מאמר שיטה

בדיקת יעילות תרגום באמצעות פרופילי פוליזום תחת לחץ חום

DOI:

10.3791/67445

⸱

11 באוקטובר 2024

 , 
1Department of Biochemical Science and Technology, National Taiwan University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול המוצג כאן כולל פרופיל פוליזומלי כדי לבודד טרנסלטום, mRNA הקשור לריבוזומים, לרנ"א לא פוליזומלי ופוליזומלי מארבידופסיס באמצעות צנטריפוגה הדרגתית של צפיפות סוכרוז. שיטה זו מדגימה את יעילות התרגום של Arabidopsis בלחץ חום.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בקרה תרגומית של גנים שונים תחת עקת חום היא צעד קריטי להסתגלות הצמח לסביבה. הערכת הפעילויות התרגומי של גנים שונים יכולה לעזור לנו להבין את המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס עמידות הצמח, ולתרום להתפתחות יבולים עם עמידות משופרת לעקה לנוכח שינויי האקלים העולמיים. מאמר זה מציג מתודולוגיה מפורטת להערכת יעילות התרגום באמצעות פרופיל פוליזום בצמחים החשופים לעקת חום. ההליך מחולק לשלושה חלקים: טיפול בלחץ חום עבור Arabidopsis, בדיקת יעילות תרגום באמצעות פרופילים polysome, וחישוב יעילות התרגום על ידי בידוד RNA לא פוליסומלי ו polysomal על בסיס הפרופיל. בחלק הראשון, צמחי Arabidopsis נתונים לתנאי עקת חום מבוקרת כדי לחקות אתגרים סביבתיים. הטיפול כולל חשיפת הצמחים לטמפרטורות גבוהות לפרקי זמן מוגדרים, מה שמבטיח השראת עקה עקבית וניתנת לשחזור. שלב זה חיוני לחקר התגובות הפיזיולוגיות והמולקולריות של הצמח לעקה של חום. החלק השני כולל את בדיקת יעילות התרגום באמצעות פרופיל פוליזום. פוליזומים מופקים באמצעות צנטריפוגה הדרגתית של סוכרוז, אשר מפרידה mRNA על בסיס עומס ריבוזומלי. זה מאפשר לבחון את תפוסת הריבוזום על mRNAs, ומספק תובנות לגבי מנגנוני הבקרה התרגומי בתנאי עקה. בחלק השלישי, RNA מבודד משני שברים פוליזומליים ולא פוליזומליים. Spike-in RNA משמש למדידה מדויקת של כמות הרנ"א בכל שבר. חישוב יעילות התרגום מתבצע על ידי השוואת התפלגות ה-mRNA על פני שברים אלה בתנאי עקה נורמלית ובתנאי עקת חום. פעילויות התרגום של גנים ספציפיים מוערכות עוד יותר על ידי ביצוע PCR כמותי בזמן אמת (qRT-PCR) עם RNA הקשור לריבוזום ורנ"א כולל. מתודולוגיה זו מתמקדת אך ורק בהשפעות של עקת חום, ומספקת פרוטוקול מפורט לניתוח רגולציה תרגומית בצמחים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תרגום חיוני לאורגניזמים כדי לסנתז חלבונים פונקציונליים מ-mRNA, לתמוך בתפקודים תאיים חיוניים ובתהליכים ביולוגיים כמו חילוף חומרים ואיתות ולאפשר תגובות עקה. ללא תרגום, תאים אינם יכולים לייצר חלבונים חיוניים, המשפיעים על מבנהם, תפקודם וויסותם, ובכך משפיעים על קיום החיים ומטפחים מגוון ביולוגי 1,2. לכן, לימוד היעילות התרגומית של צמחים הוא חיוני. תרגום כרוך במספר שלבים חיוניים. ראשית, האתחול מתרחש כאשר mRNA נקשר לריבוזום, המתאפשר על ידי גורמי אתחול כגון eIFs באיקריוטים, המזהים את קודון ההתחלה, בדרך כלל AUG. לאחר מכן, ההתארכות מתרחשת כאשר מולקולות RNA העברה (tRNA), שכל אחת מהן נושאת חומצות אמינו ספציפיות, נקשרות ברצף לריבוזום. קשרים פפטידים נוצרים בין חומצות אמינו סמוכות, מאריכים את שרשרת הפוליפפטיד על פי רצף mRNA. לבסוף, הסיום מתחיל עם מפגש עם קודון עצירה (UAA, UAG או UGA), המוכר על ידי גורמי שחרור המניעים את הריבוזום לשחרר את החלבון המסונתז החדש. במהלך התרגום, גורמי אתחול אאוקריוטים שונים (eIFs), גורמי התארכות ורנ"א ריבוזומלי פועלים יחד כדי להבטיח דיוק ויעילות 3,4.

מחקרים קודמים הצביעו על כך ששינויים לאחר תרגום ממלאים תפקיד קריטי בוויסות אינטראקציות בין eIFs ובכך משפיעים על יעילות התרגום. מחקר במבחנה גילה כי CASEIN KINASE 2 (CK2) קינאז פוספורילטים eIF3c, eIF5 ו- eIF2β כדי להגביר את האינטראקציות שלהם אחד עם השני ועם eIF1 5,6. בחושך, E3 ligase CONSTITUTIVELY PHOTOMORPHOGENIC 1 (COP1) מדכא את התרגום על ידי עיכוב זרחן בתיווך TOR של S6K-RPS6. RPS6 שאינו פוספורילציה אינו מסוגל ליצור ריבוזומים פונקציונליים, ובכך מפסיק את תרגום7. לעומת זאת, בתנאי אור, המדכא של PHYA 105 (SPA1) קינאז פוספורילטים eIF2α כדי להקל על הרכבה מורכבת eIF2 ולקדם אתחול תרגום8. ממצאים אלה מדגישים את מנגנוני הבקרה המורכבים המווסתים את התרגום בתגובה לאותות סביבתיים.

גירויים סביבתיים מתונים יכולים לקדם ביעילות תהליכי תרגום כדי להקל על הצמיחה, כגון פוטומורפוגנזה 8,9. עם זאת, כאשר גורמים סביבתיים הם מוגזמים, צמחים חסרי תנועה צריכים לפתח מנגנוני ויסות מתאימים כדי להפחית את הנזק שנגרם על ידי לחץ סביבתי10. במחקרים קודמים הקשורים לתגובות עקה של צמחים, הרוב התמקדו בוויסות ברמה המטבולית, ההורמונלית והשעתוק 11,12,13,14. עם זאת, מחקרים אחרונים החלו להדגיש את ההשפעה של רגולציה תרגומית על עמידות לעקה צמחית 15,16,17. צמחים יכולים להגביר את עמידות העקה שלהם על ידי הפחתת יעילות התרגום, ובכך למזער צריכת אנרגיה מיותרת. בשל היווצרותם של גרגרי עקה לא ממברניים בתאי צמחים, mRNA לא מתורגם וחלבונים הקשורים אליהם מצטברים בתוכם כדי להפחית את יעילות התרגום18. אחת העקות הסביבתיות הנפוצות שצמחים נתקלים בהן לעתים קרובות היא עקת חום, אשר דווחה כגורמת להיווצרות גרגרי עקה בתוך תאי הצמח19,20. העלייה העולמית בטמפרטורות הממוצעות עקב ההתחממות הגלובלית פוגעת קשות ביבול21. לכן, חקר הוויסות הפיזיולוגי של צמחים תחת עקת חום הוא חיוני. מחקר קודם הראה כי טיפול בחום של חיטה הביא לירידה ב-mRNA הקשור לפוליזום. עם זאת, mRNA שאוחסנו בגרגרי לחץ שוחררו ונקשרו מחדש לריבוזומים, מה שהקל על התרגום לאחר ההחלמה22. בנוסף, מחקרים קודמים השוו ביטוי גנים בין mRNA כולל לבין mRNA הקשור לפוליזום בצמחים שקועים16. התוצאות הצביעו על כך שרמות ה-mRNA במצב יציב הקשורות לחומצה אבסציסית ולתגובות עקה אביוטיות עלו מעט לאחר השקיעה. יתר על כן, כמות mRNA הקשורים לפוליזום גדלה באופן משמעותי. תוצאות אלה מצביעות על כך שרגולציה של תרגום עשויה למלא תפקיד קריטי יותר בשליטה על עמידות לעקה בצמחים. לכן, שיטת בידוד RNA פוליזומלית יעילה חיונית לחקר הטרנסלטום של דגימות שטופלו בלחץ.

בפרוטוקול זה, שינינו את שיטת בידוד הרנ"א משיטת מיצוי פנול/כלורופורם בסיכון גבוה ונפח עם משקעים LiCl לשיטת מיצוי פנול/גואנידיניום תיוציאנט בקנה מידה קטן, הדורשת פחות נפח. השיטה הראשונה כוללת ערבוב ישיר עם שברים פוליזומליים, וכתוצאה מכך פסולת ניסיונית גדולה יותר 9,15,23. לעומת זאת, גישה שונה זו משתמשת בעקרונות צפיפות דיפרנציאלית: רנ"א פוליזומלי מעורבב תחילה עם תמיסה עתירת מלח וללא סוכר ולאחר מכן מואץ על ידי אולטרה-צנטריפוגה. לאחר מכן, מיצוי RNA מבוצע באמצעות נפח קטן של מגיב פנול/גואנידיניום תיוציאנט. שיטה זו מפחיתה ביעילות את ייצור הפסולת האורגנית, מה שהופך את הניסוי שלנו לידידותי יותר לסביבה. בנוסף, הממסים האורגניים המשמשים הם בעלי רעילות נמוכה יותר. סיבות אלה הובילו אותנו להתאים ולשפר את הליכי הניסוי בהתאם. בנוסף, שיטות קודמות לא סיפקו פרוטוקול מקיף לחישוב יעילות התרגום באמצעות נורמליזציה של ספייק-אין, שהיא חיונית לניתוחים טרנסלאטומיים מעמיקים יותר.

במאמר זה אנו מתארים פרופיל פוליזום ופרוטוקול בידוד RNA פוליזומלי לחקירת יעילות תרגום ואנליזות טרנסלאטומיות בארבידופסיס תחת לחץ הלם חום. פרוטוקול זה שימש להערכת יעילות התרגום בסוג הבר Col-0 בתנאים רגילים, הלם חום ולאחר התאוששות. תוצאות פרופיל פוליזום ואחוז הרנ"א הפוליזומלי גילו שינויים ביעילות התרגום בעקבות טיפול בעקת חום בשתילי ארבידופסיס .

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנת שתיל שתיל Arabidopsis מטופל בחום

  1. צלחת 250 זרעים עבור כל משוכפל וכל מצב עם טפטפת על נייר סינון מונח על צלחת אגר מדיה בסיסית Murashige ו Skoog (MS) ללא סוכרוז (pH 5.6) בתוספת 1.2% phytoagar.
    הערה: כדי לשתול שתילים על לוחות MS, נייר סינון סטרילי מונח על הצלחת כדי למנוע משורשי שתילים לחדור עמוק לתוך המדיום, מה שמקל על הדגימה. לאחר מכן זורעים זרעים על גבי נייר הסינון. כדי למנוע את השפעת הסוכרים על גדילת הצמח ותוצאות הניסוי, מומלץ להשתמש במדיום טרשת נפוצה שאינו מכיל סוכרוז לגידול.
  2. עטפו את צלחת הטרשת הנפוצה המכילה זרעים נטועים ברדיד אלומיניום כדי לחסום את האור ולדגור עליה ב -4 מעלות צלזיוס למשך יומיים כדי לגרום לוורנליזציה.
  3. מעבירים את הזרעים הוורנליים לתא גדילה לגידול מתחת ל-16 שעות: 8 שעות, פוטופריוד בהיר-כהה ב-22°C עם עוצמת אור של 100 μmol/m2/s.
  4. לדגימות לחץ חום, אטמו את הצלחות הבינוניות של MS המכילות שתילים בני 5 ימים עם סרט דבק עמיד למים והניחו אותם באמבט מים של 40 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת.
  5. עבור דגימות המתאוששות לאחר טיפול בחום, יש לקרר את הצלחות מיד לאחר הטיפול בחום. לאחר מכן, מניחים אותם בתא צמיחה ב 22 ° C במשך 2 שעות.
  6. לקצור 250 שתילים עם מטופלים או לא מטופלים לתוך צינורות מיקרוצנטריפוגות 1.5 מ"ל עבור כל לשכפל ולהקפיא את הדגימות בחנקן נוזלי מיד.
    הערה: עבור כל תנאי הוכנו שתי קבוצות דגימות. האחד מיועד לניתוחי פרופיל פוליזומים, והשני מיועד למיצוי RNA לא פוליזומלי ופוליזומלי.

2. הכנת מדרג סוכרוז

  1. הכינו את תמיסת השיפוע המכילה את הריכוזים הבאים של סוכרוז: 12.5%, 24.4%, 36.3%, 48.1% ו-60%. הרכב התמיסה כולל 50 mM Tris-HCl, 25 mM KCl, 10 mM MgCl2, 100 μg/mL Heparin, ו-50 μg/mL cycloheximide (CHX).
  2. טען את תמיסות השיפוע מריכוז גבוה לנמוך, החל מלמטה ונע כלפי מעלה. לאחר הוספת כל ריכוז של תמיסת שיפוע, מקפיאים את התמיסה למצב מוצק לפני הוספת הריכוז הבא. עבור כל ריכוז של שיפוע סוכרוז, להוסיף 2.2 מ"ל. תהליך זה יגרום לשיפוע צפיפות סוכרוז לא רציף.
  3. יש לאחסן את שיפוע הסוכרוז המוכן באופן זמני בטמפרטורה של -80°C ולהפשיר למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C לפני השימוש.

3. הכנת מדגם פרופיל פוליזום

  1. טחנו 250 שתילי Col-0 בני 5 ימים, בין אם במצוקת חום או לא מטופלים, שהוקפאו בעבר לאבקה באמצעות הומוגנייזר בתדירות של 30 מחזורים לשנייה למשך דקה.
    הערה: כאשר מספר הצמחים עם אותו רקע שווה, יש להם אותה תפוקת מיצוי RNA. עם זאת, כאשר משווים ביטוי יתר של צמחים טרנסגניים או מוטנטיים בעלי רקע שונה, יש להתאים את כמות הצמחים המשמשים בהתאם לתנאי הצמח.
  2. כדי לקבל תמיסת מיצוי המכילה RNA לא פוליזומלי ופוליזומלי, הוסף 500 μL של חיץ מיצוי פוליזום (200 mM Tris-HCl, pH 8.0, 50 mM KCl, 25 mM MgCl2, 50 μg / mL cycloheximide, 100 μg / mL הפרין, 2% PTE, 10% DOC, 400 U/mL מעכב ריבונוקלאז) לכל צינור, וערבב את הדגימות על ידי היפוך ומערבול. ודא כי הדגימות נשמרות ב 4 ° C לאורך כל התהליך.
  3. צנטריפוגה את תמיסת השאיבה ב 4 ° C, 12,000 x גרם במשך 10 דקות. לאחר מכן, סנן את הסופרנאטנט דרך מסננת תאים של 100 מיקרומטר כדי לקבל תמיסת מיצוי ברורה ונטולת חלקיקים.
    הערה: החלקיקים הנמצאים בתמיסת המיצוי עשויים לשקוע במהלך אולטרה-צנטריפוגה, מה שעלול ליצור גלולה שעלולה להשפיע על הדיוק של מדידות פרופיל פוליזום.
  4. העמיסו את הסופרנאטנט המסונן על שיפוע סוכרוז שהוכן מראש וודאו שהוא מגיע לשיווי משקל.
    הערה: בשל מהירות הסיבוב הגבוהה של האולטרה-צנטריפוגה, חיוני להבטיח הן בטיחות והן תפקוד תקין של האולטרה-צנטריפוגה. כדי להשיג זאת, יש צורך לאשר כי משקלי המדגם זהים לפני סיבוב. לכן, אנו משתמשים באיזון מדויק כדי לוודא שמשקולות השיפועים אחידות לחלוטין.
  5. צנטריפוגה שיפוע הסוכרוז טעון בדגימות ב 4 ° C, 210,000 x גרם במשך 3.5 שעות באמצעות רוטור דלי מתנדנד אולטרה צנטריפוגה. הגדר את קצבי ההאצה וההאטה למקסימום. לאחר אולטרהצנטריפוגה, RNA לא פוליזומלי ופוליזומלי מופצים על פי צפיפותם בתמיסת שיפוע הסוכרוז המתאימה.
    הערה: בשיפוע הסוכרוז, RNA לא פוליזומלי עם צפיפות נמוכה יותר מתפשט בשכבה העליונה, בעוד RNA פוליזומלי, המאופיין בצפיפות גבוהה יותר בשל נוכחותם של ריבוזומים רבים העוסקים בתרגום פעיל על mRNA, מתפשט בשכבה התחתונה. לאחר מכן, פרופיל פוליזום ניתן למדוד באמצעות מקטע שיפוע צפיפות.

4. ניתוח פרופיל פוליזום

הערה: מקטע שיפוע צפיפות עם משאבת מזרק מיקרו-נפח משמש למדידת פרופיל פוליזום.

  1. הכינו את תמיסת המרדף (70% סוכרוז, 10% גליצרול ו-0.02% ברומופנול כחול) למשאבת מזרק מיקרו-נפח.
  2. השתמש בתוכנה כדי לשלוט במקטע מעבר הצבע של הצפיפות. כיול המכונה באמצעות מים שעברו דה-יוניזציה. לאחר הכיול, השתמש בו כדי לבצע פרופיל פוליזום.
    1. כדי לבצע כוונון קו בסיס, הפעל את UV/VISDetector עד שהנורית תשתנה מאדום לירוק. כוונן את ידית הסטת המקליט כדי ליישר את קו הסמן, ולאחר מכן סובב את ידית התאמת קו הבסיס למצב הפתיחה המינימלי. הגדר את ידית הרגישות ב- UV/VISDETECTOR לרמה 2.0 ולחץ על הלחצן Auto Baseline . לבסוף, השתמש בידית היסט המקליט כדי להתאים את קו הבסיס הרצוי ל- 20. התהליך המכויל ישתנה בהתאם למותג המנגנון ולדגימות השונות.
  3. לאחר אולטרה-צנטריפוגה, הניחו את הצינורות עם הדגימות על מקטע שיפוע הצפיפות באמצעות מערכת פירסינג הצינור כך שניתן יהיה לחבר את הצינור למשאבת המזרק באמצעות תמיסת המרדף וגלאי UV.
  4. העבר את מקטע שיפוע הצפיפות למצב בקרת תוכנה (REMOTE) והגדר את קצב זרימת ההזרקה של משאבת מזרק המיקרו-נפח ל- 3 מ"ל/דקה.
  5. הפעל את הגדרות התוכנה כדי להתחיל ולקבל את גרף פרופיל הפוליזום באמצעות המקטע על-ידי מדידת OD254.

5. בידוד RNA לא פוליזומלי ופוליזומלי

הערה: עבור חלק זה של הפרוטוקול, נעשה שימוש בקבוצה שונה של דגימות מאותה אצווה לאחר ביצוע אולטרה-צנטריפוגה בעקבות אותם שלבים כפי שתואר קודם לכן.

  1. בהתבסס על תוצאות מדידת פרופיל הפוליזום, אספו בנפרד את שברי ה-RNA הלא-פוליזומליים והפוליזומליים. חשב את נפחי התמיסה עבור שברים לא פוליזומליים ופוליזומליים כאחד ואסוף את החלק הלא פוליזומלי (החלק העליון).
    הערה: על פי הפרופילים, השבר עם יותר משני ריבוזומים מוגדר כשבר פוליזומלי, ואילו השבר עם פסגות rRNA 40S, 60S ו-80S מוגדר כשבר לא פוליזומלי.
  2. ערבבו היטב את שברי המטרה של RNA עם תמיסת מלח גבוהה 2x קרה מראש (400 mM Tris-HCl, pH 8.0, 100 mM KCl, 50 mM MgCl2).
  3. הוסף 8 μL של מלאי מדולל של Eukaryotic Poly-A RNA Control מהערכה.
    הערה: עבור הנורמליזציה המהירה הנדרשת לשלב השביעי. ערכת בקרת הרנ"א Poly-A האיקריוטי כוללת גנים מסוג B. subtilis , כגון הגן DAP שאינם קיימים בצמחים, כגני ייחוס. כדי לקבוע את שיעור אובדן גן הייחוס במהלך התגובה לאחר החילוץ, הוסף כמות שווה של מגיב המכיל דגימת RNA של גן DAP לצינורות שונים עם RNA לא פוליסומלי או פוליזומלי לפני החילוץ. זה מאפשר לקבוע את שיעור אובדן גן הייחוס במהלך התגובה לאחר מיצוי והוא יכול לשמש למטרות נורמליזציה.
  4. צנטריפוגה תמיסת מלח גבוהה מעורבב RNA ב 4 ° C, 450,000 x גרם, במשך 5 שעות באמצעות רוטור דלי מתנדנד אולטרה צנטריפוגה.
  5. לאחר אולטרה-צנטריפוגה, RNA יזרז בתחתית צינור הצנטריפוגה. מוזגים בזהירות את הסופרנאטנט מלמעלה כדי לשמר את כדורית הרנ"א בתחתית.
  6. שטפו במהירות את גלולת הרנ"א עם 500 מיקרוליטר של מים שטופלו בדיאתילפירוקרבונט (DEPC) לפני הקור, וחזרו על שלב זה 3x.
    הערה: כדי למנוע ממים שטופלו ב-DEPC להמיס מחדש את הרנ"א במהלך תהליך הכביסה, יש צורך לקרר מראש את המים שטופלו ב-DEPC לפני השימוש כדי להפחית את מסיסותם. בנוסף, יש למזער את זמן המגע בין המים המטופלים ב-DEPC לבין כדורי ה-RNA במהלך הכביסה.

6. מיצוי RNA לא פוליזומלי ופוליזומלי

  1. הוסף 500 μL של מגיב מיצוי RNA וערבב עם דגימת RNA לחילוץ. דוגרים במשך 10 דקות.
  2. מוסיפים 100 מיקרוליטר כלורופורם, מערבבים היטב ודגרים במשך 10 דקות להפרדת פאזות.
  3. צנטריפוגה את תערובת התגובה ב 4 ° C, 12,000 x גרם במשך 10 דקות. מעבירים את השכבה המימית השקופה העליונה המכילה RNA לצינור חדש, מערבבים אותה בעדינות עם נפח שווה של איזופרופנול, ודגרים ב -20 ° C למשך שעתיים עבור משקעים RNA.
  4. לאחר משקעים, צנטריפוגה ב 4 °C (75 °F), 12,000 x גרם במשך 10 דקות. בזהירות להשליך את supernatant ולשמור את גלולת RNA בתחתית.
  5. לשטוף את גלולת RNA עם 1 מ"ל של טרום קר 75% אתנול. צנטריפוגה בטמפרטורה של 4°C, 12,000 x g למשך 10 דקות, השליכו את הסופרנטנט וייבשו באוויר את כדורית ה-RNA.
  6. לאחר ייבוש כדורית הרנ"א, יש להשהות מחדש את כדורית הרנ"א ב-30 מיקרוליטר מים שטופלו ב-DEPC ולמדוד את ריכוז הרנ"א (OD260) באמצעות ספקטרופוטומטר בספקטרום מלא (220-750 ננומטר).

7. נורמליזציה מהירה

  1. השתמש 1000 ng של RNA מופק עבור שעתוק לאחור נעשה באמצעות ערכת qPCR בהתאם להוראות היצרן. גם RNA לא פוליזומלי וגם רנ"א פוליזומלי צריכים להיות משועתקים לאחור ל-cDNA.
  2. ערבבו 1 μL של cDNA עם פריימרים של גן DAP והשתמשו במאגר SYBR כדי למדוד את רמת הביטוי של גן המטרה בהתאם להוראות היצרן. לאחר מכן, השתמש ב- PCR בזמן אמת כדי לזהות ביטוי גנים DAP .
    הערה: רצפים של פריימרים של גן DAP הם כדלקמן:
    פריימר קדמי = 5'-ATA AAA GAA TTC AGC TAA CGC TTC C-3'
    פריימר הפוך = 5'-TTG TTT CTT TGC CTC TAT TGT ATC C-3'
  3. השווה את רמות הביטוי של גני DAP בקבוצות ה-RNA הלא-פוליזומליות והפוליסומליות שנמדדו והערך את תכולת ה-RNA בתנאים של אובדן פרופורציונלי. באמצעות תוכן RNA מנורמל, לחשב את היחס של RNA פוליזומים.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הסוג הפראי של ארבידופסיס, Col-0, גודל בתווך טרשת נפוצה תחת פוטופריוד אור של 16 שעות:8 שעות. לצורך הבקרה נעשה שימוש בשתילים בני 5 ימים ללא טיפול בלחץ חום. קבוצת עקת החום עברה שעה אחת של טיפול בחום ב 40 מעלות צלזיוס באמבט מים שחומם מראש, ואילו קבוצת ההתאוששות הונחה על 22 מעלות צלזיוס למשך שעתיים מיד לאחר הטיפול בחום. על ידי שימוש בתנאי טיפול בחום שונים ובתנאי התאוששות, אנו יכולים להשתמש בצעדים הבאים כדי למדוד את יעילות התרגום שלהם.

לפני מיצוי RNA, יש להכין תחילה את שיפוע הסוכרוז. כדי להפריד את הרנ"א הלא-פוליזומלי והפוליזומלי בהתבסס על הפרש הצפיפות ביניהם, הכנו תמיסה הדרגתית עם ריכוזי סוכרוז של 12.5%, 24.4%, 36.3%, 48.1% ו-60%. לאחר מכן העמסנו את תמיסות השיפוע מריכוז גבוה לנמוך, החל מלמטה (איור 1A). לאחר מכן, אנו יכולים להשתמש בשיפוע זה כדי להפריד את הרנ"א הלא-פוליזומלי בצפיפות נמוכה יותר בשכבה העליונה, בעוד שהרנ"א הפוליזומלי בצפיפות הגבוהה יותר יחולק בשכבה התחתונה עם ריכוזי סוכרוז גבוהים יותר. הרנ"א הלא פוליזומלי והפוליזומלי הופקו מ-Col-0 שטופל או לא טופל. כדי למנוע מחלקיקים בתמיסה להשפיע על תוצאות ניתוח פרופיל פוליזום, יש לסנן את התמיסה המכילה RNA דרך מסננת תאים כדי לקבל תמיסת מיצוי ללא חלקיקים. הסופרנאטנט המסונן הועמס על שיפוע סוכרוז שהוכן מראש ושווה. לאחר אולטרה-צנטריפוגה של דגימות טעונות גרדיאנט סוכרוז, הרנ"א הלא-פוליזומלי והפוליזומלי חולקו לפי צפיפות בתוך שיפוע הסוכרוז. לאחר מכן, פרופיל פוליזום בוצע באמצעות מקטע שיפוע צפיפות (איור 1B). מקטע שיפוע הצפיפות נשלט באמצעות תוכנה המכוילת בתחילה עם מים נטולי יונים. לאחר הכיול, הדגימות נטענות על המקטע שלאחר אולטרה-צנטריפוגה. משאבת מזרק המיקרו-נפח, הפועלת במצב בקרת תוכנה, מזריקה תמיסת סוכרוז בריכוזים גבוהים יותר משיפוע הסוכרוז לתוך השיפוע, ודוחפת את הדגימה. זה מאפשר למדידה להתחיל מראש שיפוע הסוכרוז, שם הצפיפות נמוכה יותר, ולהמשיך לכיוון התחתון, שם הצפיפות גבוהה יותר. לאחר מכן, הגדרות התוכנה מופעלות כדי להתחיל באיסוף נתונים, ויוצרות את גרף הפרופיל הפוליזום באמצעות מדידת OD254 (איור 1B). כאשר אנו צופים בעוצמת אות גבוהה יותר בחלק הפוליזומלי, זה מצביע על כך שהדגימה מפגינה יעילות תרגום גבוהה יותר.

החלקות של פרופיל פוליזום עבור שתילי Col-0 בני 5 ימים תחת טיפולים שונים מוצגות באיור 2. התוצאות של קבוצת הביקורת מדגימות הפרדה ברורה בין המקטע הלא-פוליזומלי לבין המקטע הפוליזומלי (איור 2A). אולם לאחר שעה אחת של עקת חום ב-40°C, עוצמת האות של המקטע הרב-סוכרי ירדה באופן משמעותי (איור 2B). כאשר השתילים שטופלו בחום הורשו להתאושש בטמפרטורה של 22 מעלות צלזיוס במשך שעתיים, עוצמת האות של המקטע הרב-סוכרי התאוששה לרמה דומה לקבוצת הביקורת (איור 2C). התוצאות שלנו הראו כי טיפול בלחץ חום של שעה אחת הפחית באופן משמעותי את יעילות התרגום של שתילי Arabidopsis. עם זאת, צמחים נדרשו שעתיים של התאוששות כדי להחזיר את יעילות התרגום לרמות דומות לאלה של שתילים שאינם סובלים מעומס חום.

כדי לאסוף ראיות נוספות להשוואת יעילות התרגום של שתילי Col-0 בתנאי טיפול שונים, בודדנו וחילצנו את שברי הרנ"א הלא-פוליזומליים והפוליזומליים. אוסף שברי RNA לא פוליזומליים ופוליזומליים הונחה על ידי תוצאות מדידות פרופיל פוליזום. עבור מיצוי RNA לא פוליסומלי ופוליזומלי, אנו משתמשים בריאגנט פנול/גואנידיניום תיוציאנט כדי לחלץ את דגימות הרנ"א הלא-פוליזומליות והפוליסומליות המבודדות. בעזרת שיטת מיצוי הרנ"א בה השתמשנו, אנו יכולים לקבל רנ"א יציב ואיכותי לניתוח הבא שלנו (טבלה 1). לאחר מכן, נרמל את ה- RNA המופק באמצעות ערכת בקרת ה- RNA Poly-A Eukaryotic Poly-A של GeneChip כדי להפחית שגיאות הנגרמות על ידי הפסדי מיצוי משתנים. לאחר מכן, נעשה שימוש ב-PCR בזמן אמת כדי לכמת את הביטוי של גנים מסוג DAP , הכלולים בגנים B. subtilis שנוספו לערכה. ניתוח השוואתי של רמות ביטוי גנים DAP בין קבוצות RNA לא פוליסומליות ופוליזומליות נערך כדי להעריך את תכולת הרנ"א בתנאים של אובדן פרופורציונלי (איור 3A). חישבנו את היחס בין רנ"א פוליסומלי מנורמל לרנ"א הכולל כדי להבהיר את יעילות התרגום ביניהם (איור 3B). לבסוף, היחס בין רנ"א בפוליזומים חושב באמצעות תכולת הרנ"א המנורמלת (איור 3C). התוצאות של יחס הרנ"א בפוליזומים תחת טיפולים שונים של Col-0 הציגו דפוס עקבי עם תוצאות פרופיל הפוליזום שמוצגות באיור 2A. שתי התוצאות מצביעות על כך שלחץ חום מפחית באופן משמעותי את יחס הרנ"א בחלק הפוליזומלי, וניתן להפוך השפעה זו לאחר התאוששות של שעתיים ב-22°C (טבלה 1).

משיטה זו אנו יכולים לקבל את כל מקטע הרנ"א הלא-פוליזומלי או הפוליזומלי באיכות גבוהה במקום להפריד את הרנ"א לשברים נוספים23. התוצאות שלנו מראות גם כי הן פרופילי פוליזום והן אחוז הרנ"א בפוליזומים יכולים לשקף ביעילות את יעילות התרגום בארבידופסיס עם מצבים מטופלים שונים.

figure-results-1
איור 1: דיאגרמת זרימת עבודה של פרופיל פוליזום. (A) המחשה סכמטית של הכנת שיפוע הסוכרוז בצינור צנטריפוגה בנפח 13 מ"ל. (B) תרשים הזרימה מדגים את התהליך הניסיוני של פרופיל פוליזום. ראשית, התרגום מופק. לאחר מכן, RNA לא פוליזומלי ופוליזומלי מופרדים בהתבסס על הבדלי הצפיפות שלהם באמצעות אולטרה-צנטריפוגה בשיפועי סוכרוז בצפיפויות שונות. OD254 נמדד באמצעות מקטע שיפוע צפיפות כדי לקבל את גרף תוצאות פרופיל הפוליזום להלן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: פרופיל פוליזום של Col-0 בתנאים שונים. (א, ב, ג) תוצאות פרופיל הפוליזום של Col-0 בתנאים של (A) ללא טיפול בחום (בקרה), (B) טיפול בחום ב-40°C למשך שעה אחת, ו-(C) התאוששות ב-22°C למשך שעה אחת לאחר טיפול בחום. הרנ"א הלא פוליזומלי והפוליזומלי חולקו באמצעות שיפוע סוכרוז של 12.5%-60%. המיקומים של RNA לא פוליסומלי (NP) ופוליזומלי (PL) מסומנים על הפרופילים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: דיאגרמת זרימת עבודה של חילוץ RNA לא פוליסומלי ופוליזומלי. (A) איור של נורמליזציה של רנ"א על-ידי ספייק אין. (B) המחשה של הפרדת RNA לא פוליסומלי ופוליזומלי וחישוב אחוז RNA פוליזומלי. (C) אחוז הרנ"א הרב-סוכרי ב-Col-0 שטופל במצבים שונים. קווי שגיאה מציינים את הממוצע ± SD (n=3 חזרות ביולוגיות). *ערך p < 0.01, מבחן t של סטודנט. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

תוכן (ng)260/280260/230
לשלוטרנ"א NP758.32.192.16
RNAPL302.32.212.13
עקת חוםרנ"א NP821.52.22.15
RNAPL174.32.192.21
שחזוררנ"א NP797.22.172.16
RNAPL300.92.192.18

טבלה 1: תכולת ואיכויות RNA לא פוליסומלי ופוליזומלי. טבלה זו הראתה את תוכן הרנ"א ואת תכונותיו נותחו. תוכן הרנ"א נורמל לאחר החילוץ בשיטות ששונו.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתווה שיטה פשוטה וסטנדרטית למדידת יעילות התרגום של שתילי ארבידופסיס. השלבים הקריטיים של פרוטוקול זה הם הבטחת יציבות RNA עם צנטריפוגה משנית ומיצוי מגיב מיצוי RNA, כמו גם הכנה קפדנית של שיפוע הסוכרוז. יתר על כן, אנו מספקים צעדים קריטיים לנרמול וכימות הרנ"א הלא פוליזומלי והפוליזומלי בשיטת הנורמליזציה הספייק-אין. חשוב מאוד שכל ההליכים יתבצעו על קרח באמצעות מאגרים וכלים נטולי RNase. יתר על כן, יש להקפיד על הכנה מדויקת של ריכוז הסוכרוז ולמזער את הרעידות כדי להפחית את השפעתו על השיפוע. במחקרים קודמים 24,25,26, המחקר על תגובות לחץ התמקד בעיקר בניתוחי שעתוק ופנוטיפיים. בעזרת ניתוחי פרופיל פוליזומים, אנו יכולים להמשיך ולחקור את הרגולציה של תהליכים תרגומיים בצמחים תחת עקה או גירויים סביבתיים אחרים.

הבנת תהליכים תרגומיים כרוכה לא רק בביצוע ניסויי פרופיל פוליזום, אלא גם בהשלמתם עם ניסויי תיוג אזידוהומאלנין (AHA). תיוג AHA משמש לחקר סינתזת חלבונים ופעילות תרגומית27. השיטה מחליפה שאריות מתיונין בחלבונים מסונתזים חדשים ב-AHA, אנלוג מתיונין המכיל קבוצת אזיד. תאים משלבים AHA בחלבונים מסונתזים חדשים במהלך התרגום. לאחר מכן, באמצעות טכניקות מבוססות כימיה של אזיד כמו כימיית קליק, חלבונים המכילים AHA יכולים להיות מסומנים ומזוהים באופן סלקטיבי, מה שמאפשר ניתוח כמותי והדמיה של חלבונים המתרגמים באופן פעיל28. על ידי שילוב של תיוג AHA עם פרופיל פוליזום, חוקרים יכולים לקבל תובנות עמוקות יותר על הדינמיקה של סינתזת חלבונים בתוך תאי צמח8.

בעזרת בידוד RNA פוליסומלי זה ושיטת נורמליזציה של ספייק-אין, אנו יכולים גם להשתמש ב-RNA המופק לניתוח ריצוף RNA. על ידי ניתוח mRNA הקשור לפוליזום, אנו יכולים לקבוע אילו mRNA עוברים תרגום פעיל. יתר על כן, השוואת mRNA במצב יציב עם mRNA הקשור לפוליזום מאפשרת לנו לזהות גנים המתבטאים יתר על המידה ברמת התרגום או השעתוק. רמת הביטוי של mRNA במצב יציב משקפת את פעילות השעתוק, בעוד mRNA הקשור לפוליזום מציין גנים העוברים תרגום באופן פעיל. יעילות התרגום מושפעת מגירויים סביבתיים ומשינויים שלאחר התרגום 7,8,9,16. לכן, שיטה זו מספקת הבנה מקיפה של האם חלבון היעד של עניין מתורגם ביעילות. עם זאת, המגבלה של שיטה זו היא שעדיין יהיה אובדן של RNA במהלך הליך החילוץ. ביטוי יחסי של RNA ספייק-אין המתקבל באמצעות qRT-PCR יכול גם לגרום לשגיאות מדידה קלות. מחקר נוסף ותיקוף באמצעות פרוטאומיקה או כתם מערבי נדרש כדי לחקור את ההיבטים הפונקציונליים של חלבון המטרה.

לסיכום, פרוטוקול זה מייצג שיטה פשוטה המספקת גישה פשוטה עם תוצאות ברורות להערכת יעילות התרגום. חשוב לציין, תחולתו משתרעת מעבר לשתילים המטופלים בלחץ חום וכוללת שתילים החשופים לגירויים סביבתיים שונים אחרים.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי אין ניגוד עניינים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מכירים בשירותי המחקר הטכני של אולטרה-צנטריפוגות מ- Technology Commons במכללה למדעי החיים ומרכז המכשור בחסות משרד המדע והטכנולוגיה, האוניברסיטה הלאומית של טייוואן (טייוואן). אנו מודים גם ליו-לינג ליאנג על התמיכה הטכנית, ולחברי מעבדת צ'נג על קריאה ביקורתית של כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי תוכנית מלגת איינשטיין לחוקרים צעירים מהמועצה הלאומית למדע וטכנולוגיה בטייוואן תחת מענק NO. NSTC 113-2636-B-002-007 ל- M.-C.C. M.-C.C. מכיר בתמיכה הכספית מהאוניברסיטה הלאומית של טייוואן.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
צינור אפנדורף 1.5 מ"לLabcon3012-870-000-9מיצוי RNA
13.2 מ"ל צינור צנטריפוגהבקמן קולטר331372אולטרה-צנטריפוגה
ברומופנול כחול Honeywell32712פרופיל פוליזום
כלורופורםHoneywell32211מיצוי RNA
ציקלוהקסימיד (CHX)סיגמא-אולדריץ'SI-C7698פרופיל פוליזום
דיאתיל פירוקרבונט (DEPC)סיגמא-אולדריץ'D5758מיצוי RNA
אתנולסיגמא-אולדריץ'32221מיצוי
RNA ערכת בקרת RNA פולי-A EukaryoticInvitrogen900433נורמליזציה
גליצרולHoneywell15523נורמליזציה
הפריןסיגמא-אולדריץ'SI-H3149פרופיל פוליזום
HiScript III RT SuperMix לערכת qPCRVazymeR323-01נורמליזציה
KClJ.T.Baker  3040-01פרופיל פוליזום
MgCl2Sigma-AldrichSI-M8266פרופיל פוליזום
MS מדיום בסיסיPhytoM524תרבית צמחים
תרשים שיא משאבת מזרקברנדלSYN4007LSפרופיל פוליזום
פוליאוקסיאתילן-10-טרידציל-אתר (PTE)סיגמא-אולדריץ'P2393פרופיל
פוליזוםRNasinPromegaN251Bפרופיל פוליזום
נתרן דאוקסיכולט (DOC) Sigma-AldrichSI-D6750פרופיל פוליזום
סוכרוזSigma-AldrichS5391פרופיל פוליזום
SYBR Green SupermixBio-RadBP170-8882נורמליזציה
מגיב TRIMRCTR118מיצוי RNA
Tris-HClJ.T.Baker  4109-06פרופיל פוליזום
אולטרה-צנטריפוגהבקמן קולטראופטימה L-100Kאולטרה-צנטריפוגה
UV/VISDETECTORפרופיל ברנדלUA-6פוליזום

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Picard, F., Loubière, P., Girbal, L., Cocaign-Bousquet, M. The significance of translation regulation in the stress response. BMC genomics. 14, 1-11 (2013).
  2. Yuan, S., Zhou, G., Xu, G. Translation machinery: the basis of translational control. J Genet Genom. 51 (4), 367-378 (2024).
  3. Dever, T. E., Green, R. The elongation, termination, and recycling phases of translation in eukaryotes. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (7), a013706(2012).
  4. Jackson, R. J., Hellen, C. U., Pestova, T. V. The mechanism of eukaryotic translation initiation and principles of its regulation. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (2), 113-127 (2010).
  5. Dennis, M. D., Browning, K. S. Differential phosphorylation of plant translation initiation factors by Arabidopsis thaliana CK2 holoenzymes. J Biol Chem. 284 (31), 20602-20614 (2009).
  6. Dennis, M. D., Person, M. D., Browning, K. S. Phosphorylation of plant translation initiation factors by CK2 enhances the in vitro interaction of multifactor complex components. J Biol Chem. 284 (31), 20615-20628 (2009).
  7. Chen, G. H., Liu, M. J., Xiong, Y., Sheen, J., Wu, S. H. TOR and RPS6 transmit light signals to enhance protein translation in deetiolating Arabidopsis seedlings. Proc Natl Acad Sci. 115 (50), 12823-12828 (2018).
  8. Chang, H. H., Huang, L. C., Browning, K. S., Huq, E., Cheng, M. C. The phosphorylation of carboxyl-terminal eIF2α by SPA kinases contributes to enhanced translation efficiency during photomorphogenesis. Nat Comm. 15 (1), 3467(2024).
  9. Liu, M. J., Wu, S. H., Chen, H. M., Wu, S. H. Widespread translational control contributes to the regulation of Arabidopsis photomorphogenesis. Mol Sys Biol. 8 (1), 566(2012).
  10. Des Marais, D. L., Juenger, T. E. Pleiotropy, plasticity, and the evolution of plant abiotic stress tolerance. Ann New York Acad Sci. 1206 (1), 56-79 (2010).
  11. Mittler, R., Zandalinas, S. I., Fichman, Y., Van Breusegem, F. Reactive oxygen species signalling in plant stress responses. Nat Rev Mol Cell Biol. 23 (10), 663-679 (2022).
  12. Shulaev, V., Cortes, D., Miller, G., Mittler, R. Metabolomics for plant stress response. Physio Plantarum. 132 (2), 199-208 (2008).
  13. Sun, M., et al. Transcriptome analysis of heat stress and drought stress in pearl millet based on Pacbio full-length transcriptome sequencing. BMC Plant Biology. 20, 1-15 (2020).
  14. Wasternack, C. Action of jasmonates in plant stress responses and development-applied aspects. Biotechnol Adv. 32, 31-39 (2014).
  15. Chen, T., et al. Global translational induction during NLR-mediated immunity in plants is dynamically regulated by CDC123, an ATP-sensitive protein. Cell Host Microbe. 31 (3), 334-342 (2023).
  16. Cho, H. Y., Chou, M. Y., Ho, H. Y., Chen, W. C., Shih, M. C. Ethylene modulates translation dynamics in Arabidopsis under submergence via GCN2 and EIN2. Sci Adv. 8 (22), eabm7863(2022).
  17. Wen, J., et al. Alternative splicing of TaHSFA6e modulates heat shock protein-mediated translational regulation in response to heat stress in wheat. New Phytol. 239 (6), 2235-2247 (2023).
  18. Maruri-López, I., Figueroa, N. E., Hernández-Sánchez, I. E., Chodasiewicz, M. Plant stress granules: trends and beyond. Front Plant Sci. 12, 722643(2021).
  19. Hamada, T., et al. Stress granule formation is induced by a threshold temperature rather than a temperature difference in Arabidopsis. J Cell Sci. 131 (16), jcs216051(2018).
  20. Jang, G. J., Jang, J. C., Wu, S. H. Dynamics and functions of stress granules and processing bodies in plants. Plants. 9 (9), 1122(2020).
  21. Ostberg, S., Schewe, J., Childers, K., Frieler, K. Changes in crop yields and their variability at different levels of global warming. Earth Sys Dyn. 9 (2), 479-496 (2018).
  22. Wen, J., et al. Alternative splicing of TaHSFA6e modulates heat shock protein-mediated translational regulation in response to heat stress in wheat. New Phytol. 239 (6), 2235-2247 (2023).
  23. Coudert, L., Adjibade, P., Mazroui, R. Analysis of translation initiation during stress conditions by polysome profiling. J Vis Exp. (87), e51164(2014).
  24. Hsieh, E. J., Cheng, M. C., Lin, T. P. Functional characterization of an abiotic stress-inducible transcription factor AtERF53 in Arabidopsis thaliana. Plant Mol Biol. 82, 223-237 (2013).
  25. Cheng, M. C., Liao, P. M., Kuo, W. W., Lin, T. P. The Arabidopsis ETHYLENE RESPONSE FACTOR1 regulates abiotic stress-responsive gene expression by binding to different cis-acting elements in response to different stress signals. Plant Physiol. 162 (3), 1566-1582 (2013).
  26. Van den Broeck, L., et al. From network to phenotype: the dynamic wiring of an Arabidopsis transcriptional network induced by osmotic stress. Mol Sys Biol. 13 (12), 961(2017).
  27. Dieterich, D. C., et al. detection and identification of newly synthesized proteomes with bioorthogonal non-canonical amino-acid tagging. Nat Protoc. 2 (3), 532-540 (2007).
  28. Zhang, J., et al. Proteomic profiling of de novo protein synthesis in starvation-induced autophagy using bioorthogonal noncanonical amino acid tagging. Acad Press. 588, 41-59 (2017).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Polysome ProfilingTranslation EfficiencyHeat StressArabidopsis PlantsTranslational RegulationSucrose GradientRNA IsolationSpike In NormalizationRibosome OccupancyqRT PCR

מאמרים קשורים