מאמר שיטה

מודל ביופילם מצטבר של סיסטיק פיברוזיס לחקר ביטוי גנים רלוונטי לזיהום

1.4K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/67477

⸱

18 באפריל 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Clinical Infection, Microbiology and Immunology, University of Liverpool, 2Division of Molecular Microbiology, School of Life Sciences, University of Dundee

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

מחקר זה מתאר מסגרת לפיתוח מודל ביופילם פולימיקרוביאלי מצטבר ואופטימיזציה של פרוטוקול מיצוי RNA כדי להעריך את ביטוי הגן Pseudomonas aeruginosa המשקף את סביבת הריאות של סיסטיק פיברוזיס. היישומים כוללים הערכת השפעות אנטי-מיקרוביאליות וחקר חלופות אנטיביוטיות בתנאים הרלוונטיים לסיסטיק פיברוזיס.

תקציר

שיטות בדיקה פרה-קליניות סטנדרטיות לטיפולים אנטי-מיקרוביאליים חדשניים המשמשים לטיפול בזיהומי ריאות כרוניים באנשים עם סיסטיק פיברוזיס אינן משקפות את התנאים הסביבתיים של נישת הריאות העוינת. תנאי הבדיקה הרדוקציונליסטיים הנוכחיים יכולים להוביל להתקדמות של תרכובות לאורך צינור פרה-קליני ללא עדות לפעילותן בתנאים המתאימים לנישה של סיסטיק פיברוזיס. מספר גישות המשמשות לחקר תרופות אנטי-מיקרוביאליות מסורתיות עשויות שלא להתאים לחלופות אנטיביוטיות, כולל טיפולים נוגדי אלימות כמו חומרי חישה נגד מניין ומעכבי סידרופור. פרוטוקול זה מתעד מודל ביופילם מצטבר של Pseudomonas aeruginosa כדי להשוות עמידות וביטוי גנים רלוונטי לזיהום בתרבויות חד-מינים ורב-מינים (Staphylococcus aureus ו-Candida albicans), תוך בחינת הפחתות ושינויים בביטוי גנים של יחידות יוצרות מושבה (CFU), תוך שימוש ב-algD כדוגמה. המודל מותאם לכמויות קטנות וסטטיות של תרביות חיידקים כדי לאפשר מחקר של תרכובות חדשות בשלב הגילוי של צינור פיתוח התרופות, שבו כמויות התרכובות עשויות להיות מוגבלות. ביופילמים של P. aeruginosa נוצרו במדיום סיסטיק פיברוזיס סינתטי 2 (SCFM2) למשך 24 שעות לפני הטיפול במרופנם בריכוזים שונים (1, 16 ו-256 מיקרוגרם/מ"ל) למשך 24 שעות נוספות. ביופילמים פולימיקרוביאליים הוקמו על ידי גידול סטפילוקוקוס זהוב וקנדידה אלביקנס יחד ב-SCFM2, ולאחר מכן חיסון ב-P. aeruginosa למשך 24 שעות נוספות וטיפול במרופנם. היעדר קשר ישיר בין מדדי יעילות תרכובות בניסויים פרה-קליניים לבין תוצאות ניסויים קליניים הטיל ספק בישימות כלי הסינון המעבדתיים הנוכחיים. מודל זה מאפשר לנו להבין את ההשפעה של גורמים רלוונטיים על ביטוי הגנים P. aeruginosa, כולל גנים התורמים לעמידות ולאלימות, ובכך לגשר על הפער הזה.

מבוא

סיסטיק פיברוזיס (CF) היא ההפרעה האוטוזומלית הרצסיבית הנפוצה ביותר בקרב אוכלוסיות קווקזיות1. מוטציות בגן CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator) גורמות למגוון תסמינים קליניים, כולל ייצור יתר של ריר בדרכי הנשימה. פגיעה בהובלת יונים גורמת להתייבשות רירית זו, וכתוצאה מכך היא אינה מנוקה כראוי על ידי מערכת הרירית, מה שמגביר את הרגישות לזיהומים ריאתיים כרוניים1. המיקרוביולוגיה של ריאת CF מורכבת מקבוצה מובחנת של פתוגנים אופורטוניסטיים, כאשר המופילוס אינפלואנזה וסטפילוקוקוס זהוב נחשבים לאורגניזמים עיקריים המדביקים את הריאות של תינוקות וילדים עם CF, ואחריהם ירידה של אורגניזמים אלה וקולוניזציה לאחר מכן עם Burkholderia spp., או Pseudomonas aeruginosa במהלך הבגרות1,2,3,4. בנוסף למיני חיידקים, מיקרואורגניזמים פטרייתיים נפוצים גם בסביבת הריאות של CF, כאשר Candida spp ו-Aspergillus spp הם בין מיני הפטריות המבודדים הנפוצים ביותר3,4,5. למרות שאורגניזמים אלה ממלאים תפקידים חשובים בזיהומי ריאות CF, התקדמות בטכניקות תרבית ושיטות שאינן תלויות בתרבית הראו כי זיהומי ריאות CF מוגבלים לעתים רחוקות למין חיידק יחיד, ובכך מדגישים את האופי המורכב והרב-מיקרוביאלי של CF lung1,6.

למרות ידע זה, השיטות הנוכחיות in vitro ו-in vivo לפיתוח ובדיקה של אנטיביוטיקה לשימוש בזיהומי ריאה כרוניים חסרות דמיון מלא ל-CF lung niche7, תוך התמקדות בקביעת הריכוז המעכב המינימלי (MIC) של התרופה כנגד תרביות חד-מיניות. זה מספק התייחסות מוגבלת למיקרו-סביבה הזיהומית, שהיא מרכיב מרכזי בפתולוגיה של ריאות CF8. ככזה, שיטות כוללות בדרך כלל גידול של חיידקים כתרביות פלנקטוניות, מצב גידול שככל הנראה אינו משקף את זה של חיידקים בתוך ריאת CF. זה חשוב במיוחד עבור P. aeruginosa, שבדרך כלל מופיע כאגרגטים של ביופילם שלעתים קרובות מכילים בנוסף מיני חיידקים ופטריות אחרים9. גורמים כאלה מהווים אתגרים בעת בדיקת אנטיביוטיקה לזיהומי ריאות כרוניים ומדגישים את הפער בין שיטות בדיקת הרגישות לאנטיביוטיקה לבין הפעילות האנטי-מיקרוביאלית בסביבת הריאות של CF9,10. אתגרים אלה מחמירים בעת סינון חלופות אנטיביוטיות, כגון טיפולים אנטי-אליליים, שבהם מבחני MIC אינם אינדיקטור לפעילות ואינם מספקים הבנה של אינטראקציות מארח-פתוגן11.

אלגינט, פוליסכריד חוץ-תאי, הוא מרכיב מרכזי בביופילמים של P. aeruginosa בנישת הריאות ומגביר את סבילות החיידקים לאנטיביוטיקה ולגורמים חיסוניים, כמו גם משפר את ההידבקות על פני השטח12. אלגינט הוא יעד אטרקטיבי לפיתוח טיפול אנטי-וירולנטי, ופותחו מספר טיפולים המכוונים לביוסינתזה של אלגינט, כגון אלה המכוונים ל-algD, גן מפתח בביוסינתזה של אלגינט13,14. ניתן להשתמש בתרופות כאלה בשילוב עם טיפולים אנטיביוטיים באנשים עם CF כדי לשבש את הביופילם של P. aeruginosa, ולהמיר חיידקים למצב פלנקטוני. זה מגביר את יעילות האנטיביוטיקה, שכן שיבוש של המטריצה החוץ-תאית של הביופילם מאפשר יכולת מוגברת של האנטיביוטיקה להגיע למטרה החיידקית15. עם זאת, למרות עדויות לפעילות חוץ גופית, פעולת הטיפולים הללו בתוך נישת הריאות של CF נותרה לא ברורה.

מודל הביופילם המצטבר המוצג כאן פועל כדי לטפל בבעיות אלה באמצעות הוספת S. aureus ו-C. albicans, שהם מתיישבים נפוצים עם P. aeruginosa בתוך ריאת CF. זה גם מאפשר ל-P. aeruginosa לגדול באגרגטים של ביופילם, כפי שניתן לראות בסביבת הנשימה. השימוש בחומר המחקה כיח סיסטיק פיברוזיס מדיה 2 (SCFM2) כסביבה תזונתית לצמיחה מאפשר תוספת של השפעות מארח, כולל מוצין, DNA חוץ-תאי (e)DNA ופרופיל חומצות אמינו המשחזר את זה שנראה ב-CF lung16.

כדי ללכוד עוד יותר את התנאים של ריאת ה-CF, ביופילמים נחשפים למרופנם, אנטיביוטיקה שנרשמת לעתים קרובות לאנשים עם CF בתקופות של החמרה ריאתית. השימוש באנטיביוטיקה במודל זה מומלץ כאמצעי לשכפול המצבים הקליניים בהם ניתן לרשום חומר אנטי-וירולנטי, למשל, כטיפול משולב בשילוב עם טיפול אנטיביוטי לניהול תסמינים נשימתיים במהלך החמרה. יתר על כן, הכללת מרופנם מאפשרת להעריך את תגובת השעתוק של P. aeruginosa לחשיפה לאנטיביוטיקה בתנאים רלוונטיים לזיהום. מודל זה יכול לשמש כדי לספק מידע על אילו גורמים יהיו מטרות תרופתיות מתאימות בתוך ריאת ה-CF. ניתן גם לתקן את המודל כך שיכלול אנטיביוטיקות רלוונטיות אחרות, כגון טוברמיצין, ולהעריך את הביטוי של גנים אחרים מעניינים.

כאן, נעשה שימוש במודל פולימיקרוביאלי מצטבר זה כדי להעריך את ההשפעות של נוכחות Staphylococcus aureus ו-Candida albicans וריכוזים משתנים של מרופנם (1, 16 ו-256 מיקרוגרם/מ"ל) על ביטוי algD על ידי P. aeruginosa. מרופנם נקבע לטיפול בעיקר בזיהומי ריאות של P. aeruginosa ואין לו השפעה ישירה על S. aureus או C. albicans, כאשר ה-MIC עבור שני המינים הללו הוא >256 מיקרוגרם/מ"ל.

עבודה זו תגביר את ההבנה כיצד גורמים רלוונטיים, כגון גורמים מארחים בתוך SCFM2 ומיקרואורגניזמים שמתיישבים במשותף, יכולים להשפיע על הביטוי של גנים רלוונטיים לזיהום P. aeruginosa ותספק את היסודות לפיתוח ובדיקה של טיפולים אנטי-וירולנטיים לשימוש בזיהומים כרוניים בדרכי הנשימה של CF.

פרוטוקול

1. הכנת ביופילמים של מין יחיד

  1. החיו את P. aeruginosa PAO1 מתרביות מלאי חרוזים קפואים על ידי פס חרוז בודד על אגר מרק ליזוגני (LB) ודגירה למשך 24 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
  2. הכן תרביות לילה של PAO1 על ידי לקיחת מושבה בודדת מצלחת הפסים והוספתה למדיום LB של 5 מ"ל. דגירה למשך הלילה (18 שעות) ואז לדלל ל-OD600 של 0.05 (שווה ערך ל-1 x 108 CFU/mL), ולדלל עוד יותר 1:100 ב-SCFM2 שהוכן על פי פאלמר, ואחרים 16.
  3. הוסף 180 מיקרוליטר של החיסון לבארות של צלחת מיקרוטיטר עם תחתית עגולה של 96 בארות. להכין ביופילמים במשולש ביולוגי לספירה על ידי יחידות יוצרות מושבה (CFUs). בסך הכל מבוצעים 3 שכפולים לכל שכפול ביולוגי עבור qPCR בלבד. ל-3 בארות נפרדות, הוסף 180 מיקרוליטר של SCFM2 סטרילי שישמש לבקרות המדיה.
    הערה: לוחות תחתונים עגולים נבחרו בניגוד ללוחות תחתונים שטוחים מסורתיים בשל עליונותם לאפשר חשיפה הומוגנית של הביופילם כולו לאמצעי הגידול הסובבים17.
  4. אפשרו לביופילמים להיווצר במשך 24 שעות, דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ורעידות במהירות של 75 סל"ד.

2. הכנת ביופילמים רב-מינים

  1. להחיות את P. aeruginosa PAO1 ו- S. aureus SH1000 מתרביות מלאי חרוזים קפואות כמתואר לעיל. החיו את C. albicans CAF2.1 מתרביות מלאי חרוזים קפואים על ידי פס חרוז בודד על אגר דקסטרוז Saboraud ודגירה למשך 24 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
  2. הכינו תרביות לילה של SH1000 ו-CAF2.1 על ידי לקיחת מושבה אחת מצלחת הפסים והוספת 5 מ"ל LB (תרביות לילה נפרדות לכל אורגניזם). דגירה למשך הלילה למשך 18 שעות. תקנן תרביות לילה של S. aureus SH1000 ו-C. albicans CAF2.1 בערכי LB ל-OD600 של 0.1, השווה ל-1 x 109 ו-1.2 x 107 CFU/mL, בהתאמה17,18.
  3. לדלל את S. aureus ו-C. albicans ליצירת חיסון יחיד המכיל את שני המינים בריכוזים של 1 x 106 ו-1 x 105 CFU/mL, בהתאמה, ב-SCFM2.
  4. הוסף 162 מיקרוליטר של החיסון לבארות של צלחת מיקרוטיטר של 96 בארות. חיסון ביופילמים במשולש ביולוגי לספירה על ידי יחידות יוצרות מושבה (CFUs). בסך הכל מבוצעים 3 שכפולים לכל שכפול ביולוגי עבור qPCR בלבד. ל-3 בארות נפרדות, הוסף 180 מיקרוליטר SCFM2 סטרילי שישמש לבקרות המדיה.
  5. אפשרו לביופילמים להיווצר במשך 24 שעות, דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס וניעור ב-75 סל"ד.
  6. הכינו תרבית לילה של PAO1 על ידי לקיחת מושבה בודדת מצלחת הפסים והוספתה ל-5 מ"ל של מדיום LB. דגירה למשך הלילה (18 שעות), ואז להוסיף ב-OD600 של 0.05 (שווה ערך ל-1 x 108 CFU/mL), ולדלל עוד יותר ל-1 x 105 CFU/mL ב-SCFM2.
  7. הוסף 14.2 מיקרוליטר של חיסון PAO1 לבארות של צלחת המיקרוטיטר של 96 בארות, וכתוצאה מכך החיסון הסופי של PAO1 הוא 1 x 104 CFU/mL.
    הערה: שונות זו בריכוז החיסון בין המינים השונים נועדה להבטיח ש-S. aureus ו-C. albicans לא יוכרעו על ידי P. aeruginosa וכולם ניתנים לשחזור על ידי ציפוי נקודתי מהביופילם של 24 שעות שבו אין אנטיביוטיקה.
  8. אפשרו לביופילמים הפולימיקרוביאליים להיווצר במשך 24 שעות, דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ורעידות ב-75 סל"ד.

3. DNA וטיפול אנטיביוטי בביופילמים חד-מינים ורב-מינים

  1. הוסיפו 2 מיקרוליטר של DNase I ישירות לבארות המכילות את הביופילמים בריכוז סופי של 50 מיקרוגרם/מ"ל, דגרו למשך שעה אחת ב-37 מעלות צלזיוס ונערו ב-75 סל"ד.
    הערה: זה מתווסף כדי לדלל את הביופילמים הצמיגים כדי לאפשר חדירה טובה יותר של אנטי-מיקרוביאלים, המשקף את המינון של rhDNase (DNA אנושי רקומביננטי) הנלקח על ידי אנשים רבים עם סיסטיק פיברוזיס כאסטרטגיית טיפול בהחמרות ריאתיות.
  2. הכינו מלאי אנטיביוטיקה של מרופנם ל-2.56 מ"ג/מ"ל, תוך שימוש במים מזוקקים כמדלל. יש לדלל באופן סדרתי בפקטור של 2 כדי להשיג ריכוזים של 0.01 מ"ג/מ"ל - 2.56 מ"ג/מ"ל.
  3. הוסף 20 מיקרוליטר מכל דילול מרופנם לביופילם כדי להשיג טווח מינון של 1 מיקרוגרם/מ"ל - 256 מיקרוגרם/מ"ל. הוסף 20 מיקרוליטר של מים מזוקקים לביופילם בקרה שלילית במקום האנטיביוטיקה.
  4. אטמו את צלחת המיקרוטיטר של 96 בארות עם סרט שקוף ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות, תוך רעידה ב-75 סל"ד.

4. ספירת תאים ברי קיימא ופעילות מטבולית

הערה: השלבים הבאים מיועדים לביופילמים המיועדים לכימות CFU בלבד.

  1. הוסף 10 מיקרוליטר צלולאז (100 מ"ג/מ"ל, 0.05 M ציטראט) לביופילם ודגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה, תוך ניעור ב-140 סל"ד. צלולאז משמש באופן קבוע לשיבוש שלדי התאית בתוך ביופילמים19,20,21. משבשים עוד יותר את הביופילמים על ידי פיפטינג למעלה ולמטה במידת הצורך עד שלא נמצאים גושים נראים לעין.
  2. הוסף 10 מיקרוליטר של תמיסת רזזורין 0.02% כדי להעריך את הפעילות המטבולית של ביופילמי הבדיקה ולשלוט בביופילמים ולדגור ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעה, תוך רעידות ב-140 סל"ד.
  3. מדוד את הקרינה של כל באר באמצעות אורך גל עירור של 540 ננומטר ואורך גל פליטה של 590 ננומטר בקורא המיקרו-פלטות.
  4. תקן עבור פלואורסצנטי ברקע על ידי הפחתת ערכי הקרינה מדגימות המדיה הריקות וחישוב אחוז ההפחתה כ (ממוצע שלביופילם שטופל באנטיביוטיקה F /בקרה שלילית ממוצעת F) x 100%.
  5. ספרו את תכולת הבארות, המכילות הן את הביופילמים המופרעים והן את התאים הפלנקטוניים, על ידי דילול סדרתי וציפוי נקודתי על אגר סלקטיבי כדלקמן:
    אגר סלקטיבי של Pseudomonas בתוספת 1% גליצרול ותוסף CN לספירת P. aeruginosa
    אגר מלח מניטול לספירת S. aureus |
    פפטון שמרים דקסטרוז אגר בתוספת פניצילין (250 יחידות למ"ל), סטרפטומיצין (250 מיקרוגרם/מ"ל), גנטמיצין סולפט (30 מיקרוגרם/מ"ל) וונקומיצין (3 מיקרוגרם/מ"ל) לספירת C. albicans.
    הערה: כל תכולת הבארות נספרת בשל האתגרים של הפרדת הביופילם המצטבר הצף מהתאים הפלנקטוניים. עם זאת, גישה זו משקפת בצורה מדויקת יותר את התנאים הקיימים בריאה של סיסטיק פיברוזיס. עיבוי עשוי להיות נוכח על המכסה לאחר הדגירה. כדי להבטיח שאין זיהום בין בארות, צלחת נקודתית את הפקדים הסטריליים על אגר סלקטיבי.
  6. לאחר ציפוי נקודתי על האגר הסלקטיבי, דגרו את הלוחות למשך 24 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס לפני הספירה.

5. הכנת ביופילמים למיצוי RNA

הערה: כל השלבים מנקודה זו ואילך מיועדים לביופילמים המיועדים לניתוח RT-qPCR בלבד.

  1. הסר את צלחת המיקרוטיטר בת 96 הבארות המכילה את הביופילמים מהחממה של 37 מעלות צלזיוס והעביר אותם לצינור מיקרו-צנטריפוגה של 1 מ"ל. בעת ההעברה, ודא ששכפולי הביופילם מאוגדים עבור כל חזרה ביולוגית שבוצעה. זה מבטיח שיש מספיק ביומסה למיצוי RNA.
  2. צנטריפוגה של צינורות 1.5 מ"ל המכילים את הביופילמים ב-16,000 x גרם למשך 5 דקות. אם מבצעים את מיצוי ה-RNA באותו יום, המשך לשלב 6.2.1. אם מיצוי RNA לא מתבצע באותו יום, הסר את הסופרנטנט ואחסן את הגלולה ב-250 מיקרוליטר של תמיסת ייצוב RNA ב-20 מעלות צלזיוס. תמיסה זו שימשה לאחסון כדורי חיידקים במספר מחקרים22,23.

6. מיצוי RNA

  1. חלץ RNA חיידקי ביופילמים חד-מינים ורב-מינים באמצעות ערכה מסחרית. הכן את המאגרים לפי הוראות היצרן.
  2. הסר את התרבות העליונה והשליך אותה. אם הגלולה אוחסנה בתמיסת ייצוב, יש להפשיר אותה לטמפרטורת החדר ולצנטריפוגה ב-16,000 x גרם למשך 5 דקות. השעו מחדש את הגלולה ב-600 מיקרוליטר של מגיב מיצוי RNA, ולאחר מכן שבשו אותה ידנית באמצעות מחט 0.2 מ"מ המחוברת למזרק של 2 מ"ל (שאפו 5x-10x או עד שהגלולה מופרעת לחלוטין).
  3. בצע את שלבי טיהור ה-RNA לפי ההוראות בהנחיות היצרן.
  4. כמת את ה-RNA באמצעות ספקטרוסקופ UV, ערכת בדיקת RNA BR וצינורות. הגבולות הניתנים לזיהוי של RNA באמצעות ערכת הבדיקה הם 10 - 1200 ננוגרם/מיקרוליטר, ולכן התפוקה המינימלית המקובלת של RNA עבור פרוטוקול זה היא 10 ננוגרם/מיקרוליטר.
    1. הגדר את מספר הצינורות הנדרש לדגימות ותקנים (נדרשים 2 תקנים).
    2. הכן את פתרון העבודה על ידי הוספת 199 מיקרוליטר של מאגר ו-1 מיקרוליטר של מגיב למספר דגימות (+ 2 תקנים ו-2 לשגיאה).
    3. הוסף 190 מיקרוליטר של תמיסת עבודה ו -10 מיקרוליטר של תקן 1 ותקן 2 לצינורות נפרדים.
    4. הוסף 199 מיקרוליטר של תמיסת עבודה ו -1 מיקרוליטר של דגימת RNA לצינורות נפרדים. מערבולת למשך 30 שניות ואז מאחסנים במקום חשוך למשך 5 דקות.
    5. בפלואורומטר, בחר RNA > RNA רחב טווח ופעל לפי ההוראות.
    6. העריכו את איכות ה-RNA באמצעות ספקטרופוטומטר. רוקן את הספקטרופוטומטר על ידי פיפטינג של 1 מיקרוליטר של מים נטולי DNase/RNase על הספקטרופוטומטר. נגב את המים באמצעות מגבון נטול מוך והגדר את יחס הספיגה ל-260/280 ננומטר. פיפטה 1 מיקרוליטר של RNA על הספקטרופוטומטר. אם ה-RNA טהור, ייצפה שיא בודד בין 260 ל-280 ננומטר, ויוצג יחס של ~ 2.0.
  5. המרת RNA שחולץ ל-DNA משלים (cDNA) באמצעות ערכת סינתזה של cDNA. עבור כל דגימות RNA העולות על 50 ננוגרם/מיקרוליטר, יש לדלל תחילה ל-50 ננוגרם/מיקרוליטר באמצעות מים נטולי DNase/RNase.
    1. בעזרת צינורות, הכינו את תערובת תגובת ה-cDNA לפי טבלה 1.
    2. הנח את הצינורות במחזור תרמי בתנאים הבאים: 25 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, 42 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, 85 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.

7. qPCR

  1. בצעו את ה-qPCR באמצעות qPCR Master Mix. השתמש בפריימרים הבאים של algD וגן משק בית (16S) (טבלה 2).
    הערה: הפריימרים תוכננו באמצעות הכלי המקוון NCBI-primer Blast בהתייחס לכל רצף הגנום של P. aeruginosa, ולאחר מכן סונתזו באמצעות ספק מסחרי. הפריימרים אומתו לספציפיות בביופילמים הפולימיקרוביאליים באמצעות התאמת רצף באמצעות כלי NCBI-primer Blast.
  2. לדלל את הפריימרים ל-4 מיקרומטר (4 pm/μL) על ידי דילול 20 מיקרוליטר של פריימר ב-480 מיקרוליטר של מים נטולי DNase/RNase. ניתן להקפיא אותם לשימושים מרובים.
  3. הכן את תמיסת העבודה של תערובת המאסטר qPCR לפי ההוראות בטבלה 3.
    הערה: פתרון העבודה של algD מכיל מספיק פתרון לחזרות ביולוגיות פי 3 וחזרות טכניות פי 3 לכל ריכוז מרופנם, בקרות שליליות פי 6 ושגיאה פי 2. פתרונות העבודה של 16S מכילים מספיק פתרון לסטנדרטים של פי 2 של ריכוז RNA ידוע ושגיאה פי 2.
  4. הוסף 18 מיקרוליטר של תמיסת עבודה algD לצינורות התגובה המתאימים של qPCR. זה יכלול בסך הכל 36 צינורות לניתוח ביטוי algD ו-6 צינורות לבקרות שליליות.
  5. הוסף 2 מיקרוליטר של RNA לכל אחד מצינורות התגובה qPCR או 2 מיקרוליטר של מים ללא DNase/RNase לבקרים השליליים.
  6. הוסף 18 מיקרוליטר של תמיסת עבודה 16S לצינורות התגובה המתאימים של qPCR. זה יכלול בסך הכל 2 צינורות. הוסף 2 מיקרוליטר של RNA בריכוז ידוע לצינורות התגובה qPCR.
  7. בצע את ה-qPCR בהתאם לתנאים הבאים: 2 דקות ב-95 מעלות צלזיוס, 15 שניות ב-95 מעלות צלזיוס (40 מחזורים), דקה אחת ב-60 מעלות צלזיוס.
  8. נתח את תוצאות ה-qPCR באמצעות שיטת 2-ΔΔCt, כפי שתואר קודם לכן24. בעת ניתוח ביטוי algD, השתמש בביטוי algD ב-0 מיקרוגרם/מ"ל כבקרה עבור קומפוזיציות הביופילם המתאימות ושקול ביטוי שינוי קיפול רלוונטי לתרביות לא מטופלות

תוצאות

התוצאות המוצגות ב-איור 1A מדגישות את העמידות של ביופילמים של מין בודד של Pseudomonas כאשר הם נחשפו לטיפול במרופנם, שכן לא נצפתה ירידה משמעותית באף אחד מהמינונים שנבדקו. הביקורת השלילית, שלא נחשפה למרופנם, הראתה התאוששות של 8.31 ± 0.07 Log10CFU/mL, בעוד שההפחתה הגדולה ביותר של תאים חיוניים התרחשה בריכוז של 16 µg/mL, שהביאה להתאוששות של 8.06 ± 0.10 Log10CFU/mL. עם זאת, רמה זו של עמידות היא צפויה, שכן בספרות הראו ביופילמים של P. aeruginosa עמידות גבוהה בהרבה למרופנם מאשר המקבילים הפלנקטוניים שלהם, כאשר הריכוז הנדרש כדי להיות בקטריצידי נגד הביופילמים הוא >256 µg/mL25,26, בהשוואה לתאים הפלנקטוניים, שיש להם MIC של 2 µg/mL.

איור 1B מציג את אחוז ההפחתה הממוצע בפעילות המטבולית של ביופילמים של P. aeruginosa בתרבית אחת עבור כל ריכוז של אנטיביוטיקה בהשוואה לביופילם הביקורת, שלא נחשף למרופנם. הפחתה בפלואורסצנציה מתרגמת לפעילות מטבולית מופחתת, המשמשת כמדד להפחתה במספר התאים החיוניים. תרביות שטופלו במרופנם הראו פעילות מטבולית מוגברת (מסומנת כאחוז הפחתה שלילי), מה שמעיד על היעדר פעילות בקטריצידית (או פעילות מוגבלת מאוד).

הפעילות המטבולית המוגברת ללא עלייה בהשבת CFU עשויה להצביע על התגובה המטבולית של החיידקים לחשיפה לאנטיביוטיקה. בין הביופילמים של המין הבודד לבין אלה של מספר מינים (איור 2), הצמיחה הכוללת של P. aeruginosa נבדלה רק באופן קל, כאשר השבת תאים חיוניים מהביופילם של המין הבודד הייתה גבוהה ב-0.74 ± 0.17 Log10CFU/mL מזו שנצפתה בביופילם הפולימיקרוביאלי כאשר לא נכחה אנטיביוטיקה. S. aureus ושב מהביופילם הפולימיקרוביאלי בריכוז של 6.95 ± 0.11 Log10CFU/mL, ו-C. albicans ושב בריכוז של 1.66 ± 2.88 Log10CFU/mL. עם זאת, C. albicans נמצא רק במקומות שבהם לא התווסף meropenem ולא ושב מאף ביופילם שבו ניתןה האנטיביוטיקה. מכיוון של-meropenem אין השפעה ישירה על Candida, כפי שהוכח במבחני MIC קודמים שנערכו במעבדה על מונוקלטורה של C. albicans שבה ערך ה-MIC של meropenem היה >256 µg/mL, סביר להניח שתגובת העקה הבקטריאלית של המינים האחרים השוהים יחד, S. aureus ו-P. aeruginosa, לחשיפה לאנטיביוטיקה היא שיוצרת תנאים עוינים עבור הפטרייה.

כיוון שביופילמים של P. aeruginosa, הן בתרבית בודדת והן עם פתוגנים המקולנזים יחד, אינם מראים ירידה בהשבת תאים חיוניים בריכוזי meropenem של עד 256 µg/mL, הדבר מדגיש את הצורך בטיפולים חלופיים, כגון טיפולים אנטי-וירולנטיים, למאבק בזיהומים כרוניים כאלה בקליניקה, אשר עשויים לפעול בשילוב עם חומרים אנטי-מיקרוביאליים כדי להפחית ביעילות את העומס החיידקי.

algD ביטוי ב- *P. aeruginosa* ביופילמים של מין בודד PAO1
הביטוי של algD ב- *P. aeruginosa* PAO1 שנחשפה לריכוזים שונים של meropenem (1, 16 ו- 256 µg/mLשגודלו ב-SCFM2, נבחנה באמצעות SYBR-Green RT-qPCR. לאחר מכן נותח הביטוי באמצעות שיטת 2-ΔΔCt, כאשר 16S שמש כגן הביקורת (איור 3). הביטוי של algD לא נבדל באופן מובהק בין ריכוזי המרופנם שבהם נעשה שימוש, מה שמרמז כי כאשר גדל כביופילם של מין יחיד, PAO1 algD הביטוי אינו מושפע באופן משמעותי מנוכחותו של meropenem.

ביטוי של algD בביופילמים רב-מיניים של P. aeruginosa PAO1
ביטוי ה- algD נבחן גם ב- P. aeruginosa PAO1 שגודל בביופילמים המורכבים מ- S. aureus SH100 ומ- C. albicans CAF2.1, כדי לבחון האם נוכחותם של אורגניזמים המקולנזים יחד השפיעה על ביטוי ה- algD או על התגובה למרופנם ב-PAO1. לא נצפו הבדלים משמעותיים בביטוי ה- algD בחשיפה למרופנם בריכוזים של 0-16 µg/mL. עם זאת, בריכוז של 256 µg/mL, ביטוי ה- algD היה גבוה באופן משמעותי בהשוואה לריכוזי האנטיביוטיקה האחרים (0 µg/mL לעומת 256 µg/mL p = 0.0075, 1 µg/mL לעומת 256 µg/mL p = 0.035, 16 µg/mL לעומת 256 µg/mL p = 0.0048), עם עלייה של פי 7 בקירוב בהשוואה לתנאי הביקורת (איור 4). נתון זה מדגיש כי כאשר הוא גדל בנוכחות של S. aureus ו- C. albicans, קיים ביטוי מוגבר של algD בריכוז הגבוה ביותר של מרופנם, בהשוואה למצב שבו P. aeruginosa גדל לבדו, מה שמרמז על עלייה בייצור אלגינאט בסביבה פולימיקרוביאלית. למרות הוכחת הבדלים בביטוי ה- algD בין הביופילמים החד-מיניים לרב-מיניים, לא ברור אם עלייה זו בביטוי מונעת על ידי נוכחותו של מין ספציפי (S. aureus או C. albicans) או אם אינטראקציות המערבות את שני המיקרואורגניזמים הן המניעות את השינוי בביטוי הגן.

תוצאות אלו מדגישות את החשיבות של הבנת ההשפעה של טיפולים תרופתיים ושל הסביבה על ביטוי גנים, במיוחד בהקשר של בדיקות עתידיות של טיפולים המכוונים נגד ארגניות (virulence).

תרשימי עמודות של עיכוב צמיחה בקטריאלית עבור P. aeruginosa, S. aureus ו-C. albicans לעומת ריכוז.
איור 1ביופילמים של מין בודד המורכבים מ- Pseudomonas aeruginosa PAO1את הביופילמים גידלו במשך 24 שעות ב-SCFM2, וטיפלו בהם ב- 50 µg/mL ב-DNase I למשך שעה אחת, וטופלו ב-meropenem בריכוזים שונים למשך 24 שעות נוספות.Aממוצע לוגריתמי10CFU/mL. הקו המקווק מציין הפחתה של 2-log (שווה ערך להפחתה של 99%) ב- *P. aeruginosa* התאוששות מהביקורת השלילית. (B(%) הפחתה ביחידות פלואורסצנציה יחסיות. הקו המקווק מסמן הפחתה של 50% בפלואורסצנציה, כאשר הנקודה הראשונה שמעליו נחשבת לערך ה-MIC50. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

ריכוז Meropenem לעומת צמיחה בקטריאלית (A) וירידה בפלואורסצנציה (B) בגרפים.
איור 2ביופילמים רב-מיניים המורכבים מ- Pseudomonas aeruginosa PAO1, Staphylococcus aureus SH1000, ו- Candida albicans CAF2.1הביופילמים גודלו במשך 24 שעות ב-SCFM2, ועובדו עם 50 µg/mL ב-DNase I למשך שעה אחת, וטופלו במרופנם (meropenem) בריכוזים שונים למשך 24 שעות נוספות. הקו המקווקס מציין הפחתה של 2-log (שווה ערך להפחתה של 99%) ב- *P. aeruginosa* התאוששות מהביקורת השלילית. המובהקות נקבעה באמצעות ANOVA דו-כיווני שבו **** p < 0.0001. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מורחבת של איור זה.

גרף עמודות של ביטוי יחסי לעומת ריכוז (µg/ml), המראה תוצאת ניתוח סטטיסטי (ns).
איור 3: ביטוי של algD שחולץ ממין בודד המורכב מ-P. aeruginosa PAO1. הביופילמים תורבדו במשך 24 h ב-SCFM2, טופלו ב-50 µg/mL DNase I למשך 1 h, ונחשפו לריכוזים שונים של meropenem (0, 1, 16, 256 µg/mL). ביטוי הגנים נותח באמצעות שיטת 2-ΔΔCt. הגן של בית החרושת 16S שימש בניתוח. המובהקות נקבעה באמצעות מבחן השוואות מרובות של Tukey. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

תרשים עמודות של ביטוי יחסי לעומת ריכוז; מובהקות סטטיסטית; ניתוח ביטוי גנים.
איור 4: ביטוי של algD שחולץ מביופילמים רב-מינאיים המורכבים מ-P. aeruginosa PAO1, S. aureus SH1000, ו-C. albicans CAF2.1. הביופילמים גודלו ב-SCFM2, טופלו ב-50 µg/mL DNase I למשך שעה אחת, וטופלו במרופנם בריכוזים שונים (0, 1, 16, 256 µg/mL) למשך 24 שעות נוספות. ביטוי הגנים נותח באמצעות שיטת 2-ΔΔCt. הגן הפנימי 16S שימש בניתוח. **p < 0.01 כפי שנקבע על ידי מבחן השוואות מרובות של Tukey. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

נפח לכל תגובת cDNA (μL)
5X iscript Reaction mix4
iscript Reverse Transcriptase1
מים נקיים מ-DNase/RNase14
2.5ng RNA1
נפח תגובה כולל20

טבלה 1: תמיסות עבודה של תערובת מאסטר ל-cDNA. רכיבים ונפחים הנדרשים לכל תגובת cDNA.

גןפריימר קדמיפריימר הפוך
algDCGCCGAGATGATCAAGTACATGTAGTAGCGCGACAGGTTG
16SACCGCATACGTCCTACGGCGAAGACCTTCTTCACACACG

טבלה 2: algD ו-16S פריימרים קדמיים ואחוריים ל-qPCR.

נפח לתגובה (µL)algD נפח עבודה (µL)16S נפח עבודה (µL)
GoTaq qPCR Master Mix (2X)1044040
פריימר קדימה1444
פריימר הפוך1444
מים נקיים מ-DNase/RNase626424
סה"כ 1879272

טבלה 3: תמיסות עבודה של qPCR master mix. רכיבים ונפחים הנדרשים עבור תמיסות ה-qPCR master mix של algD ו-16S.

נספחים איור 1ביופילמים רב-מיניים המורכבים מ- Pseudomonas aeruginosa LESB58, Staphylococcus aureus SH1000, ו- Candida albicans CAF2.1. הביופילמים גודלו במשך 24 שעות (n = 3) ב-SCFM2, ועובדו באמצעות 50 µg/mL ב-DNase I למשך שעה אחת, ועובדו עם meropenem בריכוזים שונים למשך 24 שעות נוספות. הקו המקווקס מציין הפחתה של 2-log (שווה ערך להפחתה של 99%) ב- *P. aeruginosa* התאוששות מהביקורת השלילית. ניתוח סטטיסטי בוצע באמצעות ANOVA דו-כיווני. *p=0.0242, ** p=0.0013, **** p <0.0001. אנא לחצו כאן להורדת איור זה.

דיון

תוצאות אלה מראות כי למרות השימוש התכוף בו בניהול החמרות ריאתיות אצל אנשים עם CF, מרופנם לא השפיע באופן משמעותי על צמיחת P. aeruginosa במודל הביופילם החד-מיני או הרב-מיני. עלייה קלה בהתאוששות P. aeruginosa נצפתה בשני המודלים לאחר טיפול ב-128 מיקרוגרם/מ"ל ו-256 מיקרוגרם/מ"ל מרופנם, כפי שנראה גם עבור S. aureus בביופילם הרב-מיני; עם זאת, עליות אלה לא היו משמעותיות. הירידה ב-C. albicans כאשר נחשף למרופנם עשויה לנבוע מתנאים עוינים לפטרייה שנוצרת על ידי החיידקים בתגובה ללחץ של האנטי-מיקרוביאלי. לא נצפו הבדלים משמעותיים בביטוי algD בין ריכוזי מרופנם כאשר P. aeruginosa גדל כביופילם של מין יחיד. עם זאת, ביטוי אלגינט היה גבוה משמעותית בביופילמים מרובי מינים כאשר טופלו במרופנם של 256 מיקרוגרם/מ"ל, מה שמצביע על כך שייצור האלגינט עשוי להיות מוגבר בתנאים אלה. ההבדלים בביטוי algD שנצפו בין הרכבי ביופילם וריכוזי מרופנם מראים כיצד נוכחותם של גורמים רלוונטיים יכולה להשפיע על ביטוי גנים רלוונטיים לזיהום ומדגישים את החשיבות של התחשבות בשימוש באנטיביוטיקה ומצב זיהום פולימיקרוביאלי בעת פיתוח ובדיקה של חלופות אנטיביוטיות.

למרות התועלת של הדגמים, ישנם מספר שיקולים כדי להבטיח יישום מוצלח. התבססותם של S. aureus ו-C. albicans בתוך הביופילמים חיונית לפני הדבקה ב-P. aeruginosa, בשל הסיכונים של S. aureus ו-C. albicans להתחרות ב-Gram שלילי. במודל ביופילם זה, נראה כי C. albicans הוא שותף גרוע בשל שיעורי ההישרדות הנמוכים משמעותית שלו בהשוואה ל-S. aureus ו-P. aeruginosa, אפילו בהיעדר אנטיביוטיקה. זה מצביע על כך שהשמרים מתחרים על משאבים או מושפעים לרעה מאינטראקציות בין מינים בתוך הביופילם27,28. היעדר C. albicans בנוכחות מרופנם, למרות שלאנטיביוטיקה אין פעילות אנטי-פטרייתית ישירה, תומך ברעיון שתגובת הלחץ של S. aureus למרופנם עשויה ליצור סביבה שאינה מסבירת פנים ל-C. albicans29,30. עם זאת, חשוב לציין שלבחירת הזן יכולה להיות השפעה על כמות C. albicans שניתן לשחזר ממודל הביופילם הפולי-מיקרוביאלי. מגמות שונות נצפות כאשר משתמשים ב-P. aeruginosa LESB58 במקום PAO1 (איור משלים 1). עם LESB58, C. albicans ניתן לשחזור בכל ריכוזי המרופנם ולמעשה מראה עלייה קלה ככל שריכוז ה-P. aeruginosa יורד כתוצאה מהאנטי-מיקרוביאלי, מה שמאפשר להרכב הקהילה להשתנות. עם זאת, למרות ההבדלים הללו, נעשה שימוש ב-PAO1 במודל זה בשל היותו זן ייחוס מעבדתי, המספק בסיס עקבי ומאופיין היטב למחקרים השוואתיים. עקביות זו חיונית לשחזור ולהסקת מסקנות מהימנות לגבי האינטראקציות בתוך הביופילם.

זה יכול להיות מאתגר להפיק כמויות גדולות של RNA מחיידקים הגדלים ב-SCFM2, בשל האופי הצמיג של המדיה. לכן, שיבוש הביופילם במחטים של 0.2 מ"מ לפני מיצוי RNA הוא צעד חשוב להגדלת תפוקת ה-RNA ולהבטיח מיצוי ריכוזים מספיקים (≥10 ננוגרם/מיקרוליטר) עבור RT-qPCR. RNA רגיש מאוד לפירוק31, לכן לאחר המיצוי, ודא שכל הפעילויות במורד הזרם המשתמשות ב-RNA מבוצעות על קרח. הקפאה קבועה של פריימרים RNA, cDNA ו-qPCR עלולה להגביר את הסבירות להתדרדרות המוצר. לכן, יש להגביל אותו ככל האפשר. אתגר נפוץ נוסף ביישום מודלים אלה הוא הסיכון לזיהום במהלך מיצוי RNA או בדיקת qPCR. ניתן למזער סיכון זה על ידי ריסוס ציוד בתמיסת פירוק DNA לפני מיצוי RNA ועל ידי שימוש בקצות פיפטה ללא DNase/RNase לאורך כל ההליך. החלפה קבועה של מים נטולי DNase/RNase תעזור גם להפחית את הסיכון לזיהום בבדיקת qPCR.

פרוטוקול זה בחר להתמקד באלgD כגן המעניין בשל נחיצותו בייצור אלגינט, המתואר כגורם אלימות מרכזי של P. aeruginosa במהלך זיהומים חריפים וכרונייםכאחד 32. לפיכך, אלגינט נחקר יותר ויותר כמטרה לטיפולים אנטי-וירולנטיים33,34. למרות שמודל זה שימש להערכת הביטוי של algD, ניתן ליישם אותו כדי להעריך את הביטוי של גנים אחרים של P. aeruginosa עבור מטרות שונות של תרופות אנטי-אלימות. מרופנם שימש במחקר זה בשל עדויות המצביעות על כך שהאנטיביוטיקה משפיעה על ביטוי גנים של ביוסינתזה של אלגינט, במיוחד כאשר P. aeruginosa גדל בנוכחות C. albicans35. יתר על כן, מרופנם נרשם לעתים קרובות קלינית לטיפול וניהול זיהומים בדרכי הנשימה של P. aeruginosa, מה שמדגיש את השימוש הרלוונטי שלו במודל זה36. עם זאת, תוספת של אנטיביוטיקות שונות, או אפילו טיפולים כפולים, אפשרית גם עם מודלים אלה. שילוב אנטיביוטיקה במודל זה יאפשר גם להשתמש במודל זה לחקר שינויים אבולוציוניים במנגנוני עמידות חיידקים, כגון התפתחות עמידות בתיווך פורין על ידי P. aeruginosa לקרבפנמים37. ניתן להתאים את מודל הביופילם הפולי-מיקרוביאלי הזה כך שיכלול מינים רלוונטיים אחרים, למשל חיידקים קומנסליים כגון Rothia sp. ו-Streptococcus sp. או להחליף אותו בחיידקים אחרים הגורמים לזיהום כגון Aspergillus sp. כדי לשקף את הדרישות של התרופה המועמדת הנבדקת.

מודלים של ביופילם פולימיקרוביאלי המחקים את ריאת CF פותחו בעבר38. המודל המתואר כאן מתבסס על עבודות קודמות במטרה להגדיל את התפוקה על ידי שימוש במערך המתאים לתרביות מיקרוביאליות בנפח קטן. זה יתרון לבדיקת תרכובות חדשות שבהן החומר הזמין עשוי להיות מוגבל. מכיוון שהמודל הוא בקנה מידה קטן וסטטי, ניתן לגדל את הביופילמים בזמינות חמצן שונה כדי לשקף מקרוב יותר את הסביבה המיקרואירופילית בריאות39,40. כדי להקל על השחזור ומטעמי עלות-תועלת, הביופילמים שדווחו במחקר זה גודלו באופן אירובי.

למרות התובנות החשובות שהתקבלו ממחקר זה, יש להכיר במספר מגבלות. ראשית, היעדר תאי מארח מגביל את התועלת שלו לחקר גורמי אלימות שיש להם מטרה תאית ישירה ליונקים. זה מתאר את האתגרים של הקמת מודלים במבחנה המתאימים לחקר גורמי אלימות ומדגיש את הצורך בפיתוח נוסף של מודלים המשכפלים את הסביבה העוינת של זיהומים כרוניים. יתר על כן, למרות שנחשב לגורם אלימות, אלגינט הוא מאפיין מרכזי של ביופילמים ומיוצר על ידי P. aeruginosa הן במעבדה והן בסביבה. שימוש במודלים במבחנה לחקר חומרים אנטי-ביופילמים עשוי להיות פחות מאתגר משימוש במודלים לחקר טיפולים אנטי-אלימים אחרים, כגון חומרים אנטי-אקסוטוקסינים, שבהם למטרה יש השפעה ישירה על תאים אוקריוטיים41.

בעוד שהבחירה בזן P. aeruginosa של PAO1 מתאימה לשחזור וסטנדרטיזציה של מודל המבחנה , ייתכן שרצוי לכלול מבודדים מזיהום כרוני. ניסויים עתידיים במודל זה עם זן מבודד מדגימות חולים יבוצעו כדי לבחון את ההשפעה של אנטי-מיקרוביאלים על זנים המותאמים לנישה הנשימתית.

השימוש ב-SCFM2 כחיקוי כיח במודל מבחנה זה מאפשר תצפית סטנדרטית וניתנת לשכפול של השינויים ההתנהגותיים של ביופילמים מצטברים שגודלו בסביבה רלוונטית לדרכי הנשימה במהלך הטיפול האנטיביוטי. SCFM2 נבחר על פני הגרסה המקורית של SCFM בשל הכללת DNA חוץ-תאי (eDNA) ומוצין, שהם גורמים חשובים בתמיכה ביצירת ביופילמים. עם זאת, חשוב לציין שקיימות גם גרסאות אחרות של אמצעי הליחה הסינתטיים, כגון SCFM3, המכיל חומצה p-אמינו-בנזואית, NAD+, אדנין, גואנין, קסנטין והיפוקסנטין42, ו-SCFM4, שהיא גרסה חסרת ברזל. יתר על כן, השימוש באמצעי כיח סינתטיים, כגון סיסטיק פיברוזיס מדיה ריאתית (CFLM) וסיסטיק פיברוזיס סינוס מדיה (CFSM), שפותחו על ידי רוהלואל ועמיתיו43, יאפשר מידור של דרכי הנשימה כדי לדמיין את ההתנהגות וההשפעה של טיפולים אנטי-וירולנטיים על ביופילמים פולימיקרוביאליים בסביבות שונות.

בעוד ש-AlgD הוא אנזים מפתח במסלול הביו-סינתטי של אלגינט, אין לקחת את רמת הביטוי שלו לבדה כאינדיקציה לייצור אלגינט. גורמים אחרים, כגון שינויים לאחר שעתוק ואחרי תרגום, כמו גם מנגנוני רגולציה, יכולים להשפיע על כמות האלגינט המיוצרת, מה שמוביל להפחתת היווצרות ביופילם, רגישות מוגברת ללחץ סביבתי ורגישות מוגברת לאנטיביוטיקה כאשר ייצור האלגינט מופחת12,14. ישנם מספר טיפולים אנטי-אלימים בפיתוח המכוונים לחלבון האלגינט כאשר מודל זה לא יתאים לקביעת יעילותם והיכן יהיה מועיל יותר למדוד ישירות את ייצור האלגינט או קריאה פונקציונלית44. כמו כן, חלק מהטיפולים האנטי-וירולנטיים עשויים להתמקד בשלבים שונים של ביוסינתזה או ויסות של אלגינט, כך שמדידת ייצור אלגינט לוכדת ישירות את ההשפעה נטו של הטיפול על גורם האלימות44. עם זאת, כמה מהטיפולים האנטי-אליים במחקרים הנוכחיים אכן מכוונים לגנים מרכזיים של אלגינט, ומודלים של ביטוי גנים כמו אלה יתאימו לחקור את ההשפעות של טיפולים כאלה13,14. טכניקות כאלה יכולות להיות מותאמות בקלות גם להקרנה בתפוקה גבוהה, מה שמאפשר הערכה מהירה של דגימות או מצבים מרובים, מה שמועיל במחקרים בקנה מידה גדול הכוללים סינון ראשוני של תרכובות אנטי-ויראליות פוטנציאליות.

בסך הכל, מודלים של ביופילם חד-מיני ורב-מינים מייצגים כלים רבי ערך לחקר הביטוי של גנים רלוונטיים לזיהום של P. aeruginosa בתנאים מתאימים ל-CF. ההשקה בקנה מידה גדול של טיפול מודולטור חוללה מהפכה בנוף הטיפול הרפואי ב-CF. עם זאת, למרות מגוון היתרונות הקליניים של מודולטורים של CF, מחקרים הראו כי שושלות משובטות של Pseudomonas נמצאותבמחזור, מה שמדגיש כי טיפולים חדשים לניהול זיהומי ריאות של P. aeruginosa עדיין נדרשים45,46. למרות המגבלות הנדונות, היישום של מודלים אלה יכול להיות שימושי בשלב הגילוי של צינור פיתוח התרופות כדי להעריך את היעילות של תרכובות בתוך נישת ריאות CF ואת האינטראקציות של תרכובות אנטי-וירולנטיות חדשות עם אנטיביוטיקה ידועה בסביבה זו.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

HL, DN ו-JF קיבלו תמיכה במענק עבור המרכז למחקר אסטרטגי (SRC) מסגרת פרה-קלינית מבוססת ראיות לפיתוח טיפולים אנטי-מיקרוביאליים בסיסטיק פיברוזיס (PIPE-CF; מספר פרויקט SRC 022) מקרן סיסטיק פיברוזיס הבריטית וקרן סיסטיק פיברוזיס האמריקאית. TH נתמך על ידי סטודנטים לדוקטורט של MRC Discovery Medicine North Doctoral Training Partnership. אנו מודים לקרן CF ולקרן CF (SRC022) ולתוכנית MRC DiMEN DTP למימון

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
קרום איטום קל לנשימה לצלחות מרובות בארות סיגמא אולדריץ' 
צלולאז מבער
(100 מ"ג/מ"ל)Cambridge Bioscience תוסף CN HY-B2220-5g
 סיגמא אולדריץ' 1.07624
ערכת מיני-הכנה של Direct-zol RNAZymo ResearchR2050
Dnase I תרמו פישר סיינטיפיקEN0521
מים ללא DNase/RnaseVWRJ60610. XC
ג'נטמיצין סולפט (30 ומיקרו; גרם/מ"ל)סיגמא אולדריץ' G3632
גליצרול (1%)Thermo Fisher Scientific15514029
GoTaq qPCR Master Mix פרומגה A6101
iScript Cdna Bio-Rad1708890
פניצילין (250 U/mL)Scientfic Laboratory SuppliesP3032-10MU
Qubit 4 FluorometerThermo Fisher ScientificQ33238
Qubit RNA BR Assay Kit תרמו פישר סיינטיפיקQ10210
צינורות קיוביטתרמו פישר סיינטיפיקQ32856
תמיסת רזזורין (0.02%)תרמופישר סיינטיפיקR12204
RNAlater SolnInvitrogenAM7021
סטרפטומיצין (250 ומיקרו; גרם/מ"ל)סיגמא אולדריץ' S9137
Thermal Cycler (השתמשנו ב-T100 Thermal Cycler)Biorad
Reagent Invitrogen15596026
Vancomycin (3 ומיקרו; גרם/מ"ל)סיגמא אולדריץ' 
Z763624בונסןערכת סינתזה 1861096-TRIzol 1709007

מקורות

  1. Blanchard, A. C., Waters, V. J. Opportunistic pathogens in Cystic Fibrosis: Epidemiology and pathogenesis of lung infection. J Pediatric Infect Dis Societ. 11 (Supplement_2), S3-S12 (2022).
  2. Kordes, A., et al. Genetically diverse Pseudomonas aeruginosa populations display similar transcriptomic profiles in a cystic fibrosis explanted lung. Nat Comm. 10 (1), 3397(2019).
  3. Chotirmall, S. H., Greene, C. M., McElvaney, N. G. Candida species in cystic fibrosis: A road less travelled. Med Mycol. 48 (Supplement_1), S114-S124 (2010).
  4. Françoise, A., Héry-Arnaud, G. The microbiome in Cystic fibrosis pulmonary disease. Genes (Basel). 11 (5), 536(2020).
  5. Haiko, J., Saeedi, B., Bagger, G., Karpati, F., Özenci, V. Coexistence of Candida species and bacteria in patients with cystic fibrosis. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 38 (6), 1071-1077 (2019).
  6. Filkins, L. M., O’Toole, G. A. Cystic fibrosis lung infections: polymicrobial, complex, and hard to treat. PLoS pathogens. 11 (12), e1005258(2015).
  7. Barton, T. E., Frost, F., Fothergill, J. L., Neill, D. R. Challenges and opportunities in the development of novel antimicrobial therapeutics for cystic fibrosis. J Med Microbiol. 71 (12), (2022).
  8. Akkerman-Nijland, A. M., et al. The pharmacokinetics of antibiotics in cystic fibrosis. Expert Opin Drug Metab Toxicol. 17 (1), 53-68 (2021).
  9. Lindgren, N. R., McDaniel, M. S., Novak, L., Swords, W. E. Acute polymicrobial airway infections: analysis in cystic fibrosis mice. Microbiology (Reading). 169 (1), 001290(2023).
  10. Hurley, M. N., Ariff, A. H. A., Bertenshaw, C., Bhatt, J., Smyth, A. R. Results of antibiotic susceptibility testing do not influence clinical outcome in children with cystic fibrosis. Journal of Cystic Fibrosis. 11 (4), 288-292 (2012).
  11. Totsika, M. Benefits and challenges of antivirulence antimicrobials at the dawn of the post-antibiotic era. Curr Med Chem. 6 (1), 30-37 (2016).
  12. Davarzani, F., et al. Evaluation of antibiotic resistance pattern, alginate and biofilm production in clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa. Iran J Public Health. 50 (2), 341-349 (2021).
  13. Ambutsi, M., Okoth, P. Comparative genomic analysis of gene clusters of Pseudomonas aeruginosa that define specific biofilm formation in deciphering target regions for novel treatment options. Sci African. 13, e00910(2021).
  14. Dai, J., Luo, W., Hu, F., Li, S. In vitro inhibition of Pseudomonas aeruginosa PAO1 biofilm formation by DZ2002 through regulation of extracellular DNA and alginate production. Front Cell Infect Microbiol. 13, 1333773(2024).
  15. Olson, M. E., Ceri, H., Morck, D. W., Buret, A. G., Read, R. R. Biofilm bacteria: formation and comparative susceptibility to antibiotics. Can J Vet Res. 66 (2), 86-92 (2002).
  16. Palmer, K. L., Aye, L. M., Whiteley, M. Nutritional cues control Pseudomonas aeruginosa multicellular behavior in cystic fibrosis sputum. J Bacteriol. 189 (22), 8079-8087 (2007).
  17. Pascoe, B., et al. Dormant cells of Staphylococcus aureus are resuscitated by spent culture supernatant. PLoS One. 9 (2), e85998(2014).
  18. Caldeira, J., Almeida, G., Macedo, A. L., Silva, J. P. M., Albergaria, H. Saccharomycin, a biocide from S. cerevisiae that kill-off other yeasts. Ann Med. 51 (Suppl 1), 94-95 (2019).
  19. Redman, W. K., Welch, G. S., Rumbaugh, K. P. Assessing biofilm dispersal in murine wounds. J Vis Exp. (174), e62136(2021).
  20. Zhang, J., et al. Cellulase promotes mycobacterial biofilm dispersal in response to a decrease in the bacterial metabolite gamma-aminobutyric acid. Int J Mol Sci. 25 (2), 1051(2024).
  21. Kamali, E., Jamali, A., Izanloo, A., Ardebili, A. In vitro activities of cellulase and ceftazidime, alone and in combination against Pseudomonas aeruginosa biofilms. BMC Microbiol. 21 (1), 347(2021).
  22. Cao, P., et al. A Pseudomonas aeruginosa small RNA regulates chronic and acute infection. Nature. 618 (7964), 358-364 (2023).
  23. Tremblay, J., Déziel, E. Gene expression in Pseudomonas aeruginosa swarming motility. BMC Genom. 11 (1), 587(2010).
  24. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  25. Aaron, S. D., et al. Single and combination antibiotic susceptibilities of planktonic, adherent, and biofilm-grown Pseudomonas aeruginosa isolates cultured from sputa of adults with cystic fibrosis. J Clin Microbiol. 40 (11), 4172-4179 (2002).
  26. Haagensen, J., et al. Spatiotemporal pharmacodynamics of meropenem- and tobramycin-treated Pseudomonas aeruginosa biofilms. J Antimicrob Chemother. 72 (12), 3357-3365 (2017).
  27. Jing, Q., et al. Staphylococcus aureus wraps around Candida albicans and synergistically escapes from Neutrophil extracellular traps. Front Immunol. 15, 1422440(2024).
  28. Wu, Y. M., et al. Enhanced virulence of Candida albicans by Staphylococcus aureus: Evidence in clinical bloodstream infections and infected Zebrafish embryos. J Fungi. 7 (12), 1099(2021).
  29. Ruiz-Sorribas, A., Poilvache, H., Van Bambeke, F. Pharmacodynamics of Moxifloxacin, Meropenem, Caspofungin, and their combinations against in vitro polymicrobial interkingdom biofilms. Antimicro Agents Chemother. 66 (2), e02149-e02121 (2022).
  30. Pohl, C. H. Recent advances and opportunities in the study of Candida albicans polymicrobial biofilms. Front Cell Infect Microbiol. 12, 836379(2022).
  31. Aburayyan, W. S. High-throughput RNA extraction method for P. aeruginosa and S. pyogenes biofilms. J Appl Pharma Sci. 13 (3), 97-105 (2023).
  32. Ramsey, D. M., Wozniak, D. J. Understanding the control of Pseudomonas aeruginosa alginate synthesis and the prospects for management of chronic infections in cystic fibrosis. Mol Microbiol. 56 (2), 309-322 (2005).
  33. Kim, S. K., et al. Inhibition of Pseudomonas aeruginosa alginate synthesis by Ebselen oxide and its analogues. ACS Infectious Diseases. 7 (6), 1713-1726 (2021).
  34. Gao, F., et al. Protective effects of anti-alginate monoclonal antibody against Pseudomonas aeruginosa infection of HeLa cells. Micro Pathogen. 145, 104240(2020).
  35. Alam, F., Blair, J. M. A., Hall, R. A. Transcriptional profiling of Pseudomonas aeruginosa mature single- and dual-species biofilms in response to meropenem. Microbiology (Reading). 169 (1), 001271(2023).
  36. Farrington, N., et al. Molecular pharmacodynamics of meropenem for nosocomial pneumonia caused by Pseudomonas aeruginosa. mBio. 15 (2), e03165-e03123 (2024).
  37. Meletis, G., Exindari, M., Vavatsi, N., Sofianou, D., Diza, E. Mechanisms responsible for the emergence of carbapenem resistance in Pseudomonas aeruginosa. Hippokratia. 16 (4), 303-307 (2012).
  38. O'Brien, T. J., Hassan, M. M., Harrison, F., Welch, M. An in vitro model for the cultivation of polymicrobial biofilms under continuous-flow conditions. F1000Res. 10, 801(2021).
  39. Guss, A. M., et al. Phylogenetic and metabolic diversity of bacteria associated with cystic fibrosis. ISME J. 5 (1), 20-29 (2011).
  40. Vandeplassche, E., et al. Antibiotic susceptibility of cystic fibrosis lung microbiome members in a multispecies biofilm. Biofilm. 2, 100031(2020).
  41. Hibbert, T. M., Whiteley, M., Renshaw, S. A., Neill, D. R., Fothergill, J. L. Emerging strategies to target virulence in Pseudomonas aeruginosa respiratory infections. Crit Rev Microbiol. , 1-16 (2023).
  42. Turner, K. H., Wessel, A. K., Palmer, G. C., Murray, J. L., Whiteley, M. Essential genome of Pseudomonas aeruginosa in cystic fibrosis sputum. Proc Natl Acad Sci. 112 (13), 4110-4115 (2015).
  43. Ruhluel, D., O'Brien, S., Fothergill, J. L., Neill, D. R. Development of liquid culture media mimicking the conditions of sinuses and lungs in cystic fibrosis and health. F1000Res. 11, 1007(2022).
  44. Yin, R., Cheng, J., Wang, J., Li, P., Lin, J. Treatment of Pseudomonas aeruginosa infectious biofilms: Challenges and strategies. Front Microbiol. 13, 955286(2022).
  45. Ledger, E. L., et al. Impact of CFTR modulation on Pseudomonas aeruginosa infection in people with Cystic Fibrosis. J Infect Dis. 230 (3), e536-e547 (2024).
  46. Armbruster, C. R., et al. Persistence and evolution of Pseudomonas aeruginosa following initiation of highly effective modulator therapy in cystic fibrosis. mBio. 15 (5), e00519-e00524 (2024).

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

Pseudomonas aeruginosaביופילם פולימיקרוביאליבדיקה אנטימיקרוביאליתטיפול במרופנםמיצוי RNAיחידות יוצרות מושבהטיפולים אנטי-וירולנטיים
מודל ביופילם מצטבר של סיסטיק פיברוזיס לחקר ביטוי גנים רלוונטי לזיהום
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.