טכניקות גידול ועיבוד אורגניאידים תלת-ממדיים ליצירת מיומטריאלים ופיברואידים ברחם

Summary

פרוטוקול זה מתאר טכניקה ידנית ליצירת הידרוגלים המכילים קולגן המוטמעים בתרביות אורגנואידיות תלת-ממדיות של תאי גזע מרקמת מיומטריאלית ופיברואיד רחמי.

Abstract

פיברואידים ברחם הם הגידולים השפירים, החד-שבטיים והגינקולוגיים הנפוצים ביותר ברחם של אישה. כדי להתגבר על המכשולים הנפוצים הקשורים לשיטות הלימוד של פתולוגיות אלו, שאפנו לגבש אסטרטגיה ליצירת מודלים תלת-ממדיים אורגנואידים של תאי גזע מיומטריום ופיברואיד ברחם, תוך שימוש בהידרוגלים המכילים קולגן כפיגומי הטמעה. בפרט, נוצלו הידרוגלים המכילים קולגן בלוחות V-bottom עם חיבור נמוך ב-96 בארות. שיטה זו אפשרה פיתוח אורגנואידים תלת-ממדיים משני סוגי תאי גזע ממיומטריום רגיל וממיומטריום המכיל פיברואיד ברחם, על ידי הטמעה שלהם בהידרוגלים המכילים קולגן ויצירת אורגנואידים בתווך מתאים להתרבות תאי גזע. האורגנואידים הצליחו להבחין, להתרבות ולהתארגן למבנים מורכבים, ופיתחו מערכת בת-קיימא. חשיבות המודל הזה היא בהבנת הפתופיזיולוגיה והאתיופתוגנזה, וכן בבדיקת תרופות חדשות למניעה או טיפול בפיברואידים ברחם.

Introduction

פיברואידים ברחם, או לייומיומות, הם הגידולים השפירים הנפוצים ביותר ברחם¹. הן משפיעות על חלק משמעותי מהנשים במהלך שנות הפוריות, כאשר מחקרים מצביעים על כך שכ-77% מהנשים חוות אותן בשלב כלשהו. בעוד שרבות מהנשים סובלות מפיברואידים ללא תסמינים, 25% משמעותיות חוות תסמינים כמו דימום רחמי לא תקין, כאבי אגן או עקרות². התפתחות וצמיחת הפיברואידים מושפעים ממגוון גורמים, כולל הורמוני מין, גורמי גדילה, שינויים גנטיים ומנגנונים ביולוגיים נוספים³.

כדי לחקור פתוגנזה ולבדוק את יעילות התרופות, פותחו מודלים במבחנה ובעלי חיים. תאים בתרביות דו-ממדיות נאלצים לגדול על משטח שטוח, מה שמעוות את צורתם ומשנה את התנהגותם בהשוואה להתנהגותם בסביבה של רקמות תלת-ממדיות. החיסרון העיקרי של תרבות דו-ממדית לעומת תרבית תלת-ממדית הוא שהיא מייצגת בצורה לקויה את הסביבה התאית הטבעית בתוך הרקמה, ואינה מחקה במדויק אינטראקציות מורכבות בין תא ותא ומטריקס תאים המתרחשות באורגניזם חי, מה שמוביל לתוצאות שעלולות להיות לא מדויקות בחקר התנהגות תא ותגובות לגירויים⁴. בנוסף, תאי UF ותאי מיומטריה מאבדים במהירות את התגובה להורמונים בתרבות דו-ממדית⁵. בסך הכל, מודלים שונים של בעלי חיים סיפקו מידע רלוונטי בנוגע לפתופיזיולוגיה של UF⁶. בהשוואה למודלים של בעלי חיים, אורגנואידים תלת-ממדיים מציעים מספר יתרונות: הם מפשטים ניסויים, תואמים להדמיה בזמן אמת, ומאפשרים חקר היבטים התפתחותיים ומחלתיים ייחודיים לאדם שאינם מיוצגים היטב במודלים של בעלי חיים^. מצד שני, ניסויים עם בעלי חיים מתוחכמים יותר, כמו פרימטים, קשים מאוד להצדקה אתית, בנוסף להוצאות גבוהות⁸. המודל האורגני התלת-ממדי בדרך כלל עדיף על תרביות תאים דו-ממדיות בכך שהוא מחקה יותר את ארכיטקטורת הרקמות ב-vivo תוך שהוא מבוקר, יעיל וחסכוני יותר ממודלים של בעלי חיים. לכן, חיוני לפתח מודלים חלופיים יעילים יותר המשכפלים במדויק את צמיחה טבעית של תאים ואת המורכבות של רקמות חולות.

מטרתנו להקים הליך לביצוע תרביות תלת-ממדיות של תאי גזע מיומטריאליים ופיברואידים ברחם באמצעות הידרוג'לים המכילים קולגן באמצעות הליך ידני, תוך הדגשת היתרונות והמגבלות העיקריים.

Protocol

הפרוטוקול אושר על ידי ועדת האתניות של אוניברסיטת שיקגו, עם מספר אישור IRB#20-1414. לפי בנק הרקמות של אוניברסיטת שיקגו, התקבלה הסכמה מדעת מכל הנבדקים מהם נאספה הרקמה.

1. 3D תרבות של אורגנואיד

1. תרבית ותחזוקה של תאי הגזע המיומטריאליים וה-UF (SC) המבודדים והמטוהרים כפי שתואר קודם⁹.
2. השגת SCs מחנקן נוזלי ואפשרה להם להפשיר. תרשים זרימה של תהליך הגידול מוצג באיור 1.
3. הוסף 5 מ"ל מחלבון פקטור החיבור להכנת הבקבוקים המצופים מראש. דגרו לפחות 4 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן תזרקו את החלבון העודף של פקטור ההתקשרות.
4. גידול את ה-SCs בבקבוקים מצופים מראש בגודל 75 ס"^{מ 2} באמצעות 10 מ"ל מהתווך הכולל את מדיום ה-Eagle's המותאם של Dulbecco (DMEM) ו-F12, בתוספת סרום בקר עוברי (FBS) של 12%. דגרו את הבקבוק באינקובטור היפוקסיה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם ריכוז חמצן של 2% עד שיגיעו למפגש של 90%, כפי שמוצג באיור 2A.
   הערה: היפוקסיה יכולה למלא תפקיד משמעותי בצמיחת תאי גזע, שכן היא יכולה לקדם התרבות והישרדות של תאי גזע.
5. בהגעה לנקודת ההתנגשות, הפרדו את התאים באמצעות תמיסת 25% טריפסין-0.1% EDTA ב-HBSS ללא סידן או מגנזיום.
   1. כדי לעשות זאת, הסר את מדיום תרבית התאים. שטוף את התאים עם 1x PBS. הוסיפו 1 מ"ל טריפסין לתא אחד בגודל 25 ס"מ² ודגרו במשך 2-3 דקות.
   2. ברגע שהתאים מתחילים להתנתק, הוסיפו מדיום עם סרום כדי לעצור את תגובת הטריפסין. שאיפת תמיסת התא לצינור וצנטריפוגה של 15 מ"ל למשך 5 דקות בעוצמה של 500 x גרם בטמפרטורת החדר.
   3. בזהירות, זרקו את הסופרנטנט, והשאירו את הכדור שלם.
6. החזירו את כדור התא לאחר מכן לתוך 1 מ"ל של תאי גזע ללא סרום מתרבים ומרובים. הפר כל גושים באמצעות פיפטינג עדין.
7. בצע כימות תאים באמצעות המוציטומטר.
   1. מערבבים 100 מיקרוליטר של מתלה תא עם 10 מיקרוליטר של תמיסת Trypan Blue של 0.4%.
   2. מערבולת את התערובת לזמן קצר ופיפטה של 10 מיקרולטר של תליית תאי כחול טרייפן לתוך תא ההמוסיטומטר בין חריץ התא לכיסוי הזכוכית ( איור 2B).
   3. ספירת תאים בתיבות 1-4, השתמשו במשוואות הבאות כדי לחשב את ספירת התאים:
      תאים/מ"ל = (סך התאים שנספרו/מספר הקופסאות הכולל שנספרו) x גורם דילול כפול 10,000
      סך התאים בדגימה = תאים/מ"ל x נפח הדגימה הכולל
8. מערבבים כ-10,000 תאים עם 2 מיקרוליטר הידרוגלים המכילים קולגן ו-98 מיקרוליטר של תאי גזע חסרי סרום המתרבים במדיום, ומניבים נפח סופי של 100 מיקרוליטר לבאר⁵עבור פלטת V-תחתית עם 96 בארות.
9. פיפט של 100 מיקרולטר מתערובת התאים לכל באר של לוח V-תחתית עם חיבור נמוך ו-96 בארות. צנטריפוגה בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות בטמפרטורה של 100 x גרם.
10. הניחו את הפלטה בתנור של 37 מעלות צלזיוס עם 5%_CO2 למשך 30 דקות.
11. הוסף נפח נוסף של 100 מיקרוליטר של מדיום מתרבות תאי גזע ללא סרום ללא הידרוג'לים המכילים קולגן לכל באר, כדי לספק את התזונה הדרושה לצמיחת האורגנים.
12. פיצו על אידוי המדיום על ידי הוספת 10-20 מיקרוליטר של תאי גזע ללא סרום המתרבים בכל באר במקרה של אידוי מופרז, דבר שמתרחש לעיתים רחוקות.
13. תרבית התאים למשך 7 ימים לצמיחה מלאה של האורגנידים איור 2C-H. החליפו את המדיום המתרבות של תאי הגזע ללא סרום פעמיים בשבוע (שאיפת המדיום הישן בעדינות ואז הוספת מדיום חדש) כדי לאפשר הארכת תרביות של אורגנואידים שמקורם ב-SCs עד 21 ימים.

2. חתך קפוא

1. אסוף תאים מלוח עם 96 בארים בצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל.
2. לצורך קריו-סקציה, שטפו אורגנואידים פעמיים עם מלח מפופר פוספט (PBS; פעם). הוסף 500 מיקרו ליטר של PBS לאורגנואידים, ואז צנטריפוגה והשליך את הסופרנאנט.
3. מקבע את האורגנידים ב-500 מיקרוליטר של 4% פאראפורמלדהיד (PFA) למשך 60 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ושטוף שוב עם 1x PBS.
4. החזירו את האורגנואידים ל-100 מיקרוליטר של 2% מתילן כחול לצביעה למשך 20 דקות. שטוף עם 1x PBS וקריופרוטקט לילה על ידי השעיה ב-500 מיקרוליטר של סוכרוז 30%.
5. למחרת, הסר את תמיסת הסוכרוז בצנטריפוגה. הטמיעו את האורגנידים בתרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT) והקפאת פלאש בטמפרטורה של −80 מעלות צלזיוס.
6. חתך את האורגנידים המוטמעים ב-OCT באמצעות קריוסטט, עומק החתך האופטימלי הוא 10 מיקרון, ומניחים מיד את החתכים על השקופיות, חתך אחד לכל שקופית.
7. שמרו את המחסניות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד שיתבצע צביעת אימונופלואורסצנציה לפי השיטה הבאה.
8. שטוף את המחסנית 3 פעמים עם 100 מיקרוליטר של 1x PBS. לאחר מכן, הוסף 100 מיקרוליטר של 0.1% טריטון ב-PBS (פעם אחת) למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
9. חסמו את האורגנידים עם 5% BSA ב-1x PBS למשך 60 דקות ודגרו במהלך הלילה עם נוגדנים ראשוניים ל-Sox-2 עם דילול (1:500) ו-α-אקטין לשריר חלק (α-SMA) בריכוז סופי של 1 מיקרוגרם/מ"ל.
10. שטוף את האורגנידים ב-100 מיקרוליטר של 1x PBS 3x ואז דגר במשך שעה בחושך עם נוגדנים משניים לצבע פלואורסצנטי מסומן על ידי Alexa Fluor (1:1000).
11. שטוף עם 100 מיקרוליטר של 1x PBS 2x ואז התקן ב-Antifade Mount Medium בתוספת DAPI (1 ng/mL).
12. צלם תמונות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם הגדלה של פי 20. ראו איור 3A ונתחו את התמונות באמצעות תוכנה לניתוח הדמיה ביולוגית.

3. צביעת אימונופלואורסצנציה של אורגנידים שלמים

1. הסר את האורגנידים מהמדיה (שלב 1.11) לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה ושטוף פעמיים עם 500 מיקרוליטר של 1x PBS.
2. תקבע את האורגנואידים עם 500 מיקרוליטר של 4% PFA למשך 60 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן זרקו את ה-PFA ושוטפים עם 500 מיקרוליטר PBS 3x.
3. חדיר את האורגנידים הקבועים עם 0.5 מ"ל בופר חוסם במהלך הלילה בטמפרטורה של 4°C.
4. למחרת, הסר את בופר החסימה, הוסף נוגדנים ראשוניים (300-500 מיקרוליטר) של קולגן III (COL3A1) עם דילול (1:500) ו-AHR עם דילול (1:1000), ודגר את הדגימות בטמפרטורה של 4°C במהלך הלילה.
5. שטפו את האורגנואידים 3 פעמים עם 500 מיקרוליטר של 1x PBS ואז דגרו עם נוגדנים משניים (594 IgG אנטי-ארנב עז ו-488 IgG נגד עכבר עזים) במהלך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס בחושך.
6. שטפו את האורגנידים 3x עם 500 מיקרוליטר של 1x PBS, ואז דגרו עם 5 מיקרוגרם/מ"ל של 4′,6-דיאמידינו-2-פנילינדול (DAPI) ב-1x PBS (300-500 מיקרוליטר לדגימה) בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות.
7. שטפו את האורגנואידים שלוש פעמים עם 500 מיקרוליטר של 1x PBS והתמונה במיקרוסקופ קונפוקלי (איור 3B).

4. דיסוציאציה אורגנואידית

1. לשחזר 100 מ״ג פפאן בתמיסת הפעלה מעוקרת במסנן לריכוז מלאי של 250 U/mL, לדוגר את התמיסה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות כדי להפעיל את האנזים
   הערה: ניתן לאחסן אותו בטמפרטורה של 2 - 8 מעלות צלזיוס למשך עד שבועיים.
2. הכינו תמיסת דיסוציאציה (מיד לפני השימוש) עם 30 U/mL פפיין ו-125 U/mL DNase I בתמיסת המלח המאוזנת של הנקס (HBSS).
3. העבר את האורגנידים (שלב 1.11) ללוחות עם 24 בארות והוסף 500 מיקרוליטר של תמיסת דיסוציאציה.
4. דגרו את הדגימות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30-60 דקות על שייקר אורביטלי מכוון ל-90 סל"ד.
5. תליון לסירוגין 5x-6x באמצעות פיפטור בנפח 1 מ"ל בטמפרטורת החדר כדי לקבל תלייה המורכבת בעיקר מתאים בודדים.
6. הוסיפו את תליית התא לצינור צנטריפוגה בנפח 15 מ"ל המכיל תמיסת מעכב פרוטאז (1 מ"ל של 10 מ"ג/מ"ל) וצנטריפוגה ב-300 x גרם למשך 5 דקות לתאי פלט ולהשליך את הסופרנטנט.
7. תלויים מחדש את התאים בבופר המתאים, וההשעיה החד-תאית המתקבלת מוצגת באיור 2I.

Results

כבר ביום הראשון לאחר הזרעה, SCs החלו להתאגד בעצמם, וליצור אורגנואידים, כפי שמוצג. קבענו שצפיפות הזריעה האופטימלית היא 10,000 SCs, אשר יצרו בעקביות אורגנואידים בעת גידול במערכת תרביות מוגדרת. מערכת זו השתמשה בהידרוגלים המכילים קולגן כמגמת ECM לתאי גזע מוטמעים ולמדיום התרבות תאי גזע למשך 7 ימים בלוח 96 בארות עם חיבור נמוך במיוחד איור 2C-G. בסביבה זו, התאים מאורגנים בעצמם כבר ביום הראשון, ומתפתחים למבנים אורגנוא...

Discussion

אורגנואידים הם מבנים תלת-ממדיים הדומים לאיברים מוקטנים ומורכבים מתאים מאורגנים שמקורם בתאי גזע או דגימות רקמה¹¹. אורגנואידים של תאי גזע שמקורם ברקמה של המטופלים יכולים לחולל מהפכה במחקר ביו-רפואי וביישומים קליניים, בזכות יכולתם המרשימה לשחזר במדויק את פיזיולוגיית UF ומחלה¹². כאן, מחקר זה מנסה לגשר על הפער הזה על ידי הכנסת מערכת תרבית אורגנואידית שמקורה ב-SCs אנושיים של חולים רגילים וחולים עם UF.

הנקודה המרכזית ב...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
קונפוקל 2-פוטון  מיקרוסקופ	לייקה, ארה"ב
אגארוזה הראשון	תאגיד VWR, ארה"ב	97062-248
מיקרופלטות ספרואידי של אקורה 96	אינספרו	CS-09-004-03	לוחות V-bottom עם חיבור נמוך
Alexa Fluor 488 נגד עכבר עזים IgG	לייף טכנולוגיות, קליפורניה, ארה"ב	(A11029)	(1:1000)
אלקסה פלואר 594 עזים נגד ארנב IgG	לייף טכנולוגיות, קליפורניה, ארה"ב	(A11037)	(1:1000)
אנטי-אהר [RPT]	ג'נטקס, טייוואן	(GTX227700a)	(1:1000)
נוגדן אקטין נגד שריר חלק אלפא	אבקאם, מסצ'וסטס, ארה"ב	(ab7817)	1 ומיקרו; g/mL
נוגדן אנטי-קולגן III	אבקאם, מסצ'וסטס, ארה"ב	(ab7778)	(1:500)
נוגדן נגד SOX1	אבקאם, מסצ'וסטס, ארה"ב	ab242125	(1:500)
גורם ההתקשרות	גיבקו, ארה"ב	S-006-100
חסימת מאגר	דאקו	X0909	5%   סרום סוס + 0.5%  טריטון X-100  ב-1X  PBS
קריוסטט	פישר סיינטיפיק, וולת'ם, מסצ'וסטס	מיקרום HM 550
DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole)	תרמו סיינטיפיק, גרמניה	62248	1 מ"ג/מ"ל
DNase I	תרמו-סיינטיפיק, ליטא	EN0521
דולבקו' s Modified Eagle' s בינונית, DMEM ו  F12	גיבקו, ארה"ב	21041-025
סרום בקר עוברי	אומגה סיינטיפיק,   וולת'ם, מסצ'וסטס	NC0471611
מטריג'ל (הידרוגלים המכילים קולגן)	קורנינג, קורנינג, ניו יורק	356237
MesenCult-ACF Plus Medium (מדיום מתרבים ללא סרום עם תאי גזע מתרבים&nb;)	טכנולוגיות תאי הגזע, ונקובר, קנדה	5446
תרכובת OCT (תרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית )	סאקורה, ארה"ב	4583
מיקרוסקופ Olympus BX41	אולימפוס אמריקה, סנטר ואלי, פנסילבניה
תמיסת מעכב פרוטאז Ovomucoid	תאגיד וורת'ינגטון ביוכימיקלים, ארה"ב	LK003182
פפיין	תאגיד וורת'ינגטון ביוכימיקלים, ארה"ב	LK003176	תמיסת הפעלה (1.1 מ"מ EDTA, 0.067 מ"מ מרקפטואנול, 5.5 מ"מ L-ציסטאין HCl)
PBS (סליין מפופר-פוספט)	גיבקו, ארה"ב	70011	pH 7.4
PFA (פאראפורמלדהיד) 4%	אינויטרוגן, ארה"ב	FB002
קוופאת	בנקהד, פ. ואחרים; QuPath: תוכנה בקוד פתוח לניתוח תמונות פתולוגיה דיגיטלית. דוחות מדעיים  (2017).	https://doi.org/10.1038/s41598-017-17204-5	תוכנה לניתוח הדמיה ביולוגית
מיקרוסקופ טיים-לאפס
בקבוקי תרבית רקמה	פישר סיינטיפיק, וולת'ם, מסצ'וסטס	FB012937
Trypsin	גיבקו, ארה"ב	A12859-01	0.25% טריפסין ו-0.1% EDTA ב-HBSS ללא סידן או מגנזיום
מדיום הרכבה אנטיפייד של VECTASHIELD בתוספת DAPI	מעבדות וקטור, קליפורניה, ארה"ב	#  UX-93952-24	1  ng/mL