מאמר שיטה

אלקטרופורציה של אורגנואידים קורטיקליים אנושיים פרוסים לחקר תפקוד גנים

2.4K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/67598

⸱

29 בנובמבר 2024

 ,  ,  , 
1Center for Regenerative Therapies Dresden, TUD Dresden University of Technology

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מציגים את המניפולציה הגנטית החריפה של אורגנואידים קורטיקליים אנושיים חתוכים על ידי אלקטרופורציה. מודלים אלה של אורגנואידים בקליפת המוח נוחים במיוחד להזרקה מכיוון שניתן לזהות בקלות מבנים דמויי חדרים לאחר החיתוך, מה שמאפשר חקירה תפקודית של התפתחות קליפת המוח האנושית, הפרעות נוירו-התפתחותיות ואבולוציה קליפת המוח.

תקציר

אורגנואידים בקליפת המוח האנושית הפכו לכלים חשובים לחקר התפתחות המוח האנושי, הפרעות נוירו-התפתחותיות ואבולוציה של המוח האנושי. מחקרים שניתחו את תפקוד הגנים על ידי ביטוי יתר או נוקאאוט סייעו במודלים של בעלי חיים לספק תובנות מכניסטיות לגבי ויסות התפתחות הניאוקורטקס. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט לנוקאאוט גנטי חריף בתיווך CRISPR/Cas9 על ידי אלקטרופורציה של אורגנואידים קורטיקליים אנושיים חתוכים. חיתוך אורגנואידים בקליפת המוח מסייע בזיהוי מבנים דמויי חדרים להזרקה והתחשמלות לאחר מכן, מה שהופך אותו למודל מתאים במיוחד למניפולציה גנטית חריפה במהלך התפתחות קליפת המוח האנושית. אנו מתארים את התכנון של רנ"א מנחה ואת התיקוף של יעילות מיקוד במבחנה ובאורגנואידים בקליפת המוח. אלקטרופורציה של אורגנואידים בקליפת המוח מבוצעת בשלבים נוירוגניים בינוניים, ומאפשרת מיקוד של רוב סוגי התאים העיקריים בניאוקורטקס המתפתח, כולל גליה רדיאלית אפיקלית, תאי אב בסיסיים ונוירונים. יחד, אלקטרופורציה של אורגנואידים קורטיקליים אנושיים פרוסים מייצגת טכניקה רבת עוצמה לחקר תפקוד גנים, בקרת גנים ומורפולוגיה של התא במהלך התפתחות קליפת המוח.

מבוא

הניאוקורטקס מתייחס לכיסוי החיצוני של חצאי המוח והוא מבנה ייחודי ליונקים. הניאו-קורטקס מייצג את מושבם של תפקודים קוגניטיביים גבוהים יותר 1,2,3,4,5. במהלך ההתפתחות, תאי גזע עצביים ותאי אב מעוררים נוירונים בתהליך הנקרא נוירוגנזה. מחקרים פונקציונליים החוקרים את התפתחות הניאו-קורטקס האנושי מספקים את הבסיס להבהרת המנגנונים העומדים בבסיס ויסות תאי גזע עצביים אנושיים, פתולוגיות עצביות ואבולוציה של המוח האנושי 2,6,7.

מבחינה היסטורית, מחקרים על התפתחות המוח האנושי הסתמכו על גישות היסטולוגיות תיאוריות המשתמשות ברקמה שלאחר המוות, כאשר מערכות תרביות רקמה צפות חופשיות עדכניות יותר אפשרו חקירות תפקודיות עם רקמת עובר אנושית 8,9. בנוסף, רקמת מוח עוברית אנושית הוכחה כבעלת יכולת להתארגן בעצמה לאורגנואידים מתרחבים לטווח ארוך10. מחקר רקמות עובריות סיפק תובנות חשובות על התפתחות האדם11,12, אך זמינות רקמות מוגבלת ושיקולים אתיים מגבילים את יישומו הנרחב למחקרים מכניסטיים של התפתחות המוח האנושי. בעשור האחרון פותחו פרוטוקולים המאפשרים יצירה של אורגנואידים עצביים תלת-ממדיים מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSC), כולל PSC המושרה על ידי בני אדם (hiPSC)13,14.

אורגנואידים מוחיים מציגים תכונות חשובות של המוח המתפתח, כגון היווצרות מבנים דמויי חדרים, קוטביות אפיקובסאלית, ציטוארכיטקטורה קליפת המוח, הגירה גרעינית אינטרקינטית במהלך חלוקת גליה רדיאלית, והגירה עצבית. חשוב לציין, מודלים אורגנואידים אנושיים חדשים אלה משחזרים מאפיינים של המוח האנושי המתפתח שאינם מעוצבים היטב בעכבר, כולל סוגי אבות עצביים מרכזיים רלוונטיים מבחינה אבולוציונית, במיוחד גליה רדיאלית בסיסית (או גליה רדיאלית חיצונית)7,14,15. מספר מגבלות של פרוטוקולים מוקדמים של אורגנואידים מוחיים - כגון בעיות עם הטרוגניות אורגנואידים, אספקת מזון מוגבלת לליבה הפנימית וזהות אזורית מגוונת - טופלו בהתקדמות הפרוטוקולים האחרונים וניתן לצפות לשיפורים נוספים בשנים הקרובות 15,16,17,18,19. אורגנואידים מוחיים וקליפת המוח האנושיים הפכו במהירות למודלים מרכזיים לחקר התפתחות קליפת המוח האנושית20, הפרעות נוירולוגיות 21,22,23,24 והתפתחות המוח 25,26,27,28,29, ולביצוע גישות סינון בקנה מידה גדול 30,31,32.

עבור מניפולציה גנטית חריפה, שתי שיטות שימשו בעיקר במודלים של בעלי חיים של התפתחות ניאוקורטקס: משלוח ויראלי על ידי זיהום של תאי מטרה33 וברחם או אלקטרופורציה חוץ גופית 34,35. הזרקת DNA - ולאחרונה, CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein (RNP) קומפלקסים36- לתוך החדרים הצדיים, ואחריו אלקטרופורציה, מספקת את היתרון כי אזורים מסוימים במוח ניתן לכוון על בסיס הכיוון של אלקטרודות אלקטרופורציה. אלקטרופורציה כרוכה בפולסים חשמליים קצרים המגבירים באופן זמני את חדירות קרום התא, ומאפשרים החדרת DNA ומולקולות טעונות אחרות לתאים. ברחם אלקטרופורציה בוצעה לראשונה בעכבר37, שם היא הפכה במהירות למתודולוגיה מיושמת באופן נרחב עבור נוירוביולוגיה התפתחותית. השיטה יושמה לאחר מכן גם על מינים אחרים, כגון חולדה38,39 וחמוס 40,41,42, מין גירנצפלי המשמש לחקר התפשטות ניאו-קורטקס וקיפול קליפת המוח 3,43,44,45.

אלקטרופורציה הפכה גם לשיטה חשובה במחקר אורגנואידים במוח האנושי46. באורגנואידים מוחיים, אלקטרופורציה יושמה כדי להמחיש מורפולוגיה של התא ואקסונים עצביים14,47, כדי לספק ריאגנטים להפלה של גנים 22,48,49, וכדי לחקור את תפקוד הגנים על ידי ביטוי יתר 50. השיטה אינה מוגבלת למודלים אנושיים אלא יושמה גם עבור שינוי גנטי של אורגנואידים מוחיים פרימטים50,51. יתר על כן, אלקטרופורציה של אורגנואידים קורטיקליים שנוצרו בביוריאקטור מסתובב ספין Ω תוארה52.

בפרוטוקול זה, אנו מתארים אלקטרופורציה של אורגנואידים קורטיקליים אנושיים פרוסים15 עבור מחקרים על תפקוד גנים בהתפתחות קליפת המוח. אורגנואידים ספציפיים לאזור המוח מגבירים את יכולת השחזור והעקביות, שהם קריטיים להצלחת ניתוח כמותי, למשל, במידול מחלות. בפרוטוקול15 של אורגנואיד קליפת המוח האנושית החתוכה, רמזי דפוס חזקים מיושמים במהלך התמיינות iPSC כדי להשיג אוכלוסייה הומוגנית של אבות המוח הקדמי הגבי, ואחריה יישום של מדיה תרבית המקדמת צמיחת רקמות עם פחות אותות מאלפים 53,54. הוכח כי חיתוך אורגנואידים בקליפת המוח מפחית מוות תאי כתוצאה מזמינות מופחתת של חומרים מזינים וחמצן בליבת האורגנואיד15. יתר על כן, חיתוך תומך בהתפתחות של מבנים דמויי חדרים המכילים גליה רדיאלית בסיסית שופעת, עם נוירוגנזה מתמשכת המובילה להיווצרות אזור דמוי צלחת קליפת המוח מורחבת15. החיתוך החוזר בפרוטוקול זה גם הופך את האורגנואידים קליפת המוח הללו למתאימים במיוחד להתחשמלות, מכיוון שניתן לזהות בקלות את לומן החדר ולכוון אותו באמצעות הזרקה. אלקטרופורציה של אורגנואידים קורטיקליים פרוסים יושמה לחקר אזורי בקרת גנים ואבולוציה קליפת המוח26,55.

במהלך הליך electroporation, תערובת ההזרקה מועברת לומן של מבנים דמויי חדר. עם הפעלת שדה חשמלי פועם, התערובת נלקחת על ידי גליה רדיאלית אפית המרפדת את החדר. כאשר גליה רדיאלית אפית מתחלקת ויוצרת סוגי תאים מחויבים יותר4, החומרים המתחשמלים מועברים לתאי אב בסיסיים ולנוירונים. צאצאים אלקטרופורטיים מופצים באזור החדר (VZ) ובאזור התת-חדרי (SVZ) לאחר 3 ימים ומשתרעים על פני רוב דופן קליפת המוח, כולל האזור דמוי הצלחת הקורטיקלית (CP), 7 ימים לאחר אלקטרופורציה במהלך שלבים נוירוגניים בינוניים26,55.

כאן, אנו מתארים שיבוש גנטי בתיווך CRISPR/Cas956 על ידי אלקטרופורציה באורגנואידים קליפת המוח האנושית פרוסה26. בנוסף, שיטת האלקטרופורציה יכולה להיות מיושמת גם עבור ביטוי יתר של גנים, ויזואליזציה של מורפולוגיה של התא ותהליכים תאיים על ידי ביטוי של חלבונים פלואורסצנטיים, מסירת ספריות פלסמיד עבור Massive Parallel Reporter Assays (MPRA), אספקת כלי עריכה אפיגנום ותיוג תאים להדמיה חיה.

פרוטוקול

כל הניסויים המערבים תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (hiPSC) בוצעו בהתאם לסטנדרטים האתיים שתוארו בהצהרת הלסינקי משנת 1964 ואושרו על ידי ועדת הביקורת האתית של בית החולים האוניברסיטאי דרזדן (IRB00001473; IORG0001076; מספר אישור אתי SR-EK-456092021).

1. תכנון RNA מנחה לנוקאאוט גנטי חריף בתיווך CRISPR/Cas9

  1. תכנן זוג רנ"א מנחה (gRNAs) המכוון לאותו אקסון עם מרחק אידיאלי של 7-11 bp (הימנעות מכפלות של 3 bp) בין מוטיבים סמוכים של פרוטוספייסר (PAMs) כדי להגדיל את הסבירות לשיבוש חלבונים באמצעות תוכנה או כלים מקוונים.
    הערה: באופן אידיאלי, אקסונים המקודדים תחומים פונקציונליים צריכים להיות ממוקדים. לחלופין, ניתן לבחור את האקסונים הראשונים של התמליל (איור 1A). בחר את הרנ"א המדריך בהתבסס על ציון פעילות (קרוב ל-1)57 וציון ספציפיות (קרוב ל-100%)58.

2. תרבית של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם

  1. כדי ליצור אורגנואידים בקליפת המוח האנושית ולאמת את תפקוד gRNA, השתמש בקו hiPSC CRTDi004-A59 הנגזר מתורם בריא.
  2. תרבית את iPSCs כפי שתואר קודם לכן60 על מטריצת קרום הבסיס מצופה 6-well לוחות בתווך תאי גזע בתנאים סטנדרטיים (37 ° C, 5% CO2). PSCs מושרים צריכים לעבור במפגש של 80% באמצעות אנזים לדיסוציאציה של תא בודד עם תוספת של מעכב מסלול ROCK (1:1,000) במהלך 24 השעות הראשונות.
    הערה: קווי iPSC אחרים עשויים לשמש לייצור אורגנואידים ולאימות gRNA.

3. מיצוי DNA גנומי מתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם

  1. השתמש 2 בארות של 80%-90% hiPSC מפגש של צלחת 6 בארות עבור מיצוי DNA גנומי. נתקו את התאים מהצלחת בעזרת אנזים כדי ליצור השעיה חד-תאית. קח את התאים ב 1 מ"ל של תווך תאי גזע (נפח כולל), ולאחר מכן להסתובב במשך 10 דקות ב 600 x גרם ולהסיר את supernatant.
  2. השהה מחדש את גלולת התא ב-250 מיקרוליטר של חיץ ליזיס (50 מילימטר TrisHCl (pH 7.5), 100 mM NaCl, 0.5% SDS, 5 mM EDTA ב-H2O) ו-12.5 מיקרוליטר של פרוטאינאז K (10 מ"ג/מ"ל מלאי). יש לדגור במשך שעתיים ב-55°C וב-250 סל"ד.
  3. מערבבים פנימה 100 μL של 5 mM NaCl. סחרור במשך 10 דקות ב- 18,000 x גרם ב- 4 ° C והעבר את הסופרנאטנט לצינורות תגובה חדשים של 1.5 מ"ל.
  4. הוסף 250 μL של איזופרופנול, הפוך את הצינורות מספר פעמים, וסחרור במשך 15 דקות ב 18,000 x גרם ב 4 ° C.
  5. הסר את supernatant, לשטוף עם 500 μL של 70% EtOH (כיתה ביולוגיה מולקולרית), להפוך את הצינורות, ולסובב במשך 10 דקות ב 18,000 x גרם ב 4 ° C.
  6. לבסוף, הסר לחלוטין את הסופרנאטנט על ידי הרחקתו בזהירות ולחץ על צינורות התגובה הפתוחים על מגבות נייר.
  7. תן לגלולה להתייבש באוויר במשך 10 דקות ב- RT, ואז להמיס את הגלולה ב -100 מיקרוליטר של מים נטולי נוקלאז למשך 30 דקות ב -37 מעלות צלזיוס.
  8. למדוד את ריכוז הדנ"א באמצעות ספקטרומטר. DNA גנומי מבודד יציב ב -20 ° C במשך מספר חודשים.

4. אימות זיהוי תבנית על ידי gRNA (in vitro)

הערה: כגישה הראשונה לאימות זיהוי תבניות מוצלח על ידי gRNAs, בצע תגובת Cas9 במבחנה שבה DNA דו-גדילי נחתך לשני מקטעים שניתן להבחין ביניהם באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז 40,61,62.

  1. כדי ליצור את התבנית, בצע תגובת שרשרת פולימראז (PCR) עם תערובת מאסטר PCR באיכות גבוהה ופריימרים של 10 מיקרומטר על DNA גנומי שבודד מ- hiPSC (סעיף 3) באמצעות תנאי המחזור הבאים: דנטורציה ראשונית ב- 98 ° C למשך 30 שניות, 40 מחזורים [98 ° C, 10 שניות; 60 ° C, 30 שניות; 72 ° C, דקה אחת] והתארכות סופית ב 72 ° C למשך 5 דקות.
    1. התאימו את טמפרטורת החישול בהתאם לפריימרים של PCR. ודא שגודל האמפליקון הוא 800 bp עד 1.5 kb עם לוקליזציה אסימטרית של אתרי הקישור gRNA.
    2. לפתור את המוצר PCR על ידי אלקטרופורזה ג'ל על ג'ל agarose 1.5%, לחתוך את הרצועה המתאימה מן הג'ל לחלץ את DNA26.
    3. למדוד את ריכוז ה- DNA של מוצר ה- PCR שחולץ באמצעות ספקטרומטר.
  2. הרכיבו את ה-gRNA הפונקציונלי על ידי שילוב של 10 מיקרומטר של CRISPR RNA (crRNA, רצף מותאם אישית, מלאי של 100 מיקרומטר) ו-10 μM tracrRNA (מלאי של 100 מיקרומטר) במאגר דופלקס נטול נוקלאז (נפח כולל של 5 מיקרוליטר). דגרו על התערובת במשך 5 דקות בטמפרטורה של 95°C, ולאחר מכן הניחו לה להתקרר לטמפרטורת החדר (RT).
  3. צור את קומפלקס ריבונוקלאו פרוטאין (RNP) על ידי שילוב של 10 מיקרומטר של gRNA משלב 4.2 ואנזים Cas9 1 μM ( מסטרפטוקוקוס פיוגנס, 62 מיקרומטר מלאי) ב- PBS למשך 15 דקות ב- RT (נפח כולל של 25 מיקרוליטר).
  4. כדי לבצע את תגובת העיכול במבחנה , ערבבו 1 מיקרומטר של קומפלקס RNP (משלב 4.3) עם תבנית DNA של 0.1 מיקרומטר (מוצר PCR משלב 4.1) ומאגר תגובת נוקלאז Cas9 1x (המכיל 200 mM HEPES, 1 M NaCl, 50 mM MgCl2, 1 mM EDTA; pH 6.5; ניתן לאחסן ב- aliquots ב -20 °C).
    1. מלאו עד נפח סופי של 10 μL במים נטולי נוקלאז.
    2. לדגור את התגובה ב 37 ° C במשך 1 שעות.
    3. הוסף 2 מ"ג / מ"ל פרוטאינאז K ודגור במשך 10 דקות נוספות ב 56 ° C כדי לשחרר את מצע ה- DNA מהאנזים Cas9. אחסנו את תערובת התגובה המעוכלת בטמפרטורה של 4°C או -20°C עד לניתוח הסופי.
      הערה: מומלץ להשתמש ביחס מולארי של 10:1 של מצע Cas9-RNP:DNA כדי להשיג את יעילות המחשוף הטובה ביותר. יש לדלל את מוצר ה-PCR במים נטולי נוקלאז לריכוז הנדרש, במידת הצורך. כבקרה שלילית, ניתן לקחת תערובת תגובה החסרה את האנזים gRNA או Cas9.
  5. דמיינו מוצרים שסועים על ידי אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז על ג'ל אגרוז 2%.
    הערה: באופן אידיאלי, שני פסים בגודל שונה אמורים להיות גלויים, ורצועת התבניות הייתה אמורה להיעלם או להיות מופחתת מאוד עבור gRNA יעיל (איור 1B).

5. אימות תפקוד gRNA בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם

הערה: מומלץ לבדוק את היעילות של gRNA המכוון לאותו קו תאים שממנו יופקו אורגנואידים קליפת המוח26. לשם כך, קומפלקסים של RNP המכילים את ה-gRNA הרלוונטי מועתקים יחד עם פלסמיד ביטוי GFP לתוך hiPSCs, התאים מתורבתים במשך 3 ימים, ו- DNA גנומי מבודד לאחר מכן לניתוח ריצוף. עבור כל בדיקת gRNA נדרשים כ-200,000 תאים. התאים לא צריכים להיות יותר מ-70%-80% חופפים והיו צריכים לעבור לפחות פעמיים לאחר ההפשרה. חשוב לקחת בקרה שלילית (gLACZ)36,63 ומצב מדומה (תמיסת נוקלאופקציה ללא RNP).

  1. שנו את התווך של hiPSC כך שיכלול מעכב ROCK (1:1,000) שעתיים לפני הניסוי כדי להגדיל את הכדאיות של התאים בתרבית תאים.
  2. מצפים את המספר המתאים של בארות של צלחת 6 בארות עם מטריצה קרום בסיסי.
  3. הפעל את יחידת הנוקלאופקטור ("יחידת X" עבור רצועות 16 בארות) ובחר את התוכנית "תאי ES, H9" כפי שתוכנתה מראש (דופק CB150). בחר את המספר המתאים של בארות של הרצועה.
  4. הכן את מתחמי ה-RNP על-ידי שילוב של 24 μM crRNA ו-24 μM tracrRNA ב-Duplex Buffer.
    1. יש לדגור בטמפרטורה של 95°C למשך 5 דקות, ולאחר מכן לתת להתקרר ל-RT, כמתואר בשלב 4.2.
    2. בינתיים, לדלל את האנזים Cas9 ל 8 מיקרומטר ב PBS.
    3. ערבבו 3 μL של gRNA ו-3 μL של Cas9, ודגרו 15 דקות ב-RT כדי להרכיב את ה-RNP.
      הערה: יחס מולארי של 3:1 gRNA:Cas9 מעניק יעילות מחשוף אופטימלית. כדי לבדוק gRNA כזוג, להכין כל RNP בנפרד ולשלב 1.5 μL של כל RNP בסוף.
  5. במהלך דגירה של 15 דקות RNP, הכינו את hiPSC לנוקלאופקציה מתחת למכסה מנוע של תרבית תאים.
    1. החליפו את ציפוי קרום הבסיס ב-1.5 מ"ל של תווך תאי גזע בתוספת מעכב ROCK (1:1,000) ו-1x פניצילין/סטרפטומיצין לכל באר.
    2. הכן את תמיסת הנוקלאופקציה כתערובת אב על קרח בהתאם להוראות היצרן.
    3. נתקו את תאי ה-HiPSC מהצלחת כדי ליצור תרחיף של תא בודד (כמתואר בסעיף 2) וספרו את התאים עם צביעת Trypan Blue בתא ספירה של נויבאואר.
    4. גלולה 200,000 תאים חיים לכל זוג gRNA ב 600 x גרם במשך 5 דקות.
  6. בתרבית התא, על קרח, להוסיף 3 μL של RNP ל 20 μL של תמיסת nucleofection בתוספת 0.2 μg / μL pCAG-GFP פלסמיד.
  7. מרחפים מחדש את התאים הכדוריים ב-23 מיקרוליטר של תערובת הנוקלאופקציה הסופית ומעבירים אותם לבאר אחת של רצועת נוקלאופקציה בת 16 בארות על קרח.
  8. לאחר שכל התנאים נמצאים ברצועה, מקם אותה במכונת הנוקלאופקטור יחידת X מחוץ למכסה המנוע ולחץ על לחצן התחל כדי להתחיל את הגרעין.
  9. לאחר מכן, העבירו את רצועת הנוקלאופקציה חזרה מתחת למכסה המנוע של תרבית התאים והעבירו תאים נוקלאופקטיבים לצלחת 6 בארות מוכנה על ידי שטיפת בארות הרצועה עם מעט תווך מהצלחת.
  10. תרבית את hiPSC במשך 3 ימים, שינוי מדיום המכיל 1x פניצילין/סטרפטומיצין מדי יום. לאחר 24 שעות, מעכב ROCK אינו נחוץ עוד.
  11. בדקו אם יש אות GFP תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי רגיל (איור 1C).
    1. ביום השלישי, מיין ואסוף תאים חיוביים ל-GFP לפי מיון תאים מופעלים פלואורסצנטיים (FACS).
    2. הכן את מאגר המיון עם 2% FBS ב- PBS ושמור על 4 ° C.
    3. מצננים צנטריפוגה שולחנית ל-4°C. הכינו צינורות תגובה של 1.5 מ"ל עם חיץ מיון של 50 מיקרוליטר המכיל מעכב ROCK (1:1,000) לאיסוף תאים לאחר FACS על קרח וצינורות פוליסטירן בעלי תחתית עגולה של 5 מ"ל עם מכסי מסננת תאים על קרח.
    4. בצע תרחיפים חד-תאיים של התאים הגרעיניים.
    5. השהה מחדש את התאים ב 1 מ"ל של תווך תאי גזע המכיל מעכב ROCK (1:1,000) לכל דגימה וצנטריפוגה ב 600 x גרם למשך 5 דקות.
    6. הסר את הסופרנאטנט והשהה מחדש את התאים ב- 200 μL של מאגר מיון עם מעכב ROCK (1:1,000), ולאחר מכן הוסף 0.4 μL של DAPI (2 ננוגרם/μL) כדי לזהות תאים חיים לפי FACS.
    7. יש לפענח את תמיסת התא דרך מכסה המסננת של הצינורות העגולים והמקוררים כדי להסיר את שאריות גושי התא.
      הערה: DAPI עלול לפגוע בכדאיות התא לאורך זמן, ולכן עדיף להוסיף טרי לכל דגימה לפני המיון.
    8. מיין 10,000 תאים חיים חיים חיוביים ל-GFP (DAPI-negative) לתוך צינורות התגובה של 1.5 מ"ל שהוכנו קודם לכן עם 50 μL של חיץ מיון המכיל מעכב ROCK (על קרח).
  12. לאחר FACS, לחלץ ישירות DNA גנומי מתאים ממוינים.
    1. סובב כלפי מטה את התאים הממוינים שנאספו במאגר המיון במהירות של 600 x גרם למשך 10 דקות.
    2. הסר את supernatant ולקחת את גלולת התא ב 250 μL של חיץ ליזה בתוספת 12.5 μL של פרוטאינאז K לכל דגימה.
    3. המשך כמתואר בסעיף 3.
    4. לבסוף, ממיסים את כדורית הדנ"א ב-50 מיקרוליטר של מים נטולי נוקלאז.
  13. בצע PCR כדי ליצור תבנית עבור ריצוף Sanger כמתואר בשלב 4.1. כבקרה, השתמש בדנ"א ממצבg LACZ ובפריימרים המכוונים לגן המעניין (אותם פריימרים המשמשים בסעיף 4). מוציאים את הגומיות המתאימות מהאלקטרופורזה של ג'ל האגרוז, מטהרים אותו מעל עמוד ושולחים אותו לריצוף סנגר.
  14. תוצאות ריצוף Sanger של Align Sanger באמצעות יישור גלובלי זוגי.
    הערה: ניתן לזהות מיקוד מוצלח על-ידי אותות על-גבי או רצפים לא שלמים הנובעים מהחדרות/מחיקות אקראיות סביב אתר קשירת ה-gRNA (איור 1D).

6. יצירת אורגנואידים קורטיקליים אנושיים פרוסים

הערה: אורגנואידים בקליפת המוח האנושית (hCO) נוצרים על פי שיטת האורגנואיד הניאוקורטיקלי החתוך (SNO), כפי שתואר קודם לכן בפירוט15,60.

  1. נתק מושבות hiPSC קטנות מבאר אחת של צלחת 6 בארות עם 1 מ"ג / מ"ל collagenase על ידי דגירה במשך 30-40 דקות ב 37 ° C באינקובטור. בינתיים, מעילים צלחת חדשה 6 בארות עם מטריצת קרום הבסיס.
    1. עצור את האנזים עם 1 מ"ל של תווך תאי גזע ואסוף את המושבות עם קצה רחב ב 5 מ"ל של תווך תאי גזע בצינור חרוטי 15 מ"ל.
      הערה: כל צעד המזכיר "קצוות פיפט רחבים" יכול להתבצע גם עם טיפים חתוכים לפתח בקוטר של לפחות 2 מ"מ.
    2. לאחר שהמושבות התיישבו לתחתית, הסר את המדיום הישן והחלף אותו בתווך תאי גזע טריים.
    3. בעזרת קצה רחב, מפזרים את המושבות באופן שווה על צלחת 6 בארות מצופות עם 1.5 מ"ל של תווך תאי גזע לכל באר.
    4. תרבית את hiPSC במשך 2-3 ימים בתנאים סטנדרטיים.
  2. לאחר שמושבות hiPSC הגיעו לקוטר של כ-1.5 מ"מ, נתקו שוב את כל המושבות עם 1 מ"ג/מ"ל קולגנאז על ידי דגירה של עד שעה אחת ב-37°C.
    1. עצור את האנזים עם 6 מ"ל של תווך המוח הקדמי 115 ואסוף מושבות מנותקות בצינור חרוטי 15 מ"ל באמצעות קצוות רחבים.
    2. לאחר שהמושבות התיישבו, הסירו את המדיום הישן ושטפו עם 5 מ"ל של תווך המוח הקדמי 1.
    3. לבסוף, להעביר את המושבות לצלחת חיבור 6 בארות נמוכה במיוחד המכילה 3 מ"ל של מוח קדמי בינוני 1 לכל באר עם קצוות רחבים ולתת להם ליצור גופים עובריים (EBs). שלב זה מציין את יום 0 של פרוטוקול האורגנואידים בקליפת המוח האנושית. מכאן ואילך, עקוב אחר הפרוטוקול כפי שפורסם15.
  3. ביום השביעי, הטמע EBs במטריצת קרום בסיסית, עם כ -20 EBs לכל "עוגייה" ותרבית במשך שבוע אחד בתווך המוח הקדמי 2 15. ביום ה-14, שחררו באופן מכני אורגנואידים מהמטריצה והמשיכו לגדל בלוחות חיבור אולטרה-נמוכים של 6 בארות בתווך המוח הקדמי 315 על שייקר אורביטלי ב-120 סל"ד.
  4. מהיום ה-35, 1% v/v מטריצת הממברנה הבסיסית מתווספת למדיום.
  5. בשבוע 6, הטמיעו אורגנואידים באגרוז בעל נקודת התכה נמוכה של 3% וחתכו ויברטומה לפרוסות בעובי 500 מיקרומטר (איור 2A, B), אשר תומך באספקת חמצן וחומרי מזון בכל האורגנואידים. במידת הצורך, חזור על חיתוך אורגנואידים כל 4 שבועות.
  6. מהיום ה-70, תרבית אורגנואידים במדיום המוח הקדמי 415.

7. אלקטרופורציה של אורגנואידים קליפת המוח האנושית פרוסה

הערה: ניתן להזריק אורגנואידים בקליפת המוח האנושית ולחשמל אותם ברגע שמבנים דמויי חדרים נראים לעין, בערך משבוע 2 ואילך. עבור אורגנואידים בשלב מאוחר יותר (שבוע 5 ומעלה), האלקטרופורציה היא היעילה ביותר ואת הכדאיות של תאים הוא הטוב ביותר כאשר ההליך מבוצע 2 ימים לאחר חיתוך של אורגנואידים26,55. לאחר החיתוך, קל לזהות מבנים דמויי חדרים, מה שמסייע להליך ההזרקה (איור 2C, D). יתר על כן, מבנים דמויי חדרים נשארים פתוחים חלקית זמן מה לאחר החיתוך, ומאפשרים לתמיסת הזרקה עודפת לברוח, מה שמגן על שלמות חגורת הצומת הדבקה המצפה את החדרים. ניתן להזיז את לוח הזמנים של החיתוך כך שיתאים לציר הזמן של הניסוי. יש לחזור על החיתוך כל 3-4 שבועות לתרבויות ארוכות טווח.

  1. משוך את נימי זכוכית בורוסיליקט להזרקות במושך מיקרו-נימי עם ההגדרות הבאות: P 500, חום 600, משיכה 30, מהירות 40, זמן 1. אחסנו את הנימים בצלחת פטרי גדולה בעזרת נייר דבק לקיבוע.
  2. ביום ההתחשמלות, הכינו מחדש את קומפלקס CRISPRR/Cas9 RNP כמתואר בשלב 5.4 עם ריכוז סופי של 24 μM RNP. קו-אלקטרופורציה של פלסמיד pCAG-GFP 0.1 מיקרוגרם/μL (או של כל כתב פלואורסצנטי אחר) תומכת בזיהוי תאים מחושמלים. בנוסף, יש להוסיף תמיסה ירוקה מהירה 0.1% במים לתערובת ההזרקה הסופית, המאפשרת אישור על אספקה מוצלחת של התערובת.
    הערה: הכינו תערובות נפרדות לכל גן מעניין ולבקרת gLACZ .
  3. לחמם מראש את הפתרון של Tyrode (חבילה אחת מלח Tyrode, 1 גרם של NaHCO3, 13 מ"ל של 1 M HEPES pH 7.25 ב 1 L של dH2O) ל 37 ° C. לאחסן את הפתרון של Tyrode הנותרת ב 4 ° C במשך מספר חודשים.
  4. בחרו hCO עם מבנים דמויי חדרים מפותחים היטב (איור 2E) והשליכו אורגנואידים שלא מראים מבנים דמויי חדרים (איור 2F). מעבירים עד 10 אורגנואידים לצלחת פטרי בקוטר 6 ס"מ המכילה את התמיסה של טירוד ושומרים את שאר ה-hCOs באינקובטור.
  5. ממלאים מיקרו-נימי זכוכית ב-10 מיקרו-ליטר של תמיסת ההזרקה בעזרת קצה פיפטה מיקרו-מעמיס ופותחים את הנימים על ידי צביטת הקצה הדק בפינצטה. בדוק אם הנימים פתוחים על ידי שחרור תערובת הזרקה לתוך הפתרון של Tyrode. בצע את ההזרקות עם מזרק זעיר בסביבה רציפה עם gating מבוקר באמצעות מתג כף הרגל.
  6. הכניסו את הנימים למרכז של מבנים דמויי חדרים (איור 2C) והזריקו 0.2-0.5 μL של התערובת על-ידי לחיצה על מתג כף הרגל.
    הערה: ניתן להזריק עד 5 חדרים לכל hCO עם סך של 7-8 hCOs מעובדים לכל שכפול. באופן אידיאלי, חדרים הפונים לחלק החיצוני של hCO צריכים להיות ממוקדים, מאחר שהם בדרך כלל המפותחים ביותר (איור 2G, H).
  7. השתמש במלקחיים עדינים כדי לדחוף את האורגנואיד נגד כדי להגביל את התנועה. אל תתפסו את האורגנואידים (איור 2C).
  8. לאחר ההזרקה, השתמשו בקצה פיפט רחב כדי להעביר 1-2 אורגנואידים לתוך תא אלקטרופורציה שמכיל את התמיסה של טירוד (איור 2C, D).
  9. כיוון האורגנואידים המוזרקים לכיוון האלקטרודות כך שגליה רדיאלית אפיקלית באזורים דמויי חדרים הפונים לחלק החיצוני של האורגנואיד תהיה ממוקדת.
  10. חבר את הכבלים לתא האלקטרופורציה כאשר הצד המוזרק של האורגנואיד פונה לקוטב החיובי (אנודה; איור 2D).
  11. לחץ על לחצן הדופק של מכשיר האלקטרופורטור כדי לבצע אלקטרופורטציה עם חמישה פולסים של 38 וולט למשך 50 אלפיות השנייה כל אחד במרווחים של שנייה אחת.
    הערה: הגדרות האלקטרופורציה עשויות להיות תלויות באלקטרופורטור הזמין וייתכן שיהיה צורך למטב אותן.
  12. חזור על שלבי ההזרקה והאלקטרופורציה עד לעיבוד המספר הרצוי של אורגנואידים.
  13. אסוף את האורגנואידים המחושלים בתווך ב- RT עד שכל הדגימות עבור אותו מצב יעובדו. ודא שהם לא נמצאים מחוץ לחממה במשך יותר מ -30 דקות בסך הכל.
  14. לאחר מכן, להחזיר את hCOs מחושמלים למדיום התרבית המתאים ולתרבת אותם מבלי לרעוד במשך 24 השעות הראשונות.
    הערה: לאחר 2-3 ימים, אות ה-GFP אמור להיראות ב-hCOs מחושמלים תחת סטריאוסקופ פלואורסצנטי (איור 2H). יש לבחור את נקודת הזמן של הניתוח לאחר אלקטרופורציה בהתאם לשאלה הביולוגית שיש לענות עליה. לאחר 3-7 ימים, תאים חיוביים ל-GFP ממוקמים על פני VZ, SVZ ו-CP15,60.

8. קיבוע והקפאה של אורגנואידים קורטיקליים אנושיים מחושמלים

  1. תקן אורגנואידים מחושמלים ב-4% פרפורמלדהיד (PFA) למשך 30 דקות ב-RT בצינור תגובה של 2 מ"ל.
    אזהרה: PFA רעיל ומסרטן. בצע את כל השלבים הקשורים ל- PFA מתחת למכסה אדים. מומלץ מאוד להשתמש בכפפות ניטריל ובמשקפי מגן.
  2. יש לשטוף פעם אחת ב-PBS למשך 5 דקות ולאחסן ב-30% סוכרוז סטרילי מסונן ב-PBS בטמפרטורה של 4°C עד שהרקמה רוויה לחלוטין בסוכרוז.
  3. הטמע אורגנואידים קבועים בתווך הטבעה עבור דגימת רקמה קפואה בתוספת 15% סוכרוז ב- PBS בגושים על קרח יבש.
  4. הכינו מקטעים של 20-30 מיקרומטר בהקפאה ואספו את הרקמה על שקופיות דבק26,64.
    הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול ברגע שהאורגנואידים הקבועים נמצאים בסוכרוז (יציב ב-4°C למשך מספר חודשים) או מוטמע בתווך הטבעה (בלוקים קפואים ניתן לאחסן בשקיות אטומות לאוויר ב-20°C למשך מספר חודשים עד שנים).

9. ניתוח אימונוהיסטוכימי של אורגנואידים קורטיקליים אנושיים מחושמלים

  1. לניתוח אימונוהיסטוכימי26,64, בצע אחזור אנטיגן במאגר ציטראט (10 mM נתרן ציטראט, 0.05% פוליסורבט 20 ב- dH2O, pH 6.0) למשך שעה אחת ב- 70 ° C באמבט מים.
  2. שטפו פעם אחת ב-PBS במשך 5 דקות, ואז ייבשו שקופיות קצרות והקיפו את המקטעים בעט שעווה.
  3. יש להרוות באמצעות גליצין 0.1 M ב-PBS (pH 7.4) למשך 30 דקות ב-RT ולאחר מכן לשטוף אותו פעמיים עם PBS למשך 5 דקות כל אחד.
  4. כסו את המקטעים בחיץ חוסם (10% נסיוב סוסים, 0.1% אוקטוקסינול 9 ב-PBS) ודגרו במשך 30 דקות ב-RT.
  5. הכינו את הנוגדנים הראשוניים בחיץ חוסם ודגרו על מקטעים למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס.
  6. למחרת, שטפו שלוש פעמים עם PBS במשך 5 דקות כל אחת, דגרו עם נוגדנים משניים ו-DAPI בחיץ חוסם למשך שעה אחת ב-RT, ושטפו שוב שלוש פעמים עם PBS במשך 5 דקות כל אחת.
  7. הרכיבו את השקופיות במדיום ההרכבה וצלמו במיקרוסקופ פלואורסצנטי (איור 3).
    הערה: מומלץ לכלול נוגדן נגד הפלואורופור המשמש בתמהיל ההזרקה כדי לזהות תאים ממוקדים מכיוון שהאות המקורי מרווה, לעתים קרובות לאחר הקיבוע. נוגדנים וצבעים המשמשים לצביעת אימונופלואורסצנטיות, כפי שהם מיוצגים באיור 3, מפורטים בטבלה 1.

10. אימות נוקאאוט בתיווך CRISPR/Cas9 ברמת החלבון

  1. כדי לאמת את הנוקאאוט ברמת החלבון, בצעו אימונוהיסטוכימיה עבור חלבון המטרה על האורגנואידים המחושלים (איור 3I).
  2. דמיינו גם את בקרתg LACZ וגם את האורגנואידים הממוקדים באמצעות אותן הגדרות כדי לאפשר השוואה של עוצמת הפלואורסצנטיות (איור 3I, J). עשו זאת באופן ספציפי לאזור כדי להשוות את ההשפעה על סוגי התאים השונים של הניאו-קורטקס המתפתח. ספירת תאים ב- ImageJ/Fiji (מונה תאי תוסף) או על ידי פילוח באמצעות תוסף StarDist 65.

תוצאות

אבלציה גנטית בתיווך CRISPR/Cas9 דורשת תכנון של gRNAs. באופן כללי, מיקוד אחד האקסונים הראשונים של גן מעניין עם זוג gRNA במרווחים של 7-11 bp זה מזה (הימנעות מכפולות של 3 bp) עובד היטב (איור 1A). כבדיקה ראשונה, ניתן לחקור את יעילות זיהוי התבניות על ידי gRNA במבחנה באמצעות תבנית PCR 26,40,62. מיקוד יעיל וחיתוך בתיווך Cas9 נראים בהפחתת הדנ"א של התבנית ובהופעה של תוצרי דנ"א שסועים על ג'ל אגרוז (איור 1B). בדיקות gRNA נוספות עשויות להתבצע בקו iPSC המשמש לייצור אורגנואידים קליפת המוח. לשם כך נדרשת גרעין של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs), אשר ניתן להמחיש באמצעות ביטוי מוצלח של כתב פלואורסצנטי (איור 1C). ניתן לאמת מיקוד יעיל של מוקד העניין על-ידי ריצוף סנגר, והתוצאה היא כרומטוגרמה שמסתיימת בפתאומיות או הופכת למונחת סביב אתר המיקוד (איור 1D), כתוצאה מספקטרום של אינדל מתיקון שבר דו-גדילי על-ידי חיבור קצה לא הומולוגיל-66. מדריך בדיקות יעילות RNA במבחנה ובתאי iPSC מסייעים בבחירת זוגות gRNA יעילים לאבלציה גנטית באורגנואידים קליפת המוח.

לפני האלקטרופורציה חותכים אורגנואידים קורטיקליים, מה שתומך בזיהוי לומן חדרי להזרקה של תערובת האלקטרופורציה (איור 2A-C). אורגנואידים מוזרקים מועברים לאחר מכן לתא האלקטרופורציה (איור 2D). עבור אלקטרופורציה, יש להשתמש באורגנואידים קורטיקליים עם מבנים דמויי חדרים מפותחים היטב (איור 2E), בעוד שאורגנואידים קורטיקליים חסרי מבנים נראים לעין צריכים להיזרק (איור 2F). תערובת האלקטרופורציה מכילה צבע המאפשר הדמיה של חדרים מוזרקים במהלך ההליך (איור 2G). לאחר 1-3 ימים בתרבית, חדרים ממוקדים בהצלחה נראים על-ידי אות GFP טבעי תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי (איור 2H).

לניתוח היסטולוגי מעמיק, ניתן לבצע אימונוהיסטוכימיה של קריוסקציות. באופן אידיאלי, מספר חדרים ממוקדים נמצאים בתוך אורגנואיד קליפת המוח מחושמל (איור 3A,B). האלקטרופורציות האופטימליות ביותר מכוונות למבנים דמויי חדרים באזור החיצוני של האורגנואיד הפונה החוצה (איור 3C), מאחר שאלה הם בדרך כלל החדרים המורחבים ביותר. במקרים מסוימים, אלקטרופורציה עלולה להוביל למוות יתר של תאים (איור 3D,E), לדוגמה, כאשר ריכוזי הפלסמיד גבוהים מדי או כאשר הגדרות האלקטרופורציה אינן אופטימליות. אלקטרופורציות הפונות לחלק הפנימי של האורגנואיד (איור 3F) מערבות לעתים קרובות אזורים פחות מורחבים של מבנים דמויי חדרים בהשוואה לחלק החיצוני. מניסיוננו, כדאי למקד את הניתוח הכמותי באזורים מוגדרים של האורגנואיד כדי להפחית את השונות. לפעמים, אלקטרופורציה עלולה לגרום להפרעה במשטח האפי (איור 3G), לדוגמה, כאשר נפח ההזרקה גבוה מדי, מה שגורם לחדרים להיקרע, או כאשר פולסים חשמליים חזקים מדי, מה שמוביל לדלמינציה של תאים. לבסוף, כאשר שני חדרים סמוכים מכוונים (איור 3H), ייתכן שיהיה קשה לקבוע את גבולות אזורי קליפת המוח ואת מקורם של תאי המטרה.

ניתן להשתמש באימונוהיסטוכימיה כדי לאמת נוקאאוט מוצלח בתיווך קריספר/Cas9 ברמת החלבון בתאים המעניינים (איור 3I), כפי שמודגם כאן על-ידי התמקדות בחלבון Polycomb Repressive Complex 1 (PRC1) PCGF467. ניתן לנתח את עוצמת האות בתאים חיוביים ל-GFP בבקרה לעומת בתנאי ניסוי (איור 3J). לחלופין, אם אין נוגדן מתאים זמין, תאים ממוקדים עשויים להיות מבודדים על ידי FACS מאורגנואידים קליפת המוח60 ומנותחים עוד יותר על ידי Sanger או Next Generation Sequencing36. יתר על כן, ניתן לנתח את הפחתת רמות החלבון גם באמצעות כתמים מערביים.

figure-results-1
איור 1: תכנון ואימות של רנ"א מנחה לנוקאאוט גנטי חריף בתיווך CRISPR/Cas9. (A) המחשה סכמטית של אסטרטגיית תכנון הרנ"א המנחה (gRNA), עם שני gRNA המכוונים לאקסון של גן מעניין. חצים שחורים מציינים פריימרים PCR להכנת תבנית המשמשים לאימות gRNA. (B) אימות יעילות gRNA במבחנה. תבניות מוגברות PCR עוכלו עם מתחמי RNP. לאחר מחשוף מוצלח, ניתן לראות שני פסים בגדלים שונים לאחר אלקטרופורזה בג'ל (משמאל), בעוד שהתבנית נשארת לא חתוכה עבור gRNA ביעילות נמוכה (מימין). (C) תמונת שדה בהיר (משמאל), פלואורסצנטיות GFP (באמצע) ותמונות ממוזגות (מימין) של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (hiPSCs) 3 ימים לאחר נוקלאופקציה עם קומפלקס RNP ופלסמיד GFP. פסי קנה מידה: 350 מיקרומטר. (D) אימות יעילות gRNA ב-hiPSCs על ידי ריצוף Sanger של DNA מוגבר מתאים חיוביים ל-GFP. לאחר פיצול מוצלח של הדנ"א הדו-גדילי, מסלולי הריצוף מראים אותות על גבי המתחילים מאתר המטרה של ה-gRNA (למעלה, KO1). במקרה של מיקוד לא מוצלח, מסלול רצף הדנ"א נשאר ללא שינוי (למטה, KO2) בהשוואה לבקרת LACZ . אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: אלקטרופורציה של אורגנואידים קורטיקליים אנושיים חתוכים. (A) איור סכמטי שמראה את זרימת העבודה עבור אלקטרופורציה של אורגנואידים בקליפת המוח האנושית (hCOs). ראשית, hCOs מחולקים לפרוסות בעובי 500 מיקרומטר. יומיים לאחר מכן, תערובת RNP המכילה פלסמיד ביטוי GFP וירוק מהיר מוזרק לתוך לומן של מבנים דמויי חדרים, מועדף באזור החיצוני של hCOs. עבור electroporation, hCOs ממוקמים בתא electroporation. לאחר מספר ימים של תרבית, ניתן לזהות אות GFP באזורים מחושמלים. (B) תמונות של חתך ויברטומי של hCOs. האורגנואידים משובצים בנקודת התכה נמוכה של 3% בתווך בבלוק (משמאל). הגוש מחולק לפרוסות בעובי 500 מיקרומטר (באמצע). האורגנואידים החתוכים מועברים חזרה לצלחת התרבית עם קצה פיפט רחב (מימין). (C) תמונות המראות את הזרקת התערובת המכילה את ה-RNP, pCAG-GFP ו-0.1% Fast Green לתוך מבנים דמויי חדרים של האורגנואידים. האורגנואידים שקועים בתמיסה של טיירוד ונימי הזכוכית הדקים מוחדרים בלומן של מרכז מבנים דמויי חדרים (משמאל). מלקחיים משמשים לייצוב האורגנואידים (שמאל ואמצע). החדרים בצד החיצוני של האורגנואידים ממוקדים (באמצע). אורגנואידים מוזרקים מועברים לתא האלקטרופורציה, או מאוחר יותר לצלחת התרבית, עם קצוות פיפט רחבים (מימין). (D) תמונות של תא האלקטרופורציה, המורכב מצלוחית פטרי מזכוכית ומשני להבי מתכת המודבקים לזכוכית. להבי המתכת משמשים כאלקטרודות ומכילים חורים לחיבור הכבלים לחיבור האלקטרופורטור. הצד המוזרק של hCO, הנראה דרך צל ירוק, צריך לפנות לאנודה (קוטב חיובי, כבל אדום) (מימין). (E) תמונות מייצגות של hCOs המציגות מבנים מפותחים דמויי חדרים. הטבעת הבהירה יותר מייצגת את האזור דמוי אזור החדר. העיגול הכהה יותר במרכז המבנה דמוי החדר מייצג את הלומן ויש לכוון אותו להזרקה. (F) תמונות מייצגות של hCOs חסרי מבנים דמויי חדרים מפותחים, שאנו ממליצים לא לכלול בניסויים נוספים. (G) תמונות מייצגות של hCOs לאחר הזרקת תערובת האלקטרופורציה, שבהן אזורים ממוקדים נראים באמצעות ירוק מהיר (חיצים כתומים). (H) תמונה מייצגת של hCO המראה אות GFP מקורי 24 שעות לאחר אלקטרופורציה. פסי קנה מידה: 100 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: ניתוח אימונוהיסטוכימי של אורגנואידים קורטיקליים אנושיים פרוסים אלקטרופורטים. (A) סכמטי המייצג אורגנואיד קליפת המוח האנושי המחושל (hCO) עם אות פלואורסצנטי ירוק. (B) צביעת DAPI (אפור) ואימונופלואורסנציה עבור GFP (ירוק) של hCO קריוסקציה עם חדרים מחושמלים מרובים, 7 ימים לאחר התחשמלות. (ג-ח) תמונות לדוגמה של תוצאות אלקטרופורציה שונות, מוכתמות עבור GFP (ירוק) וגרעינים (DAPI, אפור). (C) אלקטרופורציה אופטימלית עם גרעינים שלמים (ראה נספח 1, D), מבנה דמוי חדר ללא הפרעה, ותאים מחושמלים באזור הפונה כלפי חוץ האורגנואיד, שהוא בדרך כלל המורחב ביותר. (E) דוגמה ל-hCO המציג מוות תאי מסיבי באזור המחושל (ראה גם תוספת 2, D), המאופיין בגרעינים קטנים, צפופים ומעוותים. (F) אלקטרופורציה מוצלחת המכוונת לחלק הפנימי של האורגנואיד, שלעתים קרובות קשה יותר לפרש בגלל אזורים דמויי צלחת קליפת המוח המתמזגים עם חדרים סמוכים. (G) מבנים דמויי חדרים משובשים במרכז האזור המתחשמל (חץ כתום). (H) דוגמה ל-hCO המכיל מספר חדרים קטנים יותר שמתמזגים חלקית, ולכן קשה לכמת. (I) צביעת DAPI (אפור) ואימונופלואורסנציה עבור GFP (ירוק) ו-PCGF4 (מגנטה) 7 ימים לאחר אלקטרופורציה של קומפלקס RNP המכוון ל-LACZ (gLACZ KO, משמאל) או PCGF4 (gPCGF4 KO, מימין) לנוקאאוט בתיווך CRISPR/Cas9. תאים מעוגלים מדגישים את העוצמה המופחתת של PCGF4, מה שמצביע על אבלציה גנטית מוצלחת. אות אחיד ניתן לראות בפקד LACZ (משמאל). (J) הגרף מראה את עוצמת PCGF4 המכומתת לאחר אימונופלואורסנציה בתאים חיוביים ל-GFP עבור הבקרה (gLACZ KO) וה-KO של PCGF4 (gPCGF4 KO) ביחס לחציון ביטוי PCGF4 בתנאיg LACZ. כל נקודה מייצגת תא. נתונים מ 3-4 אורגנואידים משתי אצוות שונות (אפור ושחור) של אותו קו hiPSC. p < 0.0001, מבחן מאן-ויטני. כל התמונות נרכשו באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי (B, C) או פלואורסצנטי (E-I) לסריקת לייזר. התמונות מייצגות הקרנות בעוצמה מרבית של ערימות z בעובי 10-15 מיקרומטר. קווים מקווקווים לבנים מציינים את המשטח האפי הפונה ללומן החדר ואת המשטחים החיצוניים של hCOs. קווים מקווקווים כתומים מציינים את גבול VZ/SVZ בחדרים ממוזגים. פסי קנה מידה: 100 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

נוגדן/צבעדילול
עוף נגד GFP1:2,000
עכבר נגד PCGF41:300
Alexa Fluor 488 חמור נגד עוף1:1,000
Alexa Fluor 555 חמור נגד ארנב1:1,000
דאפי1 מ"ג / מ"ל מלאי; 1:1,000

טבלה 1: רשימת נוגדנים וצבעים ודילולם המשמשים לצביעת Immunofluorescence.

דיון

אורגנואידים מוחיים וקליפת המוח האנושיים הפכו למודלים מרכזיים לחקר התפתחות הניאוקורטקס האנושי 7,16,17. עבור מודלים של הפרעות אנושיות, קווי hiPSC איזוגניים ואורגנואידים הפכו לתקן הזהב68. עם זאת, מכיוון שיצירת קווי iPSC חדשים גוזלת זמן ויקרה, המניפולציה החריפה של מודלים אורגנואידים בקליפת המוח למחקרים על תפקוד גנים יושמה באופן נרחב.

אלקטרופורציה של אורגנואידים מוחיים וקליפת המוח 14,22,26,46,47,48,49,50,51,55 קלה ליישום, ומעבדות רבות שהשתמשו באופן מסורתי במודלים של בעלי חיים למחקרים פונקציונליים מצוידות בכלים הנדרשים. עבור הזרקה in vivo, החדרים הצדיים מכוונים בדרך כלל 34,36,37,39,40,41,42. אלה מעוצבים באורגנואידים קורטיקליים על ידי מבנים דמויי חדרים הכוללים לומן מרכזי שניתן גם להזריק. אלקטרופורציה של אורגנואידים קורטיקליים מכוונת בעיקר לכפות הרגליים הקציות של התאים המצפים את החדרים, בדרך כלל גליה רדיאלית אפית69. יעילות המיקוד משתנה בין ניסוי לניסוי, אך בדרך כלל, ניתן להשיג כמה 100 עד 1,000 תאים חיוביים ל-GFP לכל אורגנואיד לאחר 3-7 ימים של התחשמלות. משך מחזור התא בתאי אב עצביים אנושיים ארוך בערך פי שניים בהשוואה לעכבר, שם לגליה רדיאלית אפית יש אורך מחזור תא של 14 שעות ותאי אב בסיסיים של 23 שעות70. לכן, לאחר 3 ימים, בעיקר תאי גליה רדיאלית אפית ותאי אב בינוניים הם חיוביים ל-GFP, ואילו תאים חיוביים ל-GFP מופצים בכל האזורים לאחר 7 ימים. עדיין ניתן לראות אות GFP מספר חודשים לאחר אלקטרופורציה, כאשר תאים חיוביים ל- GFP מייצגים בעיקר נוירונים המפוזרים ברחבי האורגנואיד, מה שמאפשר לנו לנתח את המורפולוגיה של תאים בודדים. מיקוד של תאי אב עצביים המצפים את החדר אפשרי בשלבים שבהם אזורים דמויי חדרים ניתנים לזיהוי תחת מיקרוסקופ שדה בהיר. בפרוטוקולהנוכחי 15, זה אפשרי משבוע 2 עד שבוע 12 של התפתחות אורגנואידים קליפת המוח, ולאחר מכן החדרים מתכווצים ואינם נראים עוד. עבור נסיין מנוסה, זה ריאלי להזריק 50-80 אורגנואידים בפגישה אחת.

בעוד שצאצאי גליה רדיאלית אפית יורשים ריאגנטים של מניפולציה גנטית במהלך חלוקת התא, המיקוד הישיר של תאים בוגרים, כגון נוירונים ואסטרוציטים, אינו אפשרי בגישת האלקטרופורציה הסטנדרטית. במקום זאת, שיטות מיקוד ויראלי יושמו על תאים פוסט-מיטוטיים במערכת העצבים33,71. בפרט, וירוסים הקשורים אדנו רקומביננטי (AAVs) נמצאים בשימוש נרחב עבור העברת גנים במערכת העצבים כפי שהם קלים לייצר ו מתמר תאים ממוינים סופניים עם יעילות גבוהה71. יתר על כן, AAVs יכולים להיות ממוקדים לתת-אוכלוסיות עצביות ספציפיות. גישות שונות למיקוד נגיפיים, כולל שימוש באדנו, סנדאי ולנטיוירוסים, כבר יושמו באורגנואידים מוחיים וקליפת המוח 15,25,29,30,32,47,72,73,74.

מגבלה אחת בפרוטוקולים אורגנואידים מוחיים היא התפתחות ליבה נמקית עקב אספקת חמצן וחומרים מזינים מוגבלת. מספר אסטרטגיות יושמו כדי לשפר את כדאיות התא במרכז האורגנואידים, כולל תרבית אורגנואידים בביוריאקטורים מסתובבים14,54, תרבית משותפת של תאי אנדותל או גישות ביו-הנדסה למודל וסקולריזציה75,76, השתלת אורגנואידים במודלים של מכרסמים18,77 וחיתוך אורגנואידים15,47. כאן, השתמשנו בפרוטוקול אורגנואיד קליפת המוח האנושי פרוס, אשר הוכח כמציג היפוקסיה מופחתת בליבת האורגנואיד ותומך בהתרחבות של מבנים דמויי חדרים ואזור דמוי צלחת קליפת המוח15. בנוסף, חיתוך של אורגנואידים מוחיים מועיל גם עבור הדמיה חיה של גליה רדיאלית בסיסית, אשר ממוקם באזור subventricular, המאפשר את הדור של מפות החלטה גורל התא72. כמו כן, הדמיה חיה שימשה לחקר אורגנואידים מוחיים חתוכים בתרבית בממשק אוויר-נוזל, התומך בהישרדות עצבית ובצמיחה אקסונלית47. מצאנו כי חיתוך של אורגנואידים קליפת המוח האנושית גם הופך את המודלים האורגנואידים האלה לנוחים במיוחד להתחשמלות, שכן מבנים דמויי חדרים יכולים להיות מזוהים בקלות לאחר החיתוך. אלקטרופורציה של אורגנואידים בקליפת המוח מאפשרת החדרה של פלסמידים של DNA, המשמשים באופן קלאסי לביטוי יתר של גנים, ולאחרונה, להעברת ספריות פלסמיד שלמות55, ושל כלי עריכת גנים CRISPR/Cas9 לנטרול תפקוד הגן26.

טכנולוגיית CRISPR/Cas9 חוללה מהפכה בחקר תפקוד הגן 56,57,58,63,66. בפרוטוקול זה, תיארנו את היישום של gRNA/Cas9 קומפלקסים ribonucleoprotein36 עבור השתקה גנטית חריפה באורגנואידים קליפת המוח האנושית. תיקוף ראשוני של יעילות gRNA בוצע במבחנה, תחילה במבחנה ושנייה בתאי גזע פלוריפוטנטיים מוגנים. אנו מוצאים כי בדיקות ראשוניות פשוטות אלה מסייעות בבחירת זוגות gRNA מבטיחים, במיוחד בהיעדר נוגדנים עובדים. ככל שמאופיינים יותר ויותר כלים לנוקאאוט גנטי בתיווך CRISPR/Cas9, שלבי האימות הראשוניים עשויים להיות מושמטים בעתיד. בעוד שריצוף הדור הבא של אזורי דנ"א ממוקדים שבודדו מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים הוא כמותי יותר ובעל תוכן מידע גבוה יותר, אנו מוצאים כי ריצוף סנגר יכול לעתים קרובות להציע תוצאות מהירות בהרבה במהלך הסינון המקדים של gRNAs. בסופו של דבר, אימות של עריכת CRISPR/Cas9 יעילה באורגנואידים בקליפת המוח והפחתת רמות החלבונים בתאים המעניינים הוא ההוכחה המוחלטת ביותר לאבלציה גנטית מוצלחת בתיווך CRISPR/Cas9.

האלקטרופורציה של אורגנואידים קורטיקליים אנושיים פרוסים מאפשרת מניפולציה גנטית חריפה למחקרי רווח ואובדן תפקוד, ויזואליזציה של מורפולוגיה של תאים ואקסונים עצביים, העברת ספריות פלסמיד לגישות סינון ומבחני כתב מקבילים מאסיביים, תיוג תאים להדמיה חיה והעברת כלים לעריכת אפיגנום. ככזו, אלקטרופורציה של אורגנואידים קורטיקליים אנושיים פרוסים היא שיטה רבת עוצמה שיכולה לחשוף תובנות מכניסטיות על התפתחות קליפת המוח האנושית, הפרעות נוירו-התפתחותיות ואבולוציה קליפת המוח.

גילויים

המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי עניינים.

תודות

אנו אסירי תודה למתקנים של שותפי CRTD ו- Dresden Concept על התמיכה יוצאת הדופן שניתנה, במיוחד ק. נוימן וצוותה במתקן להנדסת תאי גזע, ה. הרטמן וצוותה במתקן מיקרוסקופיית אור, א. גומפף וצוותה במתקן ציטומטריית זרימה והרטמוט וולף מסדנת MPI-CBG לבניית תאי אלקטרופורציה. אנו מודים ליהושע שמידט על המשוב על כתב היד. MA מודה במימון מהמרכז לטיפולים רגנרטיביים TU דרזדן, DFG (אמי נת'ר, AL 2231/1-1), וקרן שראם.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
צינורות צנטריפוגה PP 15 מ"לקורנינגחרוטי 430791
יחידת ליבה 4D-Nucleofectorיחידת לונזה
4D-Nucleofector X יחידהלונזה
5 מ"ל פוליסטירן צינור תחתון עגול עם מכסה מסננת תאיםקורנינגפלקון 352235
צלחת 6 בארות, מטופל ב-ThermoFisher140675עבור hiPSC תרבית
צלחת 6 בארות, חיבור נמוך במיוחדקורנינג3471לתרבית אורגנואידים
A83-01STEMCELL Technologies72022מדיום מוח קדמי 1 (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
מדחס אווירAerotec
Alexa Fluor 488 חמור נגד עוף IgY (IgG) (H+L)Jackson Immuno Research703-545-155נוגדן משני, RRID: AB_2340375; דילול 1:1000
Alexa Fluor 555 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)InvitrogenA-31572נוגדן משני, RRID: AB_162543; דילול 1:1000
Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA, 2 nmolטכנולוגיות DNA משולבותעיצוב מותאם אישית (סדר כ-2 ננומול)
Alt-R CRISPR-Cas9 tracrRNAטכנולוגיות DNA משולבות10725325 ננומול
Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3טכנולוגיות DNA משולבות1081060100 ומיקרו; גרם, מסטרפטוקוקוס פיוגנס
אמפוטריצין B (Fungizone)Gibco15290018מדיום המוח הקדמי 2, 3 ו-4  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
נוגדן ראשוני נגד GFP (עוף, פוליקלונלי)Abcamab13970RRID: AB_300798; דילול 1:2000
נוגדן ראשוני Anti-PCGF4 (עכבר, חד שבטי)Millipore05-637 RRID: AB_309865; דילול 1:300
מיקרוסקופ פלואורסצנטי ApoTomeZeiss
חומצה אסקורביתSigma Aldrich1043003מדיום המוח הקדמי 4  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
B27-supplement (+ ויטמין A)Gibco17504044Forebrain medium 3, 4    (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
ערכת כבלים למיקרו-תופסמכשיר הרווארד BTX45-0216
ביומטרה, TRIO-Thermocycler (מכונת PCR)Analytik Jena846-2-070-723
נימים, זכוכית בורוסיליקט עם נימה, OD 1.2 מ"מ; מזהה 0.69 מ"מ; אורך 10 ס"ממוצרי מדעBF120-69-10יש למשוך לעובי ספציפי
CHIR-99021STEMCELL Technologies72052Forebrain medium 2  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
Collagenase Type IVGibco17104019
CRTDi004-Aמתקן הנדסת תאי גזע ב-CMCB DDhttps://hpscreg.eu/cell-line/CRTDi004-Aקו hiPSC מותאם לתאים בודדים מתורם בריא
DAPIRoche10236276001מלאי של 1 מ"ג/מ"ל, השתמש ב-1:1000 מדולל עבור IF
Dibutyryl-cAMPSTEMCELL Technologies73884מדיום קדמי 4  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
dimethyl sulfoxide (DMSO)Sigma AldrichD2650
DMEM/F-12, HEPESFisher Scientific31330095Forebrain medium 1, 2 ו-3  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
DorsomorphinSTEMCELL Technologies72102Forebrain medium 1  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
Dumont #55 מלקחיים, סטריגט, 11 ס"מכלים מדעיים עדינים11295-51
ECM 830 מערכת אלקטרופורציה של גל מרובעמכשיר הרווארד BTX45-2052
אתנולסיגמא אולדריץ'32205-1L-M
חומצה אתילנדיאמינטטראצטית (EDTA)סיגמא אולדריץ'EDS-500G
Fast Green FCFSigma AldrichF7252
סרום בקר עוברי (FBS)GE Healthcare SH30070.03 
Flaming/Brown Micropipette PullerSutter Instrument Co.P-97למשיכת מיקרו-נימים
Geneious PrimeGraphPad Software LLC d.b.a GeneiousSoftware גרסה 2024.0.5
gLACZKalebic et al., 2016; Platt et al., 20145'-TGCGAATACGCCCACGCGATCGG; נוקלאוטידים מסומנים בקו תחתון = PAM
GlutaMAXGibco 35050038מדיום המוח הקדמי 1, 2, 3 ו-4 (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
גליציןסיגמא אולדריץ'G8898
gPCGF4 KO1מאמר5'-TGAACTTGGACATCACAAATAGG (תואם לתמונות ה-KO באיור 3I+J)
gPCGF4 KO2מאמר5'-ACAAATAGGACAATACTTGCTGG (תואם ל-KO תמונות באיור 3I+J)
HEPESתוצרת בית1 מיליון
מלאי סרום סוסים,Gibco26050088
Human GDNF Recombinant ProteinThermo Fisher450-10Forebrain medium 4  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
אדם/עכבר/חולדה BDNF חלבון רקומביננטיתרמו פישר450-02מוח קדמי בינוני 4  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
חומצה הידרוכלורית (HCl)Sigma Aldrich258148לייצור TrisHCl
ImmEdge (שעווה) PenVector LaboraoriesH-4000
תמיסת אינסולין אנושיתSigma Aldrich  I9278מוח קדמי בינוני 3  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
IsopropanolFisher ScientificBP2618-1
החלפת סרום נוקאאוטGibco 10828-010מוח קדמי בינוני 1  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
לייזר סריקת לייזר קונפוקלי 980 מיקרוסקופZeiss
נקודת התכה נמוכה אגרוז,16520100תרמו פישרלהטמעת hCOs במהלך חתך ויברטום
מטריג'ל גורם גדילה מופחת (GFR) מטריצת ממברנת בסיס,קורנינג354230לתרבית
אורגנואידיםמטריצה מוסמכת hESC של Matrigel,354277 קורנינגלתרבית hiPSC
MgCl2, 1 Mתרמו פישרAM9530G
מיקרו-מזרק PicoPump + מתג רגלמכשירים מדויקים בעולםSYS-PV820
טיפים לפיפטה של מיקרו-מעמיס 0.5 עד 20 ומיקרו; LEppendorf5242956003להעמסת נימי זכוכית
Mowiol 4-88Sigma Aldrich81381
mTeSR 1STEMCELL Technologies85850מדיום תאי גזע
N-2 תוסףGibco17502048Forebrain medium 2 ו-3  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
NaClSigma AldrichS5886
NaHCO3Sigma AldrichS5761
NEB הבא High Fidelity 2x PCR Mastermix ניו אינגלנד BiolabsM0541S
תא ספירה נויבאוארמותג718605
מדיום נוירובזאליGibco21103049מדיום מוח קדמי  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
>חומצות אמינו לא חיוניותGibco 11140050מדיום המוח הקדמי 1, 2, 3 ו-4 (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15מאגר
דופלקס נטול נוקלאזטכנולוגיות DNA משולבות 1072570
O. C. T.Compound Tissue-Tek4583מדיום הטמעה לדגימת רקמה קפואה
P3 תא ראשוני 4D-Nucleofector X Kit SLonzaV4XP-3032
ParaformaldehydeFisher ChemicalP/0840/53
pCAG-GFPAddgene11150
עובש הטבעה Peel-A-Way TruncatedT12Polysciences Inc.18986-1להטמעת hCOs לוויברטום וחתך קריו
פניצילין-סטרפטומיצין (10,000 U/mL) Gibco15140122Forebrain בינוני 1, 2, 3 ו-4  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15 ולמדיום תאי גזע לאחר נוקלאופקציה
צלחת פטרי 60 מ"מ x 15 מ"מ, ללא אוורור,קורנינגBP50-02
צלחת פטרי תא אלקטרודה פלטינה, פער 5 מ"ממכשיר הרווארד BTX45-0504
תמיסת מלח חוצץ פוספט (PBS)תוצרת בית
Proteinase KSigma AldrichP2308מאלבום Titrachium; מלאי 10 מ"ג/מ"ל
QIAquick Gel Extraction KitQiagen28706
מעכב מסלול RHO/ROCK (Y-27632)STEMCELL Technologies72308
SB-431542STEMCELL Technologies72232מדיום המוח הקדמי 2  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
נתרן ציטראט דיהידראטסיגמא אולדריץ'W302600-1KG-K
נתרן דודציל סולפט (SDS)Sigma AldrichL3771
סוכרוז Sigma AldrichS7903
SuperFrost PlusFisher Scientific10149870
SZX10 עם KL 300 LEDOlympusSZX10או סטריאוסקופ חלופי
Thermo ShakerGrant bioPSC24N
Triton-XSigma AldrichT9284הידוע גם בשם Octoxinol 9
Trizma baseSigma AldrichT1503להכנת TrisHCl
Trypan Blue Solution, 0.4%Thermo Fisher15250061
TrypLE Express Enzyme (1x)Thermo Fisher12604021 דיסוציאציה enzmye לייצור תרחיפים חד-תאיים
Tween 20Sigma AldrichP1379הידוע גם בשם Polysorbate 20
Tyrode's saltSigma AldrichT2145-10x1l
רוטט מיקרוטום (ויברטום)LeicaVT1200 S
רחב קדח 1000 ומיקרו; L טיפים מסננים אוניברסלייםקורנינגTF-1005-WB-R-S
β-מרקפטואתנולGibco 21985-023מוח קדמי בינוני 1, 3 ו-4  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
, זה זה טהור במיוחד ללא LDEV נטולת LDEV סטרילי שקופיות הידבקות

מקורות

  1. Rakic, P. Evolution of the neocortex: A perspective from developmental biology. Nat Rev Neurosci. 10 (10), 724-735 (2009).
  2. Pollen, A. A., Kilik, U., Lowe, C. B., Camp, J. G. Human-specific genetics: New tools to explore the molecular and cellular basis of human evolution. Nat Rev Genet. 24, 687-711 (2023).
  3. Llinares-Benadero, C., Borrell, V. Deconstructing cortical folding: Genetic, cellular and mechanical determinants. Nat Rev Neurosci. 20 (3), 161-176 (2019).
  4. Florio, M., Huttner, W. B. Neural progenitors, neurogenesis and the evolution of the neocortex. Development. 141 (11), 2182-2194 (2014).
  5. Lui, J. H., Hansen, D. V., Kriegstein, A. R. Development and evolution of the human neocortex. Cell. 146 (1), 18-36 (2011).
  6. Bölicke, N., Albert, M. Polycomb-mediated gene regulation in human brain development and neurodevelopmental disorders. Dev Neurobiol. 82 (4), 345-363 (2022).
  7. Arlotta, P., Pasca, S. P. Cell diversity in the human cerebral cortex: From the embryo to brain organoids. Curr Opin Neurobiol. 56, 194-198 (2019).
  8. Long, K. R., et al. Extracellular matrix components HAPLN1, lumican, and collagen I cause hyaluronic acid-dependent folding of the developing human neocortex. Neuron. 99 (4), 702-719.e6 (2018).
  9. Namba, T., et al. Human-specific arhgap11b acts in mitochondria to expand neocortical progenitors by glutaminolysis. Neuron. 105 (5), 867-881.e9 (2020).
  10. Hendriks, D., et al. Human fetal brain self-organizes into long-term expanding organoids. Cell. 187 (3), 712-732.e38 (2024).
  11. Voices: The importance of fetal tissue research. Cell Stem Cell. 24 (3), 357-359 (2019).
  12. Temple, S., Goldstein, L. S. B. Why we need fetal tissue research. Science. 363 (6424), 207(2019).
  13. Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).
  14. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
  15. Qian, X., et al. Sliced human cortical organoids for modeling distinct cortical layer formation. Cell Stem Cell. 26 (5), 766-781.e9 (2020).
  16. Kelava, I., Lancaster, M. A. Dishing out mini-brains: Current progress and future prospects in brain organoid research. Dev Biol. 420 (2), 199-209 (2016).
  17. Pasca, S. P. The rise of three-dimensional human brain cultures. Nature. 553 (7689), 437-445 (2018).
  18. Mansour, A. A., et al. An in vivo model of functional and vascularized human brain organoids. Nat Biotechnol. 36 (5), 432-441 (2018).
  19. Andrews, M. G., et al. Lif signaling regulates outer radial glial to interneuron fate during human cortical development. Cell Stem Cell. 30 (10), 1382-1391.e5 (2023).
  20. Velasco, S., et al. Individual brain organoids reproducibly form cell diversity of the human cerebral cortex. Nature. 570 (7762), 523-527 (2019).
  21. Bershteyn, M., et al. Human ipsc-derived cerebral organoids model cellular features of lissencephaly and reveal prolonged mitosis of outer radial glia. Cell Stem Cell. 20 (4), 435-449.e4 (2017).
  22. Klaus, J., et al. Altered neuronal migratory trajectories in human cerebral organoids derived from individuals with neuronal heterotopia. Nat Med. 25 (4), 561-568 (2019).
  23. Qian, X., et al. Loss of non-motor kinesin KIF26A causes congenital brain malformations via dysregulated neuronal migration and axonal growth as well as apoptosis. Dev Cell. 57 (20), 2381-2396.e13 (2022).
  24. Watanabe, M., et al. Self-organized cerebral organoids with human-specific features predict effective drugs to combat zika virus infection. Cell Rep. 21 (2), 517-532 (2017).
  25. Benito-Kwiecinski, S., et al. An early cell shape transition drives evolutionary expansion of the human forebrain. Cell. 184 (8), 2084-2102.e19 (2021).
  26. Cubillos, P., et al. The growth factor epiregulin promotes basal progenitor cell proliferation in the developing neocortex. EMBO J. 43 (8), 1388-1419 (2024).
  27. Kanton, S., et al. Organoid single-cell genomic atlas uncovers human-specific features of brain development. Nature. 574 (7778), 418-422 (2019).
  28. Mora-Bermudez, F., et al. Differences and similarities between human and chimpanzee neural progenitors during cerebral cortex development. Elife. 5, e18683(2016).
  29. Pollen, A. A., et al. Establishing cerebral organoids as models of human-specific brain evolution. Cell. 176 (4), 743-756.e17 (2019).
  30. Esk, C., et al. A human tissue screen identifies a regulator of ER secretion as a brain-size determinant. Science. 370 (6519), 935-941 (2020).
  31. Fleck, J. S., et al. Resolving organoid brain region identities by mapping single-cell genomic data to reference atlases. Cell Stem Cell. 28 (6), 1177-1180 (2021).
  32. Li, C., et al. Single-cell brain organoid screening identifies developmental defects in autism. Nature. 621 (7978), 373-380 (2023).
  33. Janson, C. G., Mcphee, S. W., Leone, P., Freese, A., During, M. J. Viral-based gene transfer to the mammalian CNS for functional genomic studies. Trends Neurosci. 24 (12), 706-712 (2001).
  34. Tabata, H., Nakajima, K. Labeling embryonic mouse central nervous system cells by in utero electroporation. Dev Growth Differ. 50 (6), 507-511 (2008).
  35. Li, S., Li, Y., Li, H., Yang, C., Lin, J. Use of in vitro electroporation and slice culture for gene function analysis in the mouse embryonic spinal cord. Mech Dev. 158, 103558(2019).
  36. Kalebic, N., et al. CRISPR/cas9-induced disruption of gene expression in mouse embryonic brain and single neural stem cells in vivo. EMBO Rep. 17 (3), 338-348 (2016).
  37. Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: Visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).
  38. Walantus, W., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of e16 rat embryos. J Vis Exp. 6, e236(2007).
  39. Takahashi, M., Sato, K., Nomura, T., Osumi, N. Manipulating gene expressions by electroporation in the developing brain of mammalian embryos. Differentiation. 70 (4-5), 155-162 (2002).
  40. Kalebic, N., Langen, B., Helppi, J., Kawasaki, H., Huttner, W. B. In vivo targeting of neural progenitor cells in ferret neocortex by in utero electroporation. J Vis Exp. (159), e61171(2020).
  41. Kawasaki, H., Iwai, L., Tanno, K. Rapid and efficient genetic manipulation of gyrencephalic carnivores using in utero electroporation. Mol Brain. 5, 24(2012).
  42. Kawasaki, H., Toda, T., Tanno, K. In vivo genetic manipulation of cortical progenitors in gyrencephalic carnivores using in utero electroporation. Biol Open. 2 (1), 95-100 (2013).
  43. Reillo, I., De Juan Romero, C., Garcia-Cabezas, M. A., Borrell, V. A role for intermediate radial glia in the tangential expansion of the mammalian cerebral cortex. Cereb Cortex. 21 (7), 1674-1694 (2011).
  44. Kalebic, N., et al. Human-specific ARHGAP11B induces hallmarks of neocortical expansion in developing ferret neocortex. Elife. 7, e41241(2018).
  45. Johnson, M. B., et al. Aspm knockout ferret reveals an evolutionary mechanism governing cerebral cortical size. Nature. 556 (7701), 370-375 (2018).
  46. Fischer, J., Heide, M., Huttner, W. B. Genetic modification of brain organoids. Front Cell Neurosci. 13, 558(2019).
  47. Giandomenico, S. L., et al. Cerebral organoids at the air-liquid interface generate diverse nerve tracts with functional output. Nat Neurosci. 22 (4), 669-679 (2019).
  48. O'neill, A. C., et al. A primate-specific isoform of plekhg6 regulates neurogenesis and neuronal migration. Cell Rep. 25 (10), 2729-2741.e26 (2018).
  49. Buchsbaum, I. Y., et al. Ece2 regulates neurogenesis and neuronal migration during human cortical development. EMBO Rep. 21 (5), e48204(2020).
  50. Fischer, J., et al. Human-specific arhgap11b ensures human-like basal progenitor levels in hominid cerebral organoids. EMBO Rep. 23 (11), e54728(2022).
  51. Tynianskaia, L., Esiyok, N., Huttner, W. B., Heide, M. Targeted microinjection and electroporation of primate cerebral organoids for genetic modification. J Vis Exp. 193, e65176(2023).
  52. Denoth-Lippuner, A., Royall, L. N., Gonzalez-Bohorquez, D., Machado, D., Jessberger, S. Injection and electroporation of plasmid DNA into human cortical organoids. STAR Protoc. 3 (1), 101129(2022).
  53. Qian, X., et al. Generation of human brain region-specific organoids using a miniaturized spinning bioreactor. Nat Protoc. 13 (3), 565-580 (2018).
  54. Qian, X., et al. Brain-region-specific organoids using mini-bioreactors for modeling zikv exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
  55. Noack, F., et al. Joint epigenome profiling reveals cell-type-specific gene regulatory programmes in human cortical organoids. Nat Cell Biol. 25 (12), 1873-1883 (2023).
  56. Doudna, J. A., Charpentier, E. Genome editing. The new frontier of genome engineering with crispr-cas9. Science. 346 (6213), 1258096(2014).
  57. Doench, J. G., et al. Rational design of highly active sgrnas for crispr-cas9-mediated gene inactivation. Nat Biotechnol. 32 (12), 1262-1267 (2014).
  58. Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of crispr-cas9 for genome engineering. Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).
  59. Völkner, M., et al. Hbegf-tnf induce a complex outer retinal pathology with photoreceptor cell extrusion in human organoids. Nat Commun. 13 (1), 6183(2022).
  60. Schütze, T. M., Bölicke, N., Sameith, K., Albert, M. Brain Organoid Research. , Springer US. New York, NY. (2022).
  61. ALT-R CRISPR-cas9 system-in vitro. cleavage of target DNA with RNP complex. , At https://eu.idtdna.com/pages/products/crispr-genome-editing/alt-r-crispr-cas9-system#resources (2022).
  62. Albert, M., et al. Epigenome profiling and editing of neocortical progenitor cells during development. EMBO J. 36 (17), 2642-2658 (2017).
  63. Platt, R. J., et al. CRISPR-cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
  64. Florio, M., et al. Human-specific gene ARHGAP11B promotes basal progenitor amplification and neocortex expansion. Science. 347 (6229), 1465-1470 (2015).
  65. Schmidt, U., Weigert, M., Broaddus, C., Myers, G. Cell Detection with Star-Convex Polygons. , Springer International Pubs. Cham. (2018).
  66. Wang, J. Y., Doudna, J. A. CRISPR technology: A decade of genome editing is only the beginning. Science. 379 (6629), eadd8643(2023).
  67. Hoffmann, J., et al. Canonical and non-canonical PRC1 differentially contribute to the regulation of neural stem cell fate. bioRxiv. , 2024(2024).
  68. Celotti, M., et al. Protocol to create isogenic disease models from adult stem cell-derived organoids using next-generation crispr tools. STAR Protoc. 5 (3), 103189(2024).
  69. Taverna, E., Götz, M., Huttner, W. B. The cell biology of neurogenesis: Toward an understanding of the development and evolution of the neocortex. Annu Rev Cell Dev Biol. 30, 465-502 (2014).
  70. Arai, Y., et al. Neural stem and progenitor cells shorten s-phase on commitment to neuron production. Nat Commun. 2, 154(2011).
  71. Bedbrook, C. N., Deverman, B. E., Gradinaru, V. Viral strategies for targeting the central and peripheral nervous systems. Annu Rev Neurosci. 41, 323-348 (2018).
  72. Coquand, L., et al. A cell fate decision map reveals abundant direct neurogenesis bypassing intermediate progenitors in the human developing neocortex. Nat Cell Biol. 26 (5), 698-709 (2024).
  73. Fleck, J. S., et al. Inferring and perturbing cell fate regulomes in human brain organoids. Nature. 621 (7978), 365-372 (2023).
  74. Andersen, J., et al. Generation of functional human 3D cortico-motor assembloids. Cell. 183 (7), 1913-1929.e26 (2020).
  75. Nwokoye, P. N., Abilez, O. J. Bioengineering methods for vascularizing organoids. Cell Rep Methods. 4 (6), 100779(2024).
  76. Cakir, B., Park, I. H. Getting the right cells. Elife. 11, e80373(2022).
  77. Revah, O., et al. Maturation and circuit integration of transplanted human cortical organoids. Nature. 610 (7931), 319-326 (2022).

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

CRISPR Cas9
אלקטרופורציה של אורגנואידים קורטיקליים אנושיים פרוסים לחקר תפקוד גנים
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.