איתור נוגדנים עצמיים נגד MDA5 באמצעות תאי HeLa ואימונוציטוכימיה במיקרוסקופ אור

מיופתיות דלקתיות אידיופטיות (IIM), המכונה בדרך כלל מיוזיטיס, הן קבוצה הטרוגנית של הפרעות אוטואימוניות המאופיינות בדלקת שרירים כרונית, ביטויים קליניים משתנים ותוצאות טיפוליות מגוונות. תסמינים נפוצים כוללים חולשת שרירים, סיבולת מופחתת ומיאלגיה¹. תת-הסוגים העיקריים של IIM כוללים פולימיוזיטיס (PM) ודרמטומיוזיטיס (DM), בעוד שדרמטומיוזיטיס אמיופתית קלינית (CADM) נבדלת על ידי פריחות עור אופייניות הדומות לאלו הנראות בסוכרת אך עם מעורבות שרירים מינימלית או ללא מעורבות שרירים. סיבוך עיקרי ב-PM, DM ו-CADM הוא מחלת ריאות אינטרסטיציאלית (ILD), המשפיעה על כ-40% מהחולים וקשורה לתמותה מוגברת².

המהלך הקליני והפרוגנוזה של ILD ב-IIM משתנים מאוד. ILD הקשור ל-DM ו-CADM (DM-/CADM-ILD) נוטה להיות עמיד יותר לטיפול ונושא פרוגנוזה גרועה יותר בהשוואה ל-ILD הקשור ל-PM. מבין אלה, ILD חריפה או תת-חריפה, המתקדמת במהירות תוך שלושה חודשים³, חמורה במיוחד, עם שיעור הישרדות מדווח של 5 שנים בלבד של 52%, לעומת 87% ב-ILD כרוני, המתקדם לאט או נשאר יציב. ILD מתקדם במהירות (RP-ILD), תת-סוג של ILD חריף/תת-חריף, מאופיין בהופעה מהירה של קוצר נשימה ונזק מכתשית נרחב הנראה בהדמיית חזה. RP-ILD הוא מצב מסכן חיים עם פרוגנוזה גרועה, מה שמדגיש את הצורך הדחוף באבחון מוקדם והתערבות מהירה לשיפור תוצאות המטופלים ^4,5,6.

נוגדנים עצמיים ספציפיים למיוזיטיס (MSAs) התגלו כסמנים ביולוגיים קריטיים ב-ILD הקשור למיוזיטיס, כאשר נוגדנים עצמיים נגד MDA5 ממלאים תפקיד משמעותי במיוחד. נוגדנים עצמיים אלה מתגלים לעתים קרובות בחולים עם PM-/DM-/CADM-ILD ומשמשים כאינדיקטורים פרוגנוסטיים חשובים ל-RP-ILD ^7,8,9. MDA5 (גן 5 הקשור להתמיינות מלנומה) הוא קולטן לזיהוי דפוסים ציטוזולי המקודד על ידי גן המושרה על ידי אינטרפרון המזהה RNA דו-גדילי ויראלי ומיטוכונדריאלי ומתחיל תגובות חיסוניות בתיווך אינטרפרון¹⁰. למרות שהמנגנונים הפתוגניים המדויקים עדיין לא ברורים, מאמינים כי נוגדנים עצמיים נגד MDA5 משבשים את תפקוד MDA5, ובכך תורמים לפתוגנזה אוטואימונית.

זיהוי בזמן של נוגדנים עצמיים נגד MDA5 חיוני לזיהוי וניהול מוקדם של RP-ILD. באופן מסורתי, משקעים חיסוניים (IP) עם תווית רדיו באמצעות ³⁵תמציות תאי K562 המסומנים ב-S-methionine נחשבים לתקן הזהב לזיהוי נוגדנים עצמיים נגד MDA5¹¹. עם זאת, שיטה זו אינה מעשית לשימוש קליני שגרתי בשל עלותה הגבוהה, התלות בציוד מיוחד ובכוח אדם מיומן, תקנות מחמירות לסילוק פסולת רדיואקטיבית וחיי המדף המוגבלים של ריאגנטים עם תוויות רדיו. בפרקטיקה הקלינית, בדיקות כתמים משמשות בדרך כלל כחלופות; עם זאת, הם קשורים לשיעור חיובי כוזב גבוה עבור נוגדנים עצמיים נגד MDA5 ^12,13, מה שמעלה חששות לגבי דיוק האבחון. כתוצאה מכך, יש צורך דחוף בבדיקה מאשרת אמינה ולא רדיואקטיבית כדי לאמת תוצאות חיוביות ולשפר את הביטחון האבחנתי.

כדי להתמודד עם פער זה, אנו מציעים להשתמש באימונוציטוכימיה (ICC) כבדיקת אישור משלימה לנוגדנים עצמיים נגד MDA5. גישה זו כוללת טרנספקציה של תאי HeLa עם מבנה MDA5, דגירה של התאים עם פלזמת המטופל וזיהוי נוגדנים עצמיים קשורים נגד MDA5 באמצעות נוגדנים משניים מצומדים לאנזים (למשל, פרוקסידאז חזרת) בשילוב עם מצע כרומוגני להדמיה במיקרוסקופ אור. ICC מספק פלטפורמה לא רדיואקטיבית, רגישה מאוד וסטנדרטית להדמיית נוגדנים עצמיים נגד MDA5 בתוך תאים תאיים. על ידי שילוב ICC עם בדיקת הכתמים, שיטה זו שואפת להפחית את שיעורי החיוביים השגויים, לשפר את דיוק האבחון, ובסופו של דבר לשפר את הניהול הקליני והתוצאות עבור המטופלים.

מטרת מחקר זה היא לבסס פרוטוקול חזק ולא רדיואקטיבי לזיהוי נוגדנים עצמיים נגד MDA5, תוך התייחסות למגבלות שיטות הגילוי הנוכחיות ולהציע לרופאים כלי מעשי ואמין לאבחון מוקדם של RP-ILD בחולים עם PM, DM ו-CADM. בקריינות הווידיאו הנלווית, מהלך מסכן חיים זה מתואר בשפה המדוברת כ'מוות מהיר'; מבחינה מדעית, זה תואם ל-ILD (RP-ILD) המתקדם במהירות. עבודה זו מתבססת על ראיות קיימות ויש לה פוטנציאל לשפר משמעותית את ההערכה הפרוגנוסטית וקבלת ההחלטות הטיפוליות בפרקטיקה הקלינית.

1. תרבית תאים וטרנספקציה

1. שמרו על תאי HeLa עם מדיום הנשר המותאם של Dulbecco המכיל 10% סרום בקר עוברי (FBS) ו-1% אנטיביוטיקה-אנטי-פטריית בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באטמוספירה לחה של 5% CO₂ .
2. מעבר התאים כל 2-3 ימים או כאשר התאים מגיעים למפגש של 90%-100%.
3. זרע 7 × 10⁴ תאי HeLa בכל באר של צלחת של 24 בארות (1.9 ס"מ²/באר) 24 שעות לפני הטרנספקציה כדי לאפשר לתאים להגיע לכ-90% מפגש.
4. לדלל 500 ננוגרם של פלסמיד (pENTER-MDA5) ו-1.5 מיקרוליטר של מגיב טרנספקציה כל אחד ב-25 מיקרוליטר של מדיום סרום מופחת.
5. הוסף DNA מדולל למגיב טרנספקציה מדולל (יחס של 1:1). מערבבים היטב ודוגרים למשך 5 דקות.
6. הוסיפו את התערובת לתאים שנזרעו יום קודם לכן וערבבו כדי לערבב מיד את קומפלקס ה-DNA-ליפיד. ודא שהתאים מתכנסים 80%-90%.
7. דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באטמוספירה לחה של 5% CO₂ למשך 24 שעות והמשיכו לבצע ICC.
   הערה: השתמשנו בווקטור זמין מסחרית (pEnter-MDA5); מידע נוסף ניתן למצוא בטבלת החומרים. יעילות הטרנספקציה היא ~50%.
   ניתן לקבוע את הצלחת הטרנספקציה והביטוי של חלבון המטרה על ידי העברת התאים עם פלסמיד המבטא חלבון פלואורסצנטי וביצוע כתם מערבי כדי להמחיש את ביטוי חלבון המטרה.

2. קיבוע תאים

1. לאחר הדגירה, שטפו את התאים פעמיים עם PBS כדי להסיר את כל המדיה שנותרה.
   הערה: ניתן לבצע כביסה על ידי ניעור הצלחת על שייקר מסלול.
2. תקן את התאים ב-4% פרפורמלדהיד ב-PBS. השאירו את התאים למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
   זהירות: פרפורמלדהיד רעיל. השתמש בהנחיות טיפול מתאימות.
3. שאפו את המגיב המקבע והשתמשו ב-PBS כדי לשטוף את התאים פי 2.

3. חדירות תאים

1. הוסף מגיב Triton X-100 (0.3% ב-PBS) ותן לתאים לשבת במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
2. לאחר 10 דקות, השלך את חומר הניקוי.
3. הוסף PBS כדי לשטוף את התאים פעם אחת.

4. חסימת תאים

1. בצע חסימה עם 10% סרום בקר עוברי ב-PBS (1x) ודגירה על התאים למשך שעה בטמפרטורת החדר.
2. הסר את המגיב החוסם, ולאחר מכן הוסף PBS כדי לשטוף את התאים פעם אחת.

5. הכלאה של הנוגדנים של המטופל

1. הוסף את פלזמת המטופל המדולל לתאים. הקפד לדלל את דגימת המטופל (דילול של 1:5,000 ב-PBS) ב-PBS לפני השימוש.
   הערה: כוונן את הדילול כדי לשפר את האות או להקטין את הרקע לפי הצורך. כדי להבטיח תוצאות בלתי מוטות, לצוות שערך את הבדיקות לא היה ידע אילו דגימות שייכות למטופלים ואילו היו מאנשים בריאים.
2. דגרו את הדגימה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 12-16 שעות (לילה).
3. לאחר תקופת הדגירה, הסר את דגימת המטופל ושטוף את התאים פי 3 עם PBS.

6. הכלאה של נוגדנים משניים

1. טפל בתאים עם IgG אנטי-אנושי מצומד חזרת פרוקסידאז מדולל (דילול 1:250 ב-PBS), והשאיר את התאים למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
2. שעה לאחר מכן, השלך את הנוגדנים המשניים.
3. יש לשטוף עם PBS 3x.

7. צביעת תאים

1. לאחר שטיפת התאים, יש לצבוע את התאים ב-300 מיקרוליטר של תמיסת עבודה/באר DAB.
   הערה: תמיסה זו הוכנה על ידי ערבוב תרכיז כרומוגן DAB ומדלל DAB בהתאם להוראות היצרן.
2. לאחר צביעת התאים למשך 5 דקות, הסר את הצבע, שטוף במים מזוקקים דה-יונים ונער במשך 5 דקות.

8. צביעת נגד תאים

1. מכתים את גרעין התא עם המטוקסילין מדולל.
   הערה: אנו משתמשים בהמטוקסילין גיל II בדילול פי 10 ומחכים 5 דקות לתהליך הצביעה.
2. לאחר 5 דקות, השלך את ההמטוקסילין, ולאחר מכן שטוף במים מזוקקים נטולי יונים למשך 2 x 5 דקות.

9. תצפית

1. התבונן בתוצאות הצביעה באמצעות מיקרוסקופ אופטי.
   הערה: חיובי אמיתי מראה כתמים חומים חזקים בתוך תאי HeLa המבטאים MDA5; זה מאשר את הנוגדנים העצמיים נגד MDA5 בדגימת המטופל. תוצאה שלילית מראה תאי HeLa ללא צביעה חומה, מה שמעיד על היעדר נוגדנים עצמיים נגד MDA5. תוצאה חיובית כוזבת מראה צביעה חומה נרחבת בכל התאים ללא קשר לביטוי MDA5. יש להבחין בין צביעה לא ספציפית זו, הנראית במצבים אוטואימוניים אחרים, לבין חיובית אמיתית כדי למנוע אבחון שגוי.

הצוות שערך את הבדיקות היה עיוור לזהות הדגימות, כולל המטופלים הספציפיים שמהם הן נלקחו, כדי למזער הטיה פוטנציאלית בתהליך ההערכה. עם זאת, בעוד שדגימות הביקורת הבריאות לא היו נתונות לסמיות, הן הניבו באופן עקבי תוצאות ברורות וחד משמעיות.

איור 1A מדגים את הביטוי המוצלח של MDA5 בתאי HeLa שעברו טרנספטציה עם מבנה pENTER-MDA5. כדי לאמת את יעילות הטרנספקציה, ICC בוצע באמצעות נוגדן מסחרי נגד MDA5. צביעה ציטופלזמית חומה חזקה נצפתה בכ-50% מהתאים שעברו טרנספטציה, מה שמעיד על ביטוי חזק של חלבון MDA5. לעומת זאת, תאים שלא עברו טרנספקט שעובדו בתנאים זהים לא הראו צביעה ציטופלזמית, מה שאישר את הספציפיות של הנוגדן והיעדר ביטוי MDA5 אנדוגני.

בעקבות פרוטוקול ה-ICC, דגימות מייצגות של חולים חיוביים ל-MDA5, שאושרו על ידי Radiolabel immunoprecipitation, הראו צביעה ציטופלזמית חומה ברורה בתאי HeLa המבטאים MDA5, בעוד שתאים שלא עברו טרנספטציה נותרו לא מוכתמים (איור 1B). דפוס צביעה זה מצביע על נוכחות של נוגדנים עצמיים נגד MDA5 בפלזמה של המטופל ומתיישב עם הזיהוי הסטנדרטי הקבוע באמצעות 35תמציות תאי K562 המסומנים ב-S-מתיונין.

מאפייני המטופלים מסוכמים בטבלה משלימהS1, המתארת אבחנות קליניות, מצב נוגדנים נגד MDA5 וסיווג לשלוש קבוצות: חיובי נגד MDA5, חיובי כוזב וביקורת בריאה. בנוסף למצב הנוגדנים, טבלה משלימה S1 מסכמת כעת גם את הדמוגרפיה של המטופלים, כולל גיל, מין ואבחנה בסיסית עבור כל קבוצה. תגובתיות הנוגדנים דורגה כמותית למחצה כחלשה (1+), בינונית (2+) או חזקה (3+) על סמך עוצמת הרצועה, המשקפת עלייה ברמות הנוגדנים. זה מספק הקשר קליני לפירוש תוצאות ICC, תוך שמירה על המיקוד המתודולוגי העיקרי של המחקר הנוכחי. עוקבת המחקר כללה 10 חולים עם נוגדנים עצמיים מאומתים נגד MDA5 (קבוצה חיובית), חמישה חולים עם מחלות אוטואימוניות שהניבו תוצאות חיוביות כוזבות בבדיקת כתמים מסחרית (קבוצה חיובית כוזבת), ו-10 אנשים בריאים (קבוצת ביקורת בריאה). כל דגימה נבדקה לצד בקרות חיוביות ושליליות ואומתה באופן עצמאי באמצעות רדיו. עבור דגימות עם תוצאות צביעה ברורות וחד-משמעיות, ריצת ICC אחת נחשבה מספיקה. במקרים שבהם הצביעה הייתה מעורפלת או גבולית, נערכו בדיקות נוספות, כולל דילול סדרתי ובדיקות ICC משוכפלות, כדי להבטיח פרשנות מדויקת. גישה זו הבטיחה הן קפדנות מתודולוגית והן יעילות משאבים באימות הביצועים של שיטת הזיהוי מבוססת ICC.

תוצאות חיוביות כוזבות מומחשות באיור 2. בדגימות אלה נעשה שימוש בפלזמה מחולים עם מחלות אוטואימוניות שאינן מיופתיות דלקתיות אידיופטיות (IIM). בניגוד לאיור 1, צביעה ציטופלזמית חומה נצפתה באופן נרחב בכל התאים, ללא קשר למצב הביטוי של MDA5. דפוס צביעה זה מצביע על קשירה לא ספציפית ומדגיש את הפוטנציאל לתוצאות חיוביות כוזבות בדגימות מחולים עם מצבים אוטואימוניים אחרים. תוצאות שליליות מוצגות באיור 3, שבו נבדקה פלזמה מאנשים בריאים. כמעט ולא נצפתה צביעה ציטופלזמית חומה בתאי HeLa שעברו טרנספטציה או לא עברה, מה שמעיד על היעדר נוגדנים עצמיים נגד MDA5 בדגימות אלה.

איור 1: אימות ביטוי MDA5 וזיהוי נוגדנים עצמיים נגד MDA5 באמצעות ICC. (A) תאי HeLa שהועברו עם פלסמיד המבטא MDA5 נצבעו באמצעות נוגדן מסחרי נגד MDA5. נצפתה צביעה ציטופלזמית חומה חזקה, המעידה על ביטוי חזק של חלבון MDA5. לעומת זאת, תאים שלא עברו טרנספקט שעובדו בתנאים זהים לא הראו צביעה, מה שאישר הן את ספציפיות הנוגדנים והן את היעדר ביטוי MDA5 אנדוגני. (B) תאי HeLa שהועברו עם MDA5 הודגרו עם פלזמה מחולים שאושרו כחיוביים ל-MDA5 על ידי רדיו-משקעים חיסוניים. נצפתה כתמים חומים ציטופלזמיים ברורים, המדגימים נוכחות של נוגדנים עצמיים נגד MDA5 בדגימת המטופל. פסי קנה מידה = 50 מיקרומטר. קיצור: ICC = אימונוציטוכימיה. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: זיהוי אותות חיוביים כוזבים באמצעות פלזמה ממטופלים עם מחלות אוטואימוניות שאינן IIM. צביעה ציטופלזמית חומה נרחבת נצפתה הן בתאים שעברו טרנספטציה והן בתאים שאינם עוברים טרנספטציה, מה שמרמז על קשירת נוגדנים לא ספציפית. תוצאות אלו ממחישות את הפוטנציאל לזיהוי חיובי כוזב במבחני כתמי קו בעת שימוש בפלזמה מחולים עם מחלות אוטואימוניות שאינן קשורות לחולי IIM חיוביים נגד MDA5. פסי קנה מידה = 50 מיקרומטר. קיצור: IIM = מיופתיות דלקתיות אידיופטיות. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: תוצאות צביעה שליליות עם פלזמה מקבוצת ביקורת בריאה. תאי HeLa שהועברו עם MDA5 והודגרו בפלזמה מאנשים בריאים הראו מעט או ללא צביעה ציטופלזמית חומה. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה משלימה S1: מאפייני המטופל. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

למחברים אין אינטרסים מתחרים להצהיר עליהם.

חלקים מכתב היד הזה נוצרו בסיוע GPT-4 של OpenAI. המחברים סקרו וערכו את התוכן כדי להבטיח דיוק ומקוריות.