הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הזרקה תוך ורידית אופטימלית בדגי זברה בוגרים

2.8K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/67463

⸱

20 בדצמבר 2024

 ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, School of Clinical Medicine, LKS Faculty of Medicine, The University of Hong Kong, 2ZeBlast Technology Limited, Hong Kong Science Park, 3Centre for Oncology and Immunology, Hong Kong Science Park

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מציגים פרוטוקול אופטימלי ויעיל להזרקה תוך ורידית של תאים או חומרים פרמקולוגיים לדג זברה בוגר, וכתוצאה מכך השתלת תאים משופרת ושיעורי הישרדות מוגברים של דג הזברה המטופל.

תקציר

הזרקה תוך ורידית (IV) מוכרת כשיטה היעילה והנפוצה ביותר להשגת אספקה מערכתית של חומרים במודלים של מחקר יונקים. עם זאת, היישום שלו בדגי זברה בוגרים להעברת תרופות, השתלת תאי גזע ומחקרי התחדשות וסרטן הוגבל בשל האתגרים שמציבים גודל גופם הקטן וכלי הדם המורכבים. כדי להתגבר על מגבלות אלה, טכניקות הזרקה חלופיות כגון הזרקה תוך לבבית ורטרו-אורביטלית (RO) נחקרו בעבר להשתלת תאי גזע בדג זברה בוגר. עם זאת, לטכניקות אלו יש חסרונות, כולל הצורך בטכניקות הזרקה קפדניות או סיכון מוגבר לתמותה.

במחקר זה, פיתחנו הליך הזרקת IV מעודן ואופטימלי המותאם במיוחד לדגי זברה בוגרים, תוך התמודדות עם האתגרים הקשורים לאנטומיה הייחודית שלהם. כדי להדגים את היעילות של טכניקה זו, ביצענו הזרקות מוצלחות לווריד של תאי מח כליה שלמים מדגי Tg(mpo: EGFP) וצבע FITC-dextran לדגי קספר בוגרים. ההדמיה שלאחר מכן של תאים וצבעים שהוזרקו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי אישרה את מסירתם המוצלחת והשתלבטתם בתוך דג הזברה. יתר על כן, הראינו כי בהשוואה לזריקות התוך לבביות וה-RO, הזרקת הווריד הביאה לשיפור בשיעורי ההישרדות ויעילות ההשתלה בדגי הזברה המטופלים. גישה זו מאפשרת אספקה מדויקת ולוקליזציה של חומרים וטומנת בחובה פוטנציאל גדול לסריקת תרופות וכימיקלים בקנה מידה גדול באמצעות דג זברה בוגר. בנוסף, היכולת לעקוב חזותית אחר התאים והצבעים המוזרקים מספקת תובנות שלא יסולא בפז לגבי ההשתלה, הנדידה והאינטראקציות שלהם עם רקמות המארח, ומאפשרת הערכה מקיפה יותר של ההשפעות הטיפוליות והתהליכים הביולוגיים במודלים של דג הזברה.

מבוא

דג הזברה (Danio rerio) התגלה כאורגניזם מודל בעל ערך במחקר ביו-רפואי, בעיקר בשל הדמיון הגנטי שלו לבני אדם, כאשר ליותר מ-70% מהגנים האנושיים יש מקבילים לדג הזברה 1,2. הדמיון הגנטי הזה, בשילוב עם הגודל הקומפקטי של דג הזברה, מחזור ההתפתחות המהיר והיכולת למניפולציה גנטית נרחבת, הופכים אותו לכלי רב עוצמה לחקירה מדעית. תכונות אלו מועילות במיוחד לניסויים הכוללים השתלת תאים, אספקת תרופות ומעקב אחר תאים. יתר על כן, הבהירות האופטית של זחלים שקופים ומוטציות פיגמנטציה ספציפיות, כגון דג הזברה קספר, מאפשרת הדמיה מדויקת של תאים או חומרים מושתלים, ומציעה אלטרנטיבה יעילה וחסכונית יותר למודלים מסורתיים של בעלי חיים.

דגי הזברה נמצאים בשימוש נרחב לפיתוח מודלים להשתלת סרטן ולביצוע בדיקות תרופות למחלות קשות כמו גליומה, מלנומה, גידולי לבלב ולוקמיה 3,4,5,6,7,8,9,10. בדרך כלל, מודלים אלה מתחילים בשלב הזחל כדי לנצל את מערכת החיסון הלא בשלה של הזחלים ואת השקיפות הטבועה בהם, מה שמפשט את תהליך ההזרקה ומשפר את ההיתכנות של מחקרים קצרי טווח. עם זאת, שימוש בזחלים מגביל את משך הזמן להערכת השתלה והתערבויות טיפוליות 7,11. העברת פרוטוקולים ניסיוניים אלה לדג זברה בוגר מציגה אתגרים כגון הליכי הזרקה מורכבים יותר, יעילות השתלה מופחתת, שיעורי תמותה גבוהים יותר ושונות מוגברת בתגובות אינדיבידואליות. אתגרים אלה מדגישים את הצורך הקריטי בטכניקות הזרקה ואספקת חומרים משופרות, במיוחד עבור מחקרים הכוללים דגי זברה בוגרים הדורשים תקופות תצפית ממושכות.

מבחינה היסטורית, זריקות תוך-לבביות12 ורטרו-אורביטליות (RO)13 היו השיטות העיקריות להעברת תרופות והשתלת תאים בדגי זברה בוגרים. הזרקה תוך לבבית, הכוללת הזרקת חומרים ישירות ללב, מבטיחה זרימה מערכתית מיידית של תרופות אך קשורה לסיכונים משמעותיים, כולל פגיעה לבבית פוטנציאלית ותמותה גבוהה. מצד שני, הזרקת RO, המעבירה חומרים לסינוס הוורידי מאחורי העין, מקדמת גם פיזור מערכתי מהיר אך עלולה להלחיץ את הדגים ודורשת דיוק גבוה בביצוע14. זריקות IV, מבוססות היטב להעברת חומרים מערכתיים בעכברים וחולדות, חיוניות למחקרי פרמקוקינטיקה, הערכות יעילות תרופות והתערבויות טיפוליות במודלים אלה 15,16,17,18. לאחרונה, זריקות IV זכו לבולטות במחקר דגי הזברה, במיוחד במחקרים על תגובות חיסוניות מולדות19,20 ופגיעה כלייתית חריפה21 בדג זברה זחל. עם זאת, היישום שלהם בדגי זברה בוגרים נותר מוגבל.

במחקר זה, פיתחנו וביצענו אופטימיזציה של הליך הזרקת IV המותאם במיוחד לדגי זברה בוגרים, המשפר משמעותית את שיעורי ההישרדות, הדיוק ויעילות המסירה. אנו מדגימים ויזואלית שיטה זו ומספקים פרוטוקול מפורט באמצעות טכניקה מעודנת זו. ביצענו בהצלחה זריקות IV של תאי מח כליה שלם (WKM) מדגי Tg(mpo: EGFP) וצבע FITC-dextran לדגי קספר בוגרים, עם אישור אספקה והשתלה שהוערכו על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. הממצאים שלנו מראים שטכניקת הזרקת הווריד המעודנת יעילה ועקבית יותר בהשוואה לשיטות התוך-לבביות וה-RO המסורתיות. ככל שהשימוש בדג הזברה במחקר המדעי ממשיך להתרחב, אימוץ טכניקת הזרקת IV משופרת זו עשוי לשפר את ההבנה שלנו לגבי פתוגנזה של מחלות ולהאיץ את הפיתוח של גישות טיפוליות חדשות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל ההליכים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה לשימוש בחיות מעבדה ומחקר (CULATR) באוניברסיטת הונג קונג (HKU).

1. הכנת חומר הזרקה

  1. הכן מדיום תרחיף תאים: 0.9x PBS + 5% סרום בקר עוברי (FBS) + 1% פניצילין/סטרפטומיצין (עט/סטרפטומיצין).
  2. עקר את מזרק המילטון והמחט המחוברת (34 גרם, אורך 10 מ"מ, קיבולת 10 מיקרוליטר, ראה טבלת חומרים) תחת אור UV באורך גל של 270-280 ננומטר וחשוף את הפריטים למשך שעתיים.
  3. הכינו ניצני כותנה מעוקרים, רפידות קצף ונייר טישו.
  4. הכן את תערובת ההרדמה על ידי דילול טריקאין במי דגים מעוקרים לריכוז סופי של 0.2 מ"ג/מ"ל.
  5. להשתלת תאי WKM בדגי קספר , יומיים לפני ההשתלה, יש לתת מנת הקרנה תת-קטלנית של 25 Gy, המחולקת לשני מפגשים של 12.5 Gy כל אחד, הניתנים באותו יום עם מרווח של 7-8 שעות בין המנות. לתהליך ההקרנה, הניחו 5-10 דגים בוגרים בצלחת פטרי בקוטר 100 מ"מ המכילה מי דגים וחשפו אותם במכשיר גמא.
    הערה: המינון נקבע כתת-קטלני על סמך ניתוח הישרדות לאחר חשיפת דגי קספר לרמות קרינה שונות של עד 35 Gy, שנבדקו במשך 30 יום (איור 1A). יש לכייל את משך החשיפה המדויק בהתאם להגדרות הרדיאטור. אין צורך בהקרנה עבור הליכים הכוללים מתן תרופות בלבד.
  6. השתמש במעקר קיטור חיטוי מעבדתי כדי לעקר את מי הדגים המיועדים לשיכון דגים שטופלו (ראה טבלת חומרים) כדי למנוע זיהומים ולהבטיח סביבת התאוששות בטוחה לדגים לאחר ההזרקה.
    הערה: תהליך הסטריליזציה מותאם ליחידת החיטוי הספציפית בה נעשה שימוש, ואנו מקפידים על הנחיות היצרן לחיטוי תמיסות נוזליות להכנת מי הדגים.
  7. הכן מאגר שטיפת מחטים: מספר צינורות של 75% אתנול ומים טהורים במיוחד בצינורות מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מ"ל.
  8. הכן את מאגר ההשתלה על ידי המסת FITC-Dextran (משקל מולקולרי: 10,000) במדיום השעיית התאים שהוכן בעבר (0.9x PBS עם 5% FBS ו-1% עט/סטרפטוקוקוק). התאם את הריכוז ל-100 מיקרוגרם/מ"ל.
    הערה: מאגר זה ישמש להזרקות, בנפח מתוכנן של 2 מיקרוליטר לדג.

2. הכנת מח כליה שלם להשתלה

  1. המתת חסד של המספר הדרוש של דגי Tg(mpo: EGFP) על ידי טבילתם בתמיסת טריקאין של 0.4 מ"ג/מ"ל, תוך הבטחה שהם יישארו בתמיסה לפחות 10 דקות לאחר הפסקת התנועה האופרקולרית.
  2. נתח את דג ה-Tg (mpo: EGFP) כדי לבודד ולהעביר את מח הכליה (KM) למדיום תרחיף התא בתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מ"ל כפי שתואר קודם לכן22.
  3. לפרק את תאי ה-KM על ידי פיפטינג וסינון המתלה דרך מסננת תאי ניילון של 40 מיקרומטר.
  4. צנטריפוגה המתלה ב 500 × גרם למשך 8 דקות.
  5. השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את הגלולה ב-500 מיקרוליטר של מדיום תרחיף תאים.
  6. ספרו את התאים באמצעות מונה אוטומטי עם כמות של 10 מיקרוליטר של תרחיף התאים.
  7. שוב צנטריפוגה בחום של 500 × גרם למשך 8 דקות.
  8. התאם את ריכוז התאים ל-150,000 תאים/מיקרוליטר באמצעות מאגר ההשתלה.

3. הליך הזרקה

  1. שטפו היטב את מזרק המילטון 3-4x עם 75% אתנול לפני ההזרקה. שטפו את המזרק 3-4x במים טהורים במיוחד כדי להסיר שאריות אתנול.
  2. יש להעניק הרדמה לדג הזברה על ידי טבילתם בתערובת ההרדמה עד להרדמה מלאה, כפי שמעידה ירידה בתנועה ואובדן תגובות רפלקס. ברגע שהדגים מורדמים, מקמו אותם כשהצד הגבי שלהם פונה כלפי מעלה והראש שלהם מופנה שמאלה (איור 1B). הניחו בזהירות את הדגים על נייר טישו נקי ולח, שיעזור לייצב אותם להזרקה. ודא שהרקמה לחה מספיק כדי למנוע מהדג להתייבש, אך לא רטובה עד כדי גרימת החלקה.
  3. אחוז בחוזקה במזרק המילטון וזווית את המחט בזווית של ~45° לכלי הראשוני (וריד הזנב) כדי למקד אותו ביעילות תוך מזעור הנזק לרקמות שמסביב. עבור דג זברה קסר , כוונו לקטע של הכלי שנראה דרך גופו השקוף למיקום מדויק של המחט (איור 1B). עבור דגי זברה מסוג בר (Tubingen, TU) עם עור פיגמנטי, כוונו לכלי דם ראשוניים שנמצאים לאורך ציר הגוף ואחוריים לפי הטבעת באזור כלי הדם העיקריים (איור 1B). הכנס בעדינות ובצורה חלקה את המחט לתוך הכלי המיועד, תן את ההזרקה (2 מיקרוליטר) לאט כדי למזער את הלחץ, להבטיח ספיגה אופטימלית של החומר ולהפעיל לחץ עדין על המקום עם צמר גפן למשך 10 שניות כדי לשלוט בכל דימום לאחר ההזרקה.
  4. התבונן במיקרוסקופ כדי לאשר את נוכחותם של אותות GFP, מה שמבטיח את יעילות ההזרקה. ודאו שהתאים או הצבעים מופיעים כאותות ירוקים בתוך כלי הדם (איור 2A).
  5. הניחו לדגים להתאושש במי דגים מעוקרים טריים לאחר הזרקה למשך 10 דקות עד להעברה למיכל סטטי.
  6. נקה את המחט כפי שתואר קודם לכן בין זריקות של ריאגנטים שונים.
  7. כדי למנוע היווצרות תאים, הזיזו את תרחיף התאים כל 10 דקות כדי להשעות מחדש את התאים.
  8. שמור על מקסימום 15 דגים מושתלים במיכל 4 ליטר בתנאי מים סטטיים למשך הטיפול. לחלופין, אכלס את הדגים המושתלים בנפרד במיכלים סטטיים של 1 ליטר. ציידו את המיכל במשאבת חמצן ובצעו החלפות מים יומיות כדי למזער את הסיכון לזיהום.
  9. עקוב והעריך את ביטוי ה-GFP על ידי זרימה ציטומטרית בדגים כ-14 יום לאחר ההשתלה כדי להעריך את קצב ההשתלה. רשום את התמותה היומית של דגים כדי לחשב במדויק את שיעורי ההישרדות. בצע ANOVA חד כיווני לניתוח חריטה ומבחן דירוג לוג לניתוח ההישרדות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

כדי להעריך את היעילות והדיוק של שיטות הזרקה שונות בדגי קספר בוגרים, נערך ניתוח השוואתי באמצעות טכניקות תוך-לבביות, RO ו-IV (איור 2A). הוזרקו כמויות משתנות של תאי WKM מדגי Tg(mpo: EGFP), כל אחד מעורבב עם צבע FITC-dextern בריכוזים של 1 × 105 ו-3 × 105 תאים. ההצלחה של כל שיטה נקבעה באמצעות הערכה מיקרוסקופית מיידית של נוכחות אות GFP לאחר ההזרקה. התוצאות חשפו הבדלים משמעותיים בהצלחת האספקה בין השיטות. שיטת הזרקת הווריד הדגימה את היעילות הגבוהה ביותר, עם אות...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

במחקר זה, פיתחנו פרוטוקול הזרקת IV המותאם לדגי זברה בוגרים כדי לשפר את הדיוק והעקביות של אספקת תאים או תרופות. מרכיב קריטי בשיטה זו הוא היכולת למקם ולדמיין את הווריד הראשוני, שהוא חיוני לניהול מדויק של חומרים. בעוד שזן דג הזברה השקוף של קספר מומלץ לנראות אופטימלית של כלי השיט, הפרוטוקול שלנו ניתן להתאמה לשימוש עם זני דג זברה בוגרים שונים, בתנאי שנעשות התאמות מתאימות לנראות ולדיוק. הבחירה במד מחט מתאים הייתה חיונית כדי למזער את הנזק לכלי הדם ולהבטיח הובלת חומרים יעילה. יתר על כן,...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגודי אינטרסים להצהיר עליהם.

תודות

אנו מודים למתקן דג הזברה מהמרכז למחקר ברפואה השוואתית (CCMR) באוניברסיטת הונג קונג. אנו מודים לגב' ג'ו יו לינג וונג על הסיוע לבעלי חיים. העבודות נתמכו על ידי תוכנית המחקר מבוססת הנושא (T12-702/20-N), פרויקטים של קרן המחקר הרפואי והבריאות מס' 08192066 ומס' 08193106, תוכנית המחקר המשותפת של הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (NSFC) / מועצת מענקי המחקר (RGC) 2021/22 N_HKU745/21, תוכנית המו"פ הלאומית של סין (2023YFA1800100) והמרכז לאונקולוגיה ואימונולוגיה במסגרת יוזמת Health@InnoHK במימון ועדת החדשנות והטכנולוגיה. ממשלת הונג קונג SAR, סין (A.Y.H.L).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
אוטוקלאבים מעקר קיטורHIRAYAMA HRG-140
צנטריפוגה 5424Eppendorf
Countess 3 מונה תאים אוטומטיThermofisher
Countess II FLInvitrogen
Ethyl 3-aminobenzoate מלח מתאן סולפונאט (טריקאין)סיגמא-אולדריץ'MKCL9483
פלקון 40 ומיקרו; מסננת תאים mCORNINGBlue, סטרילית, ארוזה בנפרד, 50/מארז
FBS, מוסמכתGibco26140079
FITC-Dextran (MW 10000) MedChemExpress60842-46-8
מחט הזרקההמילטון HAMI20743434 גרם, אורך 10 מ"מ
מיקרו מזרקהמילטון 7635-01 10 ומיקרו; קיבולת L, דגם 701 RN
Nikon SMZ18
PBS pH 7.4 (1x)Gibco10010023
פניצילין-סטרפטומיצין (5,000 U/mL)Gibco ™15070063100x
טיפים לפיפטהEppendorf epTIPS
פיפטה חד ערוציתEppendorf 05-403-151
מים מזוקקים UltraPureInvitrogen10977015

מקורות

  1. Choi, T. Y., Choi, T. I., Lee, Y. R., Choe, S. K., Kim, C. H. Zebrafish as an animal model for biomedical research. Exp Mol Med. 53 (3), 310-317 (2021).
  2. Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8 (5), 353-367 (2007).
  3. Wu, J. Q., et al. Patient-derived xenograft in zebrafish embryos: a new platform for translational research in gastric cancer. J Exp Clin Cancer Res. 36 (1), 160(2017).
  4. Welker, A. M., et al. Correction: Standardized orthotopic xenografts in zebrafish reveal glioma cell-line-specific characteristics and tumor cell heterogeneity. Dis Model Mech. 9 (9), 1063-1065 (2016).
  5. Stoletov, K., Montel, V., Lester, R. D., Gonias, S. L., Klemke, R. High-resolution imaging of the dynamic tumor cell vascular interface in transparent zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (44), 17406-17411 (2007).
  6. Etchin, J. P. K. J., Look, A. T. Zebrafish as a model for the study of human cancer. Methods Cell Biol. 105, 309-337 (2011).
  7. Khan, N., Mahajan, N. K., Sinha, P., Jayandharan, G. R. An efficient method to generate xenograft tumor models of acute myeloid leukemia and hepatocellular carcinoma in adult zebrafish. Blood Cells Mol Dis. 75, 48-55 (2019).
  8. Corkery, D. P., Dellaire, G., Berman, J. N. Leukaemia xenotransplantation in zebrafish--chemotherapy response assay in vivo. Br J Haematol. 153 (6), 786-789 (2011).
  9. He, B. L., et al. Functions of flt3 in zebrafish hematopoiesis and its relevance to human acute myeloid leukemia. Blood. 123 (16), 2518-2529 (2014).
  10. Wang, D., et al. Transgenic IDH2(R172K) and IDH2(R140Q) zebrafish models recapitulated features of human acute myeloid leukemia. Oncogene. 42 (16), 1331(2023).
  11. Fan, R. Y., et al. Zebrafish xenograft model for studying mechanism and treatment of non-small cell lung cancer brain metastasis. J Exp Clin Cancer Res. 40 (1), 371(2021).
  12. LeBlanc, J., Bowman, T. V., Zon, L. Transplantation of whole kidney marrow in adult zebrafish. J Vis Exp. (2), e159(2007).
  13. Pugach, E. K., Li, P., White, R., Zon, L. Retro-orbital injection in adult zebrafish. J Vis Exp. (34), e1645(2009).
  14. Benjamin, D. C., Hynes, R. O. Intravital imaging of metastasis in adult zebrafish. BMC Cancer. 17 (1), 660(2017).
  15. Hilligan, K. L., et al. Intravenous administration of BCG protects mice against lethal SARS-CoV-2 challenge. J Exp Med. 219 (2), e20211862(2022).
  16. Moreo, E., et al. Intravenous administration of BCG in mice promotes natural killer and T cell-mediated antitumor immunity in the lung. Nat Commun. 14 (1), 6090(2023).
  17. Wang, Z., et al. Intravenous administration of IL-12 encoding self-replicating RNA-lipid nanoparticle complex leads to safe and effective antitumor responses. Sci Rep. 14 (1), 7366(2024).
  18. Saleem, M., et al. A new best practice for validating tail vein injections in rat with near-infrared-labeled agents. J Vis Exp. (146), e59295(2019).
  19. Rojas, A. M., Shiau, C. E. Brain-localized and Intravenous Microinjections in the Larval Zebrafish to Assess Innate Immune Response. Bio Protoc. 11 (7), e3978(2021).
  20. van Soest, J. J., et al. Comparison of static immersion and intravenous injection systems for exposure of zebrafish embryos to the natural pathogen Edwardsiella tarda. BMC Immunol. 12, 58(2011).
  21. Cianciolo Cosentino, C., Roman, B. L., Drummond, I. A., Hukriede, N. A. Intravenous microinjections of zebrafish larvae to study acute kidney injury. J Vis Exp. (42), e2079(2010).
  22. Gerlach, G. F., Schrader, L. N., Wingert, R. A. Dissection of the adult zebrafish kidney. J Vis Exp. (54), e2839(2011).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

תאי מוח הכליההשתבשות תאיםהזרקה רטרו-אורביטליתהזרקה תוך-לבביתציטומטריה עם זרימהדגי נשבעים טרנסגנייםסריקת תרופותמיקרוסקופיה פלואורסצנטית
הזרקה תוך ורידית אופטימלית בדגי זברה בוגרים
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.