מאמר שיטה

בדיקת ננו-הזרקת Cisterna Magna מזווגת ובדיקת הדמיית ניגודיות כתמי לייזר לחקר ויסות זרימת הדם במוח in vivo

1.6K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/67544

⸱

8 ביולי 2025

 , 
1Department of Neuroscience, Center for Brain Immunology and Glia (BIG), University of Virginia School of Medicine

במאמר זה

סיכום

כדי לחקור את ויסות זרימת הדם במוח in vivo, שיטות פרמקולוגיות מסורתיות הן פולשניות, ולעתים קרובות פוגעות בגולגולת, בדורה ובלפטומנינג. בעבודה זו, פיתחנו טכניקה זעיר פולשנית המשלבת הזרקת מגנה תוך-ציסטרנלית מונחית ננו-מזרק (ICM) עם הדמיית ניגודיות כתמי לייזר, תוך שמירה על שלמות הגולגולת והלפטומנינגים.

תקציר

ויסות זרימת הדם המוחי (CBF) חיוני לשמירה על תפקודים קוגניטיביים, אך המנגנונים הבסיסיים שלו עדיין לא מובנים היטב. חקירת התהליכים התאיים והמולקולריים המעורבים בוויסות זה מחייבת גישה פרמקולוגית המאפשרת העברה מדויקת של תרופות לנוזל עמוד השדרה המוחי (CSF) תוך מתן אפשרות לניטור בזמן אמת של דינמיקת זרימת הדם המוחית. במאמר זה, אנו מציגים שיטה לחקר ויסות זרימת הדם במוח in vivo על ידי שילוב של הזרקת מגנה תוך-ציסטרנלית (ICM) מבוססת ננו-מזרק עם הדמיית ניגודיות כתמי לייזר.

טכניקת הזרקת ICM מבוססת מזרק ננו-ליטר מאפשרת העברת תרופות מדויקת בטווח דינמי מ-nL/min ל-μL/min. בניסויים שלנו, גישה זו הפחיתה משמעותית את נפח ההזרקה מ-5-10 מיקרוליטר המסורתי ל-1.5 מיקרוליטר בלבד, ובכך שמרה על לחץ תוך גולגולתי תקין. בשילוב עם הדמיית ניגודיות כתמי לייזר, הצלחנו לנטר את הדינמיקה של זרימת הדם המוחית (CBF) בזמן אמת לפני, במהלך ואחרי זריקות ICM.

באמצעות שיטה זו, הערכנו שינויים ב-CBF בתגובה להזרקת ICM של שלושה מרחיבי כלי דם שונים: (S)-3,5-דיהידרוקסיפנילגליצין (DHPG), אצטילכולין ואדנוזין. בעוד שכל שלושת מרחיבי כלי הדם הגדילו את ה-CBF הבסיסי, היו להם השפעות ברורות על הדינמיקה של CBF. לדוגמה, ההשפעה של אדנוזין הייתה חולפת, בעוד ש-DHPG ואצטילכולין יצרו השפעות ארוכות טווח. עם יתרונותיה הייחודיים, שיטה זו מהווה תוספת חשובה לארגז הכלים של חקר ויסות CBF של מכרסמים in vivo.

מבוא

זרימת דם מוחית (CBF) מבטיחה אספקה רציפה של חמצן וחומרים מזינים למוח תוך הסרת פסולת מטבולית, החיונית לשמירה על תפקודים קוגניטיביים תקינים 1,2. בתנאים הומאוסטטיים, CBF נשאר יציב יחסית למרות תנודות בלחץ הזלוף, תהליך המכונה ויסות אוטומטי 3,4,5. בנוסף לוויסות עצמי, ניתן להתאים CBF מקומי באופן דינמי בתגובה לפעילות עצבית קרובה, תופעה המכונה צימוד נוירו-וסקולרי 6,7. גם ויסות עצמי וגם צימוד נוירו-וסקולרי מווסתים על ידי קבוצה של תאים - תאי אנדותל, תאי מורל, אסטרוציטים, פיברובלסטים ונוירונים - הידועים ביחד כתאי יחידה נוירו-וסקולרית 4,7. עם זאת, המנגנונים התאיים והמולקולריים שבאמצעותם סוגי התאים השונים הללו מתאמים לווסת CBF עדיין אינם ידועים ברובם.

שיטות לחקירת ויסות CBF מחולקות בדרך כלל למודלים in vitro ו-in vivo. מחקרי מבחנה, המשתמשים לעתים קרובות בפרוסות מוח חריפה, משולבים בדרך כלל עם טכניקות אלקטרופיזיולוגיות או פרמקולוגיות כדי לבחון כיצד נוירונים ותאי גליה מווסתים את ההתרחבות או ההתכווצות של כלי דם בודדים 8,9,10. המגבלה העיקרית של מודלים במבחנה היא שהם אינם משתכפלים בתנאי in vivo, במיוחד בהיעדר לחץ דם פיזיולוגי. מודלים in vivo לחקר ויסות CBF נעים בין גישות בקנה מידה מאקרו למיקרו. טכניקות בקנה מידה מאקרו, כגון טומוגרפיה של פליטת פוזיטרונים (PET) והדמיית תהודה מגנטית תפקודית (fMRI), אינן פולשניות אך סובלות מרזולוציה מרחבית וזמנית נמוכה 11,12,13,14.

שיטת המיקרוסקאלה העיקרית לחקר CBF in vivo היא הדמיה דו-פוטונית, המספקת רזולוציה מרחבית-זמנית גבוהה 9,15,16,17,18. עם זאת, טכניקה זו דורשת הסרת הגולגולת והדורה מאטר, ובשילוב עם מניפולציה תרופתית, היא הופכת לפולשנית עוד יותר, ועלולה לגרום לדימום, לפגיעה ברקמת המוח ולשנות את הלחץ התוך גולגולתי19. לכן, חיוני שתהיה שיטה למניפולציה וניטור CBF in vivo העומדת בקריטריונים ספציפיים: היא צריכה להיות לא פולשנית (שמירה על שלמות הגולגולת, הלפטומנינגים וכלי הדם), לספק רזולוציה מרחבית-זמנית גבוהה ולאפשר מניפולציה פרמקולוגית מדויקת של CBF. במאמר זה, אנו מציגים שיטה חדשה המשלבת הזרקת מגנה תוך-ציסטרנלית מבוססת מזרק ננוליטר (ICM) והדמיית ניגודיות כתמי לייזר, העומדת בכל הדרישות הללו.

גישות פרמקולוגיות מסורתיות לחקר ויסות CBF כוללות לעתים קרובות הסרת הגולגולת וקרומי המוח כדי לחשוף את רקמת המוח למתן תרופות מקומיות. לעומת זאת, הזרקת ICM מונעת נזק זה על ידי מתן תרופות ישירות לנוזל עמוד השדרה המוחי (CSF), ומאפשרת להם לעקוב אחר הזרימה הטבעית של CSF ובכך לחקות טוב יותר תנאים פיזיולוגיים. אתגר אחד בהזרקת ICM הוא שהיא בדרך כלל דורשת כמויות גדולות של נוזל - לעתים קרובות 5 מיקרוליטר או יותר בעכברים20. בהתחשב בכך שנפח ה-CSF הכולל בעכברים בוגרים הוא כ-36 מיקרוליטר, הזרקת 5 מיקרוליטר יכולה להגביר את הלחץ התוך גולגולתי ולשנות את דינמיקת ה-CBF. מערכת הננו-הזרקה שלנו, המשתמשת בפיפטות זכוכית, מספקת נוזל עם שליטה מדויקת על נפח ומהירות מבלי לגרום לדליפת CSF באתר ההזרקה.

אורטן ואלפא-כלורלוז משמשים במחקר שלנו מכיוון שהם מספקים בסיס פיזיולוגי יציב יותר של זרימת הדם במוח ומשמרים צימוד נוירו-וסקולרי (NVC) טוב יותר מחלופות נפוצות כמו איזופלורן או קטמין/קסילזין (KX). באמצעות מערכת זו, בדקנו שלושה מרחיבי כלי דם שונים - (S)-3,5-דיהידרוקסיפנילגליצין (DHPG), אצטילכולין ואדנוזין, ואישרנו שהיא מאפשרת מניפולציה וניטור מדויקים של דינמיקת CBF in vivo.

פרוטוקול

פרוטוקול זה אושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) באוניברסיטת וירג'יניה. כל הניסויים דבקו במדריך המכונים הלאומיים לבריאות לטיפול ושימוש בחיות מעבדה. שישה עכברי C57BL/6 זכרים, בגילאי 10-14 שבועות, שימשו לניסויים. ההליכים הכירורגיים מתוארים באיור 1A.

1. הכנה לניתוח

  1. מקם כרית חימום על המסגרת הסטריאוטקסית וחמם אותה מראש ל-37 מעלות צלזיוס ~ 20 דקות לפני הניתוח. הכינו אורטן טרי (750 מ"ג/ק"ג) וכלורלוז (50 מ"ג/ק"ג) במי מלח עם פוספט (PBS) להרדמה.
    הערה: להכנת תמיסת אלפא-כלורלוז ב-PBS, חיממנו את התמיסה באמבט מים של 40 מעלות צלזיוס ומערבלנו אותה כל 10-15 דקות עד להמסה מלאה. גם תמיסות האוריתן וגם תמיסות האלפא-כלורלוז סוננו באמצעות מסנן מזרק של 0.22 מיקרומטר לפני השימוש.
  2. לפני הניתוח, אסוף את כל הכלים הכירורגיים הדרושים, כולל מספריים, מלקחיים, מחזיקי מיקרו מחטים, המוסטטים, צמר גפן, מגבים ותפרים. עקרו את המכשירים על ידי חיטוי (121 מעלות צלזיוס ב-15 psi למשך 60 דקות).
  3. הכן צינורות נימי זכוכית (קוטר חיצוני 1.14 מ"מ, קוטר פנימי 0.53 מ"מ, אורך 88.9 מ"מ). השתמש במושך זכוכית כדי ליצור פיפטות זכוכית להזרקה21. התנגדות הפיפטה המועדפת היא כ - 80 - 100 MΩ. מעקרים ומאחסנים את פיפטות הזכוכית בכלי נקי.
  4. הכן ננו-מזרק עם נפח הזרקה מתאים (25 nL - 4.5 μL) ומהירות (6 nL/s - 644 nL/s).
  5. הכן את הפתרונות הבאים להרחבת כלי הדם בנוזל מוחי מלאכותי (aCSF): (S)-3,5-דיהידרוקסיפנילגליצין (DHPG) ב-5 מ"מ, אצטילכולין ב-0.5 מ"מ ואדנוזין ב-10 מ"מ.
  6. הכן מלוקסיקם (4.0 מ"ג/ק"ג) לשיכוך כאבים במהלך הניתוח. יש לתת מלוקסיקם תת עורי לעכברים כ-30 דקות לפני הניתוח כדי להבטיח שיכוך כאבים נאות.

2. הליך כירורגי

  1. שוקלים שישה עכברים זכרים C57BL/6 (בני 10-14 שבועות) ומרדימים אותם באמצעות הזרקה תוך-צפקית של אורטן (750 מ"ג/ק"ג) וכלורלוז (50 מ"ג/ק"ג). הנח את העכברים בתא הרדמה עם איזופלורן 1% כדי לשמור על הרדמה. תהליך זה אורך כ-40 דקות עד שעה.
    הערה: איזופלורן יכול להאיץ את השראת ההרדמה.
  2. הסר בזהירות את העכברים מתא ההרדמה והעריך את עומק ההרדמה על ידי אישור היעדר רפלקס צביטת הבוהן. בעזרת צמר גפן יש למרוח קרם להסרת שיער על החלק העליון של הגולגולת ועל החלק האחורי של הצוואר כדי להסיר את הפרווה.
  3. יש למרוח משחה עיניים על העיניים למניעת יובש ולמרוח מחדש לפי הצורך לאורך כל ההליך. יש לעקוב באופן קבוע במהלך הניסוי ולתת משחה נוספת במידת הצורך.
  4. מקם את העכבר בכיוון נוטה בתוך המסגרת הסטריאוטקסית, תוך הבטחת אוורור נאות עם אוויר רפואי בקצב זרימה של 1 עד 2 ליטר לדקה. אבטח את העכבר עם מוטות אוזניים לקיבוע נכון, ולאחר מכן הטה בעדינות את הראש כלפי מטה כדי ליצור זווית של 120 מעלות עם הגוף, ובכך לחשוף את בור המים.
    הערה: איזופלורן משמש אך ורק לאינדוקציה בהרדמה ולא בשלב התחזוקה.
  5. חיטוי אזור הניתוח באמצעות לפחות שלוש מריחות לסירוגין של 70% אלכוהול וקרצוף כירורגי (למשל, כלורהקסידין או פובידון-יוד) כדי להבטיח עיקור עור הולם.
  6. אתר את הפסגה העורפית מתחת למיקרוסקופ כירורגי. הרם את העור שמעל בעזרת פינצטה ובצע חתך בקו האמצע של 1 ס"מ. שלוט בכל דימום בעזרת צמר גפן.
  7. חשפו את שרירי הצוואר וחתכו בזהירות והפרידו אותם לאורך קו האמצע בעזרת מלקחיים. השתמש בשני מלקחיים מעוקלים, אחד בכל יד, כדי למשוך בעדינות את השרירים ולחשוף את הדורה מאטר, המהווה את הגבול החיצוני של בור המים.
  8. כוונן את תנוחת הראש על ידי הטיה כלפי מטה ליצירת זווית של 150 מעלות עם הגוף לחשיפה אופטימלית של בור המים.
  9. בצע חתך של 5 מ"מ לאורך התפר הסגיטלי, המכסה גם את נקודות הלמבדה וגם את נקודות הברגמה. בעזרת שני מלקחיים מעוקלים, משוך בעדינות את העור הצידה, ונקה את פני הגולגולת במי מלח. ודא שלא נשאר שיער על הגולגולת החשופה.
  10. לאחר הניקוי יש למרוח שכבה של ג'ל אולטרסאונד בעובי ~1 מ"מ על הגולגולת החשופה באמצעות צמר גפן כדי לשמור על הלחות באזור. מכיוון שג'ל אולטרסאונד עשוי להכיל בועות אוויר, ודא שכל בועות האוויר מוסרות לפני ההדמיה.
  11. מקם את העכבר מתחת לעדשה של מערכת הדמיית ניגודיות כתמי הלייזר. הפעל את המערכת ואת התוכנה הנלווית אליה. ודא שמוח העכבר מרוכז בשדה ההדמיה, ולאחר מכן השתמש בפונקציית המיקוד האוטומטי כדי להשיג את המיקוד הנכון להדמיה. במידת הצורך, הסר בעדינות את כל השערות או בועות האוויר שנותרו משדה ההדמיה באמצעות פינצטה.

3. הגדרת ננו-הזרקה

  1. אבטח את המשאבה לזרוע המניפולטור הסטריאוטקסי וחבר את הכבל לבקר. הפעל את הבקר ובחר את משאבת היעד. בלוח הבקרה, הגדר את DIRECTION ל-INFUSE. הגדר את המהירות ל-2 מיקרוליטר לדקה ואת עוצמת הקול ל-4.5 מיקרוליטר.
    הערה: מערכת הננו-הזרקה מורכבת משני מרכיבים עיקריים: משאבת ההזרקה והבקר. כל בקר יכול להפעיל שתי משאבות בו זמנית. להזרקת ICM אנו משתמשים במשאבה אחת בלבד.
  2. לאחר השלמת ה-INFUSE , הוציאו פיפטת זכוכית אחת מהמיכל ומלאו אותה בשמן מינרלי חסר צבע וריח באמצעות מחט גמישה 34 גרם MicroFil או סוג דומה של מחט. וודאו שכל פיפטת הזכוכית מלאה בשמן.
  3. נתק את קולט המשאבה, הכנס את פיפטת הזכוכית ואז הדק את הקולט. ודא שאין בועות אוויר בתוך פיפטת הזכוכית.
  4. שנה את ה-DIRECTION בלוח הבקרה עבור WITHDRAW. הגדר את המהירות ל-2 μ ליטר לדקה ואת עוצמת הקול ל-4.5 μ ליטר.
  5. הזז את הזרוע הסטריאוטקסית כדי להכניס בעדינות את הפיפטה לתמיסה המוכנה ולמשוך את הנפח הרצוי.

4. הזרקת מרחיבי כלי דם לבור המים וניטור CBF

  1. ודא שהמשאבה מקובעת היטב לזרוע המניפולטור הסטריאוטקסי. כוונן את הזווית של זרוע המניפולטור הסטריאוטקסי ל-45° במישור הקדמי-אחורי.
  2. בעזרת פינצטה מעוקלת מתחת למיקרוסקופ הדיסקציה, חשפו בזהירות את בור המים. נקו את האזור במי מלח כדי להסיר דם. השתמש במיקרומניפולטור הסטריאוטקסי כדי למקם את פיפטת הזכוכית ליד הדורה מאטר של הבור מגנה.
  3. ברגע שפיפטת הזכוכית נוגעת בדורה, תמרן אותה בעדינות כדי לעבור למרכז בור המים, והימנע מכל חדירה למוח הקטן או למדולה. ודא שקצה פיפטת הזכוכית מוכנס לעומק של 1-2 מ"מ לפני שחרור הפינצטה.
    הערה: מסגרת סטריאוטקסית דיגיטלית חיונית לניטור עומק חדירת פיפטת הזכוכית לבור המים.
  4. שנה את ה-DIRECTION בלוח הבקרה ל-INFUSE. הגדר את מהירות ההזרקה ל-300 nL/min ואת עוצמת הקול ל-1.5 μL.
  5. הפעל את התוכנה להדמיית ניגודיות כתמי לייזר (LSCI) והתאם את המיקוד כדי להשיג את התמונה הברורה ביותר של כלי הדם. ודא שאין שיער או בועות אוויר בשדה הראייה.
  6. הגדר את מרווח ההדמיה ל-5 שניות בלוח הבקרה של LSCI. רשום את ה-CBF הבסיסי למשך כ-10 דקות, וודא שקו הבסיס נשאר יציב. אם יש תנודות בקו הבסיס, המשך להקליט למשך זמן ארוך יותר עד להשגת היציבות.
  7. לאחר 10 דקות של הקלטה בסיסית יציבה, התחל את הננו-הזרקה ושים לב לזמן התחלת ההזרקה במערכת ההקלטה LSCI. לאחר השלמת ההזרקה, סמן את שעת הסיום והמשך להקליט למשך 20 דקות נוספות או יותר. לאחר השלמת הניסוי, זלוף דרך הלב את העכברים עם PBS ואוסף רקמות מוח לניתוח היסטולוגי.

תוצאות

אחרי שסיימנו את הניתוח, אבטחנו את העכבר במסגרת סטריאוטקסית עם קריאה דיגיטלית (איור 1A,B). עבור מדידת זרימת דם מוחית (CBF), פירקנו בזהירות את העור מעל הגולגולת בעקבות החתך ומרחנו ג'ל אולטרסאונד שקוף כדי לשמור על לחות על פני השטח של הגולגולת (איור 1C). כדי להקל על הזרקת מגנה תוך-ציסטרנית (ICM), ניתחנו את שרירי הצוואר סביב הפסגה העורפית כדי לחשוף את ה-cisterna magna. לאחר מכן, אנו מושכים את תמיסת המטרה עם פיפטת זכוכית, והשתמשנו במיקרומניפולטור כדי להנחות את פיפטת הזכוכית לחדור לתוך הממברנות של בור המים לעומק של 1-2 מ"מ (איור 1D,E). הזרוע הסטריאוטקסית הוטה בזווית של 45מעלות כדי לסייע בהחדרה.

לאחר מכן, בחנו שינויים דינמיים של CBF בתגובה לשלושה מרחיבי כלי דם שונים: (S)-3,5-dihydroxyphenylglycine (DHPG), אצטילכולין ואדנוזין 22,23,24,25. בתחילה רשמנו קו בסיס של 10 דקות לפני שהזרקנו 1.5 מיקרוליטר מכל מרחיב כלי דם במהירות של 300 ננוליטר לדקה במשך 5 דקות. לאחר ההזרקה, רשמנו 20 דקות נוספות של נתונים. התוצאות שלנו הראו שכל שלושת מרחיבי כלי הדם הגדילו את ה-CBF, אם כי עם דינמיקה מובהקת. DHPG גרם לעלייה חדה ב-CBF, ואחריה ירידה הדרגתית לאחר ההזרקה (איור 2A,B). לעומת זאת, אצטילכולין עורר עלייה הדרגתית ב-CBF לאורך תקופת הרישום (איור 2C,D). אדנוזין גם הביא לעלייה חולפת ב-CBF, שחזרה לרמת הבסיס כ-15-20 דקות לאחר ההזרקה (איור 2E,F).

figure-results-1
איור 1: סיכום הליכי הניתוח. (A) פרוצדורות כירורגיות עיקריות שלב אחר שלב עבור מודל ננו-הזרקה + LSCI. (B) סכימות שמציגות את מערכת הננו-הזרקה המשולבת + LSCI. הננו-מזרק מקובע ביציבות על הזרוע הסטריאוטקסית והזרוע מוטה ב-45מעלות כדי להקל על חדירת הממברנה האטלנטו-עורפית בבור המים. (C) מבט מלמעלה למטה של גולגולת העכבר תחת מערכת LSCI. הגולגולת מכוסה בג'ל אולטרסאונד. (D) מבט אחורי שמראה את פיפטת הזכוכית החודרת לבור המים. פיפטת הזכוכית הייתה מלאה בכחול אוונס כדי להקל על ההדמיה. השתמש במסגרת הסטריאוטקסית הדיגיטלית לניסוי זה כך שניתן יהיה לכמת במדויק את מרחק החדירה. (E) סכימות שמציגות את מיקום קצה פיפטת הזכוכית במגנה בור מים. ראשו של העכבר הוטה ב-30מעלות כדי להקל על הזרקת המגנה של בור המים. קיצור: LCSI = הדמיית ניגודיות כתמי לייזר. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: זרימת דם מוגברת במוח לאחר ננו-הזרקה של מרחיבי כלי דם. (A) תמונות מייצגות המציגות שינויים בזרימת הדם במוח לפני ואחרי הזרקת DHPG. מהירות הדם מקודדת בצבע. כחול מייצג מהירות נמוכה ואדום מייצג מהירות גבוהה. (B) זרימת דם בזמן אמת באזור המסומן בקו אדום, המציין את חלון הזמן להזרקת DHPG. (C) תמונות מייצגות שמראות שינויים בזרימת הדם במוח לפני ואחרי הזרקת ACh. מהירות הדם מקודדת בצבע. כחול ואדום מציינים מהירויות נמוכות וגבוהות, בהתאמה. (D) זרימת דם בזמן אמת באזור המסומן בקו האדום, שמציין את חלון הזמן להזרקת ACh. (E) תמונות מייצגות המציגות שינויים בזרימת הדם במוח לפני ואחרי הזרקת אדנוזין. מהירות הדם מקודדת בצבע. כחול ואדום מציינים מהירויות נמוכות וגבוהות, בהתאמה. (F) זרימת דם בזמן אמת באזור המסומן בקו האדום, שמציין את חלון הזמן להזרקת אדנוזין. קיצורים: DHPG = (S)-3,5-דיהידרוקסיפנילגליצין; ACh = אצטילכולין. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

דיון

אנו מציגים שיטה חדשנית לחקירת ויסות זרימת הדם במוח (CBF) in vivo על ידי שילוב של ננו-הזרקת מגנה ציסטרנלית מדויקת עם הדמיית ניגודיות כתמי לייזר (LSCI). גישה זו מאפשרת העברת תרופות מדויקת לנוזל עמוד השדרה המוחי (CSF) תוך מתן אפשרות לניטור בזמן אמת של CBF, מה שמקל על הערכת תגובתיות כלי הדם במוח.

מניפולציה פרמקולוגית וטכניקות מתן תרופות הן קריטיות לחקר CBF ותגובתיות כלי דם מוחיים in vivo. שיטות מסורתיות ליישום תרופות, כגון שימוש במרחיבי כלי דם או מכווצים, מחייבות לעתים קרובות הסרת הגולגולת, מה שעלול לפגוע בלפטומנינגים ואפילו בפרנכימה של המוח 9,10,18. טכניקות פולשניות אלה עלולות לשבש את המיקרו-סביבה של המוח, במיוחד על ידי גרימת נזק לכלי הדם ודימום, ובכך לא לשחזר את התנאים הפיזיולוגיים האמיתיים. לעומת זאת, השיטה שלנו מציעה ארבעה יתרונות משמעותיים.

ראשית, הגישה שלנו ליישום תרופות אינה פולשנית ושומרת על מצבים פיזיולוגיים. שנית, שיטות הזרקת ICM קלאסיות מסתמכות בדרך כלל על מזרקים או צינוריות, מה שעלול להוביל לדליפה של תרופות או עקבות ו-CSF בשל הגודל הגדול של הקצוות. שיטות מסורתיות אלה דורשות לעתים קרובות כמויות גדולות של תרופה או עקבות - בדרך כלל 5 מיקרוליטר או יותר, מה שיכול לשנות את הלחץ התוך גולגולתי. לעומת זאת, הזרקת ICM מונחית-ננו-מזרק שלנו דורשת רק נפח קטן של 1.5 מיקרוליטר או פחות. בנוסף, ניתן לשלוט במדויק על מהירות ההזרקה בטווח רחב, מ-1 nL/s עד 100 nL/s. בדרך כלל אנו משתמשים במהירות של 5 nL/s (300 nL/min), מכיוון שקצב זה אינו משפיע על הלחץ התוך גולגולתי. שלישית, בניגוד להזרקות תרופות מונחות פיפטה לפרנכימה של המוח או זלוף תרופות על פני השטח של קליפת המוח, אספקת התרופה שלנו המבוססת על הזרקת מגנה עוקבת אחר הזרימה הטבעית של CSF, ומחקה מקרוב מצבים פיזיולוגיים. לבסוף, מכיוון שהשיטה שלנו שומרת על שלמות הגולגולת וקרומי המוח, אנו יכולים לבצע מדידות על אותה קבוצת עכברים בנקודות זמן שונות, מה שמאפשר השוואות אורך - דבר שאינו אפשרי בשיטות אחרות ליישום תרופות. לצורך מחקרי הישרדות והשוואות אורך, יש להקפיד על טכניקות אספטיות קפדניות, כולל הכנת עור נכונה, שימוש במכשירים וחומרים סטריליים ועמידה בהנחיות מוסדיות לטיפול בבעלי חיים. יש לאפשר תקופת החלמה של שבועיים לריפוי פצעים.

שיטת ההרדמה יכולה להשפיע באופן משמעותי על ה-CBF. לדוגמה, הרדמת קטמין-קסילזין יכולה להעלות את ה-CBF ביותר מ-50% מעל רמות הבסיס, בעוד שאיזופלורן יכול להכפיל את רמת ה-CBF הבסיסית. בניסויים שלנו, בחרנו באוריתן ובכלורלוז בשל השפעותיהם המינימליות על מערכת הלב וכלי הדם, מה שעוזר לשמור על רמות פיזיולוגיות של CBF, כפי שמקובלבתחום. בנוסף, דילגנו על קנולציה תוך עורקית כדי שמדידה חוזרת של גזי דם תהיה לא פולשנית, אם כי ניתן לשלב הליכים כאלה עם השיטה שלנו26.

הגישה שלנו משלבת שתי מערכות: מערכת הזרקת ICM מבוססת ננו-הזרקה28 ומערכת הדמיית ניגודיות כתמי לייזר (LSCI)29. יש להכשיר את הנסיינים בשתי המערכות כדי לבצע את ההליך בהצלחה. מכיוון שמערכת LSCI תופסת את כל המקום מעל ראש העכבר, הטיית הזרוע ב-45מעלות לא רק מקלה על הזרקת ICM אלא גם מבטיחה תאימות בין שתי המערכות. הגדרה זו היא קריטית להצלחת הניסוי.

למתחילים המשתמשים בהזרקת ICM מונחית ננו-מזרק, נדרש תרגול נרחב כדי לשלוט בקואורדינציה של הפרדת השרירים עם פינצטה ביד אחת תוך תמרון המיקרומניפולטור כדי להנחות את פיפטת הזכוכית ביד השנייה. אור לייזר טוב ומיקרוסקופ סטריאו זרוע מפרקת חיוניים להדמיה אופטימלית במהלך ההליך.

באמצעות שיטה זו, הערכנו כיצד מרחיבי כלי דם קלאסיים כגון DHPG, אצטילכולין ואדנוזין משפיעים על CBF. כצפוי, כל שלושת מרחיבי כלי הדם הגדילו את ה-CBF; עם זאת, הם גרמו לדינמיקה שונה. DHPG גרם לעלייה חדה ב-CBF, ואחריה דעיכה איטית, בעוד שאצטילכולין עורר עלייה הדרגתית. לעומת זאת, אדנוזין ייצר רק עלייה חולפת ב-CBF.

שיטה זו צריכה להיות ישימה גם על דגמי חולדות. עם זאת, בהתחשב בכך שעובי גולגולת החולדה הוא כ-0.5-1 מ"מ, יהיה צורך לדלל אותה לצורך הדמיית ניגודיות כתמי לייזר. בנוסף, בעוד שניתן להתאים את השיטה הנוכחית לעכברים ערים קבועים בראש, היא מחייבת אימון נרחב כדי למזער את תנועת החיות במהלך הניסויים. השתמשנו במספר מוגבל של עכברים כדי להדגים את השיטה שלנו; לכן, המחקר שלנו מוגבל סטטיסטית, ויש לנקוט משנה זהירות בהסקת מסקנות רחבות מהממצאים שלנו.

למדידות CBF עקביות ואמינות, חשוב לנסיינים להכיר בכך שפרמטרים פיזיולוגיים אחרים, כגון טמפרטורת גוף, לחץ דם ורמותCO2 , ממלאים תפקיד קריטי בהערכה פיזיולוגית מקיפה ויש לשקול אותם בזהירות במחקרים עתידיים. לסיכום, אנו מציגים שיטה חדשה in vivo לחקר ויסות CBF בעכברים. גישה זו מדויקת ופולשנית מינימלית, מה שהופך אותה למתאימה היטב לחקירת דינמיקת CBF הנגרמת על ידי תרופות.

גילויים

למחברים אין ניגודי אינטרסים לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי מענקי ה-NIH (NS108763, NS127392, NS125788, NS125677).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
(RS)-3,5-דיהידרוקסיפנילגליציןטוקריסקאט. מס' 0342
אצטילכולין כלורידסיגמאA6625-25G
אדנוזיןסיגמאA9251-25G
ספוגית אלכוהול 70% איזופרופיל אלכוהולויטרקס רפואי A/S520213
AmScope SM-8T סדרה זרוע מפרקית זום סטריאו מיקרוסקופAmScopeSM-8TZ-144S-10M
Aquasonic ג'להעברת אולטרסאונד שקוףAquasonicGelPLI 03-50
עכבר דיגיטלי מכשירים סטריאוטקסייםStoelting51730D
אלכוהול אתיליסיגמא459836-2L
Fiber-Lite DC950 תאורהדולן-ג'נר תעשיותDC950H
החלפת זכוכית 1.14 מ"ממכשירי דיוק עולמיים504949
מגבונים מדויקים מדעיים של Kimtech מגבי רקמותקימברלי קלארק מקצועי5511
מכשיריהדמיה ניגודיות בלייזרMOORFLPI-2
Lasik Eye Spear (100 למארז) hospeqBV40815
MICROFIL FLEXIBLENEEDLE מכשירי דיוק עולמייםMF34G-5
שמן מינרליSigmaM5904
משטח חימום עכברפישר מדעי50-195-4000
Nair תחליב מסיר שיער חמאת קקאואמזוןASIN ‏ : ‎
NANOLITER 2020 INJECTORWorld Precision InstrumentsNANOLITER2020
P-2000 חולץ מיקרופיפטהSutter InstrumentP-2000
Puritan® ספוגיות, ראש כותנה, פיר עץ,פוריטן רפואי806-WC
חומר סיכה עיניים סטריליMedi-Vet11897
UrethaneSigmaU2500
Vetbond דבק רקמותמכשירי דיוק עולמייםVETBOND
& alpha;-ChloraloseSigma23120
B000GCW5CS

מקורות

  1. Lassen, N. A., Ingvar, D. H., Skinhøj, E. Brain function and blood flow. Sci Am. 239 (4), 62-71 (1978).
  2. Leenders, K., et al. Cerebral blood flow, blood volume and oxygen utilization: normal values and effect of age. Brain. 113 (Pt 1), 27-47 (1990).
  3. Armstead, W. M. Cerebral blood flow autoregulation and dysautoregulation. Anesthesiolo Clin. 34 (3), 465-477 (2016).
  4. Claassen, J. A., Thijssen, D. H., Panerai, R. B., Faraci, F. M. Regulation of cerebral blood flow in humans: physiology and clinical implications of autoregulation. Physiol Rev. 101 (4), 1487-1559 (2021).
  5. Strandgaard, S., Paulson, O. Cerebral autoregulation. Stroke. 15 (3), 413-416 (1984).
  6. Iadecola, C. The neurovascular unit coming of age: a journey through neurovascular coupling in health and disease. Neuron. 96 (1), 17-42 (2017).
  7. Girouard, H., Iadecola, C. Neurovascular coupling in the normal brain and in hypertension, stroke, and Alzheimer disease. J. Appl. Physiol. 100 (1), 328-335 (2006).
  8. Peppiatt, C. M., Howarth, C., Mobbs, P., Attwell, D. Bidirectional control of CNS capillary diameter by pericytes. Nature. 443 (7112), 700-704 (2006).
  9. Zonta, M., et al. Neuron-to-astrocyte signaling is central to the dynamic control of brain microcirculation. Nat Neurosci. 6 (1), 43-50 (2003).
  10. Girouard, H., et al. Astrocytic endfoot Ca2+ and BK channels determine both arteriolar dilation and constriction. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (8), 3811-3816 (2010).
  11. Grafton, S. T., et al. Functional anatomy of human procedural learning determined with regional cerebral blood flow and PET. J Neurosci. 12 (7), 2542-2548 (1992).
  12. Tillfors, M., et al. Cerebral blood flow in subjects with social phobia during stressful speaking tasks: a PET study. Am J Psychiatry. 158 (8), 1220-1226 (2001).
  13. Goense, J., Merkle, H., Logothetis, N. K. High-resolution fMRI reveals laminar differences in neurovascular coupling between positive and negative BOLD responses. Neuron. 76 (3), 629-639 (2012).
  14. Wang, J., et al. Perfusion functional MRI reveals cerebral blood flow pattern under psychological stress. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (49), 17804-17809 (2005).
  15. Takano, T., et al. Astrocyte-mediated control of cerebral blood flow. Nat Neurosci. 9 (2), 260-267 (2006).
  16. Holstein-Rønsbo, S., et al. Glymphatic influx and clearance are accelerated by neurovascular coupling. Nat Neurosci. 26 (6), 1042-1053 (2023).
  17. Shih, A. Y., et al. Two-photon microscopy as a tool to study blood flow and neurovascular coupling in the rodent brain. J Cereb Blood Flow Metab. 32 (7), 1277-1309 (2012).
  18. Otsu, Y., et al. Calcium dynamics in astrocyte processes during neurovascular coupling. Nat Neurosci. 18 (2), 210-218 (2015).
  19. Cai, C., et al. Stimulation-induced increases in cerebral blood flow and local capillary vasoconstriction depend on conducted vascular responses. Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (25), E5796-E5804 (2018).
  20. Xavier, A. L., et al. Cannula implantation into the cisterna magna of rodents. J Vis Exp. (135), e57378(2018).
  21. Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller. J Vis Exp. (20), e939(2008).
  22. Liu, X., et al. Epoxyeicosatrienoic acid-dependent cerebral vasodilation evoked by metabotropic glutamate receptor activation in vivo. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 301 (2), H373-H381 (2011).
  23. Yamada, M., et al. Cholinergic dilation of cerebral blood vessels is abolished in M5 muscarinic acetylcholine receptor knockout mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (24), 14096-14101 (2001).
  24. O'Regan, M. Adenosine and the regulation of cerebral blood flow. Neurol Res. 27 (2), 175-181 (2005).
  25. Morii, S., Ngai, A., Ko, K. R., Winn, H. R. Role of adenosine in regulation of cerebral blood flow: effects of theophylline during normoxia and hypoxia. Am J Physiol. 253 (1 Pt 2), H165-H175 (1987).
  26. Park, L., et al. Aβ-induced vascular oxidative stress and attenuation of functional hyperemia in mouse somatosensory cortex. J Cereb Blood Flow Metab. 24 (3), 334-342 (2004).
  27. Park, L., et al. NADPH oxidase-derived reactive oxygen species mediate the cerebrovascular dysfunction induced by the amyloid β peptide. J. Neurosci. 25 (7), 1769-1777 (2005).
  28. Herz, J., et al. GABAergic neuronal IL-4R mediates T cell effect on memory. Neuron. 109 (22), 3609-3618.e9 (2021).
  29. Sun, Y. -Y., et al. Prophylactic edaravone prevents transient hypoxic-ischemic brain injury: implications for perioperative neuroprotection. Stroke. 46 (7), 1947-1955 (2015).

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

הזרקה לציסטרנה מגנה (Cisterna Magna)הדמיית מכתשי לייזר (Laser Speckle Imaging)צימוד נוירו-וסקולריויסות מיקרוגליאליהזרקת חומר מרחיב כלי דםבדיקה במודל חי (In Vivo)ניתוח סטריאוקסיהדמיית מוח של מכרסמיםהזרקה תוך-ציסטרנלית
בדיקת ננו-הזרקת Cisterna Magna מזווגת ובדיקת הדמיית ניגודיות כתמי לייזר לחקר ויסות זרימת הדם במוח in vivo
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.