פרוטוקול זה מתאר הליך מפורט ליצירת תאי T קולטני אנטיגן כימריים חולפים (CAR) באמצעות mRNA לא משולב לאימונותרפיה לסרטן ומספק שיטות אמינות להערכת תאי CAR-T ותפקודם ציטוטוקסי.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
גישה לא ויראלית ליצירת תאי T קולטני אנטיגן כימריים חולפים באמצעות mRNA לאימונותרפיה לסרטן
במאמר זה
סיכום
תקציר
טיפול בתאי T של קולטן אנטיגן כימרי (CAR) התגלה כטיפול חלוצי בסרטן, והשיג הצלחה חסרת תקדים בטיפול בממאירויות המטולוגיות מסוימות כגון לימפומות ולוקמיה. עם זאת, ככל שיותר חולי סרטן מקבלים טיפולים בתאי CAR-T, ממאירויות ראשוניות משניות הקשורות לטיפול מדווחות יותר ויותר בחלקן בשל החדרת טרנסגן CAR בלתי צפויה, מה שמעלה חששות בטיחות חמורים. כדי לטפל בבעיה זו, אנו מתארים כאן גישה לא ויראלית ולא משולבת ליצירת תאי CAR-T חולפים באמצעות mRNA. חישלנו תאי T באמצעות mRNA שונה המקודד לקולטן גורם גדילה אפידרמלי אנושי 2 (HER2) ספציפי למכונית ויצרנו תאי CAR-T חולפים ממוקדי HER2. ה-CAR התבטא ביעילות על פני תא T יום אחד לאחר ההתחשמלות, גדל ביום 2 וירד באופן דרמטי ביום 5. תאי CAR-T חולפים הפגינו ציטוטוקסיות חזקה כנגד תאי סרטן שחלות SKOV-3 חיוביים ל-HER2 והפרישו רמות גבוהות של IFN-Υ. פרוטוקול זה מספק מדריך שלב אחר שלב לפיתוח תאי CAR-T חולפים בקנה מידה קטן ללא אינטגרציה קבועה של טרנסגן CAR, המתאר נהלים מפורטים להכנת mRNA CAR, הפעלה וטרנספקציה של תאי T, הערכת ביטוי CAR וניתוח חוץ גופי של תפקוד תאי CAR-T. שיטה זו מתאימה לייצור תאי CAR-T חולפים הן במחקרים פרה-קליניים והן במחקרים קליניים.
מבוא
סרטן הוא איום חשוב יותר ויותר על בריאות האדם, עם הערכה שנתית של 23.6 מיליון מקרים שאובחנו לאחרונה ו -10 מיליון מקרי מוות ברחבי העולם1. טיפול כירורגי בשילוב עם הקרנות וכימותרפיה נותר תקן הזהב לטיפול בסוגים שונים של סרטן מקומי, לא פולשני ופולשני 2,3,4. למרות שהטיפול השיטתי המסורתי השיג הצלחה עצומה בניהול סרטן בשלב מוקדם, הוא רעיל מאוד ובעל השפעה מוגבלת על סרטן גרורתי והמטולוגי5. חולים עם סוגי סרטן אלה עוברים טיפולים תכופים וסובלים מרעילות משמעותית בתקווה לייצב ולעכב את התקדמות המחלה. טיפול בתאי T ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
ה- PBMCs המשמשים כאן בודדו בעבר מדם מלא ממרכז הדם של בית החולים סטנפורד על פי פרוטוקול מועצת הביקורת המוסדית (IRB) שאושר (13942) באמצעות שיפוע צפיפות Ficoll-Paque שתואר לפני42. הסכמתם המודעת של המשתתפים לא הייתה ישימה מכיוון שהדם שבו השתמשנו כדי לאסוף את ה- PBMCs הושג באופן מסחרי ממרכז הדם של בית החולים סטנפורד.
1. הכנת mRNA CAR
- הכנת תבנית
הערה: פלסמיד ליניארי או מקטע PCR יכולים לשמש כתבנית לסנתז mRNA של CAR במבחנה, בתנאי שהם מכילים מקדם SP6 או T7 תקין, אזור לא מתורגם 5' (UTR), טרנסגן CAR ו- 3'UTR עם זנב פולי(A) מתאים. במחקר זה השתמשנו במבנה ד....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
בנינו מכונית ממוקדת HER2 מהדור השני המכילה scFv שנגזר מהנוגדן החד-שבטי המואנש נגד HER2 (mAb) 4D547, אזור טרנסממברנלי, ותחום קוסטימולטורי תוך-תאי 4-1BB ואחריו תחום ההפעלה CD3ζ (איור 1A). רצף הדנ"א המקודד את המכונית הכיל מקדם SP6 בגודל 5' כדי להניע שעתוק של ה-mRNA במבחנה של CAR (איור 1B). אורכו של ה-mRNA של CAR היה כ-2 קילו-בתים, והוא אומת על-ידי אלקטרופורזה בג'ל (איור 1C).
.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
במחקר זה, אנו מתארים גישה מפורטת לא ויראלית ולא משולבת ליצירת תאי CAR-T חולפים ומספקים הליכים טכניים להערכת תפקוד תאי CAR-T. גישה זו נמנעת משימוש בווקטורים רטרו-ויראליים ולנטי-ויראליים קונבנציונליים להעברת טרנסגנים קבועה ואקראית של CAR, ובמקום זאת ממנפת אלקטרופורציה כדי להחדיר ביעילות mRNA CAR שונה במבחנה לתאי T. שיטה זו מאפשרת ביטוי CAR חולף ברמה גבוהה על פני תא T, ומפחיתה משמעותית את הסיכון ל-SPM הקשור למוטגנזה החדרתית.
כדי לייעל את תרגום ה-mRNA של .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים ליאנג הו, רוברט ברהוביץ', יאנווי הואנג, שיימינג ז'אנג, ג'יניינג סאן, שיאנגהונג ליו, הואה ג'ואו, שירלי, שו, האוצ'י לי ויטה גולובסקאיה הם עובדים של ProMab Biotechnologies. Lijun Wu הוא עובד ובעל מניות של ProMab Biotechnologies.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי ProMab Biotechnologies.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| צבע כדאיות 7-AAD | Biolegend | 420404 | |
| ACEA Novocyte זרימה ציטומטר | Agilent | NovoCyte 3000 | |
| AIM-V בינוני | Gibco | 12055083 | |
| APC עז אנטי אנושי IgG F(ab')2 נוגדן | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 109-136-097 | |
| BglII אנזים הגבלה | ניו אינגלנד BioLabs (NEB) | R0144L | |
| 3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')G מבנה כובע RNA אנלוגי | NEB | S1411S | |
| DMEM, גלוקוז גבוה | Gibco | 11965092 | |
| Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 חרוזים | Gibco | 11131D | |
| E-Plate 96 | Agilent | 5232376001 | |
| אתנול | Sigma | 459844-4L | |
| FBS | Lonza.com | 14-503F | |
| HiScribe SP6 New | England BioLabs (NEB) | E2070S | |
| Human IL-2 חלבון רקומביננטי | Gibco | 15140122 | |
| מילניום סמני RNA | Invitrogen | AM7150 | |
| Monarch RNA ערכת ניקוי (500 μ ז) | NEB | T2050L | |
| N1-Methylpseudo-UTP | Trilink | N-1081-10 | |
| מכשיר טרנספקציה ניאון | Invitrogen | MPK5000 | |
| מערכת העברת ניאון 100-μ L Kit | Invitrogen | MPK10096 | |
| פניצילין-סטרפטומיצין (10000 U/mL) | Gibco | 14-503F | |
| RPMI 1640 בינוני | Gibco | 11875135 | |
| טריפסין-EDTA (0.05%), פנול אדום | Gibco | 25300120 | |
| UltraPure פנול:כלורופורם:איזואמיל אלכוהול (25:24:1, v/v) | Invitrogen | 15593049 | |
| xCELLigence מכשיר ניתוח תאים בזמן אמת (RTCA) | Agilent | RTCA MP | |
| ZymoPURE II פלסמיד ערכת Midiprep Zymo | Research | D4201 |
מקורות
- Ataeinia, B., et al. National and subnational incidence, mortality, and years of life lost due to breast cancer in iran: Trends and age-period-cohort analysis since 1990. Front Oncol. 11, 561376(2021).
- Jordan, R. M., Oxenberg, J.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
