מאמר שיטה

בידוד אנזימטי של שלפוחיות חוץ-תאיות של שרירי השלד

DOI:

10.3791/67439

⸱

7 בפברואר 2025

 ,  ,  , 
1Regenerative Bioscience Center, Department of Animal and Dairy Science, College of Agricultural and Environmental Science, University of Georgia

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה נועד לבודד ולטהר שלפוחיות חוץ-תאיות של שרירי השלד (SkM-EVs) מרקמות שרירי מכרסמים באמצעות ניתוק מכני, דיסוציאציה אנזימטית, סינון ואולטרה-צנטריפוגה דיפרנציאלית. זה מפגין עקביות ואמינות. ה- SkM-EV המבודדים מספקים תובנות לגבי הומאוסטזיס שרירים ומחלות, עם יישומים פוטנציאליים כסמנים ביולוגיים אבחוניים או כלי טיפול.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) הן ננו-חלקיקים דו-שכבתיים המוקפים בשומנים המשוחררים על ידי תאים להובלת מטענים ביו-אקטיביים, כגון חלבונים, רנ"א ודנ"א, לתקשורת בין-תאית. חקירת שיחות צולבות בתיווך EV בין תאים בהומאוסטזיס שרירים ובמחלות מציעה פוטנציאל משמעותי לשיפור ההבנה שלנו של התפתחות שרירים, התחדשות וניוון. עם זאת, הפרוטוקולים הנוכחיים לבידוד כלי רכב חשמליים שמקורם בשרירי השלד (SkM-EVs) מתמודדים עם אתגרים בהשגת טוהר ותנובה גבוהים, בעיקר בשל קשיים בשחרור כלי רכב חשמליים מרקמות השריר מבלי לפגוע בקרומי התאים. מאמר זה מציג פרוטוקול יעיל לבידוד SkM-EV, הכולל ניתוק מכני, דיסוציאציה אנזימטית, סינון ואולטרה-צנטריפוגה. שלבים אלה ממוטבים כדי לשפר את שחרור הרכב החשמלי מרקמות השריר, ומניבים מערכות SkM-EV בעלות טוהר גבוה. לאחר מכן, מבוצעות ציטומטריית זרימה ננו, בדיקת BCA ובדיקת כתמים מערביים כדי לאפיין את הכמות והאיכות של SkM-EV המבודדים. פרוטוקול זה טומן בחובו הבטחה להקמת פלטפורמה אמינה להשגת כלי רכב חשמליים שמקורם ברקמות, לקידום מחקר בסיסי, אבחון מחלות ואספקת תרופות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) הן חלקיקים ננומטריים הקשורים לקרום המשוחררים על ידי תאים לסביבה חוץ-תאית. כלי רכב חשמליים אלה מעבירים חומצות גרעין, חלבונים ושומנים כדי לווסת מסלולי איתות מרובים בעת קליטתם על ידי התאים המקבלים. באופן ספציפי, כלי רכב חשמליים שבודדו משרירי השלד (SkM-EVs) היו מעורבים בניוון שרירים, התחדשות וגדילה על ידי העברת מיקרו-רנ"א רגולטורי מיוגני או גורמי שעתוק 1,2,3,4. ככל שההבנה שלנו של תת-אוכלוסיות ומאפיינים של SkM-EV ממשיכה להתפתח, שלפוחיות אלה נראות מבטיחות כסמנים ביולוגיים לאבחון מוקדם 5,6 וכמטרות טיפוליות להפרעות נוירומוסקולריות. תחום מתרחב זה מציע הזדמנויות מלהיבות הן לחקירה פתולוגית והן ליישומים קליניים.

המחקר הנוכחי על SkM-EVs מתמקד בעיקר באלה המתקבלים מסופרנאטנטים של תרביות תאים לאחר תרבית ex vivo 2,7,8, ומעלה חששות לגבי נאמנות קווי תאי המטרה לאחר מעברים עוקבים והרגישות של מאפייני EV לשינוי בסביבות מלאכותיות. זה מדגיש את הצורך לבודד SkM-EV ישירות מרקמות השריר כדי להימנע מהשפעות תרבית ex vivo ולייצג טוב יותר בתנאי in vivo. למרות שפותחו מספר גישות לבידוד כלי רכב חשמליים מרקמות שריר 9,10, המחקרים עדיין משתנים באופן משמעותי בפרטי הפרוטוקול, ומשפיעים על עקביות והשוואה. פרוטוקול סטנדרטי לבידוד ואפיון SkM-EV נחוץ בדחיפות כדי להבטיח אמינות במחקרים קשורים.

בהתחשב במאפיינים הפיזיולוגיים של שרירי השלד, פיתחנו פרוטוקול לבידוד וטיהור SkM-EV מדגימות שרירי שלד של מכרסמים באמצעות ניתוק מכני, דיסוציאציה אנזימטית, סינון ואולטרה-צנטריפוגה דיפרנציאלית. באמצעות ניתוח מקיף באמצעות ציטומטריה של זרימת ננו, בדיקת BCA ובדיקת כתמים מערביים, מצאנו כי פרוטוקול זה מניב באופן עקבי SkM-EV בעלי טוהר וכמות גבוהים במסגרת זמן מוגבלת. ניתן ליישם אותו על דגימות שרירי שלד במצבים שונים, כולל פציעות שרירים חריפות וכרוניות. יתר על כן, עם התאמות מתאימות, שיטה זו יכולה להיות מותאמת לרקמות שריר מחולים אנושיים או מודלים אחרים של בעלי חיים. סטנדרטיזציה של תהליך הבידוד של SkM-EV חיונית להבטחת עקביות באיכות SkM-EV, הקלה על השוואות של מאפייני EV - כגון תפוקה, גודל, הרכב מטען ותפקוד - וקידום היישומים הפוטנציאליים שלהם כסמנים ביולוגיים אבחנתיים, כמו גם לשיפור הבנתנו את תפקידם בתהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים שונים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מבודד שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) מרקמת שריר השלד באמצעות ניתוק מכני, דיסוציאציה אנזימטית, סינון ואולטרה-צנטריפוגה דיפרנציאלית. הוא מאפשר בידוד של כלי רכב חשמליים מקבוצות שרירי גפיים בודדות או משולבות של מכרסמים, כולל טיביאליס קדמי (TA), extensor digitorum longus (EDL), סולאוס (SOL), גסטרוקנמיוס (GAS) וארבע ראשי (QUA). השימוש בבעלי חיים אושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת ג'ורג'יה, והמחקר עמד בהנחיות המכונים הלאומיים לבריאות לטיפול ושימוש בבעלי חיים במחקר. בעלי החיים שוכנו במתקני בעלי החיים במחלקה למדעי בעלי החיים והחלב באוניברסיטת ג'ורג'יה. במחקר זה נעשה שימוש בעכברים זכרים בוגרים מסוג פרא (C57BL/6J), כאשר רקמות שנקצרו מעכברים הוקרבו בגיל 3 חודשים. פרטים על הריאגנטים והציוד בהם נעשה שימוש מופיעים בטבלת החומרים.

1. ניתוק מכני של קבוצות שרירים מהעכבר

  1. הרדימו את העכברים עםCO2, ולאחר מכן נקע צוואר הרחם (בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי מוסדות). לגלח את שתי הגפיים האחוריות.
  2. אבטחו את רגל העכבר בלוח סטרילי כשהצד הקדמי של הרגל פונה כלפי מעלה (איור 1A).
  3. בצע חתך קטן (5 מ"מ) בעור בצד הצדדי של קרסול העכבר באמצעות מספריים דיסקציה.
  4. הכניסו בזהירות להב אחד של המספריים לחתך, ומקמו אותו מתחת לעור אך לא ברקמת השריר שמתחתיו. לאחר מכן, חתכו את העור כלפי מעלה לכיוון הברך כדי להאריך את אורך החתך.
  5. תפסו את העור לאורך החתך באמצעות פינצטה גסה והרחיבו את הפתח עד שהשריר נראה לעין.
  6. אתרו את שריר TA, שעובר מהברך לקרסול בצד הלטרלי של עצם השוקה11, והשתמשו בפינצטה בעלת קצה חד כדי לתפוס ולקלף את השכבה הדקה של רקמת החיבור שמכסה את השריר (איור 1B).
  7. בקרבת הקרסול יש לזהות את שני הגידים בקצה ה-TA, האחד מחובר ישירות לשריר ה-TA והשני את גיד ה-EDL, שהוא קטן יותר וממוקם בסמוך לגיד TA בצד הצידי. חותכים את שני הגידים באמצעות מספריים לדיסקציה.
  8. תפוס את שני הגידים בפינצטה מחוספסת. לאחר מכן, השתמשו בזוג נוסף של פינצטה גסה או חדה כדי להפריד בין הגידים, ובכך להפריד את ה-TA מה-EDL (איור 1C).
  9. הרימו את ה-TA על ידי הגיד שזה עתה נקטע בעזרת פינצטה מחוספסת. לאחר מכן, חותכים את גיד TA ליד הברך באמצעות מספריים דיסקציה, ובכך להסיר את השריר. חזור על תהליך זה כדי להסיר את ה- EDL, ואחסן את שני השרירים ב- PBS על קרח.
  10. שחררו את הרגל והפכו את העכבר כך שהפנים האחוריות פונות כלפי מעלה.
  11. עם העור על הרגל עכשיו הוסר חלקית, לחתוך את העור ליד הקרסול באמצעות מספריים דיסקציה. לאחר מכן, השתמשו בפינצטה גסה כדי לתפוס ולקלף את העור כלפי מעלה לכיוון החלק האחורי של הברך, וחשפו את ה-GAS.
  12. חתכו את גיד ה-GAS ליד הקרסול באמצעות מספריים לדיסקציה (איור 1D).
  13. אחזו בגיד ה-GAS בפינצטה גסה והרימו אותו כלפי מעלה כדי לחשוף את החלק התחתון של ה-GAS.
  14. אתר את גיד ה-SOL הקטן בחלק התחתון של ה-GAS קרוב לברך (היכן שה-GAS עדיין מחובר). חתכו את גיד ה-SOL באמצעות מספריים לדיסקציה, מה שגרם ל-SOL להתכווץ כלפי מעלה (איור 1E).
  15. אחזו בגיד ה-SOL הקטוע בפינצטה חדה, הרימו אותו בעדינות, ובכך נתקו את ה-SOL מהחלק התחתון של ה-GAS.
  16. חותכים את קצה ה-SOL במקום בו הוא מתחבר לקצה הקטוע של ה-GAS באמצעות מספריים לדיסקציה, ובכך מפרידים בין שני השרירים. שמרו על ה-SOL ב-PBS על קרח.
  17. חתכו את קצה ה-GAS ליד הברך והניחו אותו ב-PBS על קרח.
  18. לאחר הסרת ארבעת השרירים הרשומים מתחת לברך, הפוך את העכבר כך שהפנים הקדמיות יהיו כלפי מעלה.
  19. במידת הצורך, קלף את העור עוד יותר עם פינצטה גסה כדי לחשוף את QUA. מקם את רגל העכבר בזווית של 90° כדי לאלץ את ה-QUA להתגמש. חותכים את הגיד הקרוב ביותר לברך באמצעות מספריים לדיסקציה.
    1. הפרידו את ה-QUA מעצם הירך על-ידי חיתוך בין השריר לעצם עד שה-QUA מחובר רק דרך הגיד הפרוקסימלי (איור 1E). לאחר מכן, לנתק את הגיד הפרוקסימלי ולהסיר את QUA. הניחו את ה-QUA ב-PBS על קרח.
  20. ודאו שלאחר ניתוקי שרירים, השוקה והפיבולה חשופים בבירור (איור 1F).
  21. שטפו את השרירים כמה פעמים עם PBS כדי להסיר מזהמים כמו פרווה ודם (איור 1G). לאחר מכן, יבש את השרירים בעדינות עם מגבות נייר. השתמש באיזון אנליטי כדי למדוד את משקל השריר, אשר ישמש מאוחר יותר כדי לחשב את EV שנאסף לכל גרם של שריר.

2. דיסוציאציה אנזימטית של גושי שריר מנותקים

  1. הסירו בעדינות גידי שריר מדגימת השריר באמצעות פינצטה חדה, פינצטה, אזמל או מספריים (איור 2A).
  2. לאחר הסרת הגיד, חתכו את השריר לאורך סיבי השריר (מגיד לגיד) לגושי שריר בעובי 1 מ"מ באמצעות מספריים או אזמל כדי להגדיל את יחס שטח הפנים לנפח (איור 2B,C).
    הערה: נסו להגביל את נזקי המיופייבר במהלך החיתוך. עבור שרירים גדולים יותר כמו TA, GAS ו-QUA, בצעו חתכים נוספים בהשוואה לשרירים קטנים יותר כמו EDL ו-SOL כדי להבטיח יחס שווה בערך בין שטח הפנים לנפח בכל דגימות השריר (איור 2D).
  3. הכינו 10 מ"ל של מאגר אנזימי עיכול טרי (DEB) לכל עכבר ושמרו אותו על קרח עד לשימוש.
    1. להכנת DEB, יש לערבב 2 מ"ג של אנזים collagenase II לכל 1 מ"ל של Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) עם תמיסת פניצילין-סטרפטומיצין 1%. סנן את התמיסה דרך מסנן 0.2 מיקרומטר לאחר הערבוב.
    2. ודא של- DEB יש פעילות אנזימטית של מעל 250 יחידות. מערבבים את ה-DEB עד שהתמיסה מעורבבת היטב ואבקת האנזים collagenase II כבר לא נראית לעין.
  4. מפרידים את רקמת השריר לאליציטוטים, שכל אחד מהם מכיל 20 מ"ג רקמת שריר. לאחר מכן, הוסף 1 מ"ל של DEB לכל aliquot עבור דיסוציאציה אנזימטית.
  5. דגור על DEB ותערובת שרירים על שייקר באינקובטור בטמפרטורה של 37°C במשך 12 שעות במהירות רעידה של 100 סיבובים לדקה (סל"ד) (איור 2E).

3. סינון וצנטריפוגה במהירות נמוכה להעשרת SkM-EV

הערה: כוונו את הצנטריפוגה בקירור ל-4°C והפעילו אותה עד שתגיע לטמפרטורה שנקבעה. יש לשמור את כל הצינורות והדגימות הדרושים על קרח עד שיהיו מוכנים לשימוש.

  1. לאחר הליכי העיכול האנזימטיים, ודאו שלא נראים גושי שריר נראים לעין (איור 3A). לפני הצנטריפוגה בקירור, יש לחלץ 10 מיקרוליטר תמיסה מתערובת שרירי DEB ולהעביר אותה לצינור של 0.2 מ"ל לבדיקת כדאיות התא במידת הצורך.
  2. הכינו ותייגו צינורות מיקרוצנטריפוגות ריקים חדשים בנפח 1.5 מ"ל. הגדר מסנן 0.45 מיקרומטר ומזרק 5 מ"ל על ידי הסרת הבוכנה (אין להשליך) והברגת הרכזת לקצה העליון של מסנן 0.45 מיקרומטר. מקמו את המסנן כך שהקצה התחתון ימוקם בתוך צינור ריק שסומן לאחרונה (איור 3D). סנן את PBS 1x דרך מסנן 0.2 מיקרומטר.
  3. צנטריפוגו את התערובת במשך 10 דקות במהירות של 1,000 x גרם ו-4°C כדי להשליך פסולת כלשהי (איור 3B). העבירו את הסופרנאטנט (כ-1 מ"ל) לתוך המזרק באמצעות מיקרו-פיפטה P200 (איור 3C,E).
  4. הכניסו מחדש את בוכנה המזרק ודחפו באיטיות את הסופרנאטנט דרך המסנן, מה שמאפשר לו לעבור דרכו ולאסוף אותו בצינור המיקרוצנטריפוגה החדש בנפח 1.5 מ"ל (איור 3F).
  5. מוציאים שוב את הבוכנה ופיפטה בערך 200 μL של 1x PBS לתוך המזרק.
  6. הכניסו מחדש את הבוכנה ודחפו באיטיות את 200 μL של 1x PBS דרך המסנן (איור 3G) כדי להסיר את שאריות הסופרנאטנט מהמסנן אל תוך צינור המיקרוצנטריפוגה המסומן בנפח 1.5 מ"ל.
  7. חזור על תהליך הסינון עבור צינורות אחרים, באמצעות מסנן חדש עבור כל דגימת רקמה.
  8. לאחר הסינון, ודאו שהתמיסה שקופה ונטולת שאריות גושי שריר (איור 3H).

4. אולטרה-צנטריפוגה דיפרנציאלית לטיהור SkM-EV

הערה: כוונו את הצנטריפוגה בקירור ל-4°C והפעילו אותה עד שתגיע לטמפרטורה שנקבעה. שמור את כל הצינורות והדגימות הדרושים על קרח ומוכן לשימוש.

  1. העבר את התמיסה המסוננת למיקרו-צינוריות חדשות של 1.5 מ"ל (מתאימות עד 200,000 x גרם). אזנו את כל המיקרו-צינוריות עם PBS 1x נוסף כדי להבטיח נפח שווה לפני הכנסתם למיקרו-אולטרה-צנטריפוגה.
  2. לאחר שווידאתם שהנפח של כל הצינורות שווה, סגרו את הצינורות והכניסו אותם לרוטור של המיקרו-אולטרה-צנטריפוגה כדי להיות מאוזנים (איור 4A).
  3. הפעל את המיקרו-אולטרה-צנטריפוגה והגדר אותה לפעול במשך שעה אחת במהירות של 100,000 x גרם ו-4°C (איור 4B).
  4. הכניסו את הרוטור העמוס בצינורות לתוך המיקרו-אולטרה-צנטריפוגה, סגרו את המכסה והפעילו את הוואקום (איור 4C).
  5. ברגע שהוואקום מגיע לרמה 2, לחצו על כפתור ההתנעה והמתינו עד להשלמת תהליך הצנטריפוגה (איור 4D).
  6. לאחר השלמת מחזור מיקרו-אולטרה-צנטריפוגה, לחץ על כפתור הוואקום כדי ללחוץ מחדש על התא לפני הסרת הרוטור והצינורות. שמור את הצינורות על קרח ומקם אותם זקופים כדי למנוע הפרעה לכדור.
  7. הסירו בזהירות את הסופרנאטנט עם מיקרופיפטה P200, כדי למנוע הפרעה של הגלולה (איור 4E).
  8. הוציאו את הקצה, ואז הוסיפו 50 μL של 1x PBS לצינור לאחר הסרת הסופרנאטנט באמצעות מיקרופיפטה P200. עבור דגימות GAS ו-QUA, הוסיפו עד 500 μL של 1x PBS כדי לסייע בפירוק (איור 4F).
  9. השהה מחדש את הגלולה על ידי פיפטציה עדינה למעלה ולמטה באמצעות מיקרופיפטה P20 (או מיקרופיפטה P200 אם נוסף 500 μL) עד שהיא מפורקת לחלוטין ואינה נראית עוד.
  10. סגור את הצינור ואחסן אותו ב -4 ° C לאחסון לטווח קצר (פחות משבוע), -80 ° C לאחסון לטווח ארוך, או הנח את הצינור בחזרה על קרח אם הדגימה תאופיין מיד באמצעות ציטומטריה של זרימת ננו, כתם מערבי או בדיקות אחרות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בעקבות פרוטוקול זה, שלפוחיות חוץ-תאיות של שרירי השלד (SkM-EVs) חולצו בהצלחה מקבוצות שרירים שונות, כולל טיביאליס קדמי (TA), extensor digitorum longus (EDL), סולאוס (SOL), גסטרוקנמיוס (GAS) וארבע ראשי (QUA) מעכברי בר. אפיון מאוחר יותר של SkM-EV אלה בוצע באמצעות ציטומטריה של זרימה ננומית, והבהיר את התכונות הייחודיות שלהם כפי שמסוכם בטבלה 1. למרבה הפלא, מגרם אחד בלבד של רקמת שריר, התקבלה תפוקה מרשימה של 1.18e14 ± 4.86e13 SkM-EVs, עם גודל חלקיקים ממוצע של 73.93 ננומטר ± 2.70 ננומטר וגודל חלקיקים חציוני של 72....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול מתחיל בניתוח קבוצות שרירי הגפיים האחוריות מעכברים או ברכישת רקמת שריר אנושית לאחר המוות בהתבסס על פרוטוקולים זמינים16. הליכי הבידוד הבאים של שלפוחיות חוץ-תאיות של שרירי השלד (SkM-EVs) כוללים שלושה חלקים עיקריים: עיכול אנזימטי עדין של הרקמה לשחרור SkM-EV אינטרסטיציאלי, סינון וצנטריפוגה במהירות נמוכה, ואולטרה-צנטריפוגה. לבסוף, טכניקות שונות מיושמות פרופיל SkM-EV מבודדים.

בהתחשב בהבדלים המשמעותיים בין שרירי הגפיים מבחינת גודל, סו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי משרד ההגנה W81XWH2210261 (ליאו-יאו).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
צינורות מיקרוצנטריפוגה 0.6 מ"לThermoFisher Scientific05-408-120
צינור מיקרו 1.5 מ"ל (C) Eppendorf5720411009
צינורות מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"לThermoFisher Scientific3448שקוף, בוגר, לא סטרילי
BD 5 מ"ל מזרקבקטון דיקינסון14-827-52 טיפ לואר-לוק
שקופיות ספירת תאים, תא כפול למונה תאיםBio-Rad145-0011
צנטריפוגה 5430REppendorf22620667
פתרון ניקויNanoFCM Inc.
Collagenase IIWorthington Biochemical CorporationLS004176
DPBS (10x) נוזלי (-סידן,-מגנזיום)CytivaSH30378.02הדילול הסופי בשימוש הוא 1x
DPBS/שונה (1x)CytivaSH30264.02
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)Genesee Scientific25-500
E-POD Pure מתקן מים מרחוקMillipore SigmaZRXSP0D01
FA-45-30-11 רוטור מיקרוצנטריפוגהEppendorf05-401-503
Fisher Vortex Genie 2ThermoFisher Scientific12-812
Flow NanoAnalyzerNanoFCM Inc.
תנור פרוטוקול כללי Heratherm OGS60ThermoFisher Scientific51028112 הסעת כוח הכבידה, 2.3 רגל מעוקב 120 V
MemGlow-488 בדיקהשלד ציטו בע"מMG01-02
Millipak Special Millipore MilliporeSigmaTANKMPK02
פניצילין-סטרפטומיציןGibco15070063
Pipet-Lite LTS פיפטה L-1000XLS+Rainin17014382
Pipet-Lite LTS פיפטה L-200XLS+Rainin17014391
Pipet-Lite LTS פיפטה L-20XLS+Rainin17014392
קצות פיפטה ER LTS 1000µ L F 768G/8Rainin30808038
קצות פיפטה ER LTS 20µ L F 960G/10Rainin30807966
קצות פיפטה ER LTS 200µ L F 960G/10Rainin30807967
חרוזי בקרת איכותNanoFCM Inc.
S110-AT רוטור זווית קבועהThermoFisher Scientific455391,10,000 סל"ד
S16 exo 65-155nm חרוזיםNanoFCM Inc.
מספרייםSPI, ארה"ב
Sorvall mX 150+ מיקרו-אולטרה-צנטריפוגהThermoFisher Scientific50135641
TC 20 מונה תאים אוטומטיBio-Rad1450102
Trypan Blue SolutionCorning25-900-CI
פינצטהSPI, ארה"ב
צינורות צנטריפוגה VWR 15 מ"לAvantor89039-668
Whatman Puradisc 13 פילטריםCytiva6782-13040.45 ומיקרו; m גודל נקבוביות
עכברי C57BL / 6J מסוג ברמלאי מעבדה ג'קסון#000664

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yamaguchi, A., et al. Pulsed ultrasound promotes secretion of anti-inflammatory extracellular vesicles from skeletal myotubes via elevation of intracellular calcium level. Elife. 12, 89512(2023).
  2. Yamaguchi, A., et al. Skeletal myotube-derived extracellular vesicles enhance itaconate production and attenuate inflammatory responses of macrophages. Front Immunol. 14, 1099799(2023).
  3. Takada, Y., et al. Tumor necrosis factor-α blunts the osteogenic effects of muscle cell-derived extracellular vesicles by affecting muscle cells. Calcif Tissue Int. 112 (3), 377-388 (2023).
  4. Bourgeois, B. L., Levitt, D. E., Molina, P. E., Simon, L. Differential expression of adipocyte and myotube extracellular vesicle miRNA cargo in chronic binge alcohol-administered siv-infected male macaques. Alcohol. 108, 1-9 (2023).
  5. Kargl, C. K., et al. Angiogenic potential of skeletal muscle derived extracellular vesicles differs between oxidative and glycolytic muscle tissue in mice. Sci Rep. 13 (1), 18943(2023).
  6. Vann, C. G., et al. Differential microRNA profiles of intramuscular and secreted extracellular vesicles in human tissue-engineered muscle. Front Physiol. 13, 937899(2022).
  7. Anakor, E., et al. The neurotoxicity of vesicles secreted by als patient myotubes is specific to exosome-like and not larger subtypes. Cells. 11 (5), 845(2022).
  8. Mendhe, B., et al. Lyophilized extracellular vesicles from adipose-derived stem cells increase muscle reperfusion but degrade muscle structural proteins in a mouse model of hindlimb ischemia-reperfusion injury. Cells. 12 (4), 557(2023).
  9. Madison, R. D., Robinson, G. A. Muscle-derived extracellular vesicles influence motor neuron regeneration accuracy. Neuroscience. 419, 46-59 (2019).
  10. Hanson, B., et al. EV-mediated promotion of myogenic differentiation is dependent on dose, collection medium, and isolation method. Mol Ther Nucleic Acids. 33, 511-528 (2023).
  11. Frimand, Z., Das Barman, S., Kjær, T. R., Porpiglia, E., De Morrée, A. Isolation of quiescent stem cell populations from individual skeletal muscles. J Vis Exp. 190, e64557(2022).
  12. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (misev2018): A position statement of the international society for extracellular vesicles and update of the misev2014 guidelines. J Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  13. Welsh, J. A., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles (misev2023): From basic to advanced approaches. J Extracell Vesicles. 13 (2), e12404(2024).
  14. Fan, Y., et al. Differential proteomics argues against a general role for CD9, CD81 or CD63 in the sorting of proteins into extracellular vesicles. J Extracell Vesicles. 12 (8), e12352(2023).
  15. Baietti, M. F., et al. Syndecan-syntenin-Alix regulates the biogenesis of exosomes. Nat Cell Biol. 14 (7), 677-685 (2012).
  16. Shanely, R. A., et al. Human skeletal muscle biopsy procedures using the modified bergström technique. J Vis Exp. (91), e51812(2014).
  17. Mousavi, K., Miranda, W., Parry, D. J. Neurotrophic factors enhance the survival of muscle fibers in edl, but not sol, after neonatal nerve injury. Am J Physiol Cell Physiol. 283 (3), C950-C959 (2002).
  18. Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nat Protoc. 10 (10), 1612-1624 (2015).
  19. Ishii, K., Suzuki, N., Mabuchi, Y., Sekiya, I., Akazawa, C. Technical advantage of recombinant collagenase for isolation of muscle stem cells. Regen Ther. 7, 1-7 (2017).
  20. Motohashi, N., Asakura, Y., Asakura, A. Isolation, culture, and transplantation of muscle satellite cells. J Vis Exp. (86), e50846(2014).
  21. Mozzetta, C. Isolation and culture of muscle stem cells. Methods Mol Biol. 1480, 311-322 (2016).
  22. Clemens, Z., Wang, K., Ambrosio, F., Barchowsky, A. Arsenic disrupts extracellular vesicle-mediated signaling in regenerating myofibers. Toxicol Sci. 195 (2), 231-245 (2023).
  23. Ma, S., et al. Skeletal muscle-derived extracellular vesicles transport glycolytic enzymes to mediate muscle-to-bone crosstalk. Cell Metab. 35 (11), 2028-2043.e7 (2023).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

H EVsWestern BlotBCA

מאמרים קשורים