הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הדמיה של סיאלילציה תוך-תאית עם כימיה של קליק ומיקרוסקופ הרחבה

1.4K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/67479

⸱

7 בפברואר 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Univ. Lille, CNRS, UMR 8576 - UGSF - Unité de Glycobiologie Structurale et Fonctionnelle, 2Univ. Lille, CNRS, UMR 8520 - IEMN – Institut d’Electronique, de Microelectronique et de Nanotechnologie, 3Univ. Lille, CNRS, Inserm, CHU Lille, Institut Pasteur de Lille, US 41 - UAR 2014 - PLBS

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מציעים פרוטוקול פשוט המשלב הנדסת אוליגוסכריד מטבולית, כימיית קליקים ומיקרוסקופ הרחבה המאפשר הדמיה ביולוגית של N-גליקופרוטאינים תוך-תאיים עם רזולוציה משופרת באמצעות ציוד מיקרוסקופיה שגרתי.

תקציר

טכניקות תיוג מטבוליות מאפשרות שילוב של מדווחים ביואורתוגונליים בגליקנים, מה שמאפשר צימוד ביולוגי ממוקד של צבעים מולקולריים בתוך תאים באמצעות קליק וכימיה ביואורתוגונלית. הנדסת אוליגוסכריד מטבולית (MOE) משכה עניין רב בשל התפקיד החיוני של גליקוזילציה בתהליכים ביולוגיים רבים הכוללים זיהוי מולקולרי והשפעתו על פתולוגיות החל מסרטן ועד הפרעות גנטיות ועד זיהומים נגיפיים וחיידקיים.

למרות שמשרד החינוך ידוע יותר בזיהוי גליקוקונוגטים על פני התא, זוהי גם מתודולוגיה חשובה מאוד לחקר גליקנים תוך-תאיים בהקשרים פיזיולוגיים ופתולוגיים. מחקרים כאלה מפיקים תועלת רבה מרזולוציה מרחבית גבוהה. עם זאת, מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה אינה זמינה ברוב המעבדות ומציבה אתגרים ליישום יומיומי. מיקרוסקופ הרחבה הוא חלופה עדכנית המשפרת את הרזולוציה של מיקרוסקופיה על ידי הגדלה פיזית של דגימות ביולוגיות המסומנות בסמנים פלואורסצנטיים. על ידי הטמעת הדגימה בג'ל מתנפח וגרימת התרחבותה איזוטרופית באמצעות טיפול כימי, ניתן לדמיין מבנים תת-תאיים בדיוק וברזולוציה משופרים ללא צורך בטכניקות סופר-רזולוציה.

בעבודה זו, אנו מדגימים את היכולת של מיקרוסקופ התפשטות לדמיין גליקנים סיאליליים תוך תאיים באמצעות שימוש משולב בכימיה של MOE וקליקים. באופן ספציפי, אנו מציעים הליך לתיוג ביו-אורתוגונלי ומיקרוסקופ הרחבה המעסיק מדווח המכוון לסילילציה, שעשוי להיות קשור לאימונופלואורסצנציה עבור מחקרי לוקליזציה משותפת. פרוטוקול זה מאפשר מחקרי לוקליזציה של ביוסינתזה סיאלו-מצומדת, סחר תוך תאי ומיחזור.

מבוא

מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, למרות שנמצאת בשימוש נרחב לתיוג והדמיה של מולקולות ספציפיות בתוך תאים, מוגבלת מטבעה ברזולוציה על ידי מגבלת העקיפה של אור1 של Abbe, המגבילה את היכולת להבחין בין עצמים הקרובים יותר מ-200-250 ננומטר בקירוב. מגבלה זו נובעת מאופי הגל של האור ומהצמצם המספרי של עדשת האובייקטיביות של המיקרוסקופ, מה שמציב אתגר בעת הדמיית מבנים תת-תאיים. התגברות על מגבלות אלה מספקת תובנות טובות יותר לגבי תהליכים ביולוגיים מסוימים בקנה מידה ננומטרי.

כדי לעבור את גבול העקיפה של האור, פותחו טכניקות מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה כגון STORM (מיקרוסקופיה לשחזור אופטי סטוכסטי) ו-STED (דלדול פליטה מגורה) 2,3. STORM מסתמך על הפעלה סטוכסטית של פלואורופורים, המאפשרת לדמות רק תת-קבוצה דלילה בכל זמן נתון. זה מאפשר לוקליזציה מדויקת של פלואורופורים בודדים, המאפשרת שחזור של תמונה ברזולוציה גבוהה. STED, לעומת זאת, משפר את הרזולוציה על ידי שימוש בלייזר דלדול כדי להרוות באופן סלקטיבי את הקרינה סביב הפריפריה של נקודת העירור, ולמעשה מצמצם את פונקציית התפשטות הנקודה.

גישות אלו מנוגדות למיקרוסקופיה רחבת שדה או קונפוקלית, שבה כל הפלואורופורים מזוהים בו זמנית, וכתוצאה מכך תמונה המשלבת את כל דפוסי העקיפה ומונעת את ההבחנה בין פלואורופורים בודדים קרובים, מה שמוביל לאובדן רזולוציה. עם זאת, שיטות סופר-רזולוציה אלה דורשות מקורות אור ספציפיים מאוד, ציוד, הכנת דגימות ו/או פלואורופורים, מה שהופך את הטכנולוגיות הללו ליקרות, קשות לגישה ברוב המעבדות ומאתגרות ליישום בניסויים שגרתיים. אילוצים אלה הובילו את הקהילה המדעית לחפש פתרונות חלופיים להשגת רזולוציה גבוהה יותר, שיהיו תואמים לציוד מיקרוסקופיה זמין ולפרוטוקולי צביעה שגרתיים. בשנת 2015 פותחה שיטה לעקוף את מגבלות המיקרוסקופיה האופטית על ידי הרחבה פיזית של הדגימה על ידי בוידן ועמיתיו, הנקראת מיקרוסקופיית הרחבה (ExM)4.

ExM היא שיטה תלת-שלבית המספקת פרטים בקנה מידה ננומטרי של דגימות ביולוגיות מבלי לחרוג מגבול העקיפה של האור (איור 1). במקום זאת, הוא משתמש במיקרוסקופים קונבנציונליים מוגבלים בעקיפה כדי לצלם דגימות שהוגדלו פיזית בצורה איזוטרופית. השלב הראשון, הנקרא ג'לציה, מורכב מהטמעת הדגימה הביולוגית, בדרך כלל תאים או רקמות קבועות, בהידרוג'ל פוליאלקטרוליט מתנפח המבוסס על נתרן אקרילט ואקרילאמיד. לאחר מכן הדגימה הביולוגית עוברת טיפול אנזימטי כדי לפרק חלקית רכיבים מסוימים כגון חלבונים או ממברנות, ולפרק מבנים תאיים צפופים כדי להבטיח שהתאים יוכלו להתרחב באופן אחיד. שלב זה, הנקרא עיכול, מסייע להשיג זאת על ידי הומוגניזציה של הרכיבים המבניים של הדגימה ביחס לתכונות מכניות, ומניעת התרחבות דיפרנציאלית שעלולה להוביל לעיוות של הדגימה. לבסוף, בשלב האחרון, הנקרא הרחבה, הדגימה המוטמעת והמעוכלת בהידרוג'ל מונחת במים נטולי יונים, מה שגורם לה להתנפח. טכנולוגיה זו מביאה להרחבת הדגימה במקדם הגדלה ליניארי של כ-4-5x בכל ממד, מה שמאפשר הדמיה של פרטים תאיים עדינים באמצעות טכניקות מיקרוסקופיה סטנדרטיות. בהתחשב באופי האיזוטרופי של ההתפשטות, הדגימה הביולוגית המוגדלת בתוך מטריצת הג'ל שומרת על הפרטים הגיאומטריים התלת מימדיים שלה ועל היחסים המרחביים בין מרכיביה המבניים השונים. מידע מרחבי נשמר, אם כן, עם נפיחות, בעוד שהמרחק בין התוויות הפלואורסצנטיות המעוגנות בג'ל או הביו-מולקולות גדל באופן אחיד לכל הכיוונים. זה מאפשר הפרדה טובה יותר של אותות, וכתוצאה מכך רזולוציה משופרת.

figure-introduction-1
איור 1: סקירה כללית של פרוטוקול ExM. (א) ג'לציה: הדגימה הביולוגית מעוגנת ומוטמעת בתוך הידרוג'ל פוליאלקטרוליט מתנפח. (ב) עיכול: התכונות המכניות של הדגימה הומוגניות באמצעות שימוש באנזימים וחומרי ניקוי, פירוק חלבונים וממברנות שומנים שאחרת היו מגבילים את ההתפשטות ויוצרים עיוותים. (ג) התרחבות: ההידרוג'ל טובל במים נטולי יונים, מה שגורם לו להתרחב בצורה איזוטרופית. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

מאז 2015, ExM ראתה שיפורים טכנולוגיים משמעותיים בשימור מידע מרחבי. בפרט, עוגנים מולקולריים שונים תוכננו לחבר באופן קוולנטי ביומולקולות ישירות להידרוג'ל המתנפח 5,6. בפרוטוקול זה, השתמשנו ב-N-acryloxysuccinimide (NAS), המגיב עם קבוצות האמין החופשיות של ביומולקולות (בדרך כלל, שאריות ליזין או מיקומי N-terminal של חלבונים) כדי להצמיד קבוצת אקרילויל לחלבוני התא, כולל גליקופרוטאינים. קבוצת אקרילואיל זו מגיבה לאחר מכן עם מונומרים אחרים באמצעות תגובות צולבות במהלך הג'לציה, ומעגנת את הביו-מולקולות הללו ישירות לפולימר.

ExM תואם למגוון רחב של שיטות תיוג, כולל הנדסת אוליגוסכריד מטבולית (MOE). MOE הוא כלי רב עוצמה המאפשר תיוג של גליקנים על ידי שילוב אנלוגים של קודמנים מטבוליים המצוידים בידית כימית ביו-אורתוגונלית7. אנלוגים אלה, הידועים כמדווחים כימיים, משתלבים במסלולים מטבוליים מבלי לגרום לרעילות. בגישת MOE, חד-סוכרים מדווחים מעובדים מטבולית לסוכרי נוקלאוטידים פעילים ולאחר מכן מועברים לגליקו-מצומדים מתהווים. ההתמקדות העיקרית שלנו היא בחקר הסיאלילציה, במיוחד הדינמיקה התוך-תאית והסחר ב-N-גליקופרוטאינים סיאליליים, שהיא חיונית בהקשר של בריאות ומחלות בשל תפקידיה באינטראקציות תא-תא, ויסות חיסוני והתפתחות. סיאלילציה לא תקינה מעורבת במחלות כמו סרטן 8,9,10,11, מחלות זיהומיות 12 והפרעות גנטיות 13,14,15, מה שהופך אותה ליעד מרכזי לפיתוח טיפולי וגילוי סמנים ביולוגיים. הבנת סיאלילציה משפרת את התובנות לגבי גליקוביולוגיה ומנגנוני מחלות.

ניתן לחקור סיאלילציה באמצעות MOE עם אנלוגים של חומצה N-אצטילנוראמינית (Neu5Ac), החומצה הסיאלית הנפוצה ביותר בבני אדם, או עם אנלוגים של N-אצטילמנוזאמין (ManNAc), קודמן מטבולי של Neu5Ac, הנושא ידית ביואורתוגונלית 8,16. ManNAc מומר ל-Neu5Ac בציטוזול, ולאחר מכן מופעל לחומצה נויראמנית ציטידין-5′-מונופוספו-N (CMP-Neu5Ac) בגרעין. לאחר הפעלתם לסוכר נוקלאוטיד, סיאליל טרנספראזות במנגנון גולגי מעבירות יחידות Neu5Ac למיקומים הסופיים של שרשראות גליקן גדלות (איור 2). בעקבות השילוב המטבולי של נגזרות ManNAc לא טבעיות, ניתן לקשר את הגליקנים המתויגים של סיאליל באופן קוולנטי לפלואורופור הנושא קבוצה תגובתית משלימה לידית המדווח באמצעות כימיית קליק ביואורתוגונלית. זה מאפשר התבוננות ישירה בגליקוקונוגטים in vivo או ex vivo.

עבור רוב המדווחים על חד-סוכרים, נדרשת צורה פראצטילית כדי לחצות את קרום הפלזמה באמצעות דיפוזיה פסיבית. עם זאת, הוכח כי הן מדווחים פראצטיליים והן מדווחים לא מוגנים חוקרים ביעילות סיאלילציה16. מדווחי סיאלילציה לא מוגנים מסוגלים להיכנס לתאים על ידי מנגנוני הובלה פעילים, כלומר פינוציטוזיס עבור אנלוגים של Neu5Ac, וטרנספורטר שעדיין לא זוהה עבור ManNAc. בעוד שסוכרים לא מוגנים דורשים ריכוז גבוה יותר (בדרך כלל 100-500 מיקרומטר) כדי להשיג השפעות דומות, ברגע שהם נכנסים לתא, הם יכולים להיכנס ישירות למסלול המטבולי של חומצה סיאלית. לעומת זאת, סוכרים שעברו פראצטילציה צריכים לעבור דה-אצטילציה מלאה על ידי אסטרזות לא ספציפיות תוך תאיות לפני שהם הופכים לפעילים מטבולית. למרות שניתן להשתמש בהם בריכוזים נמוכים יותר (בדרך כלל 10-50 מיקרומטר), דה-אצטילציה לא מלאה עלולה להפריע לפעילות האנזים או להוביל לשילוב של אנלוגים של חומצה סיאלית אצטילית חלקית, מה שעלול להטות את הניתוח במורד הזרם. בנוסף, שחרור חומצה אצטית עשוי להשפיע על ה-pH באופן מקומי, מה שעלול להשפיע על תפקוד התאים. צ'ן ועמיתיו הראו גם שסוכרים פר-O-אצטילטים מגיבים עם שאריות ציסטאין חופשיות בחלבונים באמצעות מנגנון לא אנזימטי, מה שמוביל לשילוב מחוץ למטרה ולאות לא ספציפי מוגבר17,18. בפרוטוקול הנוכחי, אנו מעסיקים לכן כתבי ManNAc לא מוגנים.

figure-introduction-2
איור 2: הנדסת אוליגוסכריד מטבולית ותיוג של חומצות סיאליות. UDP-GlcNAc מומר ל-ManNAc על ידי תחום UDP-GlcNAc 2-epimerase של GNE/MNK בציטוזול. לאחר מכן ManNAc עובר זרחן בציטוזול על ידי תחום ManNAc 6-kinase של GNE/MNK ליצירת ManNAc-6-phosphate. N-acetylneuraminate synthase מזרז את העיבוי של ManNAc-6-P עם פוספואנולפירובט כדי לייצר Neu5Ac-9-phosphate, אשר לאחר מכן עובר דה-פוספורילציה על ידי חומצה סיאלית פוספטאז כדי להניב Neu5Ac. Neu5Ac יכול להיות מסופק גם על ידי מסלול ההצלה באמצעות אנדוציטוזיס ומיחזור ליזוזומלי8. לאחר הובלה לגרעין, הוא מומר ל-CMP-Neu5Ac על ידי CMP-חומצה סיאלית סינתטאז. במנגנון גולגי, CMP-NeuAc הוא המצע של סיאלילטרנספראזות המציגים חלק Neu5Ac במיקומים הסופיים של גליקנים על גליקוקונוגטים מתבגרים, אשר בסופו של דבר מתבטאים בקרום התא או מופרשים. מדווחים כימיים של ManNAz הנושאים ידית ביואורתוגונלית יכולים לחדור לתא דרך טרנספורטר פעיל לא מזוהה ולהיכנס למסלול המטבולי. יחידות ה-Neu5Az המתויגות המשולבות בגליקנים לאחר ביוסינתזה מסומנות לאחר מכן באמצעות צימוד בתיווך CuAAC של בדיקה פלואורסצנטית. קיצורים: NAc = N-אצטיל; UDP-GlcNAc = אורידין דיפוספט N-אצטיל גלוקוזאמין; ManNAc = N-אצטילמנוסמין; GNE = UDP-GlcNAc 2-אפימראז; MNK = ManNAc 6-קינאז; ManNAc-6-P = ManNAc-6-פוספט; NANS = N-acetylneuraminate synthase; PEP = פוספואנולפירובט; Neu5Ac = חומצה N-אצטילנוראמינית; Neu5Ac-9-P = Neu5Ac-9-פוספט; NANP = חומצה סיאלית פוספטאז; CMP = ציטידין-5′-מונופוספט; CMAS = CMP-חומצה סיאלית סינתטאז; STs = sialyltransferases; ManNAz = N-azidoacetylmannosamine; Neu5Az = חומצה N-azidoacetylneuraminic. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

בין התגובות הביו-אורתוגונליות האפשריות, מיקדנו את התעניינותנו בתוספת ציקלו-אזיד-אלקין (CuAAC)16,19. על פי הניסיון שלנו, CuAAC היא האפשרות הטובה ביותר לתיוג גליקנים תוך-תאיים בתאים קבועים. תגובה זו מבוססת היטב, נחקרה ביסודיות בכימיה ביואורתוגונלית, ותוקננה לשימוש בסביבות ביולוגיות מורכבות, ומספקת בסיס איתן של ידע ופרוטוקולים אופטימליים. הקינטיקה המהירה שלו אכן מציעה יעילות תגובה וסגוליות גבוהה, והוא כולל קבוצות אזיד ואלקין שקל לסנתז, יציבות, נעדרות ממערכות חיות ואינרטיות כלפי ביומולקולות מקומיות, מה שהופך אותו לאידיאלי עבור יישומי תאים קבועים שבהם רעילות נחושת אינה מהווה בעיה. תוספת אלקין-אזיד (SPAAC)20,21, תוך הימנעות מהרעלת נחושת, יש קינטיקה איטית יותר ובדיקות מגושמות יותר, מה שנוטה להוביל לאות רקע גבוה יותר ולירידה ביחס האות לרעש עבור יישומים תוך-תאיים עקב לכידה הידרופובית, בעוד שביקוש אלקטרונים הפוך Diels-Alder (IEDDA)22,23למרות שהוא מהיר ונטול נחושת, כרוך בסינתזה מורכבת יותר של בדיקה ודורש קבוצות מדווחים מגושמות יותר שעדיין לא אופיינו במלואן ביישומי MOE., מכיוון ש-ExM דורש אך ורק תאים קבועים, CuAAC מציע פתרון חזק ויעיל לתיוג ביו-אורתוגונלי.

מאמר זה מציג פרוטוקול להדמיה של גליקופרוטאינים סיאליליים תוך-תאיים בתאים, המשלב תיוג מטבולי, כימיה של קליק ביו-אורתוגונלי ומיקרוסקופ הרחבה. בהליכי הניסוי המתוארים במאמר זה, אנו משתמשים ב-N-azidoacetylmannosamine (ManNAz) כמדווח הכימי, וקשירת CuAAC של פלואורופורים אורגניים קטנים מתבצעת לפני הליך ההרחבה. גליקופרוטאינים מעוגנים להידרוג'ל עם NAS לפני הג'לציה, העיכול וההרחבה. תיוג MOE של חומצות סיאליות יכול להיות קשור לגישות אימונופלואורסצנטיות להערכת לוקליזציה משותפת, כפי שמודגם כאן עם נוגדן ראשוני נגד GM130 של עכבר הממוקם במנגנון cis-Golgi. ניתן ליישם פרוטוקול זה על תאים במצבם הפיזיולוגי, או על תאים שעברו טיפול כימי. כדי להמחיש זאת, כלורוקווין שימש לעיכוב התפקוד הליזוזומלי, המשפיע על העיבוד והסחר של גליקופרוטאינים בתוך התאים. צביעה גרעינית משמשת כציון דרך, לא רק לאיתור תאים אלא גם כאינדיקטור לאיכות תהליך ה- ExM. אכן ניתן למדוד את גורם ההתפשטות על ידי השוואת גודל הגרעין לפני ההתפשטות (preExM) ואחרי ההתפשטות (postExM).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. זריעת תאים

הערה: בצע את השלבים הבאים בתנאים סטריליים מתחת לקולט אדים למינר. ניתן ליישם שיטה זו על כל אחד מקווי התאים המשמשים בעבודה הנוכחית (HeLa, MCF7, פיברובלסטים ראשוניים), או על רוב המודלים של קווי התאים הדבקים הנפוצים במחקר 20,24,25.

  1. לגדל תאים במדיום גלוקוז גבוה DMEM בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS) בבקבוק T75 בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באטמוספירה של 5% CO2 .
  2. לאחר שהתאים הגיעו למפגש מלא, הסר את מדיום תרבית התאים ושטוף את התאים עם 4 מ"ל PBS.
    הערה: פתרונות PBS המשמשים בשלב זה וכל שלבי הכביסה הבאים חייבים להיות סטריליים על ידי סינון דרך קרום PTFE של 0.2 מיקרומטר לפני השימוש.
  3. דגרו את התאים למשך 5 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ב-2 מ"ל של תמיסת טריפסין-EDTA המכילה 0.5 גרם/ליטר טריפסין, כדי לשחרר אותם מתחתית הבקבוק.
  4. הוסף 8 מ"ל של מדיום גלוקוז גבוה DMEM המכיל 10% FBS, וערבב היטב כדי לוודא שכל תא ותא מנותק מתחתית הבקבוק.
  5. העבירו את התאים לצינור חרוטי של 15 מ"ל וצנטריפוגה למשך 5 דקות בטמפרטורה של 200 × גרם. בינתיים, הוסף כיסוי אחד (קוטר 12 מ"מ, עובי 130-160 מיקרומטר) לכל באר של צלחת בת 12 בארות.
    הערה: יש להתאים את עובי החלקת הכיסוי כך שיתאים לדרישות המיקרוסקופ המשמש בשלבי ההדמיה הבאים.
  6. הסר את הסופרנטנט לאחר צנטריפוגה והשהה מחדש את הגלולה ב-1 מ"ל של מדיום תרבית תאים.
  7. קבע את המספר הממוצע של תאים/מ"ל על ידי המוציטומטריה על פני שתי מדידות לפחות.
  8. לדלל את תרחיף התאים לריכוז של 300,000 תאים למ"ל במדיום תרבית תאים, ולזרוע 1 מ"ל של התרחיף לכל באר.
  9. אפשר לתאים להתיישב במשך 24 שעות במדיום גלוקוז גבוה DMEM המכיל 10% FBS ב-37 מעלות צלזיוס באטמוספירה של 5% CO2 לפני השלבים הבאים.

2. טיפול בכלורוקווין (לא חובה)

הערה: שלבים 2.1-2.8 ממחישים כיצד להשתמש בפרוטוקול על תאים המטופלים במגיב חיצוני (מעכב, אפקטור, תרופה), תוך שימוש בכלורוקווין כדוגמה. דלג על שלבים אלה עבור תאים שאינם מטופלים בריאגנטים חיצוניים.

  1. שקלו את הכמות הנכונה של מלח כלורוקווין דיפוספט (CQ) כדי להכין נפח מספיק של תמיסת מלאי של 10 מ"מ.
    הערה: בצע את השלבים הבאים בתנאים סטריליים מתחת לקולט אדים למינר.
  2. יש להמיס את ה-CQ המוצק בכמות הרצויה של מים נטולי יונים לריכוז סופי של 10 מ"מ.
  3. מסננים את התמיסה דרך מסנן של 0.2 מיקרומטר.
  4. Aliquot 1 מ"ל מתמיסת המלאי של 10 מ"מ בצינורות מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מ"ל ואחסן אותם בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
  5. שטפו את דגימת התא שהוכנה בשלב 1.9 עם 1 מ"ל PBS.
  6. הוסף 100 מיקרוליטר של 10 מ"מ CQ ב-9.9 מ"ל של מדיום גלוקוז גבוה DMEM המכיל 10% FBS, לריכוז סופי של 100 מיקרומטר של CQ.
  7. דגירה של תאים למשך 8 שעות ב-1 מ"ל של מדיום בתוספת 100 מיקרומטר של CQ ב-37 מעלות צלזיוס תחת אטמוספירה של 5% CO2 .
  8. שוטפים את התאים פי 3 עם 1 מ"ל PBS.

3. הנדסת אוליגוסכריד מטבולית

  1. הכן תמיסת מלאי של 5 מ"מ של ManNAz (או ManNAc למצב הבקרה השלילי) במדיום גלוקוז גבוה DMEM המכיל 10% FBS.
    הערה: תמיסת מלאי זו צריכה להיות בנפח מספיק כך שניתן לטפל בכל באר עם 1 מ"ל של תמיסה אנלוגית של סוכר. בצע את השלבים הבאים בתנאים סטריליים מתחת למכסה המנוע הלמינר.
  2. מסננים את התמיסה דרך מסנן של 0.2 מיקרומטר ומאחסנים בכמות של 1 מ"ל בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס עד לצורך.
  3. הכן מדיום בתוספת 500 מיקרומטר של ManNAz או ManNAc על ידי דילול תמיסת מלאי של 1 מ"ל שהוכנה בשלב 3.2 עם 9 מ"ל של מדיום גלוקוז גבוה DMEM המכיל 10% FBS.
  4. דגרו את התאים שהוכנו בשלב 1.9 (לניסויים בתאים לא מטופלים) או בשלב 2.8 (לניסויים בתאים שטופלו ב-CQ) ב-1 מ"ל של המדיום בתוספת 500 מיקרומטר ManNAz (או 500 מיקרומטר ManNAc לקבוצת הביקורת) למשך 24 שעות ב-37 מעלות צלזיוס באטמוספירה של 5% CO2 .

4. קיבוע וחדירות

הערה: כל השלבים הללו מתבצעים מתחת למכסה אדים.

  1. שוטפים את הדגימות עם 1 מ"ל PBS.
  2. תקן את התאים בכל כיסוי על ידי הוספת 500 מיקרוליטר של 5% פרפורמלדהיד. תן לזה לנוח 15 דקות בטמפרטורת החדר.
  3. שטפו 3x עם 1 מ"ל PBS.
  4. הכן תא לח בהתאמה אישית באמצעות קופסה אטומה גדולה מספיק (למשל, קופסת פוליסטירן) עם מכסה. הניחו פיסת נייר סופג רטובה בתחתית הקופסה, ולאחר מכן הניחו עליה שכבת פרפילם.
    הערה: החדר הלח אמור להגן לחלוטין על הדגימה מפני מקורות אור חיצוניים כאשר הוא סגור.
  5. הנח את הכיסויים על הפרפילם, התאים פונים כלפי מעלה.
    הערה: סמן את הפרפילם עם השם או ההפניה של הדגימות מראש.
  6. בצע חדירות תאים באמצעות 200 מיקרוליטר של 0.5% (v/v) Triton X-100 ב-PBS למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
  7. שטפו 3x עם 200 מיקרוליטר PBS.

5. תיוג פלואורסצנטי

  1. תיוג CuAAC של גליקנים מתויגים עם סיאליל
    הערה: יש להכין את מאגר התגובה של CuAAC לפני השימוש, ולהוסיף את המגיבים בסדר שצוין, כאשר נתרן אסקורבט מתווסף אחרון. בתמיסות מימיות מחומצנות, יוני Cu(I) שנוצרו על ידי הפחתת Cu(II) עם אסקורבט יתחמצנו מחדש בהדרגה ל-Cu(II), מה שיוביל לירידה בריכוז האסקורבט לאורך זמן. כדי לשמור על שחזור התוצאות, אין לאחסן את המאגר יותר מכמה ימים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ורצוי להשתמש בו באותו היום.
    1. כדי לתייג את הגליקנים הסיאליליים שעברו שינוי באזיד שהונדסו בסעיף 3, הכינו מאגר תגובה CuAAC המורכב מ-5 מיקרומטר AlexaFluor 488 אלקין (AF488Alk), 150 מיקרומטר CuSO4, 300 מיקרומטר 2-(4-((bis((1-(tert-butyl)-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl)amino)methyl)-1H-1,2,3-triazol-1-yl) חומצה אצטית (BTTAA), 0.1 M K2HPO4 ו-2.5 מ"מ נתרן אסקורבט במים נטולי יונים. הכן מספיק תמיסה כדי למרוח 200 מיקרוליטר על כל כיסוי.
    2. הוסף 200 מיקרוליטר של מאגר CuAAC על כל כיסוי כדי להתחיל את התגובה. ודא שהדגימה מכוסה באופן הומוגני בטיפה, ותן לה להגיב במשך 45 דקות בטמפרטורת החדר, מוגנת מפני האור.
    3. שטפו 3 פעמים עם 200 מיקרוליטר PBS כדי לעצור את התגובה ולהסיר עודפי בדיקה וריאגנטים.
  2. צביעת גרעין
    1. לתיוג גרעיני עם Hoechst 33342, יש לדלל תמיסת מלאי של 10 מ"ג/מ"ל ב-1:2000 ב-PBS.
      הערה: ניתן להשתמש בכתמי נגד גרעיניים מקבילים כגון 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) לאותו אפקט.
    2. מכסים את התאים ב -200 מיקרוליטר מתמיסה זו ודוגרים במשך 5-10 דקות בטמפרטורת החדר, מוגנים מפני האור.
    3. שטפו 3x עם 200 מיקרוליטר PBS.
  3. צביעה אימונופלואורסצנטית
    1. הכן מאגר חוסם אלבומין בסרום בקר (BSA) המכיל 0.1 גרם ג'לטין, 1 גרם BSA, 1 מ"ל FBS ו-49 מ"ל PBS עבור 50 מ"ל מאגר.
    2. דגרו את הדגימות למשך שעה ב-4 מעלות צלזיוס ב-200 מיקרוליטר של מאגר חוסם BSA. הגן על הדגימה מפני אור.
    3. לצביעה אימונופלואורסצנטית של מנגנון גולגי באמצעות נוגדן עכבר מטוהר נגד GM130 (אפיטופ מזוהה: Rat GM130 aa. 869-982 | RRID: AB_398142), יש לדלל את הנוגדן העיקרי בשעה 1:100 במאגר חוסם ה-BSA המוכן.
      הערה: ניתן להתאים שלב זה לצביעה אימונופלואורסצנטית המכוונת לאברונים אחרים על ידי שימוש בכל נוגדן ראשוני רלוונטי, ובמקרה זה יש להתאים את גורם הדילול בהתאם להנחיות היצרן.
    4. הוסף 70 מיקרוליטר מהתמיסה המכילה את הנוגדן לכיסויים ודגירה למשך שעה ב-4 מעלות צלזיוס, מוגן מפני אור.
    5. שטפו 3x עם 200 מיקרוליטר PBS.
    6. לדלל את הנוגדן המשני הפלואורסצנטי (Alexa Fluor 546 anti-mouse IgG) ב-1:600 במאגר חוסם BSA ולהוסיף 100 מיקרוליטר על כל כיסוי.
    7. דגרו את הדגימות למשך שעה בטמפרטורת החדר, מוגנות מפני אור.
    8. שטפו 3x עם 200 מיקרוליטר PBS.
    9. מעבירים את הכיסויים לצלחת של 6 בארות. אחסן את הדגימות ב-2 מ"ל PBS בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך מספר ימים, מוגן מפני אור.
      הערה: מומלץ תמיד להכין שכפול אך ורק להדמיה preExM כהתייחסות למטרות השוואה לפני ואחרי הרחבה וכדי להבטיח שדפוס התיוג לא עוות לאחר ההרחבה.

6. הדמיה מוקדמת של דגימות

הערה: השלבים הבאים תלויים בציוד ההדמיה הביולוגית שבו נעשה שימוש וייתכן שיהיה צורך להתאים אותם לדרישות המכשיר. אנא פעל לפי הכללים של המעבדה המקומית או פלטפורמת ההדמיה הביולוגית. שלבים 6.1-6.13 כאן מבוצעים במיקרוסקופ קונפוקלי לסריקת לייזר.

  1. הפעל את המיקרוסקופ וודא שמקורות האור (לייזרים) מתחממים. פתח את תוכנת רכישת ההדמיה הביולוגית.
  2. בחר את אורכי הגל של עירור הלייזר המתאימים לפלואורופורים כדי ליצור את התעלות (למשל, 405 ננומטר לצביעה גרעינית, 488 ננומטר עבור גליקנים סיאליליים עם תווית AF488Alk, ו-546 ננומטר לתיוג אימונופלואורסצנטי). הפעל את הלייזרים בהתאם.
  3. הנח ואבטח כיסוי בקוטר 32 מ"מ (עובי 130-170 מיקרומטר) במחזיק המותאם למיקרוסקופ.
  4. הנח את הדגימה שהוכנה בשלב 5.3.9, תאים עם הפנים כלפי מטה, על כיסוי 32 מ"מ. הוסף טיפת מים נטולי יונים כדי למנוע את התייבשות הדגימה.
  5. בחר עדשת מטרה מתאימה, כאן אובייקט טבילה בשמן פי 63 עם צמצם מספרי של 1.4 או שווה ערך.
    הערה: הצמצם המספרי הגבוה ביותר מספק את הרזולוציה הטובה ביותר. בעת שימוש במטרת טבילה בשמן, זכור להוסיף טיפת שמן בין המטרה לכיסוי.
  6. הנח את המחזיק על שלב המיקרוסקופ מעל המטרה.
  7. השתמש במצב פלואורסצנטי של שדה בהיר או בעוצמת לייזר נמוכה כדי לאתר אזור עניין בדגימה.
  8. הגדר את המיקוד.
  9. דמיין את התאים בתוכנה במצב פלואורסצנטי חי . הגדר את עוצמת הלייזר עבור כל ערוץ. התחל עם עוצמת לייזר נמוכה כדי למנוע פוטוהלבנה. הגדל לאט את עוצמת הלייזר והתאם את הרווח וההיסט של הגלאי כדי להגביר את האות מבלי להכניס רעש מוגזם לפי הצורך כדי לדמיין את הקרינה בבירור ללא חשיפת יתר.
    הערה: יש להתאים את הפרמטרים כדי למזער את רעשי הרקע ולמנוע רוויה של האות. חיוני לשמור על הגדרות עקביות בכל הדגימות בסדרה של ניסויים, כולל בקרות שליליות.
  10. הגדר פרמטרים של תמונה כגון גודל חור ( למשל, יחידה אוורירית אחת), מהירות סריקה (למשל, 8), גורם זום (למשל, 1), טווח ערכי בהירות (למשל, 16 סיביות), ומספר ממוצע (למשל, 2), מצב (למשל, קו) ושיטה (למשל, ממוצע) לפי הצורך כדי להגיע לתצפית הרצויה.
    הערה: ערכים אלה תלויי מערכת ודגימה ויש למטב אותם לפני הרכישה. גודל חור הסיכה תלוי בצמצם המספרי, בהגדלה ובאורך הגל: הקטנת החור עשויה לשפר את הרזולוציה על חשבון יחס האות לרעש. מומלץ להגדיר את מהירות הסריקה לערכים מהירים (המתאימים לזמן שהייה קטן לפיקסל) כדי למנוע הלבנה באור.
  11. בצע את הרכישה ושמור נתונים בפורמט הרצוי עם מטא נתונים מתאימים לעיון עתידי.
  12. לאחר סיום הרכישה, החזירו את הדגימה לצלחת 6 הבארות על ידי הוספת כמות קטנה של מים נטולי יונים כדי להקל על ההעברה עם זוג פינצטה.
    הערה: שלב 6.12 מתבצע רק אם יש צורך בהרחבה של מדגם מסוים זה. אחרת, השלך את הדגימה והשתמש בשכפולים אחרים עבור השלבים הבאים.

7. פרוטוקול מיקרוסקופ הרחבה

הערה: הדגימות מוגנות ככל האפשר מפני האור כדי למנוע פוטוהלבנה. שלבי העיגון והג'לציה מתבצעים מתחת למכסה אדים.

  1. עיגון
    1. דגרו את הדגימות עם N-acryloylsuccinimide (NAS) בריכוז של 3.2 מ"ג/מ"ל ב-PBS על שייקר מכני למשך שעה בטמפרטורת החדר. הכן כמות מספקת של תמיסה להוספת 500 מיקרוליטר תמיסה לבאר (תמיסת מלאי: 16 מ"ג/מ"ל NAS ב-DMSO).
      הערה: NAS מגיב עם שאריות הליזין ו-N-termini של חלבונים כדי להשתיל קבוצת אקרילויל, מה שמאפשר לחלבונים לעגן להידרוג'ל בשלבים הבאים.
    2. שטפו 3x עם 1 מ"ל PBS.
  2. ג'לציה
    1. הכן תמיסת מונומר המורכבת באופן הבא: ב 50 מ"ל של 1x PBS (pH 7.4), הוסף 5.843 גרם NaCl, 1.25 גרם אקרילאמיד, 0.075 גרם ביס-אקרילאמיד ו -4.313 גרם נתרן אקרילט. הכן מספיק תמיסה כדי למרוח 70 מיקרוליטר על כל כיסוי. יש להקפיא 1 מ"ל לפחות 24 שעות לפני הג'לציה.
      זהירות: המונומרים רעילים; יש לטפל בהם בזהירות עם ציוד מיגון מתאים ולשקול אותם מתחת למכסה אדים.
    2. על פיסת פרפילם, מניחים טיפה של 70 מיקרוליטר של תמיסת מונומר, ואחריה תוספת של 1.4 מיקרוליטר של 10% (v/v) N,N,N′,N′-tetramethylethylenediamine (TMEDA), ואז 1.4 מיקרוליטר של 10% (w/v) אמוניום פרסולפט (APS), המעורבבים בטיפה.
      הערה: יש להוסיף את ריאגנטים צולבים בסדר ספציפי זה, תחילה TMEDA ולאחר מכן APS.
    3. במהירות, הנח את הכיסוי בזהירות על התמיסה כשהתאים פונים כלפי מטה.
    4. אפשר לתמיסה להתפלמר למשך שעה בטמפרטורת החדר בתא לח.
  3. עיכול
    1. הכן תמיסת חיץ עיכול המורכבת ממאגר 1x TAE, 0.5% (v/v) Triton X-100, 0.8 M guanidine HCl ו-8 U/mL פרוטאינאז K.
      הערה: יש להכין את מאגר העיכול טרי ולדגור מראש למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס לפני השימוש.
    2. הוסף 1 מ"ל של מאגר עיכול להידרוג'ל שנוצר בשלב 7.2. אפשר לעיכול להמשיך במשך 3 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס על שייקר מכני.
    3. הסר את מאגר העיכול ושטוף בעדינות את הג'ל פי 3 עם 2 מ"ל מים נטולי יונים.
      הערה: ההידרוג'ל יתרחב מעט וינתק את עצמו מהחלקת הכיסוי.
  4. הרחבה
    1. השאירו את ההידרוג'ל להתרחב ב -3 מ"ל מים נטולי יונים למשך שעתיים. החלף את המים כל 30 דקות.

8. הדמיה לאחר הרחבה של דגימות

  1. הנח כיסוי בקוטר 32 מ"מ (עובי 130-170 מיקרומטר) והדק אותו על מחזיק.
  2. חותכים חתיכה מההידרוג'ל ומניחים אותה על החלקת הכיסוי, כשהתאים בתחתית הג'ל.
    הערה: החלקים שנכרתו צריכים להיות גדולים מספיק כדי לספק שטח פנים הולם לתצפית אך לא גדולים מדי, מכיוון שהדבר עלול להקשות על הטיפול בג'ל ולהגביר את הסיכון לשבירה (גודל מומלץ: 5 עד 8 מ"מ). הנח מספיק חתיכות הידרוג'ל כדי לכסות את כל שטח הכיסוי; זה יעזור לאבטח את החלקים במקומם ולמנוע כל סחף במהלך ההדמיה. במקרה של בעיות סחיפה, ציפוי מראש של הכיסויים בפולי-D-ליזין עשוי להתגלות כיתרון6.
  3. הנח את המחזיק על שלב המיקרוסקופ מעל המטרה.
  4. בצע את רכישת התמונה במיקרוסקופ קונפוקלי לסריקת לייזר עם מטרת טבילת שמן כמתואר בשלב 6.

9. חישוב גורם התפשטות (EF) ב-ImageJ

  1. פתח את נתוני ההדמיה בתוכנה החינמית ImageJ או שווה ערך.
  2. אם אתה עובד על תמונה מרובת ערוצים, פצל את הערוצים ועבוד רק על ערוץ הגרעין על ידי ניווט אל בחר תמונה | צבע | פיצול ערוצים.
  3. כדי למדוד את קוטר הגרעין, הדגש את האות המתאים לגרעין על ידי קביעת סף על ידי לחיצה על בחר תמונה | התאם | סף.... בחרו שיטה בתפריט הנפתח של ברירת המחדל המתאימה ביותר לתמונה (למשל, Otsu), והתאימו את הסף עד שצורת הגרעין תיחתך בבירור מהרקע.
    הערה: יש להתאים את הגדרת הסף עבור כל תמונה, מכיוון שייתכן שהגדרה אחת לא תתאים לכל התמונות או לכל דגימה.
  4. הגדר את המדידה לקביעת קוטר החמוס על ידי לחיצה על בחר נתח | הגדר מידות.... מהתפריט, בחר קוטר חמוס והתאם את המספר העשרוני במידת הצורך.
  5. כדי להתחיל בניתוח התמונה, לחץ על בחר נתח | לנתח חלקיקים כדי להגדיר את גודל החלקיקים; עבור הגרעין, בחר 5-אינסוף מיקרומטר רבוע | הצג תוצאות | הוספה למנהל | לא לכלול בקצוות ובשכבת-על. התחל את הניתוח.
  6. עם תחילת הניתוח, יופיעו חלונות מרובים. בתוצאות החלון, חפש את קוטר החמוס המקסימלי של כל גרעין בעמודה Feret. העתק-הדבק את הנתונים הגולמיים בגיליון אלקטרוני וחשב את גודל הגרעין הממוצע עבור דגימות מורחבות ומורחבות מראש.
    הערה: ודא שאזורי העניין (ROIs) המתאימים לכל גרעין עוקבים אחר כל הפריפריה של הגרעין.
  7. חשב את מקדם ההתפשטות (EF) באופן הבא:
    EF = figure-protocol-1
    הערה: גורם ה-EF קובע כמה הדגימה הורחבה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

להלן היישום של הפרוטוקול להמחשת גליקופרוטאינים סיאליליים בתאי HeLa (איור 3A) ותאי MCF7 (איור 3B), תוך השמטת טיפול ב-CQ (סעיף פרוטוקול 2) וצביעה של אימונופלואורסצנציה (שלב פרוטוקול 5.3).

figure-results-1
איור 3: השוואה של תבנית תיוג הסיאלילציה לפני (משמאל) ואחרי (מימין) של פרוטוקול ExM. <...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

פרוטוקול התיוג הנוכחי של CuAAC אינו כולל אמינוגואנידין במאגר התגובה. מכיוון שהוא מכוון להמחשת גליקוקונוגטים תוך-תאיים, הוא מבוצע על תאים המקובעים לאחר שלב השילוב המטבולי, כדי למנוע כל בעיית ציטוטוקסיות ולשפר את ספיגת המערכת הקטליטית. השימוש באמינוגואנידין מומלץ בדרך כלל לתיוג פני התא של תאים חיים כדי למנוע תגובות לוואי בין דהידרו-אסקורבט לשאריות ארגינין, היסטידין, וליזין של חלבונים28. שינויים אלה אכן יכולים להשפיע על תפקוד החלבון ועלולים לגרום להפרעות או ציטוטוקסיות. שיקול חשוב נוסף עבור מאגר התגו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין אינטרסים פיננסיים מתחרים או ניגודי אינטרסים אחרים.

תודות

אנו מודים למתקני TisBio ולפלטפורמת PLBS על מתן הסביבה הטכנית התורמת להשגת עבודה זו. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מה-CNRS וממשרד המחקר העליון. ברצוננו להודות לד"ר פרנסואה פולקייה, ד"ר זואי דורין, גב' דורותי ויקון וגב' סלין שולץ על שעוררו דיונים ועל שסיפקו לנו את קו התאים פיברובלסטים 533T ואת הנוגדן העיקרי GM130.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
(+) נתרן L-אסקורבטסיגמא אולדריץ'11140
צלחת תרבית תאים 12 בארקורנינג3513
אקרילאמידסיגמא אולדריץ'A8887
חומצה אקרילית N-hydroxysuccinimide ester סיגמא אולדריץ'A8060
אלקסה פלואור 488 אלקין Jena BioscienceCLK-1277-5
Alexa Fluor 546 עיזים נגד עכברים IgGInvitrogenA11003
אמוניום פרסולפטסיגמא אולדריץ'9913
ביס-אקרילאמידסיגמא אולדריץ'146072
BSAסיגמא אולדריץ'A7906
BTTAAJena BioscienceCLK-067-100
צינור צנטריפוגה 2 מ"לEPPENDORF30120094
מלח כלורוקווין דיפוספטסיגמא אולדריץ'C6628
צינור חרוטי 15 מ"לפלקון352097
כיסוי מחליק 12 מ"מ #1eprediaCB00120RA120MNZ0
כיסוי מחליק 32 מ"מ #1eprediaCB00320RA140MNZ0
CuSO4סיגמא אולדריץ'209198
DMEM מדיום גלוקוז גבוה DutscherL0104-500
Dulbecco's Phosphate Buffered Salt (PBS) DutscherL0615-500
סרום בקר עובריbiowestS1810-500
פיברובלסט 533T-נאסף מאדם בריא
FIJI ImageJ 2.9.0--
ג'לטיןביו-RAD170-6537
גואנידין HClסיגמא אולדריץ'50950
תאי HeLaATCCCCL-2
Hoechst 33342Sigma Aldrich14533
Imaris 10.2--
K2HPO4EuromedexPB0447-Bנטול מים
LSM 780 מיקרוסקופיה קונפוקלית Zeiss-MCF7
ATCCHTB-22
N-אצטילמנוזאמין (ManNAc)BIOSYNTHMA05269
NaClCarlo Erba479687-N-azidoacetylmannosamine
(ManNAz)BIOSYNTHMA46002
Objectif "Plan-Apochromat" 63x/1,4 Oil DIC M27Zeiss420782-9900-799 
מי מלח חוצץ פוספט (PBS) 10xEuromedexET330
Proteinase KSigma AldrichP2308מ  Tritirachium album
עכבר מטוהר GM130 נוגדןBD Bioscience61082250 ומיקרו; g
נתרן אקרילט Sigma Aldrich408220
T75 בקבוקקורנינג430641
TEMEDסיגמא אולדריץ'T9281
tris אצטט EDTA (TAE) 10xEuromedexEU0202-B
Triton X-100Sigma AldrichX-100
Trypan BlueDutscher702630
Trypsine-EDTA 1xDutscherL0930-100

מקורות

  1. De Souza, N. Light microscopy at the limit. Nat Cell Biol. 11 (Suppl 1), S22(2009).
  2. Tam, J., Merino, D. Stochastic optical reconstruction microscopy (STORM) in comparison with stimulated emission depletion (STED) and other imaging methods. J Neurochem. 135, 643-658 (2015).
  3. Jeong, S., Widengren, J., Lee, J. C. Fluorescent probes for STED optical nanoscopy. Nanomaterials. 12 (1), 21(2021).
  4. Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. Expansion microscopy. Science. 347 (6221), 543548(2015).
  5. Kang, S., et al. Expansion microscopy with a thermally adjustable expansion factor using thermoresponsive biospecimen-hydrogel hybrids. ACS Appl Mater Interfaces. 13 (24), 2896228974(2021).
  6. Sun, D., et al. Click-ExM enables expansion microscopy for all biomolecules. Nat Methods. 18 (1), 107113(2020).
  7. Dube, D., Bertozzi, C. Metabolic oligosaccharide engineering as a tool for glycobiology. Curr Opin Chem Biol. 7 (5), 616625(2003).
  8. Scache, J., et al. Switching azide and alkyne tags on bioorthogonal reporters in metabolic labeling of sialylated glycoconjugates: a comparative study. Sci Rep. 12 (1), 22129(2022).
  9. Holst, S., Wuhrer, M., Rombouts, Y. Glycosylation characteristics of colorectal cancer. Adv Cancer Res. 126, 203256(2015).
  10. Boyaval, F., et al. N-Glycomic signature of stage II colorectal cancer and its association with the tumor microenvironment. Mol Cell Proteomics. 20, 100057(2021).
  11. Ferreira, J. A., et al. Protein glycosylation in gastric and colorectal cancers: Toward cancer detection and targeted therapeutics. Cancer Lett. 387, 32-45 (2017).
  12. Jennings, M. P., Day, C. J., Atack, J. M. How bacteria utilize sialic acid during interactions with the host: snip, snatch, dispatch, match and attach. Microbiology. 168 (3), 001157(2022).
  13. Gilormini, P. A., et al. A sequential bioorthogonal dual strategy: ManNAl and SiaNAl as distinct tools to unravel sialic acid metabolic pathways. Chem Commun. 52 (11), 2318-2321 (2016).
  14. Vanbeselaere, J., et al. Alkynyl monosaccharide analogues as a tool for evaluating Golgi glycosylation efficiency: application to Congenital Disorders of Glycosylation (CDG). Chem Commun. 49 (96), 11293-11295 (2013).
  15. Gilormini, P. A., et al. Chemical glycomics enrichment: imaging the recycling of sialic acid in living cells. J Inherit Metab Dis. 4 (3), 515523(2018).
  16. Rigolot, V., Biot, C., Lion, C. To view your biomolecule, click inside the cell. Angew Chem. 60 (43), 2308423105(2021).
  17. Qin, W., et al. Artificial cysteine S-glycosylation induced by per-O-acetylated unnatural monosaccharides during metabolic Glycan Labeling. Angew Chem. 130 (7), 1835-1838 (2018).
  18. Qin, K., Zhang, H., Zhao, Z., Chen, X. Protein S-glyco-modification through an elimination-addition mechanism. J Am Chem Soc. 142 (20), 9382-9388 (2020).
  19. Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V., Sharpless, K. B. A. Stepwise Huisgen cycloaddition process: Copper(I)-catalyzed regioselective "ligation" of azides and terminal alkynes. Angew Chem. 41 (14), 25962599(2002).
  20. Agard, N. J., Prescher, J. A., Bertozzi, C. R. A strain-promoted [3 + 2] azide−alkyne cycloaddition for covalent modification of biomolecules in living systems. J Am Chem Soc. 126 (46), 15046-15047 (2004).
  21. Mbua, N. E., et al. Strain-promoted alkyne-azide cycloadditions (SPAAC) reveal new features of glycoconjugate biosynthesis. ChemBioChem. 12 (12), 19121921(2011).
  22. Blackman, M. L., Royzen, M., Fox, J. M. Tetrazine ligation: Fast bioconjugation based on inverse-electron-demand Diels-Alder reactivity. J Am Chem Soc. 130 (41), 1351813519(2008).
  23. Devaraj, N. K., Weissleder, R., Hilderbrand, S. A. Tetrazine-based cycloadditions: Application to pretargeted live cell imaging. Bioconjug Chem. 19 (12), 22972299(2008).
  24. Bird, R. E., et al. Bioorthogonal chemistry and its applications. Bioconjug Chem. 32 (12), 2457-2479 (2021).
  25. Slade, P. G., et al. Identifying the CHO secretome using mucin-type O-linked glycosylation and click-chemistry. J Proteome Res. 11 (12), 61756186(2012).
  26. Gambarotto, D., Hamel, V., Guichard, P. Ultrastructure expansion microscopy (U-ExM). Methods Cell Biol. 161, 5781(2021).
  27. Gambarotto, D., et al. Imaging cellular ultrastructures using expansion microscopy (U-ExM). Nat. Methods. 16, 71-74 (2019).
  28. Presolski, S. I., Hong, V. P., Finn, M. Copper-catalyzed azide-alkyne click chemistry for bioconjugation. Curr Protoc Chem Biol. 3 (4), 153-162 (2011).
  29. Santiago, F., et al. Synthesis and swelling behaviour of poly(sodium acrylate)/sepiolite superabsorbent composites and nanocomposites. Polym Int. 55 (8), 843848(2006).
  30. Wen, G., et al. Evaluation of direct grafting strategies via trivalent anchoring for enabling lipid membrane and cytoskeleton staining in expansion microscopy. ACS Nano. 14 (7), 78607867(2020).
  31. Wen, G., et al. Current progress in expansion microscopy: Chemical strategies and applications. Chem Rev. 123 (6), 32993323(2023).
  32. Drelich, L., et al. Toward high spatially resolved proteomics using expansion microscopy. Anal Chem. 93 (36), 12195-12203 (2021).
  33. Zwettler, F. U., et al. Molecular resolution imaging by post-labeling expansion single-molecule localization microscopy (Ex-SMLM). Nat Commun. 11 (1), 3388(2020).
  34. Liu, J., et al. Expansion microscopy with multifunctional polymer dots. Adv Mater. 33 (25), 2007854(2021).
  35. Klimas, A., et al. Magnify is a universal molecular anchoring strategy for expansion microscopy. Nat Biotechnol. 41 (6), 858869(2023).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

הדמיה של סיאלילציה תוך-תאית עם כימיה של קליק ומיקרוסקופ הרחבה
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.