יחסי מבנה-פעילות כמותיים, חיזוי פעילות ודינמיקה מולקולרית של מעכבי טרנסקריפטאז הפוך שאינם נוקלאוטידים

Summary

מחקר זה השתמש באסטרטגיות in-silico כדי לזהות Etravirine שנספר כחומר טיפולי מבטיח ל-HIV. הממצאים שלנו על אינטראקציות ודינמיקה מולקולריות תומכים בתכנון הרציונלי של NNRTI חדשים כחלופות אפשריות לטיפול ב-HIV.

Abstract

השכיחות הגוברת של עמידות לתרופות HIV-1 מהווה אתגר ליעילות של טיפול אנטי-רטרו-ויראלי משולב, במיוחד בדרום אפריקה. התפתחות עמידות למעכבי טרנסקריפטאז הפוך שאינם נוקלאוטידים (NNRTIs) מאיימת על ההצלחה ארוכת הטווח של טיפול אנטי-רטרו-ויראלי. בשנת 2019, עמידות לאנטיביוטיקה היוותה ישירות כ-1.27 מיליון מקרי מוות ברחבי העולם. מחקר זה השתמש בגישה in-silico כדי לחקור תרופות NNTRI ונגזרותיהן. הטכניקות ששימשו כללו חישובי תורת פונקציונאליות צפיפות, עגינה מולקולרית, ספירה, ניתוח יחסי מבנה-פעילות כמותיים (QSAR), סימולציה של דינמיקה מולקולרית (MDS) ומכניקה מולקולרית עם שיטות בורן ושטח פנים כלליות. הניתוח התמקד בנגזרות פירימידין שונות ובשש תרופות NNRTI, ובחן את האינטראקציות שלהן עם חלבון HIV-1 (קוד PDB 1HQU).

מודל QSAR פותח כדי לחזות את הפעילות הביולוגית של ששת ה-NNRTI הנחקרים. באמצעות 94 נגזרות פירימידין, מודל ה-QSAR השיג R² של 0.822 ו-Q² של 0.815, מה שמצביע על רמה גבוהה של דיוק חיזוי.

MDS נערך כדי להעריך את היציבות של ליגנדים שונים והחלופות החדשות שפותחו שלהם, והבטיח שהם יישארו קשורים לאתר הפעיל של החלבון לאורך מסגרת זמן של סימולציה של 200 ננו-שניות. Etravirine הציג תנודות של סטייה ריבועית ממוצעת שורש (RMSD) של כ-4.5 Å, בעוד שהנגזרות המנויות שלו הראו תנודות RMSD של 3.5 Å. באמצעות עגינה מולקולרית, MDS וחישובי אנרגיה חופשית, Etravirine שנמנה הפגין את הביצועים הטובים ביותר, עם ערך פעילות של 7.373 וציון עגינה של -10.517 קק"ל/מול. יתר על כן, האנרגיה החופשית המחושבת של קשירה עבור Etravirine שנספר הייתה -89.684 קק"ל/מול, ועלתה על ליגנדים אחרים שנחקרו. השיפור המשמעותי מצביע על כך של-Etravirine המותאם יש פוטנציאל מבטיח כחומר חדשני בטיפול אנטי-רטרו-ויראלי.

ערך ה-RMSD הנמוך שהושג, האינטראקציות המשופרות של חומצות האמינו והאנרגיה החופשית הגבוהה ביותר מצביעים על כך ש-Etravirine יכול לשמש כחלופה בת קיימא לטיפול ב-HIV/איידס.

Introduction

למרות התקדמות יוצאת דופן בטיפול, האיום הבריאותי העולמי החמור של תסמונת הכשל החיסוני הנרכש (איידס), הנגרמת על ידי נגיף הכשל החיסוני האנושי-1 (HIV-1), נותר איום מתמשך¹. תרופות אנטי-רטרו-ויראליות הידועות כמעכבי טרנסקריפטאז הפוך, RTIs, משמשות לטיפול בזיהום ב-HIV. טרנסקריפטאז הפוך, אנזים פולימראז של חומצה דאוקסיריבונוקלאית נגיפית (DNA) החיוני לשכפול רטרו-וירוס, מעוכב על ידי מעכבי טרנסקריפטאז הפוך (RTIs). מעכבי טרנסקריפטאז הפוך של נוקלאוזידים (NRTIs) ומעכבי טרנסקריפטאז הפוך שאינם נוקלאוטידים (NNRTIs) הם ה-RTIs^{העיקריים 2}.

טיפול אנטי-רטרו-ויראלי פעיל מאוד (HAART), שילוב של תרופות אנטי-ויראליות שונות, התגלה כטיפול הסטנדרטי ל-HIV, שולט ביעילות בהתפשטות האיידס והופך את המחלה הקטלנית הזו למצב כרוני הניתן לשליטה³. NNRTIs ל-HIV-1 הם כיום חלק משמעותי ממשטר HAART⁴. עמידות לאנטיביוטיקה (AMR) היא בין האיומים הבריאותיים הקריטיים ביותר בעולם, עם הערכה של 1,27 מיליון מקרי מוות⁵. כתוצאה מכך, יש צורך דחוף לפתור בעיות AMR ולזהות חומרים אנטי-מיקרוביאליים חדשים. על פי ארגון הבריאות העולמי (WHO), עמידות מיקרוביאלית הגיעה לרמות מדאיגות בחלקים רבים של העולם.

זה מהווה סיכון חמור להשגת יעדי פיתוח בר קיימא, מכיוון שהוא מערער את הביטחון התזונתי, הצמיחה הכלכלית והביטחון הבריאותי תוך שהוא תורם לאי שוויון חברתי וכלכלי⁶. השכיחות של נגיפים עמידים לתרופות נמצאת במגמת עלייה, אפילו בתרופות אנטי-רטרו-ויראליות שנועדו להילחם ב-HIV. על פי נתונים סטטיסטיים עדכניים, כמעט 30 מיליון אנשים ברחבי העולם נטלו טיפול אנטי-רטרו-ויראלי נכון לסוף 2022⁷.

ארגון הבריאות העולמי ערך 30 סקרים וגילה כי ב-21 מהסקרים הללו, יותר מ-10% מהאנשים שהתחילו את הטיפול האנטי-רטרו-ויראלי בקו הראשון שלהם היו עמידים ל-Nevirapine או Efavirenz⁸. יתר על כן, אנשים עם חשיפה קודמת לתרופות אנטי-רטרו-ויראליות הם בעלי סיכוי גבוה עד פי שלושה לפתח עמידות ל-NNRTI מאשר אלה ללא חשיפה⁹. מחקרים גילו כי מספר ניכר של תינוקות מתחת לגיל 18 חודשים שאובחנו לאחרונה עם HIV הפגינו שיעורים גבוהים של זנים עמידים לתרופות^10,11. באופן מזעזע, כמעט מחציתם סבלו מזן עמיד (NNRTI) עוד לפני תחילת הטיפול. ממצאים אלה מדגישים את הצורך להאיץ מחקרים לתכנון טיפול חדשני ב-HIV.

התפתחות זנים עמידים לתרופות ותופעות לוואי לא רצויות משימוש ממושך הציבו באופן בלתי נמנע אתגרים לשימוש הקליני ב-NNRTIs¹². התחלת טיפול אנטי-רטרו-ויראלי משולב (cART) מאריכה את תוחלת החיים של אנשים החיים עם HIV למרות הפוטנציאל לתופעות לוואי שליליות. תופעות לוואי אלו כוללות את הסיכון לפתח מחלות לא מדבקות, כולל ליפודיסטרופיה, היפרליפידמיה, צפיפות מינרלים מופחתת בעצם, רמת גלוקוז מוגברת בדם המובילה לסוכרת מסוג 2, יתר לחץ דם, סיכון מוגבר לשבץ מוחי ובעיות הקשורות להשמנת יתר¹³. אבחון מוקדם וגישה מהירה לטיפול רפואי מתאים בשלב הראשוני של זיהום HIV מציעים יתרונות ניכרים הן מנקודת מבט קלינית והן מנקודת מבט ציבורית. התחלה בזמן של ART וטיפול מונע נגד זיהומים אופורטוניסטיים מובילה לירידה ניכרת במחלות ובתמותה הקשורות ל-HIV.

השימוש ב-ART יכול גם לתרום לירידה בפוטנציאל ההעברה הלאה של HIV על ידי הפחתת רמת החומצה הריבונוקלאית של HIV במחזור הדם. יתר על כן, טיפול במחלות מין אחרות וזיהומים נלווים יכול גם להפחית את ההסתברות להדבקה נוספת ב-HIV¹⁴. NNRTIs הם בין מחלקות הטיפול האופציונליות של מעכבים המקיימים אינטראקציה עם RT על ידי קשירה לאזור האלוסטרי או לאתר של HIV. סוג זה של עיכוב ידוע בדרך כלל כמעכב לא תחרותי מכיוון שה-NNRTI אינו נקשר באתר הפעיל של המצע אלא מבחוץ. האפקט משנה את הקונפורמציה של אתר קשירת המצע, מעכב את הסובסטרט הסטנדרטי מלהיקשר ומוביל לסיום שרשרת מוקדם. בשל רעילותם המופחתת בהשוואה ל-NRTIs, מבנה פשוט, זמינות ביולוגית משופרת על פני מעכבי פרוטאז וסלקטיביות מצוינת, NNRTIs הפכו למעכבי HIV האטרקטיביים ביותר¹⁵. לכן, הסינתזה והעיצוב של NNRTI חדשים הם חיוניים מנקודת מבט פרמקוקינטית ^16,17.

NNRTIs חיוניים בטיפול ב-HIV/איידס בשל יעילותם החזקה ורעילותם הנמוכה. עם זאת, NNRTI מוקדמים כמו Nevirapine, Delavirdine ו-Efavirenz נתקלים בעמידות ממוטציות נגיפיות באתר הקישור NNRTI¹⁸. תרופות אלה, חלק ממשפחת ה-diarylpyrimidine (DAPY), מציגות פעילות חזקה כנגד זני NNRTI שונים, כולל אלה העמידים ל-NNRTIs^{מוקדמים 19}, ככל הנראה בשל הגמישות המולקולרית שלהם ומחסום העמידות הגבוה יותר שלהם נגד HIV-1^20,21. למרות הצלחתם, שיעור המוטציות הגבוה ב-HIV-1 RT והיעדר פעילות הגהה מהותית הובילו לפרופילי עמידות חדשים בחולים המשתמשים ב-Etravirine ו-Rilpivirine^22,23. מוטציות נגיפיות אלה שונות זו מזו, וכך גם אלה הקשורות לתרופות מוקדמות של NNRTI²⁴. למעלה מ-50 סוגים מגוונים מבחינה מבנית של תרכובות זוהו כ-NNRTIs. יש לציין כי שישה NNRTI קיבלו אישור לטיפול ב-HIV-1. תרופות מאושרות אלה כוללות את Nevirapine (NVP), Delavirdine (DLV), Efavirenz (EFV), Etravirine (ETR), Rilpivirine (RPV) ו-Doravirine (DOR). איור 1 מציג את המבנים הכימיים של שש תרופות NNRTI המאושרות^{הללו 25}.

במחקר שנערך לאחרונה²⁶, חישובי DFT ועגינה מולקולרית מצביעים על כך שלובסטטין וסימבסטטין מראים פוטנציאל כחומרים נגד נגיף הקורונה. סריקה וירטואלית זיהתה חמש מולקולות מועמדות חדשות שאושרו על ידי ה-FDA הדומות לפיגום efavirenz, עם זיקה קשירה מעולה בכיס הפעיל של הפרוטאז הראשי של COVID-19.

Soltan et ^al.27 ביצעו מחקר דומה על זיהוי מולקולות חדשות לשיפור יכולת הקישור ל-HIV RT על ידי שימוש באסטרטגיה מבוססת מקטעים עם תרופות שאושרו על ידי ה-FDA לתכנון נגזרות כימיות. הם מינפו באופן ספציפי את המבנים של דלאווירדין, אפבירנץ, אטראווירין ורילפיבירין כפיגומי יסוד. דמיון התרופה של נגזרות אלה הוערך באמצעות Swiss-ADME, ולאחר מכן עגינה שלהם למבני גביש קשורים. המחקר הסתיים בבחירת תרכובות המציגות זיקות קשירה מעולות בהשוואה לפיגומי האב שלהן, במיוחד תוך ציון שיפור בולט יותר בנגזרות שתוכננו מהדור השני של NNRTIs, etravirine ו-rilpivirine. לדוגמה, נגזרות RPV01 ו-RPV15 הראו שיפורים משמעותיים בערכי האנרגיה המעוגנים על פני רילפיבירין, מה שמצביע על תועלת פוטנציאלית בהתמקדות הן בצורות פראיות והן בצורות מוטנטיות של HIV RT.

מורוגסן ועמיתיו²⁸ ערכו מחקר הציעו גישות שונות לכימיה רפואית כדי לשפר את היעילות ולמזער את העמידות בטיפול ב-HIV. המחקר השתמש בהכלאה מולקולרית, החלפה ביואיזוסטרית ובדיקות סקר בתפוקה גבוהה. במחקר שלהם, הם הצליחו לזהות פיגומי NNRTI חדשים בעלי עוצמה גבוהה כנגד זני HIV מסוג פרא ועמידים לתרופות. הם פיתחו נגזרות DAPY המציגות סלקטיביות מצוינת ורעילות נמוכה, כאשר חלק מהתרכובות מראות עיכוב יעיל בריכוזים ננו-מולאריים.

לאחרונה, שימוש בכלים חישוביים לצד מחקר בתוך הסיליקו צבר פופולריות בשל הניתוח המעשי של המאפיינים הכימיים הקוונטיים של תרופה²⁹. במחקר זה, תכנון תרופות בעזרת מחשב, תיאוריה פונקציונלית של צפיפות, יחסי מבנה-פעילות איכותיים ודינמיקה מולקולרית יושמו כדי לגלות NNRTI חזקים.

Protocol

1. פרטים חישוביים - הכנת חלבון

1. לחץ על סמל החלון במסך הצג ולחץ על כל האפליקציות. גלול מטה כדי לנווט לתיקיית Schrodinger, פתח את התיקיה ולחץ על סמל Maestro המוצג באיור 2B, ובחר פתח כפי שמוצג באיור 2B כדי להפעיל את התוכנה.
2. אחזר את מבנה החלבון לבחירה על ידי ניווט בכפתור הכרטיסייה קובץ בתוכנה. מהתפריט הקצר שנפתח, בחר קבל PDB, כפי שמוצג באיור 3A, והזן את קוד ה-PDB הנבחר בתיבת הטקסט כפי שמוצג באיור 3B. לחץ על כפתור ההורדה , וקובץ ה- PDB שנבחר יוצג בחלון הפרויקט.
3. לחלופין, הורד את החלבון הנבחר למחשב המקומי ממאגר נתוני החלבון על ידי הזנת קוד הזהות של מסד הנתונים של החלבון (PDB ID) בתיבת החיפוש ולחץ על הורד כדי להוריד את קובץ ה-PDB למחשב המקומי. נווט אל הכרטיסייה File ובחר באפשרות Import Structures . מממשק הייבוא , אתר את ה-PDB שהורדת file כפי שמוצג באיור 3C ובחר בלחצן ייבוא כפי שמצוין באיור 3D.
   הערה: מבנה החלבון יהיה פתוח כמבנה תלת-ממדי בחלון נפרד, כפי שמוצג באיור 4.
4. נווט לפינה השמאלית העליונה של התוכנה, בחר באפשרות המשימה והקלד הכנת חלבון בשורת החיפוש . לחץ על זרימת עבודה של הכנת חלבון בתצוגה בצד ימין, כפי שמוצג באיור 5A.
5. מחלון זרימת העבודה של הכנת החלבון שצץ, כתבו את שם המשימה כשם הקובץ שיש לשמור ולחצו על כפתור ההפעלה הירוק בפינה הימנית התחתונה, כפי שמוצג באיור 5B.
6. עקוב אחר העבודה בזמן שהיא פועלת על ידי לחיצה על כפתור עבודות בפינה השמאלית העליונה, כפי שמוצג באיור 5C.
7. בחר ולחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על החלבון המוכן ובחר ליגנד מפוצל, כפי שמוצג באיור 5D. בחר לפצל לליגנדים, מים ואחרים. זאת כדי שרכיבי החלבון יהיו ערכים עצמאיים בנווט סביבת העבודה

2. הכנת ליגנד

1. הורד את התרכובות הכימיות הרצויות ממסד הנתונים של PubChem³⁰ על ידי הקלדת שם התרכובת הנבחרת בשורת החיפוש . עברו על המבנים ובחרו מבנים תלת מימדיים (תלת מימדיים). לחץ על הורד בחלון הימני העליון כדי להוריד את קואורדינטות המבנה כקובץ נתונים מובנים (SDF). אם מבנה תלת-ממדי אינו זמין, הורידו את המבנה הדו-ממדי והשתמשו בכלים אחרים ליצירת מבנה תלת-ממדי ממבנה דו-ממדי.
2. לחץ על הכרטיסייה קובץ ב-Schrodinger ובחר ייבוא מבנים, כפי שמוצג באיור 6A. נווט למיקום הקובץ שבו המבנים נשמרים בפורמט קובץ SDF כדי לטעון את התרכובות שיש להכין.
3. בחר משימה בפינה השמאלית העליונה של תוכנת שרדינגר. הקלד LigPrep בשורת החיפוש ובחר LigPrep בחלון הימני משמאל, כפי שמוצג באיור 6B.
4. בחר השתמש במבנים מתוך כדי לבחור קבצים מסביבת העבודה או מהטבלה Project. בחר את האפשרויות המועדפות מחלון LigPrep , שמור את הקובץ במחשב המקומי ולחץ על הפעל כדי לשלוח את העבודה להכנת ליגנד כפי שמוצג באיור 6C.

3. גיאומטריה ואופטימיזציה של ליגנדים

1. פתח את התוכנה³¹ לאופטימיזציה גיאומטרית של המבנים שהורדת. נווט אל הכרטיסייה File (איור 7A) ובחר פתח כדי לבחור את קובץ ה-SDF שהורדת ממסד הנתונים של PubChem.
   הערה: הקובץ ייטען בחלון הראשי. לחץ על החלון הסגול השני כדי להמחיש את אותן תרכובות כימיות. כל הגדרה מיושמת תציג את התוצאה בחלון הסגול.
2. נווט אל הכרטיסיה חישוב ובחר את הכרטיסיה הגדרת חישוב גאוס. נווט אל הכרטיסייה סוג משימה המוצגת באיור 7B ובחר אופטימיזציה או Opt+Freq.
   הערה: בהתאם למספר (גודל) האטומים או התרכובות, בצע אופטימיזציה תחילה, ואחריו תדירות. אם התרכובת קטנה יותר, בצע Opt+Freq. ככל שהמולקולה גדולה יותר, כך לוקח יותר זמן לבצע את Opt+Freq בהשוואה לאופטימיזציה ואחריה תדירות.
3. נווט ללשונית השיטה ובחר את שיטות הכימיה הקוונטית ולאחר מכן את פונקציית צפיפות מתאם החליפין הגלובלית-היברידית של כהן-שאם לבחירה, קבוצת בסיס, מטען וספין לבחירה מהחצים הנפתחים בכל סעיף.
4. נווט אל הכותרת וציין שם עבור המתחם הנחקר.
5. נווט אל הכרטיסייה קישור 0 וציין את מגבלת הזיכרון ואת המעבדים המשותפים המועדפים . בטל את הסימון בתיבות הנתיב המלא כפי שמוצג באיור 7C.
6. לחץ על לערוך כפתור בתחתית כדי לשמור את הקלט הגאוסי file, כפי שמוצג באיור 3C. שמור את הקובץ במיקום המועדף עם שם קובץ לבחירה כקובץ משימה גאוס (gjf).
   הערה: לאחר שמירת קובץ הקלט הגאוסי יופיע חלון מוקפץ המציג את תוכן הקובץ בפנקס הרשימות. ערוך את תוכן הקובץ, כולל אפשרויות כמו שינוי הטעינה והפונקציה שלא היו זמינות באפשרויות ההגדרות. קובץ העבודה הגאוסי המוכן ישמש כקובץ הקלט להגשה להפעלת חישובי האופטימיזציה והתדירות באמצעות מחשב מקומי.
   לאחר מכן, אופטימיזציה גיאומטרית של מבנים אלה בוצעה באמצעות ערכת הבסיס הפונקציונלית MN15-L³² ו-6-31++G(d,p)³³. עם זאת, במידה ומתעוררות בעיות בהפעלת תהליך האופטימיזציה והתדירות, ניתן להגיש את העבודה בעזרת HPC.

4. יצירת רשת קולטנים

1. נווט אל משימות ובחר רשת קולטנים^{דור 34}. ממשק יצירת רשת הקולטנים המוצג באיור 8A מזהה את האתר הפעיל של החלבון שבו קשור ליגנד הליבה-גביש. לחץ על בחר כדי לזהות את הליגנד ולבדוק אם קיים ליגנד מגובש משותף מההודעה העליונה הקופצת המוצגת באיור 8B.
2. בחר את הליגנדים ו/או השאריות מסביבת העבודה, ותרכובות העניין שנבחרו יציגו הדגשה כחולה בסביבת העבודה.
3. בחר בכרטיסיית ההגדרות בחלונית יצירת רשת הקולטן כדי להגדיר את גודל תיבת הרשת. גודל ברירת המחדל של תיבת הרשת הוא 10 Å x 10Å x 10Å. שנה את ממדי התיבה בכרטיסיה תיבת רשת על-ידי הזנת הערכים הרצויים ישירות או שינוי גודל התיבה באופן ידני בסביבת העבודה.
   הערה: לחלופין, הגדר פרמטרים נוספים מהכרטיסייה מתקדם כפי שמוצג באיור 8C במידת הצורך. סקור את כל ההגדרות כדי להבטיח דיוק.
4. לחץ על הפעל כדי להתחיל ביצירת רשת. לאחר השלמתו, שמור את קבצי הרשת שנוצרו להדמיות העגינה הבאות. הודעת התראה תופיע כאשר המשימה הושלמה, כפי שמוצג באיור 8D.

5. עגינה מולקולרית

1. טען את החלבון ואת הליגנדים המוכנים על ידי ניווט למשימות, עגינה³⁵ ועגינה של ליגנד (עגינת גלישה), כפי שמוצג באיור 9A.
2. טען את קובץ הרשת משלב 4.1 לעיל ובחר את הליגנדים מסביבת העבודה באמצעות השתמש בליגנד מהאפשרות באיור 9B.
3. בחר את שיטת דיוק העגינה המועדפת מכרטיסיית ההגדרות המוצגת באיור 9 ג (דיוק העגינה המוגדר כברירת מחדל הוא דיוק סטנדרטי (SP)).
4. הגדר את שדה הכוח ל-OPLS4 למידול מדויק של אינטראקציות מולקולריות. הגדר אילוצים (למשל, קשרי מימן) בכרטיסייה אילוצים .
5. סקור את כל ההגדרות ושמור את משימת העגינה או הקובץ. לחץ על RUN כדי להתחיל בתהליך העגינה.
6. הודעה מציינת שהמשימה הושלמה, וטבלת הפרויקט נפתחת לתוצאות עגינה. בחנו את התנוחות המחייבות, הפרטיטורות והאינטראקציות.

6. יצירת דגם 2D-QSAR

1. עבור אל דף האינטרנט של מרכז הקהילה KNIME וחפש את AutoQsar בשורת החיפוש . בחר את ערך AutoQsar השני שמופיע באיור 10A.
2. לחץ על סמלזרימת העבודה d ownload ובחר הורד זרימת עבודה בתפריט המוקפץ המוצג באיור 10B. שמור את זרימת העבודה במחשב המקומי.
3. ודא ש-KNIME³⁶ מותקן, ולאחר מכן פתח אותו מהמחשב המקומי. הרכיבו גיליון אלקטרוני עם החיוכים הקנוניים, שם המבנה, ערכי פעילות/IC₅₀ (במיקרומולר), ו-log (פעילות/IC) או כל מתאר כימי לבחירתכם. שמור את הקובץ בתבנית ערכים מופרדים באמצעות פסיקים (CSV) במחשב המקומי.
4. נווט אל קובץ וייבא את זרימת העבודה AutoQSAR³⁷. מהחלון המוקפץ, לחץ על ייבוא זרימת עבודה של KNIME כדי לבחור את זרימת העבודה של AutoQSAR שהורדת, כפי שמוצג באיור 10C ובחר פתח | הבא | סיום.
5. זרימת העבודה של AutoQsar תופיע בחלון סייר KNIME בפינה הימנית העליונה. לחץ פעמיים על זרימת העבודה כדי להביא את זרימת העבודה לחלון הראשי.
6. לחץ פעמיים על סמל הקורא המולקולרי (ל-MAE), ומהכרטיסייה הגדרות , לחץ על הוסף קבצים כדי להוסיף את גליון העבודה עם נתוני קלט הנתונים או הפרמטרים.
7. בחר בכרטיסייה מדיניות זיכרון ולחץ על כתוב טבלאות לדיסק | בסדר.
8. לחץ לחיצה ימנית על כפתור חלץ מאפיינים ובחר הגדר, כפי שמוצג באיור 10D.
9. בחר וסנן תכונות מולקולריות או כימיות לבחירתך מחלון ההכללה לחלון הכללה . לחץ על החל.
10. לחץ לחיצה ימנית על AutoQSAR Build Model ולחץ על הגדר. הזן אתשם דגם Q SAR בתיבת הדו-שיח המוקפץ.
11. לחץעל כפתור הבחירה ובחר את המאפיין שיתאים מבין אלה הכלולים. בחר את ערך ערכת האימונים האקראית (למשל, 85%:15%) ומספר מודלים לשמירה. לחץ על החל.
12. לחץ לחיצה ימנית על קורא המולקולות התחתון ובחר הגדר. טען את ליגנדות הבדיקה מקובץ CSV Excel מוכן המכיל את הליגנדים לבדיקה.
13. לחץ לחיצה ימנית על חלץ מאפיינים והגדר את ההגדרות לבחירתך.
14. לחץ לחיצה ימנית על קורא המולקולות העליון ובחר ביצוע.
    הערה: נקודה כתומה מציינת שהתהליך התחיל, ונורה ירוקה תראה את הביצוע המוצלח של התהליך. השלב הבא ימשיך עד שכל הצמתים יבוצעו בהצלחה.
15. . הפעל את קורא המולקולות השני עבור ליגנדות בדיקה.
16. שמור את תיקיית ה- zip עם התוצאות מהבדיקה וההדרכה שנקבעו לאחר הביצוע המוצלח של כל הצמתים.
    הערה: בחר את המודל בעל הביצועים הטובים ביותר על סמך תוצאות אימות צולב כגון SD - סטיית תקן, R2 - מתאם ערכת אימון בין ערכי פעילות בפועל וחזויים ומתאם פעילות בפועל וחזוי Q2 - ערכת בדיקות.
17. הערך את ביצועי זרימת העבודה על-ידי הערכת ביצועי המודל באמצעות ניקוד או צמתים סטטיסטיים.
18. כדי לפרש את התוצאות, זהה את המתארים העיקריים או העיקריים באמצעות חשיבות התכונה. הצג את התוצאות באופן חזותי כתרשים פיזור או תרשים עמודות כדי לקבוע את יחסי הגומלין בין הביצועים למתאר. שמור את זרימת העבודה וייצא את נתוני התוצאות, התחזיות וההדמיות כתרשים פיזור ו/או קבצי CSV.

7. ספירה

1. נווט אל משימה וחפש את Ligand Designer, כפי שמוצג באיור 11A.
2. בחר זוג של החלבון המעוגן וקומפלקס הליגנד מנווט סביבת העבודה. לחץ על נתח סביבת עבודה מחלון מעצב ליגנד. כדי ליצור ולהעריך ליגנדים חדשים, בחר סריקת איזוסטר מרשימת זרימות העבודה המופיעות, כפי שמוצג באיור 11B מרמז על שיטת הגידול המרחיבה את הליגנד על ידי הוספת שברים לחלקים קיימים של המולקולה.
3. לאחר הגדרת אפשרותהספירה האלקטרונית , לחץ על ספירה מחלון ההתראה של סריקת איזוסטר שמופיע. חזור על שלב 6.2 עבור אותו חלבון וליגנד אחר עד שכל הליגנדים ירוצו את אותו תהליך. סקור את הליגנדים שנמנו מטבלת הפרוייקטים.
4. שמור את המבנים על ידי ייצוא הליגנדים המעוצבים.
   הערה: שיטת הספירה יצרה קבוצה של ציוני עגינה עם השלמת הסימולציה.
5. בחר בנפרד את התרכובות שנמנו עם ציוני העגינה השליליים יותר ועגן אותן מחדש באמצעות הליך העגינה המתואר בסעיף 4.

8. הומו ולומו

1. פתח את התוכנה והעלה את הליגנד המותאם בפורמט קובץ עבודה גאוס.
2. נווט אל כלים ובחר עורך MO בנקודות אדומות וירוקות, כפי שמוצג באיור 12A.
   הערה: שיטת הספירה יצרה קבוצה של ציוני עגינה עם השלמת הסימולציה.
3. בחלונית עורך MO תחת שיטה, טען את קובץ FChk על ידי לחיצה על טען Mos מקובץ Chk או FChk הקיים, כפי שמוצג באיור 12B.
4. לחץ על הכרטיסייה ויזואליזציה | עדכון. המתן ~10 שניות עד שהמשטח הנוכחי יופיע, כפי שמוצג באיור 12D.
5. לחץ על אחת משתי תיבות הסימון לצד האיורים הצהובים המודגשים כדי לבחור משטח HOMO או LUMO³⁸ להצגה בחלון שלידו.
6. לחץ לחיצה ימנית על הרקע הסגול ובחר קובץ. לחץ על שמור את קובץ התמונה כדי לשמור את התמונה של המשטח הנוכחי, כפי שמוצג באיור 12E.
7. לחץ לחיצה ימנית על הרקע הסגול ובחר תצוגה. בחר את פורמט התצוגה כדי לשנות את הרקע בכרטיסייה כללי, שקיפות פני השטח בכרטיסייה משטח, גודל וצבע גופן בכרטיסייה טקסט, איכות התמונה והפריסה המועדפת של המשטח תחת הכרטיסייה מולקולה, כפי שמוצג באיור 12F.
8. לחלופין, צור קובץ קוביה והעלה את קובץ ה-FChk ב-GaussView. נווט אל הכרטיסייה תוצאות ובחר משטחים/קווי מתאר. לחץ על פעולות קוביה וטען את הקוביה. לחץ על פעולות Surface ובחר משטח חדש. חזור על שלב 8.7 כדי לערוך את המשטח.
   הערה: ככל שפער האנרגיה בין ה-HOMO ל-LUMO³⁹ קטן יותר (ההבדל בין LUMO ל-HOMO), כך המולקולה צפויה להיות תגובתית יותר. חשב את פער האנרגיה (_פער E) באמצעות Eq 1 עבור כל מולקולה.
   

9. סימולציה של דינמיקה מולקולרית – הכנה ומזעור של מערכות

1. ודא שחבילת שרדינגר הותקנה במחשב המקומי וטען את המבנים המורכבים של חלבון-ליגנד בסביבת העבודה⁴⁰.
2. לחץ על כפתור המשימה ובחר Desmond System Builder⁴¹. בלוח בונה המערכת , בחר בכרטיסייה Solvation ובחר את מודל הממס המוגדר מראש כפי שמוצג באיור 13A, צורת התיבה כפי שמוצג באיור 13B, ושיטת חישוב גודל התיבה כפי שמוצג באיור 13C⁴², המתאימים לקומפלקס החלבון-ליגנד.
3. בחר בכרטיסייה יונים ולחץ על חשב מחדש כדי לנטרל את המערכת על ידי הוספת מונים והגדרת ריכוז המלח הרצוי.
4. בחר את OPLS^43,44 לבחירה כשדה הכוח.
5. תן שם למשימה כראוי ושמור את קובץ המשימה במחשב המקומי. לחץ על הפעל כדי לשלוח את המשימה להכנה.
   הערה: ודא ששם המשימה נשמר. השתמש בשם מפורט.
6. שיווי משקל וייצור
7. הצגת הפרויקט בסביבת העבודה לאחר הכנת המערכת. בחר את קומפלקס החלבון-ליגנד מנווט סביבת העבודה, נווט במשימה ובחר דינמיקה מולקולרית (דזמונד).
8. טען את קומפלקס הליגנד-חלבון מסביבת העבודה בלוח הדינמיקה המולקולרית. בחר את ציר הזמן הרצוי של הסימולציה מהכרטיסיה הדמיה . בחר NPT כמחלקת האנסמבל⁴⁵.
9. תן שם לעבודה כראוי וכתוב את העבודה. לחץ על סגור כדי לצאת מחלון הדינמיקה המולקולרית.
10. הגש את העבודה הכתובה להכנת דינמיקה מולקולרית באמצעות מסוף מקומי. בסיום, פתח את העבודה שהושלמה והמשך את זמן הסימולציה מציר הזמן הראשוני שנקבע לסימולציה עד לזמן הסימולציה הרצוי⁴⁵, לדוגמה, 100 ns, 200 ns.
    הערה: חזור על שלב 9 עבור קומפלקסים אחרים של חלבון-ליגנד.
    1. פתח את העבודה שהושלמה בתוכנת Schrodinger Maestro ומזג את מסגרות הזמן השונות של הסימולציה אם הופעלו עבודות נפרדות. נווט אל לחצן משימה ובחר את דיאגרמת האינטראקציה של הסימולציה. טען את הקבצים הממוזגים או את הקובץ הבודד כדי להמחיש את המסלול.
11. צור דוח הכולל את ההדמיות ותוצאות פלט מפורטות אחרות.

10. מכניקה מולקולרית עם שטח בורן ופנים כללי (MM-GBSA)

1. פתח את קובץ המסלול והפעל את המסלול. דמיין היכן קומפלקס החלבון-ליגנד מאוזן ושים לב למספר המסגרות. הגש את העבודה דרך הטרמינל לעיבוד.
2. חזור על סעיף 9 (הכן את סימולציית הדינמיקה המולקולרית של החלבון) עבור קומפלקס החלבון-ליגנד האחר.
3. קטנציה/הצג את תוכן קובץ הפלט כדי לנתח את התוצאות שנוצרו. קרא את ממוצע ה-ΔG כדי לקבל את האנרגיה החופשית המחייבת של קומפלקס החלבון-ליגנד.
4. הורד את קובץ ה-CSV כדי להמחיש את התרומות של מולקולות תוך-מולקולריות שונות.
5. כדי לחשב את אנרגיית הקישור החופשית של הקומפלקס, שימו לב לפרמטרים התרמודינמיים וההמסה השונים, כולל אנרגיית הקישור (_{ΔG bind}), מודל המסה קולומבי (ΔG_bind Coulumb), מונח המסה לא קוטבי (ΔG_bind Lipo), תיקון קשרי מימן (ΔG_bind Hbond), קשירה קוולנטית (ΔG_bind Covalent), תיקון אריזה π-π (ΔG_bind Packing), אנרגיית המסה אלקטרוסטטית כללית (ΔG_bind sol GB), ואינטראקציה של ואן דר ואלס (ΔG_bind vdW).
   1. גזר את ה-ΔGbind הסופי על ידי חישוב ממוצע ערכי_ה-ΔG שנקבעו עבור כל תמונת מצב בתוך סימולציית MD, כפי שמוצג ב-Eq 2.

Results

יצירת רשת קולטנים ועגינה מולקולרית

כלי יצירת רשת הקולטנים של מאסטרו שימש לאפיון נכון של אתר הקישור לעגינה שלאחר מכן. הליגנד המשותף התגבש שימש להגדרת הרשת. נעשה שימוש בהגדרת גלישה מדויקת SP לעגינה מולקולרית. הכלי LigPrep ב-Schrödinger Maestro שימש להכנת הליגנדים לעגינה באמצעות שדה הכוח OPLS4. עבור סימולציות דינמיקה מולקולרית, שדה הכוח OPLS4 שימש בדזמונד. שדות כוח הם בסיסיים לסימולציות מולקולריות קלאסיות, והדיוק שלהם קריטי לאיכות סימולציות קשירת חלבון-ליגנד בגילוי תרופות. עבור OPLS4, הקצאת המטען והפרמטרים הושלמה באמצעות Schrödinger Maestro. היישום של פרמטרי OPLS4 הביא לשיפורים משמעותיים בהשוואות אנרגטיות וגיאומטריות בהשוואה לפרמטרי ברירת המחדל של OPLS2005.

זה היה כרוך בעגינה של ליגנדים ספציפיים הידועים כבעלי זיקה לחלבון המטרה של HIV-1, מה שמאפשר ניתוח יסודי של האינטראקציות בין מולקולות ליגנד לשאריות קולטנים. טבלה 1 מייצגת סיכום של סיווג מורכב עבור מודלים של QSAR.

עם עגינת HBY561, פרוטוקול העגינה הוערך על ידי השוואת הליגנד המעוגן מחדש לזה שנמצא באתר הפעיל של החלבון הגבישי 1HQU. מבני HBY561 המעוגנים והמגובשים מסופקים בקובץ משלים 1 (איור משלים S1 ואיור משלים S2). כדי להעריך את הדמיון בין תנוחות מעוגנות למבני ייחוס, ערך סטיית שורש-ממוצע-ריבוע (RMSD) של פחות מ-2.0 Å נחשב באופן נרחב כקריטריון לתוצאות עגינה אמינות. סף זה מצביע על כך שהמבנה החזוי מתיישב באופן הדוק עם נתוני הניסוי. במחקר זה, הליגנדים הדגימו RMSD של 1.27 Å כאשר השוו את מבנה הייחוס לתנוחת העגינה, כפי שמוצג באדום באיור משלים S3. זה הראה שפרוטוקול העגינה הספיק לעבודה זו, וכתוצאה מכך, כל הליגנדים עוגנו באותן הגדרות. בבחינת ציוני העגינה המוצגים בטבלה 2, Efavirenz ו-Etravirine הראו את הציונים החיוביים ביותר ב-10.432 eV ו-9.647 eV ביחס לציון העגינה של הליגנד המשותף HBY561 (-9.242 eV). איורים משלימיםS4 מקובץ משלים 1 מציג את דיאגרמות האינטראקציה של הליגנדים בין חלבון ה-HIV-1 המקורי לבין ליגנד גבישי, אטראווירין ו-Efavirenz.

קשרי מימן, ערימת π-π ואינטראקציות הידרופוביות הם הכוחות העיקריים התורמים לקשירה. מקרה ספציפי של קשרי מימן הופיע בין HBY561 לחלבון המיועד 1HQU, הכולל במפורש את שאריות חומצות האמינו LYS101. דפוס הקישור הזה שיקף תצפיות שנעשו עם הליגנדים Efavirenz ו-Etravirine, כפי שמוצג באיור 14.

יתר על כן, אינטראקציות הידרופוביות היו חיוניות לקשירה במספר מיקומי חלבון הכוללים HBY561, Etravirine ו-Efavirenz, בנוסף לכוחות הבין-מולקולריים, קשרי מימן וערימת π-π. ערימת π-π נצפתה בין TYR318 לטבעת הארומטית ב-Efavirenz. גם קשרי מימן וגם ערימת π-π היו חיוניים בשמירה על קשרי הקישור בין הליגנדים לחלבון. דיאגרמות אינטראקציה של ליגנד של HBY_561, Nevirapine, Doravirine, Efavirenz ו-Etravirine מוצגות בקובץ משלים 1-SupplementalFigureS5.

כוחות בין-מולקולריים אלה משפיעים על אינטראקציות חלבון-ליגנד והם חיוניים לפיתוח תרופות המפחיתות AMR ב-HIV-1. תפקידם בשיפור זיקת הקשירה, הספציפיות ומנגנון הפעולה מסייע בתכנון תרופות שיכולות למקד ולעכב ביעילות את הנגיף, ובכך לתת מענה לחשש הגובר מעמידות אנטי-מיקרוביאלית בהקשר של טיפול ב-HIV-1.

הכנת מערך נתונים 2D-QSAR

שלבי ההכשרה והבדיקה כללו 94 תרכובות. תרכובות אלו סווגו לארבע מחלקות, כל אחת מייצגת ליגנדים הקשורים לחלבון הספציפי שנבדק. תהליך ההכשרה השתמש בזרימת העבודה של KNIME AutoQSAR עם פעילות, HOMO ו-LUMO נבחרו כשלושת המתארים לחקירה זו.

דור 2D-QSAR

ערכי הפעילות של כל 94 המולקולות נקבעו באמצעות נתונים ניסיוניים (טבלה משלימה S1). את התוצאות שנוצרו ממודל QSAR ניתן למצוא בטבלה 3. תרכובות Class 1 בטבלה משלימה S2 שימשו למידול QSAR, המציג את קבוצות ה-Ar שנוספו וערכי הפעילות שלהן בהתאמה. התוצאות מארבעת המחלקות מצביעות על כך שהציון הגבוה ביותר של 0.8223, R² של 0.815 ו-Q ² של 0.8182 הושג, המקביל לדרגה 1. זה מתיישב עם הקריטריונים הקודמים של כיוון ל-R² קרוב ל-1 ו-Q² גדול מ-0.7⁴⁶. כתוצאה מכך, בחרנו במחלקה 1 לאימון מודל ה-QSAR שלנו. בעוד שמודלים עבור מחלקות 3 ו-4 הראו ערך מתאם מצוין R² של 0.8172 ו-0.6673, בהתאמה, הם לא תאמו את הביצועים של Class 1.

נערך מתאם צולב כדי לאמת עוד יותר את היציבות של מודל ה-QSAR המוצע על פי הקריטריון שההפרש בין ציון Q² 0.8223 ל-R² צריך להיות קטן או שווה ל-0.3⁴⁷. למודל המוצע שלנו למחלקה 1 יש הבדל של 0.0038. תרשים הפיזור המתאר את הפעילות הנצפית לעומת הפעילות החזויה מסופק באיור 15.

פער אנרגיה HOMO-LUMO

קביעת פער האנרגיה בין האורביטל המולקולרי הנמוך ביותר שאינו תפוס לבין האורביטל המולקולרי התפוס הגבוה ביותר, הידוע בכינויו פער האנרגיה HOMO-LUMO, ממלאת תפקיד מכריע באפיון התגובתיות הכימית והיציבות הקינטית של מולקולה בהקשר של שש תרכובות NNRTI. האורביטלים המולקולריים הגבוליים ממלאים תפקיד מרכזי בהקלת אינטראקציות העברת מטען עם אתר הקישור של חלבון ה-HIV. אישור מינימום האנרגיה הובטח על ידי בחינת תדרי רטט ואישור היעדר תדרים שליליים או דמיוניים; לאחר מכן, התקבלו ערכי HOMO ו-LUMO עבור כל מינימום אנרגיה. ערך HOMO גבוה יותר מסמל את מיומנות המולקולה כתורם אלקטרונים, בעוד שערך נמוך יותר מצביע על כך שהיא פועלת כמקבל אלקטרונים חלש. איור משלים S6 מייצג את פערי האנרגיה HOMO_LUMO עבור ששת ה-NNRTI הממוטבים. יתר על כן, פער אנרגיה מופחת בין רמות האנרגיה של HOMO ו-LUMO משפיע מאוד על אינטראקציות העברת מטען בין-מולקולריות המתרחשות בין המולקולות הנחקרות בשל יכולת קבלת האלקטרונים החזקה והפעילות הביולוגית של המולקולות⁴⁸.

המגמה בערכי פער האנרגיה, כפי שמוצג בטבלה 4, עוקבת אחר סדר יורד: Efavirenz > Etravirine > HBY-561 > Nevirapine > Delavirdine > Doravirine > Rilpivirine. פער האנרגיה המשמעותי שנצפה עבור Efavirenz ו-Etravirine מסמל כי ניתוחי ציוני העגינה חושפים מתאם בין פעילות ביולוגית לפער HOMO-LUMO. יש לציין כי הפוטנציאל האנטי-ויראלי גדל עם ערכי פער HOMO-LUMO גדולים יותר. זה מצביע לא רק על יציבות התרכובות אלא גם על הפוטנציאל שלהן ליצור אינטראקציות יציבות עם הקולטן. פער ה-HOMO-LUMO ממלא תפקיד משמעותי בהבנת הפעילות הביולוגית של מולקולות, במיוחד בהקשר של תכנון תרופות ל-HIV-1.

ספירה

כלים שונים נוצרו לספירת ספריות וירטואליות. הכלים המשמשים לספירה כוללים את שרדינגר. הוא מסתמך על שיטת דילוג הליבה, שבה ספריות נוצרות על ידי החלפת קובץ מצורף אחד או כמה במבנה ליבה עם שברים מתרכובות ריאגנטים⁴⁹. כלי הספירה ב-Maestro v13.1 שימש להוספת קבוצות צד או אטומים מותאמים אישית לכל אחד מששת ה-NNRTI. התרכובות החדשות שימשו גם לחיזוי פעילויות. חל שיפור בערכי הפעילות הצפויים של המולקולות שנמנו בהשוואה למולקולות NNRTI המותאמות בתחילה, כפי שניתן לראות בטבלה 5.

השיפור שהוצג בערכי הפעילות של הליגנדים שנמנו נבע מתהליך הספירה שבוצע מכיוון שקבוצת ה-R המותאמת אישית שנוספה השפיעה על כוחות האינטראקציה של התרכובת המוצעת החדשה והחלבון המקורי. התרכובות שנמנו הוכנו עבור מכניקת הקוונטים על ידי אופטימיזציה של מולקולות אלו וחישוב תדרי הרטט שלהן. פערי האנרגיה שלהם חושבו והושוו לפערי האנרגיה של ה-NNRTIs. התצפית הכוללת, כפי שמוצג בטבלה 6, מצביעה על כך שהתרכובות שנמנו יציבות יותר ממקבילותיהן האופטימליות.

בטבלה 6 נצפה כי פער האנרגיה של התרכובות שנמנו בהשוואה לתרכובות המותאמות הראה מגמה דומה. זה מצביע על כך שהתכונות הכימיות של המולקולות שנמנו נותרו ללא שינוי, ללא קשר לסיבוב קונפורמציה כלשהו. לפיכך, הם הצליחו לשמור על כוחות בין-מולקולריים חשובים עם שאריות חומצות האמינו של החלבון.

לפני ביצוע תהליך הספירה עבור ה-NNRTIs כמתואר בסעיף פרוטוקול 6, לתוצאות הפלט שנצפו היו ציוני העגינה הראשוניים שלהן מתהליך הספירה, המיוצגים בטבלה 7 תחת עמודת ציון העגינה שנספרה. כפי שהוסבר בסעיף פרוטוקול 4, תהליך העגינה המולקולרית בוצע כדי לאמת את ציון העגינה המוצע עבור התרכובות שנמנו. ניתן היה לראות כי לאחר עגינה מחדש של התרכובות שנספרו, ציוני העגינה החדשים השתפרו, כפי שמוצג בעמודה 'ליגנדים שנספרו מחדש'. הציונים המעוגנים מחדש עבור התרכובות שנמנו הושוו לציוני העגינה של ה-NNRTI המקוריים המיוצגים תחת העמודה 'ציון עגינה מקורי' בטבלה 7. ניתן היה לראות כי עבור התרכובות שנמנו, ציוני העגינה עבור HBY_561, Etravirine, Efavirenz ו-Doravirine היו טובים יותר מאלו של התרכובות האופטימליות המקבילות להם. עם זאת, ל-Delavirdine יש את אותו ציון עגינה כמו Delavirdine שנמנה ואופטימלי.

דינמיקה מולקולרית

שלושה קשרי מימן נוצרים על ידי HBY 561 עם LYS101, אטומי ה-N האלקטרושליליים ביותר וה-OH. ליגנד הגביש, או המולקולה השלישית, יוצר שני קשרי מימן בו זמנית עם גופרית ומימן וקישור מימן שלישי עם GLU138. חשוב לציין, ערימת π-π ואינטראקציות הידרופוביות תורמות באופן משמעותי לכוחות הבין-מולקולריים המעורבים. יתר על כן, נוכחותם של קשרי מימן נוספים היא חיונית לדינמיקה מולקולרית, המשתקפת במיוחד בגרפים של סטייה ריבועית ממוצעת שורש (RMSD) המתקבלת. בסך הכל, שלושה קשרי מימן נצפים כנוצרים על ידי Efavirenz עם אטום החנקן האלקטרושלילי מאוד, אטום החמצן בטבעת הלא ארומטית האחרת, וטבעת הבנזן ו-TYR318 בין הליגנד N אלקטרושלילי מאוד בטבעת המרכזית. נראה קשר מימן שני בין N מהטבעת לבין OH ו-LY101. Etravirine מראה שלושה קשרי מימן עם LYS101. דורבירין יוצר קשר מימן עם GLU138. Nevirapine מראה שני קשרי מימן עם LY101.

במקרה זה, האינטראקציה של שאריות חומצות אמינו המשותפת לכל הליגנדים היא LYS101. למרות שהמבנים שלהם שונים, כולם מקיימים אינטראקציה עם אותן שאריות חומצות אמינו. סימולציות MD בוצעו עם הפרמטרים המפורטים בסעיף פרוטוקול 2.8 כדי לוודא עד כמה כל ליגנד (NNRTI וה-NNRTI הרשום) נקשר לאתר הפעיל של 1HQU. אינטראקציית הליגנד המתוארת באיור 16 מצביעה על קשרי מימן חזקים בין חומצת האמינו LY101 של החלבון לבין המולקולות HBY 561, Nevirapine, Efavirenz ו-Etravirine. כפי שניתן לראות בהשוואה בטבלה 7, אינטראקציות חזקות אלה מסבירות את ציוני העגינה הגבוהים של כל תרכובת.

כדי להעריך את יעילות הקישור של כל ליגנד, כולל NNRTI ו-NNRTI שנספר באתר הפעיל של 1HQU, נערכו סימולציות דינמיקה מולקולרית (MDS). באופן ספציפי, נבחרו ארבע התרכובות שנמנו שהפגינו ציוני עגינה טובים יותר מהשילובים המותאמים המקוריים. תרכובות נבחרות אלה הועברו ל-MDS כשיטת אימות כדי לבחון ולצפות בתגובה של כל מולקולה עם חלבון HIV-1 לאורך תקופה מסוימת, בהתחשב באינטראקציות הבין-אטומיות בנוכחות ליגנד.

לפני שהתחלנו את MDS עבור הגליקנים שנמנו לאחרונה, היה חיוני לאשר את התאמת פרוטוקול הסימולציה למערכת שלנו. כדי להשיג זאת, הצעד הראשוני כלל הפעלת MDS של החלבון החופשי 1HQU. לא היה ליגנד באתר הפעיל של החלבון (איור 17A ואיור משלים S7). עד ~60 ns, ישנן תנודות ניכרות במבנה החלבון, המייצרות תזוזות Cα RMSD של עד 4.5 Å; לאחר מכן, נראה שהחלבון מתייצב עם תנודות RMSD של ~3.5 Å עד 200 ns. ייצוב זה שכנע אותנו שפרוטוקול MD יתאים למתחמי החלבון-ליגנד שלנו, אשר ינותחו בסעיף הבא.

200 ns MDS של Etravirine ו-Etravirine שנמנו (איור 17B,C) הראו תנודות של סטייה ריבועית ממוצעת (RMSD) של Etravirine קרוב ל-5.0 Å ושיווי משקל של 4.5 Å. ה-Etravirine שנמנה הראה תנודות RMSD של 4.5 Å ושיווי משקל של 3.5 Å. ייצוב זה מצביע על כך ש-Etravirine שנמנה יכול להיות ליגנד NNRTI פוטנציאלי לטיפול ב-HIV/איידס. מסלול עם RMSD פחות מ-5 Å מסמל אפקט קשירה חזק בין החלבון של האתר הפעיל לליגנד. תצפית זו נערכה עבור כל התרכובות שהוזכרו קודם לכן, למעט Nevirapine ו-Doravirine, בין התרכובות שנמנו (תיק משלים 1: איור משלים S8, איור משלים S9, איור משלים S10 ואיור משלים S11).

איור 18 ואיור 19 ממשיכים לנתח את הקישור בין Etravirine, Etravirine שנמנה והחלבון. הנתונים המנותחים כוללים היסטוגרמה של מגעי האינטראקציה, ליגנד-חלבון וחלבון-ליגנד. היסטוגרמה של מגע האינטראקציה עבור כל ליגנד בהתאמה הקשורה לחלבון קשורה ישירות לכוחות האינטראקציה המתאימים בין שאריות חומצת האמינו של החלבון לליגנד. השכיחות הגבוהה של LYS101 מובחנת מאוד עבור Etravirine ו-Etravirine שנספר, ונצפתה פס כתום עבה גלוי לעין. פס כתום בהיר שניתן להבחין בו במעומעם הממוקם בקצה התחתון של תרשים ה-Etravirine שנספר נצפה בקורלציה עם TYR181. התאמה זו מצביעה על קיומם של שני כוחות משיכה בין-מולקולריים בין GLU138. תצפית חיובית זו עבור הליגנדים וצורותיהם המנויות הושוו לניתוח ליגנד טוב יותר כתרכובת NNRTI פוטנציאלית. בהתבסס על התוצאות שסופקו, ל-Etravirine הנזכר יש פוטנציאל לשמש לטיפול ב-HIV/איידס.

מכניקה מולקולרית עם חישובי בורן ושטח פנים כלליים (MM-GBSA)

במחקר זה, המקור העיקרי לקלט אנרגטי לאנרגיה החופשית הקשירה,_קשירת ΔG, היה התרומה של אינטראקציית ואן דר ואלס, ΔG_VdW. ל-Etravirine יש ΔG_VdW גבוה יותר של -66.146 קק"ל/מול מאשר מקבילו הידוע NNRTI עם ΔG_VdW של -64.669 קק"ל/מול. ערך_{ה-ΔG Hbond} הגבוה יותר של -2.541 קק"ל/מול שנספר Etravirine מצביע על התרומה המשמעותית של כוחות המשיכה של המימן בין הליגנד לחלבון. התרומות של ΔG_Coulomb ו-ΔG_Covalent עבור etravirine שנמנו (-17.976 ו-2.807 קק"ל/מול) היו גדולות בהרבה מאלו של מקבילו הידוע של NNRTI, שהיו לו -11.196 ו-2.491, בהתאמה.

התוצאות שנצפו במהלך הקישור של Etravirine ו-Etravirine שנמנו עם חלבון 1HQU עקביות במקצת. Etravirine שנמנה נמצא טוב יותר ממקבילו, Etravirine, בשל שני קשרי מימן נוספים. המחקר גם גילה כי Etravirine שנמנה היה מועדף לקשירה לכיס המזוהה. _הקישור השלילי יותר של ΔG (-89.684 קק"ל/מול) עבור Etravirine שנספר בהשוואה לזה של Etravirine (-80.551 קק"ל/מול) מראה כי Etravirine שנמנה הוא מעכב טוב של HIV-1 RT.

איור 1: מבנים כימיים של שישה מעכבי טרנסקריפטאז הפוך ללא נוקלאוטידים מאושרים על ידי מינהל המזון והתרופות האמריקני עבור נגיף הכשל החיסוני האנושי-1. NVP = נביראפין; DLV = Delavirdine; EFV = Efavirenz; ETV = Etravirine; RPV = רילפיבירין; DOR = Doravirine. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: פתיחת היישום Maestro Schrodinger ב- Windows במחשב המקומי. (א) ניווט ליישום מאסטרו שרדינגר במחשב המקומי. (ב) כיצד לפתוח ולהפעיל את אפליקציית מאסטרו שרדינגר במחשב המקומי. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: ייבוא מבנה קובץ PDB מהמחשב המקומי לחלון הפרויקט ב-Schrödinger. (A) פונקציית מבנה ייבוא ב-Maestro Schrodinger. (ב) תיבת טקסט מזהה PDB. (ג) הורדת PDB file במחשב המקומי. (ד) לחצן ייבוא כדי לאפשר ייבוא של קובץ מזהה ה-PDB שהוכנס. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: מבנה קובץ PDB המיובא לחלון הפרויקט של Schrodinger. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5: זרימת עבודה של הכנת חלבון. (A) ממשק חיפוש זרימת עבודה של הכנת חלבון. (B) שמירת שם קובץ העבודה והתחלת תהליך הכנת החלבון. (ג) חלון ניטור לביצוע עבודות. (ד) פירוק הליגנד למרכיביו האישיים. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 6: זרימת עבודה של הכנת ליגנד. (א) ייבוא מבנים מהמחשב המקומי לחלון פרויקט הכנת חלבונים שרדינגר. (ב) חיפוש אחר תהליך הכנת ליגנד. (ג) חלון זרימת עבודה של הכנת ליגנד. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 7: זרימת עבודה של גיאומטריה ואופטימיזציה. (A) חלון תפריט GaussView לאופטימיזציה של גיאומטריה. (ב) סוגי משימות זמינים בכרטיסייה חישוב של GaussView. (ג) אפשרויות זמינות תחת הכרטיסייה Link0 ב-GaussView. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה. 

איור 8: יצירת רשת גלישה וזרימת עבודה של עגינה מולקולרית. (A) ממשק זרימת עבודה ליצירת רשת קולטנים. (ב) הודעה קופצת לבחירת אטום בתוך הליגנד. (ג) הגדרות מתקדמות של קולטנים. (ד) הודעה על השלמת עבודה. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 9: עגינת ליגנד גלישה. (א) ממשק לעגינה של ליגנד גלישה חיפוש. (ב) ממשק עגינה של ליגנד. (C) הגדרות דיוק עבור Glide Docking. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 10: זרימת עבודה של הכנת KNIME QSAR. (A) חיפוש צומת AutoQSAR בדף האינטרנט של מרכז הקהילה של KNIME. (B) לחצן הורד כדי להשיג את AutoQSAR KNIME Node. (ג) ייבוא זרימת העבודה AutoQSAR KNIME שהורדת. (ד) הגדרות תצורה עבור ליגנדים בעת בניית מודל QSAR. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 11: ספירת ליגנדים באמצעות מעצב ליגנד במאסטרו שרדינגר. (א) חיפוש אפשרויות מעצב ליגנד בשרדינגר. (ב) רשימת תהליכי עבודה לביצוע תהליך הספירה. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 12: זרימת עבודה של יצירת HOMO-LUMO. (A) כדי לגשת לאפשרויות העורך המולקולרי בכרטיסייה כלים ב-GaussView. (B) טעינת קובץ Chk או FChk קיים ליצירת אורביטלים מולקולריים גבוליים. (C) איור של אורביטלי הגבול HOMO ו-LUMO ב-GaussView. (D) דמיינו חלון שמציג את אורביטלי הגבול של HOMO ו-LUMO. (E) הצלת מסלולי הספר של ה-HOMO וה-LUMO. (F) ממשק פורמט תצוגה ב-GaussView. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 13: תהליך הכנה, הגדרה, הכנה וביצוע של דינמיקה מולקולרית. (A) Desmond System Builder: אפשרויות המסה לקביעת מודלים של מים קשיחים. (B) אפשרויות גבול של Desmond System Builder לקביעת צורת תיבה. (ג) בונה מערכות דזמונד: שיטה לחישוב גודל הקופסה. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 14: דיאגרמות אינטראקציה של ליגנד בין 1HQU ל-3 ליגנדים מעוגנים עליונים. כוחות האינטראקציה בין חלבון (1HQU) ו-(A) ליגנד הגביש (HBY561), (B) Efavirenz ו-(C) Etravirine. כוחות אלה משפיעים על אינטראקציות חלבון-ליגנד והם חיוניים לפיתוח תרופות המפחיתות עמידות אנטי-מיקרוביאלית ב-HIV-1. תפקידם בשיפור זיקת הקשירה, הספציפיות ומנגנון הפעולה מסייע בתכנון תרופות שיכולות למקד ולעכב ביעילות את הנגיף, ובכך לתת מענה לחשש הגובר מעמידות אנטי-מיקרוביאלית בהקשר של טיפול ב-HIV-1. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 15: תרשים פיזור מציג את הפעילות הנצפית לעומת הפעילות החזויה עבור מחלקה 1 של מודל QSAR. הגרף מייצג את ההתאמה בין מחלקה 1 כערכת האימון לבין תרכובות NNRTI כערכת המבחן כדי לתת ערך פעילות חזוי. קיצורים: NNRTI = מעכבי טרנסקריפטאז הפוך שאינם נוקלאוטידים; QSAR = יחסי מבנה-פעילות כמותיים. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 16: דיאגרמות אינטראקציה של ליגנד. כוחות האינטראקציות בין החלבון לבין (A) ליגנד גבישי שנמנה HBY_561, (B) נמנה Nevirapine, (C) נמנה Doravirine, (D) נמנה Efavirenz, ו-(E) נמנה Etravirine. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 17: דיאגרמת אינטראקציה של סימולציה של דינמיקה מולקולרית של החלבון החופשי Etravirine ו-Etravirine שנספר. (A) דיאגרמת אינטראקציה של דינמיקה מולקולרית של החלבון החופשי. (B) דיאגרמת אינטראקציה של דינמיקה מולקולרית של Etravirine. (C) דיאגרמת אינטראקציה של דינמיקה מולקולרית של Etravirine שנספר. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 18: אינטראקציה יוצרת קשר היסטוגרמה בין Etravirine לחלבון. (A) ציר הזמן של מגעי חלבון-ליגנד עבור Etravirine. (B) ציר הזמן של אינטראקציות חלבון-ליגנד לאורך זמן, כולל קשרי H, הידרופוביים, יוניים ומגעי גשר מים. (C) סכמטית המציגה אינטראקציות מפורטות בין אטומי ליגנד ושאריות חלבון. מוצגות רק אינטראקציות המתרחשות יותר מ-30% מזמן הסימולציה (0.00 עד 200 ns). אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 19: אינטראקציה מגעת היסטוגרמה בין Etravirine שנספר לבין החלבון. (A) ציר הזמן של מגעי חלבון-ליגנד עבור Etravirine שנספר. (B) ציר הזמן של אינטראקציות חלבון-ליגנד לאורך זמן, כולל קשרי H, הידרופוביים, יוניים ומגעי גשר מים. (C) סכמטית המציגה אינטראקציות מפורטות בין אטומי ליגנד ושאריות חלבון. מוצגות רק אינטראקציות המתרחשות יותר מ-30% מזמן הסימולציה (0.00 עד 200 ns). אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

מחלקה	יעד חלבון	טווח מורכב	המספר הכולל של תרכובות שנבחרו
1	NL4-3 HIV-1 מסוג פרא	(8a1-8e5 – EC50 (nM)a)	25
2	IIIB WT HIV-1	13a1-13d6 - EC50 (nM)a	23
3	מתח עמיד RES056 NNTI	13a1-13d6 - EC50 (nM)a	23
4	זן ROD HIV-2	13a1-13d6 - EC50 (nM)a	23
סך כל התרכובות שנבחרו למידול QSAR			94

טבלה 1: סיכום קריטריוני סיווג מורכבים למידול QSAR. מערך נתונים של 94 תרכובות דיהידרופורו[3,4-d] פירימידין סונתז על ידי קאנג ועמיתיו⁵⁰ להתמקדות בזני HIV שונים, כלומר, NL4-3 מסוג פרא HIV-1, IIIB WT HIV-1, זן RES056 NNRTI עמיד וזן ROD HIV-2. נגזרות פירימידין אלה קובצו לארבע מחלקות לפי חלבון היעד שלהן להכנה לביצוע אימון ה-QSAR שלנו. הטבלה מסכמת כיצד מולקולות אלה קובצו לארבע מחלקות על פי ערכי EC₅₀ הניסיוניים שלהן, המייצגים את עוצמת התרופה, המופעלת כריכוז שבו התרופה מפעילה 50% מהשפעתה המקסימלית. קיצורים: NNRTI = מעכבי טרנסקריפטאז הפוך שאינם נוקלאוטידים; QSAR = יחסי מבנה-פעילות כמותיים.

שם החלבון	ליגנד	ציון עגינה
1HQU	אפאבירנץ	-10.432
	אטראווירין	-9.647
	HBY_561	-9.242
	דורבירין	-9.04
	נביראפין	-8.825
	רילפיבירין	-7.722
	דלבירדין	-6.519

טבלה 2: ציוני עגינה של שישה NNRTI אופטימליים וחלבון HIV-1. ציוני העגינה הם עבור ששת ה-NNRTI הנחקרים. הציון השלילי יותר מעיד על יעילות קשירה טובה בין הליגנד לחלבון. Efavirenz ו-Etravirine הראו את הציונים החיוביים ביותר ב-10.432 eV ו-9.647 eV ביחס לציון העגינה של הליגנד המשותף HBY561 (-9.242). ליגנדים פוטנציאליים היו אלה עם ציון עגינה שלילי יותר, פחות מ-9.242 eV.

מחלקת תרופות	התאמת פעילות ב-85 אחוז	עמודה 1	טור2	עמודה 3	טור4	טור5
	הציון	ס"ד	R2	RMSE	שאלה2	Q2 MW (השערת אפס)
1	0.8223	0.3268	0.815	0.2479	0.8185	0.1462
2	0.5671	0.2996	0.5067	0.1996	0.2264	0.4736
3	0.8172	0.3692	0.8114	0.1536	0.9065	-1.1532
4	0.6673	0.367	0.6436	0.1709	0.8852	0.1445
* SD - סטיית תקן,
R2 – מתאם ערכת אימון בין ערכי פעילות בפועל וחזויים,
Q2 - מערך בדיקה של מתאם פעילות בפועל וחזויה.
RMSE - שגיאת שורש ממוצע בריבוע

טבלה 3: פרמטרים סטטיסטיים של מודל 2D-QSAR. הטבלה מציגה את סטיית התקן, את המתאם של ערכת האימון בין ערכי הפעילות בפועל והחזויים (R²), ואת הציון הגבוה של מתאם הפעילות בפועל והחזויה עבור כל כיתה (Q²). הציון הגבוה יותר (R²) מייצג את המעמד.

ליגנד	הומו	לומו	פער E
אפאבירנץ	-0.2242	-0.06943	0.15477
אטראווירין	-0.21408	-0.08141	0.13267
נביראפין	-0.20602	-0.07759	0.12843
HBY_561	-0.19687	-0.0748	0.12207
דלבירדין	-0.19651	-0.07958	0.11693
דורבירין	-0.22413	-0.10916	0.11497
רילפיבירין	-0.21343	-0.11216	0.10127

טבלה 4: פער אנרגיה HOMO-LUMO של ה-NNRTI האופטימליים. הטבלה מציגה את התוצאות של פערי האנרגיה של HOMO-LUMO שהתקבלו לאחר אופטימיזציה של ששת ה-NNRTIs.

ליגנד	ליגנדים אופטימליים	ליגנדים שנמנו
דורבירין	7.229	7.374
רילפיבירין	7.302	7.279
אטראווירין	7.229	7.374
אפאבירנץ	7.229	7.323
דלבירדין	7.302	7.302
נביראפין	7.229	6.988
HBY_561	7.229	7.323

טבלה 5: ציוני פעילות חזויים של NNRTI ממוטבים לעומת NNRTI תואמים. הטבלה משווה את ציוני הפעילות החיזוי בין ליגנדים מותאמים למספרים. ככל שציוני הפעילות גבוהים יותר, כך התרכובת טובה יותר כתרופה מובילה פוטנציאלית.

ליגנד	פער אנרגיה לאחר אופטימיזציה	פער אנרגיה לאחר ספירה	הפרש פער בין תרכובות ממוטבות לתרכובות ממוספרות
דורבירין	0.115	0.126	0.011
רילפיבירין	0.101	0.127	0.030
אטראווירין	0.133	0.126	0.010
אפאבירנץ	0.155	0.126	0.030
דלבירדין	0.117	0.126	0.010
נביראפין	0.128	0.126	0.002
HBY_561	0.122	0.126	0.004

טבלה 6: השוואה בין פערי האנרגיה החזויים של ה-NNRTI שנמנו ופער האנרגיה המקורי של ה-NNRTI המותאמים. הטבלה מציגה השוואה של פער האנרגיה של HOMO-LUMO בין הליגנדים האופטימליים והמנוסים והבדלי פער האנרגיה ביניהם.

ליגנד ממוספר	כלל 5 המאפיינים	עמודה 1	טור2	עמודה 3	טור4	טור5	נוספה קבוצה צדדית	ציון עגינה ממוספר	ציון עגינה מקורי	ליגנדים שנמנו מעוגנים מחדש
	AlogP	תשדיר שירות	HBD	HBA	מגה-וואט	MPO
דורבירין	2.4	125.9	2	8	441.8	0.49	הידרוקסיל	-8.894	-9.04	-9.739
אטראווירין	4.4	140.9	3	8	451.3	0.37	הידרוקסיל	-10.258	-9.647	-10.517
אפאבירנץ	3.7	64.3	2	3	330.7	0.75	אמין	-10.284	-10.432	-11.025
נביראפין	2.6	58.1	1	4	284.3	0.73	פלואוריד	-9.112	-8.825	-9.445
HBY_561	2.4	93.9	2	6	358.5	0.66	אמיד	-9.596	-9.242	-10.1
AlogP - (לוגריתם מחושב של מקדם החלוקה אוקטאנול-מים).
PSA - (שטח פנים קוטבי)
HBD - (תורמי קשרי מימן)
HBA - (מקבלי קשרי מימן)
MW - (משקל מולקולרי)
MPO - (אופטימיזציה מרובת פרמטרים)

טבלה 7: השוואת ניקוד עגינה בין ה-NNRTI המקורי ל-NNRTI. הטבלה מציגה את ההשוואה בין ציוני העגינה שנספרו, שהם ציוני העגינה לאחר הספירה. ציוני העגינה המקוריים הם ציוני העגינה של ה-NNRTI המותאמים. הציונים שנמנו מחדש הם ציוני העגינה של הליגנדים שנספרו. מכיוון שתהליך הספירה נותן ציון עגינה חזוי, היה צורך לעגן מחדש את הליגנדים באותה שיטה כמו הליגנדים המותאמים. הקבוצות שנוספו הן אלה שנוספו לליגנדים במהלך תהליך הספירה.

ליגנד	כריכת ΔG	ΔGקולומב	ΔGקוולנטי	ΔGבונד	ΔGליפו	חבילת ΔG	ΔGSolv	ΔGVdW
אטראווירין	-80.551	-11.196	2.491	-1.509	-27.447	-4.826	26.605	-64.669
נמנה אטראווירין	-89.684	-17.976	2.807	-2.541	-27.652	-4.211	26.034	-66.146
HBY561	-79.664	-12.261	0.994	-0.521	-26.052	-1.278	18.624	-59.169
נספר HBY561	-82.719	-13.443	1.534	-0.603	-27.053	-1.210	20.600	-62.544
אפאבירנץ	-71.372	-12.984	1.151	-0.834	-25.353	-1.379	14.472	-46.44
מונה אפבירנץ	-79.125	-18.602	1.753	-2.159	-25.409	-1.198	16.619	-50.129

טבלה 8: MMGBSA reXts של ליגנדים נבחרים ב-1HQU. הטבלה מייצגת את המכניקה המולקולרית עם חישובי בורן ושטח פנים כלליים, המראים אנרגיה חופשית ממוצעת (ΔGbind) של קומפלקס החלבון-ליגנד. הטבלה מציגה השוואה בין הליגנדים המותאמים במקור המראים ציוני עגינה טובים ביחס לליגנדים הקריסטליים לבין עמיתיהם המנויים. התרכובת שנבחרה עם ציון עגינה גבוה יותר וסימולציה דינמית מולקולרית טובה של תנודות RMSD בשיווי משקל אמורה גם לספק את חישובי MMGBSA על ידי הצגתהאנרגיה החופשית השלילית ביותר של (ΔG_bind). במקרה זה, Etravirine שנמנה עונה על שני הפרמטרים החישוביים.

קובץ משלים 1: rXts אחרים שהושגו במחקר זה. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

Discussion

שיטת DFT²⁶ שימשה לניתוח התכונות האלקטרוניות והיציבות של נגזרות פירימידין שונות, מה שלא קורה במחקרים דומים. השימוש ב-DFT מאפשר הבנה מעמיקה יותר של האינטראקציות המולקולריות ברמה הקוונטית, ומשפר את תהליך התכנון של NNRTIs. במחקר זה, בחרנו שישה NNRTI עם ערכי פעילות לא ידועים. אחזרנו את המבנים המולקולריים שלהם ממסד הנתונים של PubChem וביצענו אופטימיזציה גיאומטרית באמצעות הבסיס הפונקציונלי Minnesota 15 Local (MN15-L)³² ו-6-31++G (d,p)² שנקבעו בחבילת התוכנה של מכניקת הקוונטים Gaussian 16 גרסה C01³³ . כדי להגדיר קבצי קלט סימולציה, השתמשנו ב- GaussView 6.0²⁶. לאחר מכן המבנים הקוונטיים עוגנו לאתר הפעיל של חלבון HIV-1.

המחקר השתמש בגישת QSAR⁵¹, המותאמת לחיזוי הפעילות הביולוגית של NNRTIs על סמך המבנה הכימי שלהם. מודל זה נוצר באמצעות מערך נתונים של 94 נגזרות דיהידרופורו[3,4-d] פירימידין, המאפשר זיהוי של קבוצות תפקודיות מרכזיות המשפיעות על הפעילות האנטי-ויראלית. שילוב מודל QSAR חזק הוא התקדמות מכרעת, מכיוון שהוא מסייע בסינון תרכובות בשלב מוקדם בתהליך התכנון, ומשפר את היעילות של גילוי תרופות.

הפעילויות החזויות של התרכובות החדשות נלקחו בחשבון, וציוני העגינה אומתו. טכניקת העגינה המולקולרית המתקדמת חקרה את אינטראקציות הקישור בין NNRTI לאנזים HIV-1 reverse transcriptase. זה הושלם על ידי סימולציות דינמיקה מולקולרית לאורך תקופה ממושכת (200 ns), שסיפקו תובנה לגבי היציבות וההתנהגות של קומפלקסי התרופה-חלבון בתנאים פיזיולוגיים. דינמיקה מולקולרית⁵² אישרה את הממצאים ממחקרי עגינה. על ידי הדמיית ההתנהגות של קומפלקסים של תרופות-אנזימים לאורך זמן, אנו יכולים להעריך את היציבות הדינמית והאינטראקציות שאולי לא ייתפסו במחקרי עגינה סטטית⁵³. גישה זו מספקת הערכה מציאותית יותר של ביצועי NNRTIs במערכות ביולוגיות. הסימולציות הראו כי Etravirine ייצר תנודות RMSD של כ-4.5 Å, בעוד שה-Etravirine שנספר נתן תנודות RMSD של 3.5 Å. היו קווי דמיון שונים בין Etravirine ל-Etravirine שנספר, כאשר לתרכובת שנספרה יש אינטראקציות משופרות של חומצות אמינו בתוך האתר הפעיל של החלבון. ה-RMSD הנמוך יותר, האינטראקציות המשופרות עם חומצות אמינו והאנרגיה החופשית הגבוהה ביותר מצביעים על כך שה-Etravirine המונה יכול לשמש כחלופה בת קיימא לטיפול ב-HIV/איידס.

השימוש בטכניקות ספירה⁵⁴ ליצירת סטריאואיזומרים וביצוע סריקת איזוסטר הוא היבט ראוי לציון במחקר זה. שיטה זו מאפשרת לחוקרים לחקור מרחב כימי רחב יותר עבור NNRTI פוטנציאליים על ידי שינוי שיטתי של מבנים קיימים, מה שיכול להוביל לגילוי תרכובות בעלות יעילות משופרת ועמידות מופחתת.

המחקר משלב ניתוח HOMO-LUMO הנגזר מחישובים מכניים קוונטיים כדי להעריך את התגובתיות והיציבות של התרכובות. היבט זה מתעלם לעתים קרובות במחקרים דומים⁵⁵, אך הוא מספק תובנות חשובות לגבי תכונות אלקטרוניות שיכולות להשפיע על הפעילות הביולוגית

השימוש בשיטת MMGBSA במחקר זה כדי להעריך את האנרגיות החופשיות של ה-NNRTI שנמנו כמעכבי HIV-1 reverse transcriptase (RT) פוטנציאליים מציג היבט חדש המשפר את המשמעות וההשפעה הפוטנציאלית של עבודה זו על התפתחות הטיפול ב-HIV.

היישום של MMGBSA במחקר זה מספק הערכה מדויקת יותר של אנרגיות הקישור החופשיות עבור ה-Etravirine שנספר בהשוואה למקבילו. על ידי חישוב ערכי אנרגיה חופשית מחייבת, המחקר מעריך כמותית את זיקת הקישור של Etravirine שנספר, שהייתה גבוהה משמעותית (9.133 קק"ל/מול) מזו של Etravirine סטנדרטי. רמת פירוט זו בחישובי אנרגיה מחייבים מאפשרת הבנה ניואנסית יותר של האופן שבו שינויים מבניים יכולים להשפיע על היעילות של NNRTIs, מה שלעתים קרובות חסר במחקרים דומים שעשויים להסתמך אך ורק על הערכות איכותניות.

הערך_{הקוולנטי} של ΔG המדווח של 1.477 קק"ל/מול מצביע עוד יותר על עוצמת האינטראקציה עבור התרכובת שנספרה. הגישה ההשוואתית היא חדשנית מכיוון שהיא לא רק מזהה מועמד מבטיח אלא גם ממקמת אותו בהקשר הרחב יותר של טיפולים קיימים, ומספקת אמת מידה לפיתוח עתידי של NNRTI.

ההשוואה המוצגת בטבלה 8 מצביעה גם על כך ש-Etravirine שנמנה יכולה להיות תרכובת פוטנציאלית לשמש כ-ART חלופי מכיוון שהאנרגיה החופשית המחייבת שלו של (ΔG_bind) היא הגבוהה ביותר בהשוואה ל-Etravirine, HBY56, Etravirine ועמיתיהם המפורטים.

תוצאות המחקר שלנו עשויות להשפיע באופן משמעותי על הפיתוח של חומרים טיפוליים חדשים לזיהום HIV. בנוסף, גישה זו עשויה לאפשר זיהוי המועמד המבטיח ביותר נגד HIV. ממצאים אלה עשויים לסלול את הדרך לתכנון רציונלי של NNRTI חדשים של HIV-1.

השילוב של MMGBSA בשילוב עם שיטות חישוביות אחרות (כמו עגינה מולקולרית, מידול QSAR וסימולציות דינמיקה מולקולרית) משפר את חוסן הממצאים. גישה משולבת זו מאפשרת הערכה מקיפה של התרכובות, החל מאופטימיזציה מבנית ועד להתנהגות דינמית בהקשר ביולוגי. מתודולוגיה כזו היא חדשה יחסית במחקר NNRTI, שבו מחקרים מתמקדים לעתים קרובות בשיטות מבודדות ללא ראייה הוליסטית של תהליך תכנון התרופה. המחקר מדגיש מספר תוצאות מבטיחות והבנה משופרת של האינטראקציות המולקולריות בין NNRTI לאנזים טרנסקריפטאז הפוך, מה שיכול ליידע את מאמצי תכנון התרופות העתידיים.

בעוד שמחקרים אחרים בתחום פיתוח NNRTI מתמקדים לעתים קרובות בשיטות חישוביות בודדות או ניתוחי עגינה בסיסיים, מחקר זה בולט על ידי שילוב חישובים כימיים קוונטיים עם דינמיקה מולקולרית ומודלים QSAR, שימוש בגישת ספירה שיטתית המרחיבה את המרחב הכימי הפוטנציאלי עבור NNRTIs, ושימוש בסיליקו מקיף מסגרת שלא רק מנבאת זיקות קשירה אלא גם מעריכה את היציבות והדינמיקה של אינטראקציות תרופה-אנזים.

בסך הכל, החידוש של מחקר זה טמון בגישה הרב-גונית שלו, הממנפת טכניקות חישוביות מתקדמות כדי להתמודד עם האתגרים של עמידות לתרופות בטיפול ב-HIV, ובכך לסלול את הדרך לפיתוח NNRTI יעילים יותר. הממצאים מדגישים את הפוטנציאל לפיתוח NNRTI יעילים יותר שיכולים להתגבר על מגבלות הטיפולים הנוכחיים.

כמה יישומים עתידיים של הגישה המתוארת בפרוטוקול זה כוללים את הדברים הבאים.

אינטגרציה עם למידת מכונה

מחקרים עתידיים יוכלו לשלב MMGBSA עם אלגוריתמים של למידת מכונה כדי לשפר את כוח החיזוי של הערכות אנרגיה חופשית מחייבות. על ידי אימון מודלים על מערכי נתונים גדולים, החוקרים יכלו לשפר את הדיוק והאמינות של התחזיות, ולאפשר זיהוי טוב יותר של מועמדים מבטיחים ל-NNRTI.

יישום בתכנון תרופות מבוסס פרגמנטים

ניתן להשתמש ביעילות ב-MMGBSA בתכנון תרופות מבוסס שברים, שבו מקטעים מולקולריים קטנים מותאמים לשיפור זיקת הקשירה. גישה זו יכולה להוביל לזיהוי של NNRTI חדשים עם עוצמה וסלקטיביות משופרות נגד HIV-1.

חקר מנגנוני עמידות לתרופות

ניתן ליישם את הטכניקה כדי לחקור את אינטראקציות הקישור של NNRTI עם זנים מוטנטיים של HIV-1. על ידי השוואת אנרגיות חופשיות של NNRTI מול גרסאות פראיות ועמידות כאחד, חוקרים יכולים לקבל תובנות לגבי מנגנוני העמידות לתרופות וליידע על תכנון מעכבי הדור הבא.

הערכת תכונות פרמקוקינטיות

ניתן להשתמש ב-MMGBSA גם כדי להעריך את התכונות הפרמקוקינטיות של NNRTIs, כגון מסיסות וחדירות. על ידי הבנת האופן שבו תכונות אלה מתואמות עם זיקה קשירה, חוקרים יכולים לייעל מועמדים לתרופות לפרופילים טיפוליים טובים יותר.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
GaussView	GaussView		V6.1.1
KNIME	KNIME		V4.7.1
Schrodinger Maestro V13.6	SCHRODINGER INC.		שנת שחרור רישיון 2023-2