הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה חסכונית לטיהור, הרחבה ואפיון תאי גזע מזנכימליים הומוגניים ביותר של מח עצם (BMSCs) מעכברים. גישה זו מאפשרת רכישה של כמויות גדולות של BMSCs עם פוטנציאל התפשטות והתמיינות גבוה, תמיכה במודלים של עכברים וקידום מחקר פרה-קליני.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
טיהור, הרחבה ופנוטיפ מבוסס ציטומטריה של תאי גזע מזנכימליים במח עצם שמקורם בעכבר
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
תאי גזע מזנכימליים (MSCs) הם אוכלוסייה של תאי גזע שיכולים להתחדש בעצמם ולהתמיין לשושלות תאים מרובות. ביניהם, MSCs המצויים במח העצם, הידועים כתאי גזע מזנכימליים של מח העצם (BMSCs), ממלאים תפקיד מכריע באוסטאוגנזה, תמיכה המטופויאטית, ביות/נדידה ודיכוי חיסוני. BMSCs נמצאים בשימוש נרחב בביולוגיה של התא ובמחקר הנדסת רקמות בשל הפוטנציאל שלהם לאסטרטגיות טיפוליות תאיות, כמו גם זמינותם הקלה, היציבות הגנטית והחיסון הנמוך שלהם. תאי גזע המטופויאטיים (HSCs) ו-BMSCs מתקיימים במקביל במח העצם אך יש להם תאי אב מובחנים. בעת חילוץ תאים ממח העצם, מתקבלים בדרך כלל סוגי תאים מרובים, מה שעלול להוביל להטרוגניות באוכלוסיית התאים, מה שעלול לגרום להטיה ולא לעמוד בסטנדרטים ניסיוניים גבוהים. לכן, חיוני לפתח טכניקות יעילות לשיפור ההומוגניות והתשואה של BMSCs במבחנה. מחקר זה מציג פרוטוקול מפורט לטיהור, הרחבה ופנוטיפ מבוסס ציטומטריית זרימה של BMSCs המתקבלים מעכברי BALB/c. ההומוגניות והפנוטיפ של תאי גזע של BMSCs במעבר שלישי אופיינו באמצעות ציטומטריית זרימה, הדגימו חיוביות עבור CD29, CD44 ו-Sca-1, שליליות עבור CD45 ו-CD31, ואישרו את יכולת ההתמיינות האוסטיאוגנית והאדיפוגנית שלהם. פרוטוקול חסכוני זה מספק שיטה קלה ויעילה להשגת מספר מספיק של BMSCs הומוגניים עם פוטנציאל התפשטות והתמיינות גבוה, החיוני לקידום המחקר במודלים של עכברים ומחקרים פרה-קליניים נרחבים.
מבוא
תאי גזע מזנכימליים של מח עצם (BMSCs) ידועים במאפיינים המולטיפוטנטיים שלהם ונמצאים בשימוש נרחב בטיפול במחלות שונות בשל תכונותיהם המתחדשות, ההתמיינות והאימונומודולטוריות 1,2. BMSCs ניתנים להשגה בקלות, מסוגלים להתרחב באופן נרחב, מציגים תכונות מדכאות חיסון ואינם מעורריםתגובות חיסוניות מיידיות, מה שהופך אותם למושכים עבור יישומי הנדסת רקמות ונשאים יעילים לטיפול תאי.
במח העצם, שתי אוכלוסיות תאי גזע עיקריות וצאצאיהם, תאי הגזע ההמטופויאטיים וה-BMSCs, הם התושבים העיקריים4. באופן מסורתי, BMSCs מתקבלים באמצעות שאי....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הטיפול בבעלי חיים אושר בהתאם להנחיות האתיקה של חיות מעבדה (אישור אתי מס': PZSHUTCM2211070009) מאוניברסיטת שנחאי לרפואה סינית מסורתית. במחקר זה נעשה שימוש בעכברי BALB/c נקבות בנות שמונה שבועות (דרגת SPF, 20 ± 1 גרם משקל גוף). פרוטוקול זה מתאר את הטיהור, המעבר, פנוטיפ מבוסס ציטומטריית זרימה והתמיינות אוסטאוגנית ואדיפוגנית של BMSCs שמקורם בעכבר. הריאגנטים והציוד המשמשים מפורטים בטבלת החומרים.
1. טיפול בבעלי חיים
- עכברי בית בתנאים ספציפיים ללא פתוגן (SPF) בכלובים מאווררים בנפרד, עם חמישה עכברים בכל כלוב. ספק הזנה בדרגת SPF ומים סטריליים. שמור על מחזור אור/חושך של 12 ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
BMSCs שמקורם בעכבר בודדו ותרבו במשך כשבועיים כדי ליצור את המעבר השלישי (P3) BMSCs (איור 3). כפי שמוצג באיור 3A, תאים שזה עתה חולצו ממח העצם נשארו חד-גרעיניים עם טיפות שומן גלויות. תאים בצורת ציר הופיעו בצלחת התרבית, והגיעו למפגש של 60%-80% ביום התרביתהחמישי (איור 3B,C). מה-P1-P3 (איור 3D-F), ה-BMSCs הציגו ציר .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
טיפול בתאי גזע זכה לעניין רב בשל הפוטנציאל שלו לחולל מהפכה ברפואה הרגנרטיבית. מחקרים פרה-קליניים סיפקו ראיות משמעותיות התומכות ביישום הקליני של תאי גזע, במיוחד BMSCs13. עם זאת, אתגרים כמו תפוקת תאים נמוכה, זיהום וצמיחה איטית עיכבו את היישום הקליני שלהם. לכן, יש צורך דחוף במחקר המתמקד בסטנדרטיזציה של תהליכי הכנת BMSC כדי לשפר את תפוקת התאים והפונקציונליות, ובכך להרחיב את השימוש הקליני בהם2.
שיטה זו מציגה מספר יתרו.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים ביחס למחקר זה.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מתוכנית המו"פ הלאומית של סין (2020YFE0201600) והקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (82174408 ו-82374477).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| מזרק 1 מ"ל (מחט מזרק 22 גרם) | קבוצה חביבה (KDL) | 60017031 | |
| שלב אחד NBT/BCIP | פירס ביוטכנולוגיה בע"מ | 34042 | צביעת פוספטאז אלקליין |
| 10% פורמלין ניטרלי חומצי | וקסיס | 5200250 | קיבוע תאים |
| צלחת 6 בארות | מעבדה | 11110 | תרבית תאים |
| צלחת 24 בארות | מעבדה | 11310 | תרבית תאים |
| 40 μ מסננת תאים m | קורניג | 352340 | סינון להסרת אגרומרטים |
| מזרק 50 מ"ל | קבוצה חביבה (KDL) | 60017040 | |
| 75% אתנול | שנחאי NianYue ביוטכנולוגיה ושות', בע"מ | 31009001 | חיטוי עור העכברים |
| אליזרין אדום S | סיגמא-אולדריץ' | א5533 | איתור מרבצי סידן וגושים מסויידים |
| נוגדן חד שבטי APC CD44 (שיבוט: IM7) | מדע אלקטרוני | 17-0441-82 | ציטומטריית זרימה |
| APC עכברוש IgG2b עם בקרת איזוטיפ (שיבוט: eB149/10H5) | מדע אלקטרוני | 17-4031-82 | ציטומטריית זרימה |
| אוטוקלאב | חברת היריאמה היפנית | HVE-50 | מכשירים כירורגיים לעיקור |
| אינקובטור CO2 | תרמו פישר טכנולוגיה (סין) ושות', בע"מ | 300583057 | תרבית תאים |
| זרימה ציטופלקס | בקמן קולטר | א00-1-1102 | ציטומטריית זרימה |
| דקסמתזון | סיגמא-אולדריץ' | D4902 | התמיינות אוסטאוגנית של BMSCs |
| צלחת (100 מ"מ) | קורנינג | 430167 | תרבית תאים |
| צלחת (60 מ"מ) | קורנינג | 430166 | הרגעה לדוגמא במהלך ההשתלה |
| כדורי צמר גפן מחטאים | שנחאי Honglong תעשייתי ושות', בע"מ | 20230627 | חיטוי עור העכברים |
| כפפות סטריליות חד פעמיות | שנחאי Honglong תעשייתי ושות', בע"מ | YT21131 | פעולה סטרילית |
| דיאטת מכרסמים מוקרנים של אריה כפול | Suzhou Shuangshi ניסיוני הזנת בעלי חיים טכנולוגיה ושות', בע"מ | ג'יגה-בייט 14924.3 | מזון לבעלי חיים |
| סרום בקר עוברי | שנחאי ביוסון מדע & טק ושות', בע"מ | BS-0002-500 | תרבית תאים |
| FITC אוגר נגד חולדות CD29 (שיבוט: Ha2/5) | BD Biosciences | 555003 | ציטומטריית זרימה |
| FITC אוגר IgM, λ 1 בקרת איזוטיפ (שיבוט: G235-1) | BD Biosciences | 553960 | ציטומטריית זרימה |
| ג'לטין (0.1%) | אורי סל | GLT-11301 | לשפר את יכולת ההדבקה של התאים |
| IVCs כלוב עכברים | Suzhou Monkey King ציוד ניסיוני לבעלי חיים טכנולוגיה ושות', בע"מ | HH-MMB-2 | מחסום בעלי חיים |
| חומצה L-אסקורבית | סיגמא-אולדריץ' | א8960 | התמיינות אוסטאוגנית של BMSCs |
| עט סימון | זברה סחר (שנזן) ושות', בע"מ | YYST5 | סמן את המידע הסלולרי על צלחת הפטרי |
| שינוי MEM אלפא (1X) | שנחאי NianYue ביוטכנולוגיה ושות', בע"מ | SH30265 | תרבית תאים |
| מח עצם עכבר תאי גזע מזנכימליים ערכת התמיינות אדיפוגנית | צרפת | MUXMX-90031 | BMSCs התמיינות אדיפוגנית |
| Nikon Eclipse Ti2 מיקרוסקופ הפוך Synstem | יפן Nikon Corporatin | Ti2-U | התבונן בתאים וצלם תמונות |
| מספריים לעיניים | שנחאי NianYue ביוטכנולוגיה ושות', בע"מ | Y00030 JZ | חותכים את העור |
| פינצטה לעיניים | שנחאי NianYue ביוטכנולוגיה ושות', בע"מ | BS-ZER-S-100 ביושארפ | השג רקמת עצם עכבר. |
| פסטר פיפטה | שנחאי NianYue ביוטכנולוגיה ושות', בע"מ | BS-XG-03M | שאפו את המדיום התרבותי |
| PE Rat נגד עכבר CD31 (שיבוט: Ha2/5) | BD Biosciences | 553373 | ציטומטריית זרימה |
| PE עכברוש IgG2a, κ בקרת איזוטיפ (שיבוט: R35-95) | BD Biosciences | 553930 | ציטומטריית זרימה |
| PE-Cyanine7 Ly-6A/E (Sca-1) נוגדן חד-שבטי (שיבוט: D7) | מדע אלקטרוני | 25-5981-82 | ציטומטריית זרימה |
| PE-Cyanine7 חולדה IgG2a ובקרת איזוטיפ (שיבוט: eBR2a) | מדע אלקטרוני | 25-4321-82 | ציטומטריית זרימה |
| פניצילין-סטרפטומיצין | שנחאי NianYue ביוטכנולוגיה ושות', בע"מ | 2585636 | תרבית תאים |
| PerCP-CY5.5 נגד עכבר חולדה CD45 (שיבוט: Ha2/5) | BD Biosciences | 561869 | ציטומטריית זרימה |
| PerCP-Cy5.5 חולדה IgG2b, κ בקרת איזוטיפ (שיבוט: A95-1) | BD Biosciences | 550764 | ציטומטריית זרימה |
| אזמל | מפעל מכשירים כירורגיים oמכשירים רפואיים בשנחאי? קבוצה ושות' בע"מ | J11010-10# JZ | בודד את הגפיים האחוריות והגו של העכבר, והסר רקמות זרות מהעצם |
| מכסה מנוע סטרילי | תרמו פישר טכנולוגיה (סין) ושות', בע"מ | ECO0.9 | שולחן ניתוחים כירורגי |
| וילונות כירורגיים סטריליים | הנאן Huayu ציוד רפואי ושות', בע"מ | 20160900 | לספק אזור ניתוח סטרילי |
| צינור (50 מ"ל) | שנחאי Baisai, ביוטכנולוגיה ושות', בע"מ | BLD-BL2002500 | אחסן את תמיסת התאים המסוננים |
| טריפסין-EDTA (0.25%) | ג'יבקו | 25200056 | לעכל תאים דבקים |
| &בטא;-גליצרופוספט | סיגמא-אולדריץ' | G5422 | התמיינות אוסטאוגנית של BMSCs |
מקורות
- Chu, D. -T., et al. An update on the progress of isolation, culture, storage, and clinical application of human bone marrow mesenchymal stem/stromal cells. Int J Mol Sci. 21 (3), 708(2020).
- Huang, S., et al.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
