זה יכול להיות ארוך יותר כל עוד הנוזל לא מתייבש).
  2. mTeSR Plus מחמם מראש עם מעכב 10 μM Rho, סליל מפותל המכיל חלבון קינאז (ROCK) (Y-27632) (ממלאי 1 מ"מ שהוכן במים מזוקקים סטריליים) ב-37 מעלות צלזיוס.
  3. הפעל את מערכת ה-Nucleofection. בחר/י את יחידת ה-X ולאחר מכן בחר/י את מיקומי הבארות שיש לבצע. בחר את פתרון P3 והזן את הקוד באופן ידני (CA-137).
  4. יש לקצור iPSCs במפגש של 70-80% עם 1 מ"ל TrypLE ולדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. בדוק מתחת למיקרוסקופ כדי לאשר את הדיסוציאציה.
  5. פיפטה 4-6 פעמים כדי לקבל מתלה חד-תא, ואז לנטרל עם 5 מ"ל PBS וגלולה ב-300 × גרם למשך 5 דקות.
  6. שטפו בעדינות את התאים פעם נוספת כדי להסיר את כל עקבות ה-TrypLE.
  7. השעו מחדש ב-1 מ"ל של mTeSR Plus עם מעכב סלע וספרו את התאים.
  8. כדי ליצור iPSCs אנטי-GPC3 CAR, השתמשו ב-1 ×-106 תאים לכל טרנספקציה בצינור מיקרו-צנטריפוגה וסובבו מטה ב-300 × גרם למשך 5 דקות.
  9. בזמן הסיבוב, שלב את ה-DNA של הטרנספוזון המבטא CAR עם וקטור ביטוי טרנספוזאז סופר PiggyBac בצינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מ"ל ביחס של 3:1 (למשל, 3 מיקרוגרם של פלסמיד המכיל את הטרנספוזון ל-1 מיקרוגרם של פלסמיד טרנספוזאז).
  10. כלול בקרה חיובית של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) (טבלת חומרים) באמצעות 0.5 מיקרוליטר של תמיסה של 1 מ"ג/מ"ל, ובקרה שלילית ללא טרנספקט כדי לאשר את ביטוי ה-GFP.
  11. השעו מחדש את גלולת התא בזהירות ב-20 מיקרוליטר של תמיסת נוקלאופקטור P3 בטמפרטורת החדר (RT) עם התוסף המסופק בערכת הנוקלאופקטיה. לאחר מכן, הוסף תערובת זו לצינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מ"ל המכיל DNA פלסמיד, וכתוצאה מכך נפח סופי של כ-22-25 מיקרוליטר.
    הערה: השעו מחדש את כל ה-iPSCs שיש להעביר בתמיסת P3 Nucleofector לפני הוספת פלסמידים GPC3 CAR או פלסמיד בקרת GFP לתאים.
  12. העבר את תרחיף התא/DNA לרצועות של 20 מיקרוליטר של 16 בארות. ודא שהדגימה מכסה את תחתית הקובט ללא בועות.
  13. הקש בעדינות על רצועות 16 בארות על החלק העליון של הספסל כדי להסיר בועות אוויר ולשקע תאים בתחתית.
  14. הנח את רצועות 16 הבארות המכילות iPSCs ותערובת DNA CAR לתוך מערכת Nucleofection, בחר את התוכנית CA-137, פתרון P3 ולאחר מכן התחל את התוכנית. תוכנית זו תסתיים בשנייה אחת ותציג סימון ירוק.
  15. הוסף לבאר 80 מיקרוליטר של mTeSR Plus מחומם מראש עם מדיום מעכב ROCK, והעביר בזהירות את התאים לצלחת 6 הבארות המצופה ב-BMM (נפח סופי של 1 מ"ל לבאר).
  16. בדוק בקצרה את התאים תחת מיקרוסקופ הקרינה לאחר 4 שעות עבור ביטוי GFP כלשהו כדי לאשר את שיעור ההצלחה של טרנספקציה.
  17. סקר iPSCs לביטוי GFP כדי להעריך את יעילות הטרנספקציה 24 שעות לאחר הטרנספקציה באמצעות ציטומטריית זרימה23,41 כדי לאשר את ביטוי ה-GFP.
  18. דגירה למשך 4 ימים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, החלפת המדיה כנדרש לפני שתמשיך לבחירת התרופה.
    הערה: כל נוקלאופקציה דורשת 0.2-2 x 106 iPSCs לכל תגובה. בהתאם למספר התגובות, ניתן להשתמש בצלחות 24 בארות או צלחות 6 בארות.

3. בחירה משובטת ואישור פלוריפוטנטיות של GPC3-CAR iPSCs

  1. בצעו סדרה של בחירות זאוצין (1:10,000) על ה-iPSCs שעברו טרנספטציה כדי לבחור באופן משובט GPC3-CAR iPSCs.
  2. כדי לאשר את יעילות הטרנספקציה, מדוד את ביטוי ה-GFP באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי וציטומטריית זרימה23,41.
    הערה: מבנה ה-CAR משולב עם FLAG tag44,45 לצורך הערכת ביטוי CAR הן בשלב ה-iPSC והן לאחר התמיינות תאי NK.
  3. שמור על ה-CAR iPSCs שעברו טרנספטציה תחת בחירת תרופות עד שהם משיגים ביטוי אופטימלי של גן CAR ו-GFP.
  4. כדי להבטיח ביטוי הומוגני של GFP ו-CAR, האריכו את משך בחירת התרופה למשך 2-3 שבועות.
  5. בצע מיון תאים על סמך ביטוי GFP או CAR באמצעות זרימה ציטומטרית כדי להשיג אוכלוסייה הומוגנית של iPSCs23 שנבחרו באופן משובט.
  6. מבנה ה-CAR המשמש כאן מכיל סמן בחירת תרופות זאוצין. בחר את התאים המועברים בגן GPC3 CAR על ידי הוספת זאוצין (50 מיקרוגרם/מ"ל של זאוצין) למדיום התרבית.
  7. לאחר בחירת זאוצין, יש לדלל את הגן GPC3 CAR שעברו טרנספקציה של iPSCs ולצלח אותם לצלחת של 96 בארות כדי להשיג בערך תא אחד לכל באר. ניתן לעשות זאת באמצעות דילול סדרתי או באמצעות סדרן תאים.
    הערה: השתמש במיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנטי (FACS) כדי לבודד תאים בודדים שעברו טרנספטציה על סמך ביטוי של סמן פלואורסצנטי המקושר למבנה ה-CAR.
  8. אפשר לתאים הבודדים להתרחב למושבות בצלחת 96 הבארות.
  9. האכילו את התאים במדיום תרבית טרי כל 3-4 ימים פעם אחת, ופקחו על הבארות לצמיחת המושבה.
  10. סנן את המושבות לביטוי CAR. ניתן לעשות זאת על ידי תגובת שרשרת פולימראז (PCR), תגובת שרשרת פולימראז כמותית (qPCR), או כתמים מערביים כדי לאמת את נוכחותו של מבנה ה-CAR23,47.
  11. לחלופין, השתמש בזרימה ציטומטרית23,41 כדי לזהות את ביטוי פני השטח של חלבון CAR.
    הערה: במחקר זה, ביטוי ה-CAR כומת על ידי ביטוי תג FLAG באמצעות ציטומטריית זרימה.
  12. בנוסף, בצע קריוטיפ כדי לזהות חריגות כרומוזומליות.
    הערה: זה יכול להיעשות על ידי ארגוני צד שלישי כגון Wicell (wicell.org) או Thermo Fisher Scientific (thermofisher.com).
  13. לאחר זיהוי השיבוטים החיוביים ל-CAR ללא כל חריגות, הרחב את השיבוטים הללו בכלי תרבית גדולים יותר כגון צלחת 6 בארות ובקבוק T75.
  14. שימור בהקפאה של תאי ה-CAR iPSCs המורחבים באופן משובט באמצעות מדיום שימור בהקפאה בבקבוקונים מרובים לשימוש עתידי.
    הערה: הנקודות הבאות מומלצות בשלב זה: (i) שמירה על תנאי תרבית אופטימליים עבור iPSCs כדי למנוע התמיינות. (ii) יש לאפשר 1-4 שבועות להשיג אוכלוסייה הומוגנית של ביטוי CAR ו-GFP ב-iPSCs לאחר בחירת התרופה. (iii) המשך לעקוב אחר התאים ליציבות ביטוי CAR וסמני פלוריפוטנטיות. (iv) השתמש בבקרות מתאימות במהלך שלבי הסינון והאימות. (v) לאחר ברירה והרחבה משובטים, אמת פלוריפוטנטיות על ידי הערכת ביטוי TRA-1-81 ו-SSEA-4 על iPSCs המבטאים CAR.

4. יצירת תאי אב המטופויאטיים מ-CAR iPSCs מהונדסים על ידי היווצרות גוף עוברי ספין (EB)

הערה: פרוטוקול EB ספין או אורגנואיד המטופויאטי משמש לייצור אבות המטופויאטיים23,34. התאים בתוך ה-EBs מתמיינים לתאי סטרומה כדי לתמוך בהתפתחות לימפוציטים38, ובכך מבטלים את הצורך בתאי סטרומה שמקורם בקסנו כמו OP9 23,34,48. להלן ההוראות לאיסוף תאים מבאר אחת של צלחת בת 6 בארות להיווצרות EB.

  1. מעבר ~ 200,000 תאים / באר של צלחת מצופה מראש BMM 6 בארות יומיים לפני היווצרות EB ספין. ודא שהוא מגיע למפגש של 70-80% ביום הגדרת ה-EBs של הסיבוב. בדרך כלל, באר אחת של צלחת 6 בארות מספיקה לשתי צלחות של ספין EB.
  2. הסר את מדיום התרבות ונתק את התאים על ידי דגירה עם 1 מ"ל של TrypLE Select מחומם מראש ב-37 מעלות צלזיוס 5 דקות.
  3. נתק בזהירות אגרגטים של תאים לתרחיף תא בודד באמצעות מיקרופיפטה של 1 מ"ל והעביר את התאים לצינור חרוטי של 15 מ"ל. הוסף 3 מ"ל של 1x PBS כדי לעצור את תגובת הדיסוציאציה, ושטוף את התאים פעם אחת עם 3 מ"ל PBS.
  4. השעו מחדש את התאים במדיום mTesR Plus וסננו דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר כדי להסיר אגרגטים.
  5. סובבו את התאים כדי להסיר את הסופרנטנט, ושטפו את התאים שוב עם 5 מ"ל PBS. לאחר מכן השעו מחדש את התאים ב-1 מ"ל של מדיום STEMdiff APEL (מדיום היווצרות EB).
  6. ספרו ודללו את התאים לצפיפות מתאימה באמצעות מדיום היווצרות EB המכיל את הציטוקינים הבאים (SCF: 40 ננוגרם/מ"ל, BMP4: 20 ננוגרם/מ"ל, VEGF: 20 ננוגרם/מ"ל) בתוספת מעכב ROCK של 10 מיקרומטר.
  7. זרע 3000-10000 תאים/באר ב-100 מיקרוליטר של מדיה (100,000 תאים/מ"ל) בצלחות של 96 בארות.
    הערה: מספר התאים המשמשים להיווצרות EB עשוי להשתנות בהתאם לקו ה-iPSC. מומלץ לבדוק בין 3,000 ל -10,000 תאים לבאר בצלחות של 96 בארות.
  8. בעזרת פיפטה רב-ערוצית, טען את מתלה התא לצלחות של 96 בארות ב-100 מיקרוליטר לבאר.
    הערה: להיווצרות טובה יותר של גופים עובריים (EBs), מומלץ להשתמש בצלחות 96 בארות עם חיבור נמוך במיוחד.
  9. צנטריפוגה את הצלחת בת 96 הבארות ב-300 × גרם למשך 5 דקות, ולאחר מכן דגירה על הצלחות ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2 למשך 6 ימים.
    הערה: מחקרים ראשוניים מצאו ש-6 ימים מספיקים כדי להוליד >30% תאי CD34+ עבור קווי ה-CAR iPSC במחקר זה.
  10. בדוק את איכות ה-EB על ידי זרימה ציטומטרית23,41.
    1. הכינו 4 מ"ל של 0.25% טריפסין מחומם מראש עם 0.4% סרום עוף (16 מיקרוליטר עבור 4 מ"ל טריפסין) לניתוק EBs.
    2. מעבירים 10-30 EBs לצינור חרוטי של 15 מ"ל.
    3. הוסיפו את תמיסת הטריפסין/סרום עוף ל-EBs ודגרו באמבט מים למשך 10 דקות, תוך מערבולת כל 30 שניות כדי להבטיח דיסוציאציה מוחלטת של EBs.
    4. פיפטה את ה-EBs הטריפסיניים. ערבבו למעלה ולמטה מספר פעמים כדי לנתק היטב את ה-EBS.
    5. הוסף 5 מ"ל של 1x PBS כדי לעצור את תהליך הטריפסיניזציה.
    6. סנן את תמיסת התא דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר בצינור חרוטי חדש.
    7. צנטריפוגה של התאים ב -300 x גרם למשך 5 דקות.
    8. שאפו את הסופרנטנט והשעו מחדש ב 3-5 מ"ל של מדיה טרייה.
    9. ספרו את התאים, צבעו עם סמני EB טיפוסיים כגון CD34, CD31, CD43 ו-CD45, ונתחו באמצעות זרימה ציטומטרית23,41 (איור 3).
    10. הוסף את נפח הנוגדנים המומלץ על פי הוראות היצרן לכל צינור המכיל תאים בודדים מנותקים של EB ב-100 מיקרוליטר של מאגר זרימה ודגירה על קרח למשך 30 דקות39,41.
    11. לאחר הדגירה יש לשטוף את התאים פעמיים עם מאגר זרימה, להוסיף כתם חי/מת כחול SYTOX ולנתח באמצעות ציטומטריית זרימה.
      הערה: בדרך כלל, >30% תאי CD34+ מתקבלים מכלל האוכלוסייה של גופי עוברי ספין מנותקים ביום השישי באמצעות iPSCs ששימשו במחקר זה, אם כי אחוז זה יכול להשתנות בהתאם למקור ה-iPSC ולתנאי התרבית.

5. התמיינות של תאי NK שמקורם ב-GPC3 CAR iPSC מ-Spin EBs

הערה: ניתן להעביר את ה-Spin EBs המבטאים GPC3 CAR לצלחות של 24 בארות או צלחות של 6 בארות המצופות ב-2% ג'לטין או ללא ציפוי. לשינויים בינוניים, צלחות 6 בארות מתאימות יותר, בעוד שציפוי ג'לטין 2% משפר את ההתקשרות של EBs.

  1. הכן צלחות מצופות ג'לטין 6 בארות על ידי ביצוע השלבים הבאים.
    1. הכן תמיסת ג'לטין של 2% (w/v) על ידי המסת ג'לטין במים בדרגת תרבית רקמות.
    2. עקר את התמיסה על ידי חיטוי ב-121 מעלות צלזיוס, 15 psi למשך 30 דקות.
    3. מצפים את פני השטח של כל באר ב-5-10 מיקרוליטר של תמיסת ג'לטין לס"מ2 (~1 מ"ל לבאר של צלחת של 6 בארות).
    4. דגרו את הצלחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 2-4 שעות לפני השימוש. לאחר הדגירה, שאפו את כל תמיסת הג'לטין שנותרה לפני שתמשיכו בהעברת EBs.
  2. הכן מדיום התמיינות תאי NK: הוסף 56.6% DMEM+ GlutaMAX-I, 28.3% F12+ GlutaMAX-I, 15% סרום AB אנושי מומת חום, 1% P/S, 2 מ"מ L-גלוטמין, 1 מיקרומטר β-מרקפטואתנול, 5 ננוגרם/מ"ל נתרן סלניט, 50 מיקרומטר אתנולמין ו-20 מ"ג/ליטר חומצה אסקורבית. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס בחושך.
  3. הוסף 3 מ"ל של מדיום התמיינות NK המכיל את הציטוקינים הבאים לכל באר של לוחות 6 הבארות המצופים בג'לטין (IL-3: 5 ננוגרם/מ"ל, SCF: 20 ננוגרם/מ"ל, IL-7: 20 ננוגרם/מ"ל ו-IL-15: 10 ננוגרם/מ"ל).
  4. ביום 6, העבירו את Spin EBs ישירות לתוך צלחות 6 הבארות המוכנות בציפוי ג'לטין המכילות מדיום התמיינות NK על ידי ביצוע השלבים הבאים.
    1. העבירו בזהירות את ה-EBs מצלחות של 96 בארות לכלי של 10 ס"מ, בעזרת פיפטה סרולוגית של 10 מ"ל כדי להסיר את רוב המדיום.
    2. הוסף 3 מ"ל של מדיום התמיינות NK המכיל את הציטוקינים הנ"ל לכל באר של צלחת 6 הבארות המצופה בג'לטין.
    3. מחלקים 16-20 EBs לכל באר של צלחת 6 הבארות באמצעות מיקרופיפטה של 1 מ"ל.
      הערה: בממוצע, ניתן להשתמש ב-EBs מצלחת אחת של 96 בארות כדי לזרוע צלחת אחת של 6 בארות עבור צלחת הבידול של NK.
  5. בצע שינויים בינוניים כל 5-7 ימים. לאחר השבוע הראשון של התמיינות תאי NK, אל תכלול את IL-3 בתקשורת.
    הערה: לאחר 14 יום, יש להחליף את המדיום כל 3-4 ימים.
  6. יש להמשיך בשינויים בינוניים למשך 3-4 שבועות. הערך את הביטוי של סמני תאי NK (CD45+CD56+) על ידי זרימה ציטומטרית24,42 על תאי השעיה.
  7. כאשר >80% מתאי ההשעיה מבטאים CD45+CD56+, קצרו את התאים על ידי העברתם דרך מסנן של 70 מיקרומטר כדי להסיר גושים.
  8. תרבית משותפת של תאי NK שנקטפו עם 100 aAPCs מוקרנים אפורים34,48 ותרבית במדיום הרחבה NK המכיל IL-2 (100ng/mL) ו-IL-15 (10 ng/mL).

6. הרחבה של תאי NK שמקורם ב-anti-GPC3 CAR iPSC

הערה: בדרך כלל, ניתן להשיג תשואה של 2-20 × 106 תאי NK מצלחת אחת של 6 בארות, עוד לפני ההרחבה. כדי להקל על הרחבה נוספת של תאי NK ליישומים במורד הזרם, תאים מציגי אנטיגן מלאכותיים (aAPCs) משמשים ליצירת תאי NK >1 × 109 .

  1. השתמש בתאי K562 מהונדסים המבטאים 41BBL ו-IL-21 (41BBL-mbIL-21)48 כ-aAPCs כדי לגרום להתרחבות תאי NK.
  2. לפני תרבית משותפת של aAPCs עם תאי NK, הקרינו aAPCs עם 100 אפור ושמרו אותם כמלאים קפואים.
  3. קצרו את תאי התרחיף מצלחת 6 הבארות ותרבו את תאי ה-NK במדיום התפשטות NK בתוספת 50 U/mL IL-2 ו-IL-15 (10 ננוגרם/מ"ל; יש להוסיף טרי) בצפיפות של 5 ×-105 תאים/מ"ל.
  4. הוסף aAPCs מוקרנים מופשרים לתאי NK ביחס של 1:1.
  5. יש לחדש את מצע התרבית כל 3-4 ימים, ולהוסיף IL-2 ו-IL-15 טריים בריכוז של 50 U/mL ו-10 ננוגרם/מ"ל, בהתאמה.
  6. ודא שתאי NK שמקורם ב-CAR iPSC שומרים על יכולת ההתרחבות לאורך תקופה של >3 חודשים, תוך שמירה על כדאיות התא והפעילות הציטוליטית.

7. אפיון פנוטיפי ופונקציונלי של תאי NK שמקורם ב-GPC3 CAR iPSC

הערה: האפיון של תאי NK שמקורם ב-GPC3 CAR iPSC כרוך בהערכה מקיפה של הפרופיל הפנוטיפי והפעילות התפקודית שלהם.

  1. להעריך את קולטני ההפעלה של NK, כולל CD45, CD56, CD94, CD16, NKp30, NKp44, NKp46, NKG2D, DNAM, TRAIL ו-FasL, הביטוי על תאי NK שמקורם ב-anti-GPC3 CAR iPSC באמצעות זרימה ציטומטרית24,42 כדי לקבוע את פעילות תאי ה-CAR NK וסטטוס ההתבגרות (איור 4).
  2. להעריך את הפעילות התפקודית במבחנה של תאי NK שמקורם ב-GPC3 CAR iPSC באמצעות מבחני Caspase-3/7 מבוססי ציטומטריית זרימה, מבחני שחרור גרגירי CD107a, מבחני שחרור ציטוקינים IFN-γ ו-TNF-α כנגד מטרות גידול שונות.
  3. לבדיקת Caspase3/7, בצע את השלבים הבאים.
    1. ספרו את תאי המטרה וצבעו אותם מראש בצבע פלואורסצנטי למעקב אחר תאים בריכוז סופי של 5 מיקרומטר ב-PBS למשך 15 דקות ב-37 מעלות צלזיוס.
    2. שטפו תאי מטרה מוכתמים במדיום תרבית שלם לפני תרבית משותפת עם תאי NK שמקורם ב-CAR iPSC ביחסי אפקטור למטרה שונים (E:T) ב-37 מעלות צלזיוס.
    3. לאחר 3 שעות ו-30 דקות של תרבית משותפת, הוסף מגיב זיהוי ירוק Caspase-3/7 למשך 30 דקות נוספות של דגירה, וכתוצאה מכך זמן הדגירה הכולל של 4 שעות.
    4. הוסף 1 מיקרוליטר של תמיסת צביעה של תאים מתים במהלך 5 הדקות האחרונות של הצביעה, וערבב בעדינות.
    5. נתח את התאים המוכתמים באמצעות ציטומטריית זרימה23,41 (איור 5).
  4. יישם פרוטוקול זה כדי להבטיח הבנה מקיפה של המאפיינים הפנוטיפיים והפעילות התפקודית של תאי NK שמקורם ב-GPC3 CAR iPSC, מה שמאפשר הערכה חזקה של הפוטנציאל הטיפולי שלהם.
    הערה: בדרך כלל לוקח 4-5 שבועות להשיג >90% תאי CD45+CD56+ מהתמיינות תאי NK הנגזרים מ-GPC3 CAR iPSC מבוססי ספין EB ותנאי התפשטות NK באמצעות קווי GPC3 CAR iPSC. קווי תאי iPSC מסוימים עשויים לדרוש רק 3 שבועות, וקווים מסוימים עשויים להימשך זמן רב יותר (כ-4-5 שבועות).

8. פתרון בעיות בפריטים ופתרונות

הערה: פתרון בעיות בהתמיינות, הרחבה ובדיקה פונקציונלית של תאי GPC3 CAR NK שמקורם ב-iPSC בשיטת ה-spin embryoid body (EB) יכול לכלול מספר שלבים. להלן כמה בעיות נפוצות שאדם עשוי להיתקל בהן, יחד עם פתרונות מוצעים:

  1. תסמינים של היווצרות EB לא עקבית
    1. בדוק אם ה-EBs קטנים מדי או גדולים מדי, עם צורות לא סדירות.
  2. פתרון להיווצרות EB לא עקבית
    1. התאם את מהירות הצנטריפוגה ומשך הזמן המשמשים ליצירת EBs. מהירות של כ-200-300 × גרם למשך 5-10 דקות אופיינית.
    2. ודא שנעשה שימוש בצלחות ה-U-bottom המתאימות או בכלי תרבית עם חיבור נמוך במיוחד כדי להקל על היווצרות EB.
    3. ודא שה-iPSCs הומוגניים וללא תאים ממוינים שעלולים להשפיע על היווצרות EB.
  3. תסמינים של התמיינות לקויה של iPSCs לתאי NK
    1. בדוק אם יש ביטוי נמוך של סמני תאי NK (למשל, CD56, NKp46).
    2. בדוק אם יש כישלון ביצירת EBs או EBs שנוצרו בצורה גרועה.
  4. פתרון להתמיינות לקויה של iPSCs לתאי NK
    1. ודא שהריכוזים של גורמי גדילה חיוניים (למשל, VEGF, BMP4, Y-27632, FLT3, IL-15, IL-7, SCF ו-IL-3) הם אופטימליים להיווצרות EB והתמיינות תאי NK. התאם את הריכוזים על סמך מחקרים קודמים 23,34,41.
    2. ודאו שצפיפות הזריעה הראשונית של iPSCs מתאימה. בדרך כלל, צפיפות של 8000-10,000 תאים/100 מיקרוליטר מומלצת להיווצרות ספין EB.
    3. ודא שמדיום ההתמיינות מנוסח כהלכה, כולל תוספי מזון נחוצים (למשל, חלופות ללא סרום או סרום, ציטוקינים אחרים).
    4. אפשר מספיק זמן להיווצרות EB, מינימום 6 ימים עד עד 12 ימים לפני המעבר למדיום התמיינות תאי NK.
  5. תסמינים של התרחבות לקויה של תאי NK
    1. בדוק אם יש תפוקת תאים מוגבלת במהלך ההרחבה.
    2. בדוק אם יש כדאיות מופחתת של תאי NK מורחבים.
  6. פתרונות להרחבה לקויה של תאי NK
    1. הגדל את הריכוז של IL-15 ו-IL-2 בשלב ההרחבה. זה יכול לשפר משמעותית את התפשטות תאי NK.
    2. שקול להשתמש בתאי הזנה כגון aAPCs מוקרנים כדי לשפר את ההישרדות וההתרחבות של תאי NK.
    3. עקוב אחר צפיפות התאים באופן קבוע ותאי מעבר לפני שהם מגיעים לצפיפות יתר כדי לשמור על תנאי גידול אופטימליים.
  7. תסמינים של תוצאות בדיקות פונקציונליות לא אופטימליות
    1. בדוק אם יש ציטוטוקסיות מופחתת כנגד תאי מטרה.
    2. בדוק רמות נמוכות של הפרשת ציטוקינים (למשל, IFN-γ, TNF-α).
  8. פתרונות לתוצאות בדיקות פונקציונליות לא אופטימליות
    1. בצע אופטימיזציה של יחס המטרה לאפקטור במבחני ציטוטוקסיות. התחילו ביחס של 10:1 והתאימו בהתאם לתוצאות.
    2. ודא שתאי NK מופעלים כראוי לפני בדיקות פונקציונליות. זה עשוי לכלול גירוי מקדים עם ציטוקינים או תרבית משותפת עם aAPCs מוקרנים.
    3. ודא את הרגישות של קו תאי המטרה לליזה בתיווך תאי NK. השתמש ביעדים רגישים ידועים כפקדים.
    4. האריכו את משך הבדיקות התפקודיות כדי לאפשר מספיק זמן לפעילות תאי NK להתבטא.
  9. תסמינים של רמות ביטוי משתנות של CAR
    1. בדוק אם יש ביטוי CAR לא עקבי בין תאי NK.
  10. פתרונות לרמות ביטוי משתנות של CAR
    1. ודא את היעילות של שיטת טרנספקציה CAR (למשל, התמרה ויראלית, אלקטרופורציה). התאם את תנאי ה-MOI (ריבוי זיהום) או אלקטרופורציה במידת הצורך.
    2. יישם סמני בחירה מתאימים להעשרת תאי CAR+ NK. השתמש בבחירת אנטיביוטיקה או במיון סמנים פלואורסצנטיים לפי הצורך.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דיאגרמה סכמטית של התמיינות והתרחבות של תאי NK שמקורם ב-anti-GPC3-CAR iPSC
התרשים הסכמטי ממחיש את ההתמיינות במבחנה של תאי NK מהונדסים נגד GPC3-CAR שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים (iPSCs) וייצוג סכמטי של וקטור piggyBac הנושא מבנה GPC3 CAR. בתחילה, iPSCs לא מותאמים עוברים טרנספטציה עם וקטור piggyBac המקודד את GPC3 CAR (קולטן אנטיגן כימרי). לאחר טרנספקציה, iPSCs אלה המבטאים GPC3 CAR מורחבים באופן משובט ולאחר מכן מתמיינים לתאי NK פונקציונליים שמקורם ב-CAR iPSC. תאי NK מהונדסים אלה עוב...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר גישה סטנדרטית וניתנת לשחזור ליצירת תאי NK שמקורם ב-iPSC המבטאים CAR ממקור תאים עקבי שמטרתו להקל על אימונותרפיה ממוקדת "מהמדף" של סרטן. מספר מחקרים פרה-קליניים וקליניים הראו את היעילות של אימונותרפיה מבוססת תאי NK מאמצת בטיפול בסרטן תוך מזעור רעילות, כמו מחלות השתל נגד המארח (GvHD) או תסמונת שחרור ציטוקינים (CRS)23,42, 49,50,51,52,53,54,55,56,57

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DSK הוא מייסד שותף ויועץ ל-Shoreline Biosciences ויש לו מניות בחברה. DSK גם מייעץ ל-Therabest ו-RedC Bio עבורם הוא מקבל הכנסה ו/או הון עצמי. תנאי ההסדרים הללו נבדקו ואושרו על ידי אוניברסיטת קליפורניה, סן דייגו בהתאם למדיניות ניגוד העניינים שלה. שאר המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לכל חברי מעבדת קאופמן על התמיכה, התובנות המדעיות והדיונים. מחקרים אלה נתמכו על ידי מענקי ה-NIH/NCI U01CA217885, P30CA023100 (תוספת מנהלית) ומכון תאי הגזע של סנפורד ב-UCSD. JT: כתיבה ותיקון של כתב היד. DSK: בדק וערך את כתב היד.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
aAPC מעבדת דין א. לי N/A
מדיום תרבית a-MEM  פישר סיינטיפיק Cat#12634
APC anti-DYKDDDDK (תג דגל)BD Biosciences Cat#637308
נגמ"ש אנטי-אנושי TRA-1-81 תרמו-פישר17-8883-42 
APC-CD16BD Biosciences חתול#302015
APC-CD43 BD BiosciencesCat# 560198 
APC-CD45 BD BiosciencesCat# 555485 
APC-GPC3BD Biosciences Cat#DB100B
APC-NKG2D BD ביוסיינס חתול# 558071 
CellEvent Caspase-3/7 מגיב לזיהוי ירוק תרמו פישר Cat#C10423
ערכת שגשוג תאים סגולים של CellTrace תרמו פישר Cat#C34571צבע פלואורסצנטי למעקב אחר תאים 
פתרון CryoStor טכנולוגיות תאי גזעhttps://www.stemcell.com/products/cryostor-cs10.htmlמדיום שימור הקפאה
CTS NK XpanderGibcoA5019001
CTS NK-Xpander MediumLife TechnologiesCat#A5019001
DMEMGibco11965084
DMEM, גלוקוז גבוה, תוסף GlutaMAX, פירובטGibco10569010
ערכת העשרת תאי NK אנושיים EasySep StemCell Technologies, Inc. Cat#19055
אתנולמיןסיגמא אולדריץ'E9508
סרום בקר עוברי פישר סיינטיפיק Cat# 10437010
FITC-CD94 BD ביוסיינס Cat#555888
תוסף GlutaMAXGibco35050061
GolgiPlug BD ביוסיינס Cat#555029
GolgiStop BD ביוסיינס Cat#554724
Ham's F-12 Nuttrient Mix, תוסף GlutaMAXGibco31765035
לסוסים פישר סיינטיפיק Cat#16050130
סרום אנושי AB Sigma-AldrichCat#BP2525100
ערכת NucleofectorTM לתאי גזע אנושיים לונזה Cat# VPH-5012
אנושי: תאי HePG2 ATCC Cat#HB-8065
אנושי: תאי HePG2-td-tomato-luc מעבדת דן ס. קאופמןלא ישים
אדם: תאי iPS מעבדת דן ש. קאופמן לא ישים
אדם: תאי SNU-449  ATCCCat#CRL-2234
אנושי: תאי SNU-449-td-tomato-luc מעבדת דן ס. קאופמןN/A
IncuCyte Caspase-3/7 בדיקת אפופטוזיס ירוקה Essenbioscience Cat#4440
חומצה L-אסקורביתסיגמא אולדריץ'A5960
MP ביו-רפואיים  סרום אנושי, סוג ABMP ביומדיקלICN2938249
mTeSR בתוספתStemCell Technologies, Inc. 100-0276
תוכנת NovoExpress ACEA Biosciences 
https://www.agilent.com/en/product/research-flow-cytometry/flow-cytometry-software/novocyte-novoexpress-software-1320805 נוגדן SSEA-4 אנטי-אנושי PE/Cy7 ביולג'נד330420
PE-CD16 BD ביוסיינס חתול#560995 
PE-CD226BD Biosciences Cat#559789
PE-CD34 BD BiosciencesCat# 555822 
PE-CD45 BD ביוסיינס חתול# 555483 
PE-CD94 BD ביוסיינס חתול#555888 
PE-CY7-CD56 BioLegend Cat# 318318 
PE-FAS ליגנד BD ביוסיינס חתול#564261 
PE-NKp30BD BiosciencesCat# 558407
PE-NKp44 BD ביוסיינס חתול#558563 
PE-NKp46BD מדעי הביולוגיה חתול#331908
PE-NKp46 BD ביוסיינס חתול#557991 
מעיל באפי דם היקפי בנק הדם של סן דייגו (https://www sandiegobloodbank.org/) N/A
PE-TRAIL BD ביוסיינס חתול#565499 
pKT2-mCAG-IRES-GFP-ZEO מעבדת ברנדן מוריאריטי N/A
pMAX-GFP פלסמידLonzaN / AGFP בקרה חיובית 
פריזמה 9Graphpad גרסה 9
pSpCas9 GenScriptPX165
RBC מאגר ליזה (10x)BiolegendCat#420301
בסיסי bFGF אנושי רקומביננטי מו"פ D מערכות Cat#4114-TC
BMP-4  אנושי רקומביננטי;PeproTechCat#120-05
ליגנד FLT-3 אנושי רקומביננטי PeproTechCat# 300-19
IL-15 אנושי רקומביננטי PeproTechCat# 200-15
IL-2 אנושי רקומביננטיPeproTechCat# 200-02
IL-3 אנושי רקומביננטיPeproTechCat#200-03
IL-7 אנושי רקומביננטי;PeproTechCat# 200-07
חלבון קשרית אנושית רקומביננטיR& D מערכות Cat#3218-ND-025
SCF  אנושי רקומביננטי;PeproTechCat# 300-07
TGF ובטא אנושי רקומביננטי; 1PeproTechCat#100-21
VEGF אנושי רקומביננטי PeproTechCat# 100-20
RPMI1640Gibco11875093
נתרן סלניטסיגמא אולדריץ'214485
STEMdiff APEL 2 MediumStemCell Technologies, Inc. 5270EB היווצרות בינוני
STEMdiff APEL2 בינוני StemCell Technologies, Inc. Cat#05270
וקטור ביטוי Super piggyBac TransposaseSBICat#PB210PA-1
SYTOX AADvanced ערכת כתמי תאים מתיםThermoFisher ScientificS10274, S10349ערכת תמיסת צביעת תאים מתים
&בטא;-מרקפטואתנולGibco21985023
סרום

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chan, I. S., Ewald, A. J. The changing role of natural killer cells in cancer metastasis. J Clin Invest. 132 (6), e143762(2022).
  2. Yu, Y. The function of NK cells in tumor metastasis and NK cell-based immunotherapy. Cancers (Basel). 15 (8), 2323(2023).
  3. Paul, S., Lal, G. The molecular mechanism of natural killer cells function and its importance in cancer immunotherapy. Front Immunol. 8, 1124(2017).
  4. Myers, J. A., Miller, J. S. Exploring the NK cell platform for cancer immunotherapy. Nat Rev Clin Oncol. 18 (2), 85-100 (2021).
  5. Llovet, J. M., et al. Hepatocellular carcinoma. Nat Rev Dis Primers. 7, 6(2021).
  6. Yang, Y., Xiong, L., Li, M., Jiang, P., Wang, J., Li, C. Advances in radiotherapy and immunity in hepatocellular carcinoma. J Transl Med. 21 (1), 526(2023).
  7. Rich, N. E., Yopp, A. C., Singal, A. G. Medical management of hepatocellular carcinoma. J Oncol Pract. 13 (6), 356-364 (2017).
  8. Niu, M., Yi, M., Li, N., Wu, K., Wu, K. Advances of Targeted Therapy for Hepatocellular Carcinoma. Front Oncol. 11, 719896(2021).
  9. Yu, S. J. Immunotherapy for hepatocellular carcinoma: Recent advances and future targets. Pharmacol Ther. 244, 108387(2023).
  10. Ntellas, P., Chau, I. Updates on systemic therapy for hepatocellular carcinoma. Am Soc Clin Oncol Educ Book. 44, e430028. 44, e430028(2024).
  11. Liu, T. -H., Shen, Y. -C., Cheng, A. -L. Immune checkpoint inhibitors for hepatocellular carcinoma - A game changer in treatment landscape. J Formos Med Assoc. 121 (8), 1371-1383 (2022).
  12. Sun, Q., Hong, Z., Zhang, C., Wang, L., Han, Z., Ma, D. Immune checkpoint therapy for solid tumours: clinical dilemmas and future trends. Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 320(2023).
  13. Huang, A., Yang, X. -R., Chung, W. -Y., Dennison, A. R., Zhou, J. Targeted therapy for hepatocellular carcinoma. Signal Transduct Target Ther. 5 (1), 146(2020).
  14. Girardi, D. M., Pacífico, J. P. M., Guedes de Amorim, F. P. L., Dos Santos Fernandes, G., Teixeira, M. C., Pereira, A. A. L. Immunotherapy and targeted therapy for hepatocellular carcinoma: A literature review and treatment perspectives. Pharmaceuticals (Basel). 14 (1), 28(2020).
  15. Laface, C., et al. Targeted therapy for hepatocellular carcinoma: Old and new opportunities. Cancers (Basel). 14 (16), 4028(2022).
  16. Shyam Sunder, S., Sharma, U. C., Pokharel, S. Adverse effects of tyrosine kinase inhibitors in cancer therapy: pathophysiology, mechanisms and clinical management. Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 262(2023).
  17. Cappell, K. M., Kochenderfer, J. N. Long-term outcomes following CAR T cell therapy: what we know so far. Nat Rev Clin Oncol. 20 (6), 359-371 (2023).
  18. June, C. H., O'Connor, R. S., Kawalekar, O. U., Ghassemi, S., Milone, M. C. CAR T cell immunotherapy for human cancer. Science. 359 (6382), 1361-1365 (2018).
  19. Schuster Stephen, J., et al. Chimeric antigen receptor T cells in refractory B-cell lymphomas. N Engl J Med. 377 (26), 2545-2554 (2017).
  20. Schmidt, D., et al. Engineering CAR-NK cells: how to tune innate killer cells for cancer immunotherapy. Immunother Adv. 2 (1), Itac003(2022).
  21. Zhang, B., et al. Chimeric antigen receptor-based natural killer cell immunotherapy in cancer: from bench to bedside. Cell Death Dis. 15 (1), 50(2024).
  22. Wang, K., et al. Reprogramming natural killer cells for cancer therapy. Mol Ther. 32 (9), 2835-2855 (2024).
  23. Li, Y., Hermanson, D. L., Moriarity, B. S., Kaufman, D. S. Human iPSC-derived natural killer cells engineered with chimeric antigen receptors enhance antitumor activity. Cell Stem Cell. 23 (2), 181-192.e5 (2018).
  24. Liu, E., Marin, D., et al. Use of CAR-transduced natural killer cells in CD19-positive lymphoid tumors. N Engl J Med. 382 (6), 545-553 (2020).
  25. Chen, L., Xie, T., Wei, B., Di, D. L. Current progress in CAR-T cell therapy for tumor treatment. Oncol Lett. 24 (4), 358(2022).
  26. Rafiq, S., Hackett, C. S., Brentjens, R. J. Engineering strategies to overcome the current roadblocks in CAR T cell therapy. Nat Rev Clin Oncol. 17 (3), 147-167 (2020).
  27. Sterner, R. C., Sterner, R. M. CAR-T cell therapy: current limitations and potential strategies. Blood Cancer J. 11 (4), 69(2021).
  28. Albinger, N., Hartmann, J., Ullrich, E. Current status and perspective of CAR-T and CAR-NK cell therapy trials in Germany. Gene Ther. 28 (9), 513-527 (2021).
  29. Dagher, O. K., Posey, A. D. Forks in the road for CAR T and CAR NK cell cancer therapies. Nat Immunol. 24 (12), 1994-2007 (2023).
  30. Xie, G., Dong, H., Liang, Y., Ham, J. D., Rizwan, R., Chen, J. CAR-NK cells: A promising cellular immunotherapy for cancer. EBioMedicine. 59, 102975(2020).
  31. Cichocki, F., van der Stegen, S. J. C., Miller, J. S. Engineered and banked iPSCs for advanced NK- and T-cell immunotherapies. Blood. 141 (8), 846-855 (2023).
  32. Goldenson, B. H., Hor, P., Kaufman, D. S. iPSC-derived natural killer cell therapies - Expansion and targeting. Front Immunol. 13, 841107(2022).
  33. Zhu, H., Kaufman, D. S. Engineered human pluripotent stem cell-derived natural killer cells: the next frontier for cancer immunotherapy. Blood Sci. 1 (1), 4-11 (2019).
  34. Knorr, D. A., et al. Clinical-scale derivation of natural killer cells from human pluripotent stem cells for cancer therapy. Stem Cells Transl Med. 2 (4), 274-283 (2013).
  35. Shimizu, Y., Suzuki, T., Yoshikawa, T., Endo, I., Nakatsura, T. Next-generation cancer immunotherapy targeting Glypican-3. Front Oncol. 9, 248(2019).
  36. Schepers, E. J., Glaser, K., Zwolshen, H. M., Hartman, S. J., Bondoc, A. J. Structural and functional impact of posttranslational modification of Glypican-3 on liver carcinogenesis. Cancer Res. 83 (12), 1933-1940 (2023).
  37. Batra, S. A., et al. Glypican-3-specific CAR T cells coexpressing IL15 and IL21 have superior expansion and antitumor activity against hepatocellular carcinoma. Cancer Immunol Res. 8 (3), 309-320 (2020).
  38. Gao, W., et al. Immunotoxin targeting glypican-3 regresses liver cancer via dual inhibition of Wnt signalling and protein synthesis. Nat Commun. 6, 6536(2015).
  39. Thangaraj, J. L., Coffey, M., Lopez, E., Kaufman, D. S. Disruption of TGF-β signaling pathway is required to mediate effective killing of hepatocellular carcinoma by human iPSC-derived NK cells. Cell Stem Cell. 31 (9), 1327-1343.e5 (2024).
  40. Maddineni, S., Silberstein, J. L., Sunwoo, J. B. Emerging NK cell therapies for cancer and the promise of next generation engineering of iPSC-derived NK cells. J Immunother Cancer. 10 (5), e004693(2022).
  41. Zhu, H., et al. Metabolic reprograming via deletion of CISH in human iPSC-derived NK cells promotes in vivo persistence and enhances antitumor activity. Cell Stem Cell. 27 (2), 224-237.e6 (2020).
  42. Strati, P., et al. Preliminary results of a phase I trial of FT516, an off-the-shelf natural killer (NK) cell therapy derived from a clonal master induced pluripotent stem cell (iPSC) line expressing high-affinity, non-cleavable CD16 (hnCD16), in patients (pts) with relapsed/refractory (R/R) B-cell lymphoma (BCL). J Clin Oncol. 39, 7541-7541 (2021).
  43. Hong, D., et al. Preliminary results of an ongoing phase I trial of FT500, a first-in-class, off-the-shelf, induced pluripotent stem cell (iPSC) derived natural killer (NK) cell therapy in advanced solid tumors. J Immunother Cancer. 8 (3), A231-A232 (2020).
  44. Zah, E., et al. Systematically optimized BCMA/CS1 bispecific CAR-T cells robustly control heterogeneous multiple myeloma. Nat Commun. 11 (1), 2283(2020).
  45. Ahn, S., et al. Cancer immunotherapy with T cells carrying bispecific receptors that mimic antibodies. Cancer Immunol Res. 7 (5), 773-783 (2019).
  46. Ludwik, K. A., Telugu, N., Schommer, S., Stachelscheid, H., Diecke, S. ASSURED-optimized CRISPR protocol for knockout/SNP knockin in hiPSCs. STAR Protoc. 4 (3), 102406(2023).
  47. Zhu, H., Kaufman, D. S. An improved method to produce clinical scale natural killer cells from human pluripotent stem cells. Methods Mol Biol. 2048, 107-119 (2019).
  48. Denman, C. J., et al. Membrane-bound IL-21 promotes sustained ex vivo proliferation of human natural killer cells. PLoS One. 7 (1), e30264(2012).
  49. Leivas, A., et al. NKG2D-CAR-transduced natural killer cells efficiently target multiple myeloma. Blood Cancer J. 11 (8), 146(2021).
  50. Ramdial, J. L., et al. A phase II clinical trial of "Off-the-Shelf" NK cells with allogeneic stem cell transplantation to decrease disease relapse in patients with high-risk myeloid malignancies. Blood. 140 (Supplement 1), 7484-7485 (2022).
  51. Bachanova, V., et al. Initial clinical activity of FT596, a first-in-class, multi-antigen targeted, off-the-shelf, iPSC-derived CD19 CAR NK cell therapy in relapsed/refractory B-cell lymphoma. Blood. 136, 8(2020).
  52. Bae, W. K., et al. A phase I study of locoregional high-dose autologous natural killer cell therapy with hepatic arterial infusion chemotherapy in patients with locally advanced hepatocellular carcinoma. Front Immunol. 13, 879452(2022).
  53. Marin, D., et al. Safety, efficacy and determinants of response of allogeneic CD19-specific CAR-NK cells in CD19+ B cell tumors: a phase 1/2 trial. Nat Med. 30 (3), 772-784 (2024).
  54. Fehniger, T. A., et al. A phase 1 trial of CNDO-109-activated natural killer cells in patients with high-risk acute myeloid leukemia. Biol Blood Marrow Transplant. 24 (8), 1581-1589 (2018).
  55. Nguyen, R., et al. A phase II clinical trial of adoptive transfer of haploidentical natural killer cells for consolidation therapy of pediatric acute myeloid leukemia. J Immunother Cancer. 7 (1), 81(2019).
  56. Miller, J. S., et al. Successful adoptive transfer and in vivo expansion of human haploidentical NK cells in patients with cancer. Blood. 105 (8), 3051-3057 (2005).
  57. Liu, E., et al. Use of CAR-transduced natural killer cells in CD19-positive lymphoid tumors. N Engl J Med. 382 (6), 545-553 (2020).
  58. Daher, M., Melo Garcia, L., Li, Y., Rezvani, K. CAR-NK cells: the next wave of cellular therapy for cancer. Clin Transl Immunology. 10 (4), e1274(2021).
  59. Lin, X., Sun, Y., Dong, X., Liu, Z., Sugimura, R., Xie, G. IPSC-derived CAR-NK cells for cancer immunotherapy. Biomed Pharmacother. 165, 115123(2023).
  60. Bachanova, V., et al. Safety and efficacy of FT596, a first-in-class, multi-antigen targeted, off-the-shelf, iPSC-derived CD19 CAR NK cell therapy in relapsed/refractory B-cell lymphoma. Blood. 138, 823(2021).
  61. Saetersmoen, M. L., Hammer, Q., Valamehr, B., Kaufman, D. S., Malmberg, K. J. Off-the-shelf cell therapy with induced pluripotent stem cell-derived natural killer cells. Semin Immunopathol. 41 (1), 59-68 (2019).
  62. Gerew, A., et al. Deletion of CISH and TGFβR2 in iPSC-derived NK cells promotes high cytotoxicity and enhances in vivo tumor killing. Blood. 138, 2780(2021).
  63. Goldenson, B. H., Hor, P., Kaufman, D. S. iPSC-derived natural killer cell therapies - Expansion and targeting. Front Immunol. 13, 841107(2022).
  64. Karvouni, M., Vidal-Manrique, M., Lundqvist, A., Alici, E. Engineered NK cells against cancer and their potential applications beyond. Front Immunol. 13, 825979(2022).
  65. Ayuso, J. M., et al. Microphysiological model reveals the promise of memory-like natural killer cell immunotherapy for HIV± cancer. Nat Commun. 14 (1), 6681(2023).
  66. Miller, J. S., et al. Safety and virologic impact of haploidentical NK cells plus interleukin 2 or N-803 in HIV infection. J Infect Dis. 229 (5), 1256-1265 (2024).
  67. Gutiérrez-Hoya, A., Soto-Cruz, I. NK cell regulation in cervical cancer and strategies for immunotherapy. Cells. 10 (11), 3104(2021).
  68. Lisco, A., et al. Treatment of relapsing HPV diseases by restored function of natural killer cells. N Engl J Med. 385 (10), 921-929 (2021).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

NK CARNK

מאמרים קשורים