מאמר שיטה

זיהוי אתרי אינטגרציה של Lentivirus רלוונטיים מבחינה תפקודית בספריית תאי מוטגנזה החדרתית

DOI:

10.3791/67552

⸱

10 בינואר 2025

 ,  , 
1Institute of Genomics, School of Medicine, Huaqiao University, 2State Key Laboratory of Cellular Stress Biology, School of Life Sciences, Xiamen University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מוטגנזה החדרתית היא כלי חיוני בגנטיקה קדימה לזיהוי אלמנטים גנומיים פונקציונליים. כאן, אנו מתארים את המסך מבוסס החדרה עבור אלמנטים ותעתיקים פונקציונליים (InSET), שיטה לאיתור אתרי אינטגרציה של lentivirus בתוך ספריית תאי מוטגנזה מבוססת lentivirus.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

היקף הרצפים התפקודיים בגנום האנושי הוא נושא מרכזי אך שנוי במחלוקת בביולוגיה. למרות שמסכים גנטיים הפוכים בעלי תפוקה גבוהה עשו צעדים בחקר זה, הם לעתים קרובות מגבילים את היקפם לאלמנטים גנומיים ידועים ועשויים להציג השפעות לא ספציפיות. זה מדגיש את הצורך הדחוף בכלי גנומיקה פונקציונליים חדשים המאפשרים הבנה עמוקה ובלתי משוחדת של פונקציונליות הגנום. פרוטוקול זה מציג את המסך מבוסס ההכנסה לאלמנטים ותעתיקים פונקציונליים (InSET), שיטה לזיהוי אתרי אינטגרציה של lentivirus בתוך ספריית תאי מוטגנזה מבוססת lentivirus. InSET מקל על לכידת אתרי אינטגרציה לנטי-ויראלים ברחבי הגנום, עם ריצוף מהדור הבא המשמש לאיתור וכימות רצפי אגפים. העיצוב של InSET מאפשר ניתוח של וריאציות שפע של אתרי אינטגרציה במסכים פנוטיפיים בקנה מידה גדול, ומבסס אותו ככלי חזק לגנטיקה קדימה ולזיהוי אלמנטים גנומיים פונקציונליים. יתרון מרכזי של InSET הוא היכולת שלו לחשוף אלמנטים גנומיים שלא זוהו בעבר, כולל אקסונים פונקציונליים חדשים של RNA מקודד חלבון ולא מקודד, ללא תלות בהערות קודמות. בסך הכל, ל-InSET יש ערך משמעותי בחקר המורכבות המורכבת של הגנום והטרנסקריפטום האנושי, שבו אלמנטים גנומיים רבים ממתינים לאפיון פונקציונלי.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

גנומיקה פונקציונלית נותרה תחום מכריע ומאתגר, אפילו בעידן הפוסט-גנומי, כאשר חלק ניכר מהאזורים הגנומיים עדיין חסרים אפיון פונקציונלי. סיבה מרכזית לאתגרים אלה נעוצה באופי המורכב של הגנום והטרנסקריפטום האנושי, המאופיינים בשעתוק מתפשט ובשחבור חלופי אוניברסלי הן באזורים מקודדי חלבון והן באזורים שאינם מקודדים1,2,3,4,5. מורכבות זו הודגשה בהרחבה באמצעות מחקרי העשרה ממוקדי RNA6,7,8,9. יותר ויותר מוכר כי אלמנטים גנומיים חדשים רבים נותרו לא ממופים וללא הערות פונקציונליות10,11,12בנוסף למקטעים המבוארים היטב של הגנום האנושי.

בשנים האחרונות נצפו התקדמות בכלים של גנטיקה הפוכה, כגון הפרעות RNA (RNAi) ומערכות CRISPR/Cas13,14,15,16,17,18,19,20,21. עם זאת, לשיטות אלה יש חסרונות בולטים, כולל השפעות לא ספציפיות ועלויות גבוהות הקשורות ליצירת ספריות מורכבות של RNA סיכות ראש קצרות (shRNAs) או RNA מדריך יחיד (sgRNAs)22,23,24,25. בנוסף, שיטות אלו מתמקדות בעיקר באלמנטים גנומיים מוערים. לעומת זאת, לגנטיקה קדימה יש יתרון בזיהוי אלמנטים גנומיים פונקציונליים חדשים וללא הערות. בהתחשב במורכבות הגנום והטרנסקריפטום האנושי, כמו גם המספר העצום של אלמנטים גנומיים חדשים, ליכולת זו של גנטיקה קדימה יש חשיבות משמעותית.

ספריות תאים גנטיות קדימה נוצרות לעתים קרובות באמצעות אינטגרציה רטרו-ויראלית אקראית, מה שהופך את הזיהוי היעיל של אתרי אינטגרציה ברחבי הגנום לקריטי לבדיקת גנטיקה קדימה. איתור אתרי אינטגרציה אלה כרוך בדרך כלל בכלים מהלכים על הגנום26. אמנם חלה התקדמות משמעותית בכלים אלה, אך מעטים מותאמים ליישומי ריצוף מהדור הבא (NGS) ומיושמים לאחר מכן במחקרי מוטגנזה הכנסתית. מוטגנזה החדרתית בשורות תאים משתמשת לעתים קרובות בשיטות כמו PCR הפוך (I-PCR) או PCR בתיווך הגברה ליניארית (LAM-PCR) כדי לזהות אתרי אינטגרציה27,28,29. עם זאת, שיטות אלו דורשות בדרך כלל עיכול אנזימי הגבלה או שלבי קשירה, שיכולים להפחית את היעילות ולהכניס הטיות בתוצאות.

כדי לשפר את הזיהוי היעיל של אתרי אינטגרציה ברחבי הגנום במסכי גנטיקה קדמיים, הוצגה כאן שיטה הנקראת שיטת Insertion-based Screen for functional Elements and Transcripts (InSET). על ידי שילוב הליכת גנום עם NGS, InSET מאפשר זיהוי תפוקה גבוהה של אתרי אינטגרציה של lentivirus בספריות מוטגנזה מבוססות lentivirus. בהשוואה לשיטות הקיימות27,28,29, InSET הוא פשוט ופשוט יחסית, ומבטל את שלבי העיכול או הקשירה של אנזימי ההגבלה, מה שהופך אותו לנוח ונגיש יותר. יתר על כן, למרות שמסך הגנטיקה הקדמית הקיים בתאי יונקים מוגבל למעט מאוד קווי תאים הפלואידים או כמעט הפלואידים27,28,29,30,31, InSET הוכח כעובד בשורות תאים אנופלואידיות32.

מחקר זה מספק פרוטוקול מפורט, צעד-אחר-צעד, ליישום שיטת InSET. בנוסף, הוא מדגים את היישום של InSET במחקרי מוטגנזה הכנסתית. InSET משמש ככלי רב עוצמה לזיהוי אקסונים חדשים בתוך אלמנטים גנומיים, המקיף הן RNA מקודד חלבון והן לא מקודד בשורות תאים אנושיים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

איור 1 מספק סקירה סכמטית של שיטת InSET. לכיסוי אופטימלי, הכינו חמש ספריות מקבילות מ-1 מיקרוגרם של DNA גנומי, ולאחר מכן איגדו אותן לריצוף הדור הבא. הליך זה הושלם בהצלחה ברציפות בבדיקות קודמות, אם כי משתמשים יכולים להציג נקודות השהיה על פי שיקול דעתם. מידע מפורט על הריאגנטים והציוד המשמשים במחקר זה ניתן למצוא בטבלת החומרים.

1. לכידת אתרי אינטגרציה של lentivirus בגנום

  1. השתמש ב-DNA הגנומי המבודד מספריית תאי מוטגנזה מבוססת לנטי-וירוס (1 מיקרוגרם), כפי שתואר במחקר קודם32, כתבנית ל-PCR ליניארי בתגובה של 50 מיקרוליטר המכילה 1x Taq Buffer, 2.5 U Taq DNA Polymerase, 4 μL של תערובת dNTP (2.5 מ"מ כל אחד), ו-0.3 מיקרומטר של פריימר ביוטיניל 3-LTR_prime (טבלה 1) בשפופרת PCR.
    הערה: פריימר 3-LTR_prime חישול לאזור ה-LTR של רצף ה-lentivirus. אם הוא מתחבר ל-5' LTR, השבר המוגבר כולל את הרצף הגנומי האגפי. אם הוא מתחבר ל-3' LTR, השבר המוגבר מכיל רצף פנימי של lentivirus, שלא ניתן ליישר אותו לגנום המארח ולכן יסונן החוצה במהלך ניתוח נתוני ריצוף במורד הזרם. ניתן לשנות פריימר זה גם כדי להתאים לסוגים אחרים של וקטורים המשמשים ליצירת ספריית תאי מוטגנזה הכנסתית.
  2. בצע 50 מחזורים של PCR ליניארי במחזור תרמי PCR רגיל, הוסף 2.5 U של Taq DNA Polymerase בהתחלה ושוב מיד לאחר 25 מחזורים. תנאי ה-PCR הם כדלקמן: 94 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות; 50 מחזורים של 94 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, 55 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות ו-72 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות; 72 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות < > הערה: כדי לשמור על פעילות ה-Taq DNA Polymerase במהלך תגובות ממושכות, מומלץ להוסיף את האנזים הן בתחילת התגובה והן בנקודת האמצע.
  3. העבירו את מוצרי ה-PCR לצינור צנטריפוגה חדש ונקי בנפח 1.5 מ"ל.
  4. מערבבים היטב את מוצרי ה-PCR עם 10 מיקרוליטר של חרוזים מגנטיים של ביוטין-סטרפטווידין.
  5. דוגרים את התערובת למשך שעתיים בטמפרטורת החדר, מנערים ב -400 סל"ד באמבט מתכת.< > הערה: הוציאו את הצינור כדי לערבב היטב עם הפיפטה כל 15 דקות.
  6. השתמש במעמד מגנטי כדי לאסוף את החרוזים, ואז הסר בזהירות את הסופרנטנט.
  7. שטפו את החרוזים עם 300 מיקרוליטר של מאגר כריכה/שטיפה (10 מ"מ של Tris-HCl (pH 7.5), 1 מ"מ של EDTA, 1 מ' של NaCl, 0.1% Tween-20) 6 פעמים והשליכו את הסופרנטנט.
  8. שטפו עם 300 מיקרוליטר (65 מעלות צלזיוס) מים מזוקקים ללא DNase/RNase פעמיים והשליכו את הסופרנטנט.
  9. עבור סינתזת הגדיל השני, השעו מחדש את החרוזים בנפח תגובה של 24 מיקרוליטר המכיל 1x Klenow Fragment Buffer, 2 μL של תערובת dNTP (2.5 מ"מ כל אחד), ו-6.25 מיקרומטר של פריימר P5_N6 (טבלה 1) בצינור PCR.
    הערה: הכן תמיסת מלאי של 100 מיקרומטר של פריימר P5_N6. פריימר P5_N6 מורכב מרצף מתאם P5 קבוע בקצה 5' ורצף הקסמר אקראי בקצה 3'. ההקסמר האקראי יכול להיקשר למגוון רחב של רצפי מטרה, מה שהופך אותו למתאים להגברת מקטעי DNA שונים הנוצרים באמצעות PCR ליניארי.
  10. דגרו מראש את התערובת בטמפרטורה של 15 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות במחזור תרמי PCR.
  11. הוסף 2 U של שבר קלנוב (שבר גדול E.coli DNA פולימראז).
  12. דגרו את התערובות בתרמו-ציקלר PCR בתנאים הבאים: רמפה איטית ב-0.5 מעלות צלזיוס לדקה מ-15 מעלות צלזיוס ל-25 מעלות צלזיוס ואחריה דגירה של 30 דקות; ואז רמפה לאט ב-0.5 מעלות צלזיוס לדקה עד 37 מעלות צלזיוס ואחריה דגירה של שעה אחת.
  13. העבירו את מוצרי ה-PCR לצינור צנטריפוגה חדש ונקי בנפח 1.5 מ"ל.
  14. השתמש במעמד מגנטי כדי ללכוד את החרוזים, ואז השליך את הסופרנטנט.
  15. שטפו את החרוזים בעדינות עם 300 מיקרוליטר של 4 מעלות צלזיוס מים מזוקקים ללא DNase/RNase. אספו את החרוזים והשליכו את הסופרנטנט.

2. בניית ספריית NGS עם PCR מקונן

  1. השעו מחדש את החרוזים משלב 1.15 בנפח תגובת PCR של 25 μL המכיל 1x Taq Buffer, 1.25 U Taq DNA Polymerase, 0.5 μM של פריימר P5 (טבלה 1), 2 μL של תערובת dNTP (2.5 מ"מ כל אחד), ו-0.5 מיקרומטר של פריימר 3-LTR_Nest (טבלה 1) בשפופרת PCR.
  2. בצע תגובות PCR בתרמו-ציקלר PCR בתנאים הבאים: 94 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות; 20 מחזורים של 94 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, 55 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות ו-72 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות; 72 מעלות צלזיוס למשך 7 דקות.
  3. השתמש ב-5 μL של מוצרי ה-PCR משלב 2.2 כתבנית לסבב הבא של PCR בנפח של 50 μL המכיל 1x Taq Buffer, 2.5 U Taq DNA Polymerase, 4 μL של תערובת dNTP (2.5 mM כל אחד), 0.4 μM של פריימר Illumina_P5 (טבלה 1) ו-0.4 μM של פריימר Illumina_P7-3LTR (טבלה 1).
  4. בצע תגובות PCR בתרמו-ציקלר PCR בתנאים הבאים: 94 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות; 15 מחזורים של 94 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, 55 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות ו-72 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות; 72 מעלות צלזיוס למשך 7 דקות.
  5. העבירו את מוצרי ה-PCR לצינור צנטריפוגה נקי של 1.5 מ"ל.< /> הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול בשלב זה, ולאחסן את הדגימות בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
  6. טהר את מוצרי ה-PCR באמצעות נפחים של פי 1.2 של חרוזים נקיים של DNA, מה שמביא את הנפח הסופי ל-21 μL.
    הערה: קח 10 מיקרוליטר של מוצרי PCR מכל אחת מ-5 הספריות שהוכנו במקביל, אגד אותם יחד וטהר לנפח סופי של 21 מיקרוליטר. פרוטוקול הטיהור של מוצרי ה-PCR מותאם מהוראות היצרן לחרוזים הנקיים של ה-DNA (ראה טבלת חומרים).
    1. מאזנים את החרוזים מ 2-8 מעלות צלזיוס לטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
    2. מערבבים היטב את החרוזים על ידי היפוך או מערבולת.
    3. פיפטה פי 1.2 נפחים של החרוזים לצינור צנטריפוגה נקי של 1.5 מ"ל.
    4. הוסיפו את מוצרי ה-PCR לחרוזים וערבבו היטב על ידי פיפטינג למעלה ולמטה 10 פעמים.
    5. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות כדי לאפשר קשירת DNA לחרוזים.
    6. הניחו את הדגימות על מעמד מגנטי והסירו את הסופרנטנט ברגע שהתמיסה צלולה (כ-5 דקות).
    7. הוסף 200 מיקרוליטר של 80% אתנול כדי לשטוף את החרוזים, לדגור בטמפרטורת החדר למשך 30 שניות ולהסיר את הסופרנטנט.
      הערה: יש להכין את 80% האתנול טרי.
    8. חזור על שלב 2.6.7 פעם אחת.
    9. יבש את החרוזים בטמפרטורת החדר כשהמכסה פתוח למשך כ -5 דקות.
    10. הסר את הצינור מהמעמד המגנטי, הוסף 22 מיקרוליטר מים מזוקקים ללא DNase/RNase, ערבב היטב על ידי פיפטינג למעלה ולמטה 10 פעמים, ותן לו לשבת בטמפרטורת החדר למשך 2 דקות.
    11. הנח את הצינור על המעמד המגנטי עד שהתמיסה צלולה (כ-2 דקות), ולאחר מכן העביר 21 מיקרוליטר של סופרנטנט לצינור צנטריפוגה נקי של 1.5 מ"ל.
      הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול בשלב זה, ולאחסן את הדגימות בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
  7. השתמש ב-1 מיקרוליטר של מוצרי PCR מטוהרים כדי למדוד את הריכוז באמצעות הפלואורומטר עם ערכת זיהוי הקרינה dsDNA הזמינה מסחרית (ראה טבלת חומרים).
    הערה: פרוטוקול מדידת הריכוז עוקב אחר הוראות היצרן עבור ערכת זיהוי dsDNA.
    1. הכן את הכנת פתרון העבודה על ידי ערבוב המגיב והמאגר (המסופק בערכה) ביחס של 1:200.
    2. הכן את תקני הבדיקה על ידי ערבוב של 10 מיקרוליטר של תקן #1 ו-10 מיקרוליטר של תקן #2 (מסופק בערכה), כל אחד עם 190 מיקרוליטר של תמיסת עבודה. מערבלים בעדינות את התערובת למשך 2-3 שניות.
    3. הכן את דגימת הבדיקה על ידי ערבוב של 1 מיקרוליטר של מוצרי ה-PCR המטוהרים עם 190 מיקרוליטר של תמיסת עבודה. מערבלים בעדינות את התערובת למשך 2-3 שניות.
    4. דגרו את תקני הבדיקה ודגימות הבדיקה למשך 2 דקות בטמפרטורת החדר, תוך שמירה עליהם מוגנים מפני אור.
    5. הפעל את הפלואורומטר.
    6. בחר את תוכנית הרגישות הגבוהה dsDNA מהתפריט הראשי.
    7. לכיול, הכנס את תקן #1 למכונה, לחץ על כפתור קרא תקן כדי למדוד את התקן הראשון, ולאחר מכן הכנס תקן #2 ולחץ על כפתור קרא תקן כדי למדוד את התקן השני.
    8. למדידת דגימה, לחץ על כפתור הפעל דוגמאות כדי לעבור לדף מדידת הדגימה. הכנס כל צינור המכיל את דגימת הבדיקה, ולחץ על כפתור הקריאה כדי לקבל את הריכוז.
      הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול בשלב זה, ולאחסן את הדגימות בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
  8. בצע NGS על פלטפורמות Illumina תוך שימוש באסטרטגיית קצה מזווג של 150 bp (PE150) בקנה מידה של 30 ג'יגה-בסיס (GB).
    הערה: שלב זה בדרך כלל מועבר למיקור חוץ לחברות הריצוף.

3. ניתוח נתונים

הערה: הניתוח בשורות תאים אנושיים שימש כדוגמה בסעיף זה.

  1. מיפוי אתרי אינטגרציה של lentivirus
    1. סנן קריאות רצף עם יותר מ-50% בסיסים באיכות נמוכה (ציון פרד <20), יותר מ-15 בסיסי 'N', או קצר מ-150 בסיסים באמצעות כלי fastp33 (ראה טבלת חומרים).
    2. בחר רק קריאות קצה מזווג עם הקריאה 2 המתחילה בתג LTR "GCCTTGTGTGTGTGTTAGATCCACAG
      ATCAAGGATATCTTGTCTTCGTTGGGAGTGAAT
      TAGCCCTTCCA".
      הערה: רצף זה תלוי ברצף הווקטור המשמש ליצירת ספריית תאי המוטגנזה ההכנסתית.
    3. חתוך את רצף תגי ה-LTR מהקריאות שנבחרו משלב 3.1.2.
    4. יישר את הקריאות החתוכות ל-GRCh37/hg19 באמצעות BWA-MEM 34 (ראה טבלת חומרים) עם הגדרות ברירת מחדל.
    5. שמור רק זוגות קריאה שבהם גם קריאה 1 וגם קריאה 2 ממופים באופן ייחודי לגנום עם תצורה וריווח נכונים, המסומנים על ידי FLAG 147 ו-FLAG 163.
    6. הגדר את מיקום ההכנסה כבסיס המיושר הראשון של הקריאה החתוכה 2.
    7. נרמל את ספירת הקריאה בכל אתר הוספה ייחודי למספר הכולל של קריאות מיושרות באופן ייחודי בכל דגימה.
  2. זיהוי החדרות המשפיעות על הכושר התאי (IACFs)
    הערה: בניתוח הסטטיסטי, רצוי לבצע השוואות זוגיות בין שלושת השכפולים הביולוגיים של דגימות ביקורת ומטופלות כדי לזהות מיקומים מועשרים או מדוללים משמעותית. מספר השכפולים שהוזכרו לעיל הוא מינימלי. מומלץ להשתמש בכמה שיותר שכפולים מעשיים כדי להבטיח את אמינות ודיוק התוצאות.
    1. המר את ספירת הקריאה המנורמלת של כל מיקוםל-10 ערכים.
    2. הגדר אתערכי היומן 10 של מיקומים עם אפס קריאות כ-5.
    3. בצע מבחן t זוגי דו-צדדי של סטודנט על ערכיהיומן 10.
    4. התאם את ערכי ה-p עבור השוואות מרובות באמצעות שיטת Benjamini-Hochberg בסביבת R.
    5. בחר פוזיציות עם סף False Discovery Rate (FDR) של 25% כ-IACF.
  3. זיהוי אשכולות המשפיעים על הכושר התאי (CACFs)
    הערה: שלושה שכפולים ביולוגיים של דגימות בקרה ומטופלות הומלצו לניתוח זה.
    1. זהה את אשכולות ההחדרה המועשרים או המדולדלים משמעותית בין דגימות ביקורת ומטופלות באמצעות SICER35 (ראה טבלת חומרים) עם סף FDR של 1%. הפקודה לניתוח SICER היא "sh $SICER/SICER.sh $InputDir $In $Control $OutputDir hg19 1 10 1 0.8 30 0.01".
      הערה: המשמעויות של הפרמטרים בפקודה לעיל הן כדלקמן: ["InputDir"] ["קובץ מיטה של אתרי הכנסת מדגם מטופל"] ["קובץ מיטה של אתרי הכנסת מדגם בקרה"] ["OutputDir"] ["מינים"] ["סף יתירות"] ["גודל חלון (bp)"] ["גודל שבר"] ["שבר גנום אפקטיבי"] ["גודל פער (bp)"] ["ערך E"].
    2. השג אזורי אשכול המשותפים לשני שכפולים ביולוגיים לפחות עם פונקציית ה"הצטלבות" של חבילת BEDTools36 (ראה טבלת חומרים) וסמן אזורי אשכול אלה כ-CACFs.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערכת בקרת איכות של ספריית NGS, המבוצעת בדרך כלל על ידי ספק הריצוף, משמשת כבדיקת האיכות הסטנדרטית לפני הרצף. כדי להדגים את ההשפעה של איכות הספרייה, הושוו שתי דוגמאות. הספרייה האיכותית, שכותרתה s2-20-15, הוכנה באמצעות פרוטוקול PCR מקונן סטנדרטי, המורכב משני שלבי הגברה עוקבים: הראשון עם 20 מחזורים, ואחריו השני עם 15 מחזורים. לעומת זאת, הספרייה באיכות נמוכה, שכותרתה s1-30, הוכנה באמצעות PCR חד-שלבי עם 30 מחזורים לשילוב מתאמי Illumina.

כפי שמוצג בטבלה 2, לדגימה באיכות נמוכה יש ריכ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בניתוח גנטי קדימה, הליכה בגנום חיונית לפרופיל אתרי אינטגרציה בספריות תאי מוטגנזה הכנסתיים. שיטות קלאסיות של הליכה בגנום כמו I-PCR ו-LAM-PCR דורשות לעתים קרובות עיכול וקשירה של אנזימי הגבלה, מה שיכול להפחית את מורכבות הספרייה ולהכניס הטיות עקב תלות באתר האנזים 27,28,29. שיטת InSET מתגברת על מגבלות אלה על ידי ביטול שלבי ההגבלה, העיכול והקשירה. הוא דומה ל-PCR מעוגן מעריכי ברצף האגף (Flea-PCR)37 אך מפושט עוד ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין גילוי נאות.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

D.X. נתמך על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (32000441), הקרן למדעי הטבע של מחוז פוג'יאן, סין (2023J01130), קרנות המחקר הבסיסיות עבור האוניברסיטאות המרכזיות של אוניברסיטת Huaqiao (ZQN-924), וקרנות המחקר המדעי של אוניברסיטת Huaqiao (18BS205). P.K. נתמך על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (32170619), קרן המחקר למדענים בכירים בינלאומיים מהטבע הלאומי קרן המדע של סין (32150710525), והקרן למדעי הטבע של מחוז פוג'יאן, סין (2020J02006).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.5 מ' EDTAInvitrogenAM9260Gלהכנת מאגר כריכה/כביסה
1 מ' Tris-HCl (Ph 8.0)Invitrogen15568025להכנת מאגר כריכה/כביסה
10&; מאגר שברים של קלנוב טקארה2140A
10&פעמים; Taq BufferTiangenET101-01-01
5 M NaClInvitrogenAM9659להכנת מאגר כריכה/כביסה
BeaverBeads StreptavidinBeaver22307-11 μ m
BEDToolsתוכנה, v2https://bedtools.readthedocs.io/en/latest/
BWA-MEMתוכנה, v0.7.12
dNTP תערובתTakara40302.5 mM כל אחד
Equalbit dsDNA HS ערכת בדיקהVazymeEQ111-02
fastpתוכנה
HiSeq X עשרIlluminaפלטפורמת SY-412-1001Illumina, במיקור חוץ ל-Novogene Corporation (בייג'ינג)
Klenow FragmentTakara2140A
NovaSeq 6000Illumina20012850 פלטפורמת Illumina, במיקור חוץ ל-Novogene Corporation (בייג'ינג)
Qubit 3.0 FluorometerThermoFisher ScientificQ33216
SICERSoftware, v1.1
Taq DNA פולימראזTiangenET101-01-01
Tween-20HuShi30189328להכנת מאגר כריכה/שטיפה
UltraPure מים מזוקקיםInvitrogen10977015
VAHTS DNA חרוזים נקייםVazymeN411-01

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kapranov, P., et al. Large-scale transcriptional activity in chromosomes 21 and 22. Science. 296 (5569), 916-919 (2002).
  2. Bertone, P., et al. Global identification of human transcribed sequences with genome tiling arrays. Science. 306 (5705), 2242-2246 (2004).
  3. Carninci, P., et al. The transcriptional landscape of the mammalian genome. Science. 309 (5740), 1559-1563 (2005).
  4. Kapranov, P., et al. The majority of total nuclear-encoded non-ribosomal RNA in a human cell is 'dark matter' un-annotated RNA. BMC Biol. 8, 149(2010).
  5. Djebali, S., et al. Landscape of transcription in human cells. Nature. 489 (7414), 101-108 (2012).
  6. Kapranov, P., et al. Examples of the complex architecture of the human transcriptome revealed by race and high-density tiling arrays. Genome Res. 15 (7), 987-997 (2005).
  7. Denoeud, F., et al. Prominent use of distal 5' transcription start sites and discovery of a large number of additional exons in encode regions. Genome Res. 17 (6), 746-759 (2007).
  8. Mercer, T. R., et al. Targeted RNA sequencing reveals the deep complexity of the human transcriptome. Nat Biotechnol. 30 (1), 99-104 (2011).
  9. Deveson, I. W., et al. Universal alternative splicing of non-coding exons. Cell Syst. 6 (2), 245-255.e5 (2018).
  10. Xu, D., Tang, L., Kapranov, P. Complexities of mammalian transcriptome revealed by targeted RNA enrichment techniques. Trends Genet. 39 (4), 320-333 (2023).
  11. Amaral, P., et al. The status of the human gene catalogue. Nature. 622 (7981), 41-47 (2023).
  12. Mattick, J. S., et al. Long non-coding RNAs: Definitions, functions, challenges and recommendations. Nat Rev Mol Cell Biol. 24 (6), 430-447 (2023).
  13. Bassik, M. C., et al. A systematic mammalian genetic interaction map reveals pathways underlying ricin susceptibility. Cell. 152 (4), 909-922 (2013).
  14. Wang, T., et al. Identification and characterization of essential genes in the human genome. Science. 350 (6264), 1096-1101 (2015).
  15. Zhu, S., et al. Genome-scale deletion screening of human long non-coding RNAs using a paired-guide RNA CRISPR-Cas9 library. Nat Biotechnol. 34 (12), 1279-1286 (2016).
  16. Liu, S. J., et al. CRISPRi-based genome-scale identification of functional long non-coding RNA loci in human cells. Science. 355, 6320(2017).
  17. Bester, A. C., et al. An integrated genome-wide CRISPRa approach to functionalize lncRNAs in drug resistance. Cell. 173 (3), 649-664.e20 (2018).
  18. Liu, Y., et al. Genome-wide screening for functional long non-coding RNAs in human cells by Cas9 targeting of splice sites. Nat Biotechnol. 36, 1203-1210 (2018).
  19. Xu, D., et al. A CRISPR/Cas13-based approach demonstrates biological relevance of vlinc class of long non-coding RNAs in anticancer drug response. Sci Rep. 10 (1), 1794(2020).
  20. Noguchi, Y., Matsui, R., Suh, J., Dou, Y., Suzuki, J. Genome-wide screening approaches for biochemical reactions independent of cell growth. Annu Rev Genomics Hum Genet. 25 (1), 51-76 (2024).
  21. Recinos, Y., et al. CRISPR-dCas13d-based deep screening of proximal and distal splicing-regulatory elements. Nat Commun. 15 (1), 3839(2024).
  22. Cho, S. W., et al. Analysis of off-target effects of CRISPR/Cas-derived RNA-guided endonucleases and nickases. Genome Res. 24 (1), 132-141 (2014).
  23. Zhang, X. H., Tee, L. Y., Wang, X. G., Huang, Q. S., Yang, S. H. Off-target effects in CRISPR/Cas9-mediated genome engineering. Mol Ther Nucleic Acids. 4 (11), e264(2015).
  24. Stojic, L., et al. Specificity of RNAi, LNA and CRISPRi as loss-of-function methods in transcriptional analysis. Nucleic Acids Res. 46 (12), 5950-5966 (2018).
  25. Gao, F., Cai, Y., Kapranov, P., Xu, D. Reverse-genetics studies of lncRNAs-what we have learnt and paths forward. Genome Biol. 21 (1), 93(2020).
  26. Leoni, C., Volpicella, M., De Leo, F., Gallerani, R., Ceci, L. R. Genome walking in eukaryotes. FEBS J. 278 (21), 3953-3977 (2011).
  27. Carette, J. E., et al. Haploid genetic screens in human cells identify host factors used by pathogens. Science. 326 (5957), 1231-1235 (2009).
  28. Carette, J. E., et al. Global gene disruption in human cells to assign genes to phenotypes by deep sequencing. Nat Biotechnol. 29 (6), 542-546 (2011).
  29. Burckstummer, T., et al. A reversible gene trap collection empowers haploid genetics in human cells. Nat Methods. 10 (10), 965-971 (2013).
  30. Carette, J. E., et al. Ebola virus entry requires the cholesterol transporter niemann-pick c1. Nature. 477 (7364), 340-343 (2011).
  31. Cao, J. Y., et al. A genome-wide haploid genetic screen identifies regulators of glutathione abundance and ferroptosis sensitivity. Cell Rep. 26 (6), 1544-1556.e8 (2019).
  32. Xu, D., et al. Evidence for widespread existence of functional novel and non-canonical human transcripts. BMC Biol. 21 (1), 271(2023).
  33. Chen, S., Zhou, Y., Chen, Y., Gu, J. Fastp: An ultra-fast all-in-one FASTQ preprocessor. Bioinformatics. 34 (17), i884-i890 (2018).
  34. Li, H. Aligning sequence reads, clone sequences and assembly contigs with bwa-mem. arXiv preprint arXiv:1303.3997. , (2013).
  35. Zang, C., et al. A clustering approach for identification of enriched domains from histone modification chip-seq data. Bioinformatics. 25 (15), 1952-1958 (2009).
  36. Quinlan, A. R., Hall, I. M. Bedtools: A flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
  37. Pule, M. A., et al. Flanking-sequence exponential anchored-polymerase chain reaction amplification: A sensitive and highly specific method for detecting retroviral integrant-host-junction sequences. Cytotherapy. 10 (5), 526-539 (2008).
  38. Demeulemeester, J., De Rijck, J., Gijsbers, R., Debyser, Z. Retroviral integration: Site matters: Mechanisms and consequences of retroviral integration site selection. Bioessays. 37 (11), 1202-1214 (2015).
  39. Kvaratskhelia, M., Sharma, A., Larue, R. C., Serrao, E., Engelman, A. Molecular mechanisms of retroviral integration site selection. Nucleic Acids Res. 42 (16), 10209-10225 (2014).
  40. Ambrosi, A., et al. Estimated comparative integration hotspots identify different behaviors of retroviral gene transfer vectors. PLoS Comput Biol. 7 (12), e1002292(2011).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Lentivirus Integration SitesInsertional MutagenesisFunctional GenomicsForward Genetic ScreenGenome Wide ScreeningNext Generation SequencingFunctional Genomic ElementsPCR AmplificationMagnetic Bead PurificationHuman Genome Analysis

מאמרים קשורים