מאמר שיטה

תהליך עבודה מהיר ופשוט לכימות מבני דרוזופילה חיצוניים למבוגרים

DOI:

10.3791/67485

⸱

8 בנובמבר 2024

 ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, San José State University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מציגים זרימת עבודה מהירה, בעלות נמוכה, עבור הדמיה ברזולוציה גבוהה של עיני דרוזופילה בוגרות כדי לכמת דפוסי דפוס ופגמי גדילה. אנו מתארים את הפרוטוקול שלנו להכנת דגימות על ידי הרכבה נקודתית, רכישת תמונה ברזולוציה גבוהה וניתוח תמונה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עין תרכובת דרוזופילה היא רקמה בעלת תבנית מדויקת שחשפה מנגנונים מולקולריים ותהליכים ביולוגיים המניעים מורפוגנזה. זהו מבנה פשוט של עיני יחידה חוזרות, המכונה ommatidia, המשמש לאפיון אינטראקציות גנטיות ותפקודי גנים. מוטציות המשפיעות על ארכיטקטורת העין ניתן לזהות ולנתח בקלות; לפיכך, מערכת זו משמשת לעתים קרובות במוסדות חסרי משאבים. ניתוח פנוטיפי נוסף כולל לעתים קרובות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM) כדי להפיק תמונות בהגדלה גבוהה המתאימות לניתוח כמותי. עם זאת, SEMs הם יקרים ודורשים ריאגנטים יקרים; הכנת הדגימה משתרעת על פני ימים; ולעתים קרובות, הם זקוקים לצוות במשרה מלאה להכנת דגימות ותחזוקת מכשירים. זה מגביל את התועלת שלהם במוסדות חסרי משאבים או במהלך צנע תקציבי. באנטומולוגיה, השימוש בטכנולוגיית הדמיה דיגיטלית ברזולוציה גבוהה הוא פרקטיקה נפוצה לזיהוי ואפיון מינים. מאמר זה מתאר שיטה המשלבת אסטרטגיות ומאפשרת הדמיה דיגיטלית ברזולוציה גבוהה של מבני דרוזופילה בוגרים וניתוח כמותי באמצעות התוכנה הפתוחה ImageJ. זרימת העבודה היא חלופה מהירה וידידותית לסטודנטים המתקנת את המגבלות של מתקני מחקר תת-ממומנים ותת-משאבים עם גישה חסכונית ומהירה לניתוח פנוטיפי כמותי.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Drosophila melanogaster הוא אורגניזם מודל גנטי רב עוצמה המשמש במשך עשרות שנים כדי להבהיר מסלולי איתות מולקולרי והתנהגויות תאיות. רבים ממסלולי האיתות שהשתמרו אבולוציונית וחיוניים להתפתחות רב-תאית זוהו לראשונה ומנגנון הפעולה שלהם הוגדר בדרוזופילה. כ 65-75% מכל הגנים הקשורים למחלות אנושיות יש אורתולוגים Drosophila 1,2. עין הדרוזופילה הבוגרת היא מודל חשוב שאיפשר בדיקות גנטיות בלתי משוחדות שאפשרו גילוי גנים שמורים חשובים המעורבים במחלות אנושיות, כולל סרטן 3,4, ניוון עצבי 5 והפרעות מטבוליות6.

עין הדרוזופילה מורכבת מ~800 עיני יחידה, הנקראות אומטידיה, המסודרות במדויק בתבנית משושה על פני השטח של העין הבוגרת7. כל אומטידיום מורכב משמונה נוירונים קולטי אור התופסים מיקום מובחן בתוך טרפז א-סימטרי. אלה נתמכים על ידי ארבעה תאי חרוט לא עצביים ושני תאי פיגמנט ראשוניים המפרישים עדשה ופסאודו-חרוט כדי למקד אור על הרבדומרים קולטי האור של נוירוני קולטני האור. אומטידיה שכנה מופרדת על ידי שורה אחת של תאי סריג אינטראומטידיאלים, המורכבים מתאי פיגמנט משניים, תאי פיגמנט שלישוניים וקומפלקסי זיפים מכנו-סנסוריים 8,9,10.

הפרעות בהתפתחות העיניים נראות בעיניים בוגרות כגודל עיניים מוגדל או קטן, שפע חריג או מבנה של עדשות או זיפים, או כ"עין מחוספסת" שבה דפוס המשושה האינווריאנטי בדרך כלל משתבש כך שלא ניתן עוד לעקוב אחר שורה של אומטידיה על פני השטח של העין. ניתן להבקיע פנוטיפים אלה ברמת הרקמה הגסה באמצעות מיקרוסקופים מנתחים. ניתוח מפורט של פנוטיפים כולל באופן מסורתי סריקת מיקרוסקופ אלקטרונים ואחריו ניתוח תמונה כמותי11. עם זאת, סריקת מיקרוסקופ אלקטרונים דורשת מכשור יקר, ריאגנטים יקרים, הכנת דגימות המתפרשת על פני ימים, ולעתים קרובות, צוות במשרה מלאה לתחזוקה.

figure-introduction-1
איור 1: תהליך עבודה להדמיית מבני דרוזופילה בוגרים. (A) לאסוף ולתקן דרוזופילה בוגרת באתנול 70%. (B) הכינו דגימות להדמיה על ידי הרכבה נקודתית והצמדה לפינים. (C) קבל תמונות ברזולוציה גבוהה באמצעות ערימת מיקוד ושילוב. (D) כימות תמונות באמצעות FIJI. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

מאמר זה מציג תהליך עבודה זול יחסית, בעל זמן הכנת דגימה קצר, ניתן להציב אותו בקלות על ספסל מעבדה בגובה 3 מטרים, אינו דורש חומרים מסוכנים, ויכול להיות תוספת ארוכת חיים למעבדות מחקר דרוזופילה (איור 1). הרכבה נקודתית היא טכניקה אנטומולוגית המשמשת לייבוש באוויר ולשימור חרקים קטנים ובעלי גוף רך, כגון דרוזופילה12. שיטה זו מסתמכת על שילוב מטרות מיקרוסקופ עם מצלמות DSLR ברזולוציה גבוהה להגדלות יעילות של פי 10 עד פי 1,000. עומק השדה המוגבל הטבוע בצילום מאקרו מתגבר על ידי הערמת מיקוד: תפירת סדרה של תמונות כאשר מישור המוקד נע דרך הדגימה המעניינת13. שיטה זו מניבה תמונות ברזולוציה גבוהה המתאימה לכימות פנוטיפים וניתן להתאים אותה בקלות למבנים אחרים בעלי עניין, כגון כנף, רגל, בית חזה ובטן. תהליך העבודה של ניתוח התמונה משתמש בתוכנית ניתוח התמונות החינמית FIJI (NIH ImageJ). מתודולוגיה זו הופכת את הכנת הדגימות, הדמיה ברזולוציה גבוהה וניתוח לנגישים לסטודנטים לתואר ראשון ולמדענים במוסדות חסרי משאבים.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. איסוף וקיבוע דרוזופילה למבוגרים

  1. הגדירו צלבי דרוזופילה או זנים נבחרים והניחו אותם בבקבוקונים המכילים מזון לזבובים. לדגור על הבקבוקונים בטמפרטורה הרצויה (בדרך כלל 25 מעלות צלזיוס) עד שהזבובים התפתחו והמבוגרים נסגרים (~ 10-14 ימים ב 25 מעלות צלזיוס).
  2. הרדימו את הזבובים עםCO2 והניחו אותם על כרית CO2 .
  3. מיין את הזבובים עם נוצה ובחר את הפרטים עם הפנוטיפ הרצוי (למשל, כנפיים ישרות). צור סדרן זבוב נוצות על ידי חיתוך נוצת אווז כך שתתאים לקצה המחודד של פיפטה סרולוגית של 1 מ"ל.
  4. הכינו צינור מיקרוצנטריפוגה 1.7 מ"ל עם 1 מ"ל של 70% אתנול. מניחים את הזבובים שנבחרו בצינור המיקרוצנטריפוגה ומניחים קרח. אחסנו את צינורות המיקרוצנטריפוגות בטמפרטורה של 4°C למשך הלילה (איור 2A).
    הערה: אין לשמר זבובים באתנול למשך יותר מ-24 שעות. אחסון ארוך טווח של זבובים באתנול 70% יגרום לאובדן פיגמנט בעיניים ובגוף.

2. הכנת דגימה על ידי הרכבה נקודתית

הערה: דרוזופילה הם חרקים בעלי גוף רך שהופכים שבירים וקורסים כאשר הם מיובשים באוויר; לכן, פרוטוקול זה דורש שהדגימות יצולמו באותו יום שבו הן מותקנות. עבוד בקבוצות קטנות של ~5 זבובים בכל פעם כדי למנוע אובדן דגימה. הגדל את מספר הדגימות בקבוצה בהתבסס על יעילות. דגימות הדורשות זמן רב יותר לפני הדמיה יכולות להתייבש באמצעות סדרה של ריכוז הולך וגדל של hexamethyldisilazane (HMDS)14.

  1. חתך נקודות משולש קטנות (7.1 מ"מ x 2.7 מ"מ) מקרטון ארכיוני במשקל 65 ליברות באמצעות ניקוב נקודתי מיוחד. הכינו נקודות על-ידי כיפוף החוד (הצר ביותר ב-25%) לזווית של 90° בעזרת מלקחיים עדינים מסוג Dumont #5 (איור 2B).
  2. באמצעות מלקחיים עדינים של Dumont #5, הסר את הזבובים מצינורות המיקרוצנטריפוגות (שלב 1.4). הכתם בעדינות את הזבובים ברקמת מעבדה נטולת סיבים כדי להסיר עודפי אתנול. מקמו כל זבוב על צדו השמאלי על כרטיס אינדקס תחת מיקרוסקופ מנתח.
    הערה: הסר את הזבובים מהצינור על ידי אחיזה במבנה אנטומי שאינו אזור העניין - כאשר אנו מדמים את הראש, אנו מחזיקים דגימות על ידי הכנף או הרגל. אין להחזיק דגימות ליד הבטן, מכיוון שמבנה זה משמש להדבקת הזבוב על נקודת הקלף.
  3. הכינו את דבק הסתרה, התאמת עקביותו לצמיגות הרצויה. ערבבו 1-2 טיפות של דבק הסתרה עם 1-2 טיפות מים שעברו דה-יוניזציה (DI), וערבבו עם צינור העברה על כרטיס אינדקס. הרימו נקודת קלף מוכנה בקצה הרחב בעזרת מלקחיים, והניחו כמות קטנה של הדבק המדולל על הקצה הכפוף של הנקודה על-ידי טבילתה לתוך תערובת הדבק-מים (איור 2C).
    הערה: הדבק צריך להיות ניתן למריחה אך לא נוזלי.
  4. מרחו את הקצה הכפוף של הנקודה על הצד הקדמי של הבטן הימנית סביב מקטעי בטן 2-3 (איור 2C). לפני שהדבק מתייבש, בצעו התאמות קלות בזבוב כך שהציר הקדמי-אחורי של הזבוב יהיה מאונך לקצה הכפוף של הנקודה.
  5. הכניסו פין הרכבה מס' 3 לקצה הרחב של נקודת הכרטיס (איור 2D) והדקו אותו לגוש הצמדת חרקים (איור 2E). תייג כל סיכה או שורת סיכות בגנוטיפ המתאים.

figure-protocol-1
איור 2: הכנת הדגימה. (A) דרוזופילה בוגרת ממוינת על פי סמנים פנוטיפיים ונאספת לצינורות מיקרוצנטריפוגות מסומנים המכילים 70% אתנול על קרח. הזבובים מאוחסנים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. (B) נקודות כרטיס נייר מוכנות על ידי כיפוף הקצה הצר 90° משאר הכרטיס באמצעות זוג #5 מלקחיים. (C) זבובים מוחלצים מצינורות ומאפשרים להם להתייבש באוויר לזמן קצר. דבק הסתר נמרח על הקצה הקטן והמקופל של נקודת הקלף המוכנה ומודבק לזבוב הבוגר במקטעים 2-3 בבטן. (D) הדגימות מותקנות, עם תווית זיהוי, על סיכת חרק נירוסטה #3. (E) דגימות מוצמדות מאוחסנות בלוח דגימה עד שהן מוכנות לרכישת תמונה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

3. רכישת הדמיה בערימת מיקוד ברזולוציה גבוהה

  1. קבל צילומים ברזולוציה גבוהה של עיני זבוב באמצעות מערכת הדמיה מורכבת ומותאמת אישית להערמת פוקוס שהורכבה ומותאמת אישית.
    1. צלם תמונות עם גוף מצלמת DSLR עם עדשת טלפוטו 70-200 מ"מ המחוברת ליעד מיקרוסקופ Apo 20x באמצעות מתאם עדשת 77 מ"מ.
    2. ודאו שהדגימה מוארת באמצעות הבזק דרך מפזר (איור 3).
    3. שלוט במיקום Z באמצעות בקר Stackshot ומסילת מאקרו.
    4. חבר את המצלמה, המבזק והבמה הממונעת לחצובת אלומיניום אנודייז כבדה.
  2. מקם כל דגימה נקודתית על גימבל במה אוניברסלי כשהראש מכוון כך שהעין פונה לכיוון העדשה. בצע התאמות מיקום הראש על ידי הזזת הראש בעדינות עם המלקחיים.
    התראה: התאמות גדולות ומהירות עלולות לגרום לעריפת ראשים בשוגג.
  3. כאשר המצלמה קשורה למחשב נייד, התאם את הגדרות הרכישה בתוכנה. דגימות צילום בהגדלה של 20x עם ההגדרות הבאות: עוצמת הבזק 1/32, מהירות תריס 1/200, צמצם F2.8 ו-ISO 400. ודא שכל תכונות המיקוד האוטומטי וייצוב התמונה כבויות.
    הערה: הגדרות אלה מאזנות בין תאורת המבזק האופטימלית, מהירות התריס ועומק השדה. יהיה צורך להתאים אותם להגדלות אחרות ו / או שילובי עדשות.
  4. קבעו את המיקום לשמירת אוסף התמונות שנוצר (10-50 תמונות) בתיקיית הקבצים הרצויה. ודא קיבולת אחסון מספקת עבור התמונות (~ 8.5 MB לתמונה).
  5. התאם את הגדרות מחסנית המיקוד ביחידת הבקרה Stackshot במצב מרחק אוטומטי.
    1. הגדר את גודל הצעד ל- 5 מיקרומטר וחשב את מספר השלבים על-ידי הגדרת מיקומי ההתחלה והעצירה של ערימת המיקוד.
    2. הצג את הדגימה במצב LiveView וכשהמצלמה במצב צילום אוטומטי כדי לזהות את מיקומי ההתחלה והעצירה.
    3. הזז את המסילה כך שהחלק הקרוב ביותר של הדגימה יהיה בפוקוס (הגדר את מיקום ההתחלה ), ולאחר מכן עבור למקום שבו התכונה הרחוקה ביותר של עניין נמצאת בפוקוס (קבע מיקום קצה ).
  6. החזר את המצלמה למצב צילום ידני והתחל את רכישת התמונה מיחידת הבקרה Stackshot.
    הערה: זמן רכישת התמונה תלוי בגודל הדגימה. ככל שעומק השדה הדרוש לדגימות גדולות גדול יותר, כך יותר פרוסות נכללות באוסף התמונות, מה שיאריך את זמן הרכישה הכולל.
  7. פתח קבצים בתוכנת ערימת המיקוד שבוצעה אליה הפניה. צור תמונה מוערמת על-ידי לחיצה על ערימה | יישור וערמה הכל (PMax).
  8. שמור את התמונה הסופית בכונן הקשיח של המחשב כקובץ .tif על-ידי לחיצה על קובץ | שמור תמונת פלט.
    הערה: בהתאם לרזולוציה של קובץ התמונה המוערם ומספר הדגימות המצולמות, ייתכן שיהיה צורך בכוננים קשיחים חיצוניים גדולים (1 TB) לגיבוי תמונה. בפרוטוקול זה, ערימת תמונות היא כ- 100 MB כל אחת לפני דחיסה.

figure-protocol-2
איור 3: רכישת תמונה. (א) מכשיר הדמיה עם חלקים המסומנים כדלקמן: א) גוף מצלמת DSLR; ב) עדשת טלפוטו; ג) 20x Apo מיקרוסקופ מטרה ומתאם; ד) פלאש; ה) מפזרי עדשה וכיפה; ו) בקר Stackshot, מסילת מאקרו ושלב סיבובי; ז) גימבל במה אוניברסלי; ח) חצובה. (B) מכשיר הדמיה עם מפזר אור במקומו. (C) צילום תקריב של דגימה רכובה במקומה לצורך הדמיה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

4. זרימת עבודה לניתוח FIJI לחישוב אזור העיניים למבוגרים

  1. לניתוח תמונות, השג את תוכנת FIJI15 מאתר האינטרנט של ImageJ.net.
  2. בחר תמונות לניתוח שבהן העין ממורכזת ומיושרת עם תאורה מתאימה וטשטוש היקפי מינימלי, המציין יישור נכון עם המצלמה.
  3. כייל את קנה המידה של התמונה.
    1. הורד את תמונת סרגל קנה המידה להגדלה של 20x המתאימה ל- 500 מיקרומטר. לחלופין, בזמן רכישת התמונה, צלם סרגל באמצעות אותן הגדרות. פתח את התמונה בתוכנת FIJI.
    2. מדדו את אורך סרגל קנה המידה (איור 4A). השתמש בכלי קו ישר כדי לעקוב אחר הקו במדויק. לחץ על נתח | למדוד. מרחק פיקסלים זה שווה ערך ל- 500 מיקרומטר (איור 4B).
    3. חישוב פיקסלים למיקרון. השתמש באפשרות זו כדי להמיר מדידות פיקסלים למדידות מיקרומטר.
  4. פתחו את קובץ התמונה המוערם בפיג'י (איור 4C).
  5. בחר זכוכית מגדלת מסרגל הכלים כדי להגדיל את אזור המיקוד. נסו למלא את המסך בעין ובקוטיקולה הקרובה של הראש (איור 4D).
  6. בחר Freehand Select Tool מסרגל הכלים. שרטט את אזור הרשתית קרוב ככל האפשר, לפי קווי המתאר של השורה החיצונית ביותר של אומטידיה (איור 4E). להסרת חלק מהבחירה, לחצו לחיצה ממושכת על לחצן האפשרויות ובחרו בפיקסלים להסרה. להוספה לבחירה, לחצו לחיצה ממושכת על לחצני האפשרויות וההזחה ובחרו בפיקסלים להוספה.
  7. כדי לחשב את האזור, בחר נתח | מדידה מהתפריט העליון (איור 4F). יופיע חלון חדש עם פרמטרים של שטח, ממוצע, מינימום ומקסימום. העתק והדבק נתונים אלה בגיליון אלקטרוני לצורך תיעוד והמרה מפיקסלים למדידות מיקרומטר.
  8. לבצע ניתוחים סטטיסטיים מתאימים.

figure-protocol-3
איור 4: ניתוח תמונות בפיג'י. (A) שינוי קנה מידה של התמונה המקורית. הורד את תמונת הכיול ומדוד את אורך הסרגל של 500 מיקרומטר. (B) התאם את קנה המידה באמצעות הפונקציה Set Scale . (C) פתח את התמונה המוערמת. (D) הגדל את התמונה כך שהעין תהיה ממורכזת וכמעט מסך מלא. (E) השתמש בכלי בחירה חופשית כדי לשרטט את העין בגבול שבין השורה החיצונית ביותר של אומטידיה לבין הקוטיקולה שמסביב. (ו) מדידת האזור באזור שנבחר מחושבת על ידי לחיצה על נתח | מדידה | אזור. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עין דרוזופילה היא מערכת מודל מצוינת לחקר דפוסי רקמות, בקרת גדילה ומוות תאי. לאחרונה פרסמנו מחקר החוקר כיצד pH תוך-תאי (pHi) משפיע על צמיחת רקמות. ראשית, ביססנו מערכת גנטית שבה ביטוי יתר של מחליף נתרן-פרוטונים DNhe2 (האורתולוג של יונקים NHE1) בעין המתפתחת גורם למומים בדפוס ולהתרבות מוגברת16. התפשטות מוגברת עם pHi גבוה יותר נצפית במינים שונים, משמרים ועד יונקים17. עם זאת, ראינו גם כי עם pHi מוגבר, העין הבוגרת נראתה קטנה יותר בגודל בהשוואה לבקרות.

ניתוח כמותי של אזור העיניים למבוגרים נעשה כדי לקבוע כיצד ביטוי מוגבר של DNhe2 מקטין את גודל הרקמה בעין דרוזופילה . תחילה רכשנו תמונות ברזולוציה נמוכה באמצעות מיקרוסקופ עם החדרת עיניים (איור 5A), אולם אלה לא היו באיכות מספקת לביצוע מדידות כמותיות. באופן ספציפי, קצוות העין אינם ממוקדים, ובכך מונעים מדידה מדויקת של אזור העין.

מדדנו את האזור של כל עין בתמונות ברזולוציה גבוהה של עיני דרוזופילה בוגרות (איור 5B). לזבובים המבטאים GMR>DNhe2 היו עיניים קטנות יותר באופן משמעותי (ממוצע 74.28 מיקרומטר2) מאשר בקרת הרקע הגנטי עם1118 זבובים (ממוצע 125.83 מיקרומטר2) או בקרת הנהג GMRGAL4 זבובים הטרוזיגוטיים (ממוצע 142.49 מיקרומטר2), שהיא ירידה של 41% ו-48% בשטח, בהתאמה (איור 5C). ניתן לייחס ירידה זו בגודל העיניים, למרות ההתרבות המוגברת, לרמות גבוהות של מוות תאי.

גנים ידועים של אוטופגיה, כולל Atg1, אשר גורם להיווצרות פאגופורים, שימשו במחקרי אינטראקציה גנטית (איור 5). ההשפעות על גודל העיניים של מבוגרים כומתו באמצעות צילום ברזולוציה גבוהה וניתוח שטח (איור 5B). גודל העיניים שוחזר (129.9 מיקרומטר2 לעומת 74.28 מיקרומטר2) ב-GMR>DNhe2 טס הטרוזיגוטי עבור Atg13 בהשוואה ל-GMR>DNhe2 בלבד והיה דומה לבקרות (איור 5C). בשילוב עם ניתוח סמנים מולקולריים, התוצאות שלנו תומכות במוות מוגבר של תאים אוטופגיים ב-pHi גבוה יותר.

figure-results-1
איור 5: הצלה של ירידה בגודל הרשתית הקשורה לעלייה ברמת החומציות התוך-תאית עם ירידה באוטופגיה. (A) תמונות ברזולוציה נמוכה של עיני זבוב בוגרות שצולמו במיקרוסקופ עם החדרת עיניים. (B) תמונות ברזולוציה גבוהה של עיני זבוב בוגרות המשמשות לכימות גודל העיניים עבור הגנוטיפים הבאים: w1118; GMRGAL4; GMR>DNhe2; GMRGAL4; אטג13; GMR>DNhe2; אטג13. (C) מידות העיניים הממוצעות שנמדדו למבוגרים היו: w1118 (125.83 מיקרומטר2, N = 7); GMRGAL4 (142.49 מיקרומטר2, N = 9) ו - GMR>DNhe2 (74.28 מיקרומטר2, N = 6), GMRGAL4; Atg13 (146.4 מיקרומטר2, N = 15); GMR>DNhe2; Atg13 (129.9 מיקרומטר2, N = 19) ומצוין על ידי הצגת ערכי חציון עם טווחים בין-רבעוניים. מובהקות סטטיסטית נקבעה על ידי מבחני t לא מזווגים עם התיקון של וולש. הנתונים ב-B וב-C פורסמו בעבר18. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

מסקנותינו מתחזקות על ידי הכנת הדגימה, הדמיה ברזולוציה גבוהה והניתוח המתואר כאן. שיטות אלה אפשרו תיאור מדויק וכמותי של גודל עיני דרוזופילה בוגרות עם גנוטיפים שונים. אנו ממשיכים להשתמש בגישה זו כדי להעריך אינטראקציות גנטיות אחרות שיבהירו מנגנונים של בקרת גדילה תלוית pH.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן אנו מתארים שיטה להכנת דגימה, הדמיה ברזולוציה גבוהה וניתוח של מבני דרוזופילה בוגרים. עין הדרוזופילה היא מערכת מודל גנטית שהניבה תובנות קריטיות לגבי מנגנונים מולקולריים העומדים בבסיס מחלות כולל סרטן19, ניוון עצבי20 ומחלות מטבוליות21. בפרט, נוצרים "אווטארים" של חולי סרטן שבהם נוצרות דרוזופילה טרנסגנית הנושאת מוטציות אונקוגניות וניתן להשתמש בהם לבדיקת תרופות בתפוקה גבוהה22. למרות שאנו מתמקדים בעין הבוגרת, פרוטוקול זה יכול להיות מותאם לניתוח מבנים אחרים של עניין כגון כנף, רגל, בית החזה והבטן.

מיומנויות מוטוריות עדינות נדרשות במספר שלבים קריטיים של פרוטוקול זה. הכנת דגימה של דרוזופילה בוגרת על ידי הרכבה נקודתית דורשת סבלנות ותרגול. אנו ממליצים למתחילים לתרגל הרכבה נקודתית לפני הכנת דגימות נדירות או יקרות. ישנם מספר צעדים קריטיים שידרשו תרגול של מיומנויות מוטוריות עדינות ותשומת לב זהירה.

השלבים הקריטיים הראשונים בפרוטוקול הם הכנת נקודות הקלף ומריחת הדבק להדבקת נקודת הקלף על הבטן (שלב פרוטוקול 2.4-2.5). חשוב למרוח בדיוק את הכמות הנכונה של דבק מכיוון שמבנים אנטומיים מטרה (כלומר, הראש) עשויים להיות מכוסים בדבק אם מורחים יותר מדי או שזה לא העקביות הנכונה. כמו כן, יש להדביק את הדגימה במיקום מתאים, כאשר הציר הקדמי-אחורי ניצב לסיכת ההרכבה. השלב הקריטי השני הוא מיקום הראש להדמיה ברזולוציה גבוהה (שלב פרוטוקול 3.2). חשוב שהראש יהיה מכוון כשהעין פונה לעדשת המצלמה. כדי להתאים את הראש, התאמות קטנות נעשות באמצעות מלקחיים. תנועות עדינות והדרגתיות הן חיוניות מכיוון שעריפת ראש מקרית עלולה להתרחש עם התאמות גדולות או כוחניות. שלב נוסף בו נדרשים מוטוריקה עדינה הוא בעת שימוש בכלי הבחירה Freehand מסרגל הכלים FIJI (שלב פרוטוקול 4.6). כאן, חשוב לעקוב קרוב ככל האפשר לשורה החיצונית של אומטידיה של העין. דיוק זה הוא המפתח למדידות שטח קפדניות וניתנות לשחזור של העין (איור 4E).

שיטות הדמיה כגון מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM) נותרו הגישה העיקרית לדמיין ולנתח מבנים חיצוניים. עם זאת, פרוטוקולי SEM דורשים מהמשתמש לטפל בכימיקלים מסוכנים ולהפעיל מכשירים מרובים, כולל מייבשי נקודות קריטיות, מכשירי ציפוי מרזב וה- SEM עצמו. הכנת הדגימה אורכת מספר ימים ודורשת הכשרה אינטנסיבית ומיומנות. אתגר משמעותי העומד בפני מוסדות אקדמיים הוא ההשקעה הכספית והמחויבות לתחזוקת המכשיר, ומניסיוננו, כוח אדם בעל מומחיות בתחזוקה ותפעול של ציוד זה לרוב אינו נתמך ברמה המוסדית. הפרוטוקול שלנו מפחית עלויות ומבטל חשיפה לכימיקלים מסוכנים במחיר של הדמיה ברזולוציה נמוכה יותר בהשוואה ל- SEM.

המערכת שתוארה במחקר זה הייתה חבילה שהורכבה מראש, אך אופייה המודולרי מאפשר להוזיל את העלות על ידי החלפת רכיבים בודדים בציוד המיוצר בתוך החברה (למשל, שלבי דגימה, מפזרי פלאש), מותגים או דגמים חלופיים, או ציוד שעשוי להיות כבר קיים במעבדה. בעוד שחיבור מטרות המיקרוסקופ למצלמות מאקרו הולך וגובר בקרב חובבים וצלמים מקצועיים, ייתכן שיהיה צורך בניסוי וטעייה עבור שילובים שונים של מטרות ועדשות. כדי לשכפל את המערכת המתוארת כאן, יש לחבר מטרת מיקרוסקופ מתוקן אינסוף לעדשת צינור (עדשת טלפוטו כאן) עם מתאם מושחל מתאים. שיקול נוסף בעת החלפת רכיבים הוא לוודא שמרחק העבודה של העדשה תואם למידות תושבת המצלמה, תושבת הדגימה ומסילת מיקוד המאקרו. לבסוף, תוכנת ערימת הפוקוס שנבחרה כאן היא מסחרית, אך קיימים פתרונות רבים להערמת מיקוד בעלות נמוכה או בחינם לאחר עיבוד, כולל תוספי ImageJ.

בעוד פרוטוקול זה דורש תרגול כדי לשלוט בטכניקות טיפול דגימות, הוא נועד לרכוש ולנתח תמונות ברזולוציה גבוהה לניתוח פנוטיפי מפורט. ההליכים המוצגים כאן מהווים חלופה מהירה וזולה למתודולוגיות הדמיה מסורתיות. על ידי שימוש בטכניקות הדמיה דיגיטלית מבוססות תוכנה חופשית לניתוח כמותי, המתודולוגיה שלנו נגישה ולא תדרוש רכישות תוכנה או עדכונים יקרים. מערך ההדמיה דורש קצת עלות ומאמץ, אך לאחר הקמתו, אמור להיות תוספת ארוכת טווח למעבדות דרוזופילה . שיטה זו מניבה תמונות ברזולוציה גבוהה המתאימה לכימות פנוטיפים וניתן להתאים אותה בקלות למבנים אחרים בעלי עניין, כגון כנף, רגל, בית חזה ובטן. מתודולוגיה זו הופכת את הכנת הדגימות, הדמיה ברזולוציה גבוהה וניתוח לנגישים לסטודנטים לתואר ראשון ולמדענים במוסדות חסרי משאבים.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים רוצים להודות לחברי מעבדת גרילו-היל על הדיונים והתמיכה. אנו מודים לטים אנדריז, רנדי קירשנר, קיטי (נגוק-הונג) נגוין, מרקו פרנט, ג'וני שלוב וליברדו וליז על התמיכה הטכנית המצוינת. עבודה זו נתמכה על ידי פרסי NIH SC3GM132049 ו- 1R16GM153640 (BKGH), פרס מחקר של הפקולטה לביוטכנולוגיה של CSU (LM ו- BKGH), וקרנות הזנק מהמכללה למדעים והמחלקה למדעי הביולוגיה באוניברסיטת סן חוזה (FJL). ציון מיוחד מגיע לברנד בקר על תושייתם ועזרתם בתהליך זה. אנו מודים לקהילת BioIcons (https://bioicons.com/) על אספקת סמלים באיכות גבוהה עבור הדמויות שלנו ובמיוחד ל-Serviere עבור סמל הפיפט, ול-DBCLS עבור הסמלים של דרוזופילה, מלקחיים ומיקרוסקופ אלקטרונים שולחני המשמשים באיור 1 ובאיור 2, אשר מורשים תחת CC-BY 4.0 Unported. אנו מודים גם לקהילת SciDraw (https://scidraw.io/) על אספקת אייקונים באיכות גבוהה עבור הדמויות שלנו, במיוחד Diogo Losch De Oliveira (doi.org/10.5281/zenodo.3925953), אשר מורשים תחת רישיון Creative Commons 4.0 (CC-BY).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
1 מ"ל פיפטה סרולוגיתThermoFisher Scientific170353N
1.7 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגהGenesee Scientific 24-282LR
20x מיקרוסקופ אובייקטיביMitutoyo Corp.378-804-3
ארכיון 65 פאונד כרטיסים נינה בע"מ91901
Canon EF 70-200 מ"מ USM II עדשת טלפוטוCanon3044C002
Canon EOS 6D Mark II DSLR גוף מצלמהCanon1897C002
Diffuser Domeפתרונות מקרוסקופיים PA-DIF-GIM-SM
מפזר עבור Mitutoyo M Plan APO יעדיםפתרונות מקרוסקופיים mitutoyo-diffusers
Drosophila בקבוקונים ותקעיםGenesee Scientific 32-117BF
Dumont #5 מלקחיים עדינים פישרסיינטיפיקNC9889584
נוצות אווז אמזוןB01CMMJI6U
חצובה אלומיניום אנודייז כבדהדברים ממש נכונים, LLCTFA-32G
KimwipesFisher Scientific06-666Aרקמת מעבדה נטולת מוך
Levenhuk M1000 Plus מצלמה דיגיטליתLevenhuk70358
סיכת הרכבה מס' 3אינדיגו אינסטרומנטס33414-3
Nutri-Fly בלומינגטון Drosophila mediaGenesee Scientific 66-113מזון זבוב
פוינט-פונץ'M.C. Mieth Manufacturing, Inc.448פרט
מהדק מברגדברים ממש נכונים, LLCSK-Clampלחיבור מסילת המאקרו לחצובה
בקר Stackshot ומסילת מאקרוCognisys Inc.
מתאם טבעת מוריד מתאם עדשה 763461174207 מצלמת RAFלחיבור מטרת המיקרוסקופ לעדשת המצלמה
דבק טיטבונדפרנקלין אינטרנשיונל5013
Yongnuo YN-24-EX מאקרו Twin Lite פלאששנזן Yongnuo ציוד צילום ושות'.YN-24EX
Software
Canon EOS Utility (v. 3.16.1). תוכנת הרכישהשל Canon
המכונים הלאומיים לבריאותפיג'ישל פיג'י משוחררת כקוד פתוח תחת הרישיון הציבורי הכללי של GNU. FIJI גרסה 2.14.0/1.54f 
תוכנת GraphPad PrismGraphPad, בוסטון, מסצ'וסטס ארה"בפריזמה גרסה 10.3.1
Zerene Stacker (v.1.04)Zerene Systems, LLCתוכנת ערימת פוקוס
ST3X_100_BUNDLE

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rubin, G. M., et al. Comparative genomics of the eukaryotes. Science. 287 (5461), 2204-2215 (2000).
  2. Ugur, B., Chen, K., Bellen, H. J. Drosophila tools and assays for the study of human diseases. Dis Model Mech. 9 (3), 235-244 (2016).
  3. Hodgson, J. A., Parvy, J. -P., Yu, Y., Vidal, M., Cordero, J. B. Drosophila larval models of invasive tumorigenesis for in vivo studies on tumour/peripheral host tssue interactions during cancer cachexia. Int J Mol Sci. 22 (15), 8317(2021).
  4. Lam Wong, K. K., Verheyen, E. M. Metabolic reprogramming in cancer: mechanistic insights from Drosophila. Dis Model Mech. 14 (7), dmm048934(2021).
  5. Bonini, N. M. A perspective on Drosophila genetics and its insight into human neurodegenerative disease. Front Mol Biosci. 9, e1060796(2022).
  6. Drummond-Barbosa, D., Tennessen, J. M. Reclaiming Warburg: using developmental biology to gain insight into human metabolic diseases. Development. 147 (11), dev189340(2020).
  7. Ready, D. F., Hanson, T. E., Benzer, S. Development of the Drosophila retina, a neurocrystalline lattice. Dev Biol. 53 (2), 217-240 (1976).
  8. Johnson, R. I. Hexagonal patterning of the Drosophila eye. Dev Biol. 478, 173-182 (2021).
  9. Weasner, B. P., Kumar, J. P. The early history of the eye-antennal disc of Drosophila melanogaster. Genetics. 221 (1), iyac041(2022).
  10. Pichaud, F., Casares, F. Shaping an optical dome: The size and shape of the insect compound eye. Semin Cell Dev Biol. 130, 37-44 (2022).
  11. Oster, I. I., Crang, R. E. Scanning electron microscopy of Drosophila mutant and wild type eyes. Trans Am Microsc Soc. 91 (4), 600-602 (1972).
  12. Gibb, T. J., Oseto, C. Insect collection and identification: Techniques for the field and laboratory. , Academic Press. (2019).
  13. Mertens, J., Roie, M. V., Merckx, J., Dekoninck, W. The use of low cost compact cameras with focus stacking functionality in entomological digitization projects. ZooKeys. 712, 141-154 (2017).
  14. Brown, B. V. A further chemical alternative to critical-point-drying for preparing small (or large) flies. Fly Times. 11, 10(1993).
  15. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Method. 9 (7), 676-682 (2012).
  16. Grillo-Hill, B. K., Choi, C., Jimenez-Vidal, M., Barber, D. L. Increased H+ efflux is sufficient to induce dysplasia and necessary for viability with oncogene expression. eLife. 4, e03270(2015).
  17. White, K. A., Grillo-Hill, B. K., Barber, D. L. Cancer cell behaviors mediated by dysregulated pH dynamics at a glance. J Cell Sci. 130 (4), 663-669 (2017).
  18. Peralta, J., et al. Drosophila Nhe2 overexpression induces autophagic cell death. Mol Biol Cell. 35 (7), br13(2024).
  19. Munnik, C., Xaba, M. P., Malindisa, S. T., Russell, B. L., Sooklal, S. A. Drosophila melanogaster: A platform for anticancer drug discovery and personalized therapies. Front Genet. 13, 949241(2022).
  20. Nitta, Y., Sugie, A. Studies of neurodegenerative diseases using Drosophila and the development of novel approaches for their analysis. Fly. 16 (1), 275-298 (2022).
  21. Pletcher, R. C., et al. A genetic screen using the Drosophila melanogaster TRiP RNAi collection to identify metabolic enzymes required for eye development. G3: Genes|Genomes|Genetics. 9 (7), 2061-2070 (2019).
  22. Bangi, E., et al. A personalized platform identifies trametinib plus zoledronate for a patient with KRAS-mutant metastatic colorectal cancer. Sci Adv. 5 (5), eaav6528(2019).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

ImageJFocus Stacking

מאמרים קשורים