Method Article

טיהור, הרחבה ופנוטיפ מבוסס ציטומטריה של תאי גזע מזנכימליים במח עצם שמקורם בעכבר

DOI:

10.3791/67600

⸱

July 11th, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 2Central Laboratory for Science and Technology, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 3Key Laboratory of Theory and Therapy of Muscles and Bones, Ministry of Education

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה חסכונית לטיהור, הרחבה ואפיון תאי גזע מזנכימליים הומוגניים ביותר של מח עצם (BMSCs) מעכברים. גישה זו מאפשרת רכישה של כמויות גדולות של BMSCs עם פוטנציאל התפשטות והתמיינות גבוה, תמיכה במודלים של עכברים וקידום מחקר פרה-קליני.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תאי גזע מזנכימליים (MSCs) הם אוכלוסייה של תאי גזע שיכולים להתחדש בעצמם ולהתמיין לשושלות תאים מרובות. ביניהם, MSCs המצויים במח העצם, הידועים כתאי גזע מזנכימליים של מח העצם (BMSCs), ממלאים תפקיד מכריע באוסטאוגנזה, תמיכה המטופויאטית, ביות/נדידה ודיכוי חיסוני. BMSCs נמצאים בשימוש נרחב בביולוגיה של התא ובמחקר הנדסת רקמות בשל הפוטנציאל שלהם לאסטרטגיות טיפוליות תאיות, כמו גם זמינותם הקלה, היציבות הגנטית והחיסון הנמוך שלהם. תאי גזע המטופויאטיים (HSCs) ו-BMSCs מתקיימים במקביל במח העצם אך יש להם תאי אב מובחנים. בעת חילוץ תאים ממח העצם, מתקבלים בדרך כלל סוגי תאים מרובים, מה שעלול להוביל להטרוגניות באוכלוסיית התאים, מה שעלול לגרום להטיה ולא לעמוד בסטנדרטים ניסיוניים גבוהים. לכן, חיוני לפתח טכניקות יעילות לשיפור ההומוגניות והתשואה של BMSCs במבחנה. מחקר זה מציג פרוטוקול מפורט לטיהור, הרחבה ופנוטיפ מבוסס ציטומטריית זרימה של BMSCs המתקבלים מעכברי BALB/c. ההומוגניות והפנוטיפ של תאי גזע של BMSCs במעבר שלישי אופיינו באמצעות ציטומטריית זרימה, הדגימו חיוביות עבור CD29, CD44 ו-Sca-1, שליליות עבור CD45 ו-CD31, ואישרו את יכולת ההתמיינות האוסטיאוגנית והאדיפוגנית שלהם. פרוטוקול חסכוני זה מספק שיטה קלה ויעילה להשגת מספר מספיק של BMSCs הומוגניים עם פוטנציאל התפשטות והתמיינות גבוה, החיוני לקידום המחקר במודלים של עכברים ומחקרים פרה-קליניים נרחבים.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תאי גזע מזנכימליים של מח עצם (BMSCs) ידועים במאפיינים המולטיפוטנטיים שלהם ונמצאים בשימוש נרחב בטיפול במחלות שונות בשל תכונותיהם המתחדשות, ההתמיינות והאימונומודולטוריות 1,2. BMSCs ניתנים להשגה בקלות, מסוגלים להתרחב באופן נרחב, מציגים תכונות מדכאות חיסון ואינם מעורריםתגובות חיסוניות מיידיות, מה שהופך אותם למושכים עבור יישומי הנדסת רקמות ונשאים יעילים לטיפול תאי.

במח העצם, שתי אוכלוסיות תאי גזע עיקריות וצאצאיהם, תאי הגזע ההמטופויאטיים וה-BMSCs, הם התושבים העיקריים4. באופן מסורתי, BMSCs מתקבלים באמצעות שאיבת מח עצם ממוקדת ומזוהים כתאים נצמדים לפלסטיק במבחנה. עם זאת, שיטה זו אינה מספיקה כדי להבדיל BMSCs מתת-אוכלוסיות אחרות של מח עצם, כולל תאי אנדותל, פריציטים, לויקוציטים ותאי גזע המטופויאטיים5. לכן, יש צורך בפרוטוקול קל ויעיל לבידוד BMSCs.

העבודה הנוכחית מפרטת את ההפרדה והטיהור של BMSCs באמצעות היצמדותם הפיזית ללוחות תרבית תאים מפלסטיק. ניסויי זרימה ציטומטרית נערכו ב-BMSCs במעבר השלישי באמצעות סמני פני השטח CD29, CD44 ו-Sca-1, כפי שתוארו עלידי הוועדה 6 של האגודה הבינלאומית לטיפול בתאים וגנים (ISCT). על פי קריטריוני ISCT, MSCs של עכברים מאופיינים בחיוביות עבור CD29, CD44 ואנטיגן תאי גזע 1 (Sca-1), ושליליות עבור סמן תאים המטופויאטיים CD45 וסמן תאי אנדותל CD31. בנוסף, BMSCs צריכים להיות רב-פוטנטיים, ולהדגים התמיינות משולשת לאוסטאובלסטים, כונדרוציטים ואדיפוציטים. בניסוי זה, אוסטאוגנזה הושרה ב-BMSCs שחולצו, עם צביעת ALP שבוצעה ביום 7 ובדיקת S אדומה אליזרין ביום 21 כדי להעריך את ההתמיינות. התמיינות אדיפוגנית של BMSCs מבודדים ומטוהרים הושרה גם היא, עם צביעת שמן אדום O שבוצעה ביום 21 כדי להעריך אדיפוגנזה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הטיפול בבעלי חיים אושר בהתאם להנחיות האתיקה של חיות מעבדה (אישור אתי מס': PZSHUTCM2211070009) מאוניברסיטת שנחאי לרפואה סינית מסורתית. במחקר זה נעשה שימוש בעכברי BALB/c נקבות בנות שמונה שבועות (דרגת SPF, 20 ± 1 גרם משקל גוף). פרוטוקול זה מתאר את הטיהור, המעבר, פנוטיפ מבוסס ציטומטריית זרימה והתמיינות אוסטאוגנית ואדיפוגנית של BMSCs שמקורם בעכבר. הריאגנטים והציוד המשמשים מפורטים בטבלת החומרים.

1. טיפול בבעלי חיים

  1. עכברי בית בתנאים ספציפיים ללא פתוגן (SPF) בכלובים מאווררים בנפרד, עם חמישה עכברים בכל כלוב. ספק הזנה בדרגת SPF ומים סטריליים. שמור על מחזור אור/חושך של 12 שעות.
    הערה: שיטה זו נבדקה ונמצאה אפשרית הן בזני העכבר BALB/c והן ב-C57BL/6. מאמר זה משתמש בעיקר ב-BALB/c כדוגמה.

2. קצירת עצם הירך והשוקה מגפיים אחוריות של עכבר

  1. המתת חסד של בעלי החיים באמצעות חנק CO2 ואחריו פריקת צוואר הרחם7 בהתאם להנחיות אתיות.
  2. השרו עכברים ב-75% אתנול למשך 5 דקות (איור 1A).
    הערה: תאי גזע נקצרו תוך 30 דקות2 לאחר המתת חסד, וכל התהליך, כולל שטיפת מח עצם, סינון וזריעה לצלחות תרבית, הושלם תוך שעתיים כדי להבטיח כדאיות תאים אופטימלית.
    הערה: השתמש בעכברים בוגרים (בני ≥8 שבועות) לקבלת תפוקת BMSC אופטימלית; עכברים בני 8-12 שבועות הם אידיאליים8.
  3. בצעו חתך של כ-1 ס"מ בגפה האחורית של גיד אכילס באמצעות מספריים סטריליים לדיסקציה (איור 1B).
  4. בצעו חתך מעגלי סביב הגפה האחורית של גיד אכילס עם מספריים סטריליים כדי לחשוף את השוקה הדיסטלית (איור 1C).
  5. קלפו את העור מהחתך לכיוון הירך כדי להסיר אותו משתי הגפיים האחוריות (איור 1D).
  6. חתכו לאורך עצם הכסל כדי להפריד את ראש עצם הירך מעצם הירך (איור 2A).
    הערה: הימנע מפגיעה במפרקים הדו-צדדיים של עצם הירך במהלך דיסקציה כדי למנוע אובדן מח עצם.
  7. הניחו את עצם הירך והשוקה שנאספו בצלחת בקוטר 60 מ"מ המכילה PBS סטרילי טרום-קר המכיל 2% פניצילין/סטרפטומיצין (איור 2B).
  8. חתכו כמה שיותר גידים ושרירים מהשוקה והפיבולה באמצעות אזמל סטרילי כדי להקל על שטיפה מאוחרת יותר (איור 2C).
  9. החזר את העצמות המעובדות ל-PBS המכיל 2% פניצילין/סטרפטומיצין והעביר אותן למכסה המנוע הסטרילי לשלבי הבידוד הבאים.

3. טיהור ותרבות של BMSCs עכברים

  1. הכן מדיום שלם של MEM Alpha Modification (αMEM) לתרבית BMSC על ידי השלמת αMEM עם 10% סרום בקר עוברי ו-1% פניצילין/סטרפטומיצין.
    הערה: בחר במדיום αMEM מכיוון שהוא מכיל 1000 מ"ג/ליטר גלוקוז, שהוא ריכוז נמוך יחסית. זה עוזר למנוע עיכוב של התפשטות תאים שיכולה להתרחש בסביבות עם גלוקוז גבוה9
  2. קח מזרק של 50 מ"ל והצמד את המחט שמגיעה עם המזרק.
  3. משוך 20 מ"ל של מדיום αMEM למזרק 50 מ"ל, ולאחר מכן החלף את המחט בזו שמגיעה עם מזרק 1 מ"ל.
    הערה: השתמש במחט מזרק של 1 מ"ל כדי להתאים לגודל העצם ולמזער את הנזק לתאים. מזרק של 50 מ"ל מאפשר שטיפה יעילה של מח העצם עם סיכון מופחת לזיהום תאים כתוצאה מהחדרות חוזרות ונשנות.
  4. השתמש במספריים כדי לחתוך את שני קצוות עצם הירך או השוקה המופרדים במכסה מנוע סטרילי.
  5. הכניסו את המחט לתוך העצם לאורך הקצה החתוך ושטפו את מח העצם לתוך צלחת תרבית של 100 מ"מ המכילה מדיום αMEM שלם (איור 2D).
  6. שטפו את חללי העצם שוב ושוב עד שחלקי העצם נראים חיוורים כדי להבטיח שרוב מח העצם חולץ (איור 2E).
  7. פיפטה למעלה ולמטה 40 פעמים בעדינות עם קצה פיפטה כדי לפזר את התאים המצטברים ככל האפשר.
  8. סנן את תרחיף התאים דרך מסננת תאים של 40 מיקרומטר לתוך צינור צנטריפוגה של 50 מ"ל כדי להסיר פסולת, שברי רקמות וגושים לא מפוזרים.
  9. העבירו את תרחיף התאים המסונן לתבנית תרבית תאים של 100 מ"מ והוסיפו מדיום αMEM שלם לנפח סופי של 15 מ"ל למנה.
    הערה: תרבית את כל תאי מח העצם שנאספו מעצם הירך והשוק של כל עכבר בצלחת תרבית אחת של 100 מ"מ כדי להקל על צמיחת התאים. בהתבסס על ניסויים קודמים, ניתן לבודד כ-1 ×-10-7 BMC מעכבר בן 8 שבועות (משתי עצם הירך ושתי טיביות). תאים אלה נזרעים לתוך צלחת תרבית של 100 מ"מ בצפיפות של 1.8 × 105 תאים/סמ"ר לתרבית ראשונית.
  10. החזיקו את המנה בשתי ידיים וסובבו אותה בעדינות בתנועת דמות שמונה 15 פעמים כדי להבטיח פיזור אחיד של תאים על פני הצלחת.
  11. מניחים את צלחת התרבות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחממה של 5% CO2 ובתרבית למשך 5 ימים (איור 3A).
    הערה: הימנע מהזזת צלחת התרבית בתקופה זו כדי להבטיח צמיחת תאים אחידה.

4. החלפת מדיום αMEM לתרבית BMSC

  1. התבונן בתאים תחת מיקרוסקופ כדי לקבוע אם הם הגיעו למפגש של 80%. אם לא, המשך עם ההחלפה הבינונית ביוםהחמישי .
  2. צייר 3 מ"ל PBS עם פיפטה פסטר סטרילית והוציא אותה מגובה של 1 ס"מ מעל צלחת התרבות במיקומים שונים.
    הערה: הימנע מחלוקת נוזלים בצד אחד של המנה, מכיוון שהדבר עלול להסיר תאים דבקים עקב כוח פגיעה מוגזם ולמנוע הסרה יעילה של תאים לא רצויים.
  3. לאחר הוספת 3 מ"ל PBS, יש לנער בעדינות את צלחת התרבות כדי לשטוף היטב את התאים, ולהוציא PBS מהכלי בעזרת פיפטה. חזור על תהליך הכביסה פעם נוספת כדי להבטיח שהתאים נשטפים היטב.
  4. צייר 15 מ"ל של מדיום αMEM שלם עם פיפטה פסטר סטרילית והוציא אותו מגובה 1 ס"מ מעל צלחת התרבות במיקומים שונים.
  5. החזירו את צלחת התרבית לאינקובטור וניטרו עד שהתאים יגיעו למפגש של 80% לפני תת-התרבות (איור 3B).

5. מעבר BMSCs

  1. שטפו 80% מהתאים המתכנסים פעמיים עם PBS (איור 3C).
    הערה: שטיפת התאים עם PBS לפני העיכול מסייעת בהסרת שאריות תווך והפרשות תאים ומפחיתה את הידבקות MSC לצלחת התרבית.
  2. עכל את התאים עם 1 מ"ל של 0.25% טריפסין-EDTA על ידי דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחממה של 5% CO2 למשך 2-3 דקות.
  3. נטרל את הטריפסין על ידי הוספת 4 מ"ל של מדיום αMEM שלם לתרחיף התא.
  4. שאפו את תרחיף התאים מצלחת התרבות באמצעות קצה פיפטה של 1 מ"ל, ושטפו בעדינות את תחתית הכלי כדי לנתק את כל התאים הדבקים.
  5. העבירו את תרחיף התאים לצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל וצנטריפוגה בטמפרטורה של 300 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  6. השתמש בפיפטה כדי להשליך את הסופרנטנט ולהשעות מחדש את כדור התא ב-2 מ"ל של מדיום αMEM שלם.
    הערה: עבור תת-תרבית, צפיפות זריעה של כ-4 ×-104 תאים/סמ"ר נמצאה אופטימלית להמשך צמיחה והתפשטות.
  7. פצלו את התאים ביחס של 1:1-1:2 לצלחות תרבית תאים חדשות של 100 מ"מ (זה מהווה את המעברהראשון , P1) (איור 3D).
  8. פצלו את התאים בערך כל שלושה ימים ביחס של 1:1.5 כאשר הם מגיעים למפגש של 80% כדי ליצור את המעבר השני (P2) (איור 3E) ואת המעבר השלישי (P3) (איור 3F) של BMSCs.

6. הכנת BMSCs P3 לזיהוי פנוטיפי והתמיינות אוסטאוגנית

  1. השלך את מדיום תרבית התאים.
  2. שטפו את ה-P3 BMSCs עם 3 מ"ל PBS פעמיים.
  3. עכל את ה-BMSCs P3 עם 1 מ"ל של 0.25% טריפסין-EDTA על ידי דגירה ב-37 מעלות צלזיוס באינקובטור של 5% CO2 למשך 2-3 דקות כאשר הם מגיעים למפגש של 80%.
  4. נטרל את הטריפסין על ידי הוספת 4 מ"ל של מדיום αMEM שלם לתרחיף התא.
  5. העבירו את תרחיף התא לצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל, צנטריפוגה בטמפרטורה של 300 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, והשליכו את הסופרנטנט.
    הערה: כדורי ה-P3 BMSC שהוכנו כאן ישמשו לזיהוי פנוטיפי באמצעות זרימה ציטומטרית ולהערכת התמיינות אוסטאוגנית או אדיפוגנית.

7. זיהוי פנוטיפי של BMSCs על ידי ציטומטר זרימה

  1. השעו מחדש את כדורי התא של P3 BMSCs עם 1.5 מ"ל של תמיסת PBS המכילה 2% FBS והתאימו את הריכוז ל-5 ×-106 תאים/מ"ל.
  2. השתמש ב-100 מיקרוליטר של תרחיף התאים לכל אחד מ-11 הצינורות כדי להשיג 5 ×-105 תאים לכל צינור. הכן את הקבוצות הבאות: תווית ריקה, בקרת איזוטיפ CD29, CD29, בקרת איזוטיפ CD44, CD44, בקרת איזוטיפ Sca-1, Sca-1, בקרת איזוטיפ CD31, CD31, בקרת איזוטיפ CD45 ו-CD45.
    הערה: במחקר הנוכחי נעשה שימוש בפלואורוכרומים הבאים: CD29-FITC, CD29 isotype-FITC, CD44-APC, CD44 isotype-APC, Sca-1-PECy7, Sca-1 isotype-PECy7, CD45-PerCPcy5.5, CD45 isotype-PerCPcy5.5, CD31-PE ו-CD31 isotype-PE (כפי שמוצג בטבלת החומרים). ניתן לשנות פלואורוכרומים אלה על סמך התצורות של ציטומטרים זרימה שונים.
  3. עבור כל קבוצה, הוסף את הריאגנטים הבאים: 2 מיקרוליטר של PBS לקבוצה הריקה של התווית, 2 מיקרוליטר של איזוטיפ CD29 לקבוצת הבקרה של איזוטיפ CD29 (דילול 1:50), 2 מיקרוליטר של CD29 לקבוצת CD29 (דילול 1:50), 0.5 מיקרוליטר של איזוטיפ CD44 לקבוצת הבקרה של איזוטיפ CD44 (דילול 1:200), 0.5 מיקרוליטר של CD44 לקבוצת CD44 (דילול 1:200), 0.5 מיקרוליטר של איזוטיפ Sca-1 לקבוצת הבקרה של איזוטיפ Sca-1 (דילול של 1:200), 0.5 מיקרוליטר של Sca-1 לקבוצת Sca-1 (דילול של 1:200), 2 מיקרוליטר של איזוטיפ CD31 לקבוצת הבקרה של איזוטיפ CD31 (דילול של 1:50), 2 מיקרוליטר של CD31 לקבוצת CD31 (דילול של 1:50), 2 מיקרוליטר של איזוטיפ CD45 לקבוצת הבקרה של איזוטיפ CD45 (דילול של 1:50), ו-2 מיקרוליטר של CD45 לקבוצת CD45 (דילול של 1:50).
    הערה: נעשה שימוש בנוגדנים בהתאם להמלצות היצרן האופטימליות לזרימה ציטומטרית. ניסויים ראשוניים אישרו צביעה אופטימלית וסגוליות לתאי מטרה. עיין בהנחיות המינון של היצרן ובצע בדיקות מוקדמות של טיטר לפי הצורך.
  4. מערבבים בעדינות צנטריפוגה בעזרת צנטריפוגת דקלים, ודוגרים במשך 30 דקות בחום של 4 מעלות צלזיוס בחושך.
  5. מוסיפים 900 מיקרוליטר PBS לכל צינור, מערבבים על ידי היפוך, וצנטריפוגה ב-300 × גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. יש להשליך את הסופרנטנט כדי להסיר עודפי נוגדנים.
  6. השעו מחדש את גלולת התא בכל צינור עם 300 מיקרוליטר PBS ונתחו באמצעות ציטומטר זרימה.
    הערה: אין צורך לתקן תאים עם פורמלדהיד ניטרלי של 2.5% אם ניתן להשלים את בדיקת ציטומטר הזרימה תוך 1-2 שעות. אם לא ניתן לבצע ניתוח תוך 1-2 שעות, תקן תאים עם פורמלין חוצץ ניטרלי של 2.5% (מוכן על ידי ערבוב של 10% פורמלין ניטרלי עם PBS ביחס של 1:3) ואחסן ב-4 מעלות צלזיוס בחושך למשך הלילה לבדיקת ציטומטר זרימה מאוחרת יותר.
  7. כוונן את מתח ציטומטר הזרימה באמצעות הקבוצה הריקה של התווית כדי להבטיח שהאוטו-פלואורסצנציה של התא נמצאת בטווח של כ-1/4-1/3 מציר הקואורדינטות. טען ברצף את התאים מאיזוטיפ CD29, CD29, איזוטיפ CD44, CD44, איזוטיפ Sca-1, Sca-1, איזוטיפ CD31, CD31, איזוטיפ CD45 וקבוצות CD45. הגדר את שער P1 (כפי שהוגדר בתרשים FSC/SSC) ללכוד 10,000 תאים, הפועלים במהירות בינונית.
    הערה: ודא שציטומטר הזרימה מצויד בערוצים המתאימים, כגון אלה הנפוצים בניסויים: FITC, PE, PerCp-Cy5.5, PE-Cy7 ו-APC, או ערוצים אחרים התואמים לפלואורסצינים מצומדים לנוגדנים.

8. התמיינות אוסטאוגנית של BMSCs

  1. השעו מחדש כדורי P3 BMSC במדיום αMEM שלם, והתאימו את הריכוז ל-1 ×-105 תאים/מ"ל.
  2. זרע BMSCs P3 לתוך צלחת תרבית תאים של 24 בארות על ידי הוספת 1 מ"ל של מדיום αMEM שלם המכיל 1 × 105 תאים לכל באר.
  3. תרבית את ה-BMSCs P3 ב-37 מעלות צלזיוס באינקובטור של 5% CO2 למשך 3-5 ימים עד שהם מגיעים למעל 90% מפגש. החלף את מדיום ה-αMEM השלם במדיום טרי כל יומיים.
  4. חלקו את הבארות השונות באופן שווה לשתי קבוצות: קבוצת הביקורת השלילית (ללא אינדוקציה של התמיינות אוסטאוגנית) וקבוצת ההתמיינות האוסטיאוגנית
  5. הכן את מדיום האינדוקציה להתמיינות אוסטאוגנית על ידי השלמת מדיום ה-αMEM השלם עם 10 מילימול/ליטר β-גליצרופוספט, 50 מ"ג/ליטר חומצה L-אסקורבית ו-10-8 מול/ליטר דקסמתזון.
  6. השליכו את מדיום תרבית התאים ושטפו את ה-P3 BMSCs עם 1 מ"ל PBS.
  7. הוסף את מדיום האינדוקציה של ההתמיינות האוסטיאוגנית לבארות של קבוצת ההתמיינות האוסטיאוגנית לאינדוקציה של התמיינות אוסטאוגנית (1 מ"ל/באר).
  8. הוסף את מדיום ה-αMEM השלם לבארות של קבוצת הביקורת (1 מ"ל/באר).
  9. תרבית את ה-BMSCs P3 ב-37 מעלות צלזיוס בחממה של 5% CO2 למשך 7 או 21 ימים, והחלפת מדיום האינדוקציה של ההתמיינות האוסטיאוגנית או מדיום ה-αMEM השלם באותו מדיום טרי כל 3 ימים.
    הערה: תאים עם אינדוקציה של 7 ימים משמשים לצביעה של פוספטאז אלקליין (ALP). תאים עם אינדוקציה של 21 יום משמשים לבדיקת S אדום אליזרין.

9. זיהוי תאים אוסטאוגניים ממוינים עם צביעת ALP

  1. שוטפים את התאים בכל באר של צלחת 24 הבארות עם 1 מ"ל PBS פעם אחת.
  2. תקן את התאים על ידי הוספת 0.5 מ"ל של תמיסת פורמלין 10% חוצץ ודגירה למשך 20 דקות.
  3. שוטפים את התאים בכל באר שוב עם 1 מ"ל PBS פעם אחת.
  4. הוסף 0.5 מ"ל של מגיב צביעת פוספטאז אלקליין 1-שלב NBT/BCIP לכל באר, ודגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות עם עטיפת נייר אלומיניום להגנה מפני אור.
  5. השליכו את התמיסה, שטפו את התאים בכל באר עם 1 מ"ל מים מזוקקים פעם אחת, והניחו לצלחת להתייבש.
  6. התבונן ורכוש תמונות של מושבות מוכתמות באמצעות מצלמה כדי לזהות תאים חיוביים ל-ALP עם משקעים שחורים-סגולים.
    הערה: ריאגנט הצביעה האלקליין פוספטאז (ALP) 1-שלב NBT/BCIP מייצר משקע שחור-סגול חזק ובלתי מסיס בתגובה עם ALP, אותו ניתן לדמיין בקלות.

10. זיהוי תאים אוסטאוגניים מובחנים על ידי בדיקת S אדומה אליזרין

  1. שוטפים את התאים בכל באר של צלחת 24 הבארות עם 1 מ"ל PBS פעם אחת.
  2. תקן את התאים על ידי הוספת 0.5 מ"ל של תמיסת פורמלין 10% חוצץ ודגירה למשך 20 דקות.
  3. שוטפים את התאים בכל באר של צלחת 24 הבארות עם 1 מ"ל PBS פעם אחת.
  4. הוסף 0.5 מ"ל של 0.1% אליזרין אדום S ב-0.1 מול/ליטר Tris-HCl (pH 8.3) לכל באר, ודגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30-60 דקות.
  5. השליכו את התמיסה, שטפו את התאים בכל באר עם 1 מ"ל מים מזוקקים פעם אחת, והניחו לצלחת להתייבש.
  6. התבונן ורכוש תמונות של מושבות מוכתמות באמצעות מצלמה לזיהוי תאים חיוביים ל-S אדומים של אליזרין.
    הערה: בדיקת ה-S האדומה של אליזרין להתמיינות MSC לתאי עצם מינרליים בוגרים מביאה להיווצרות קומפלקס S-סידן אדום אליזרין, המייצר כתם אדום בוהק שניתן לצפות בו חזותית.

11. הכנת מדיית התמיינות אינדוקציה אדיפוגנית A עבור BMSCs

הערה: עבור התמיינות אדיפוציטים של BMSCs, ערכת התמיינות אדיפוציטית של תאי גזע מזנכימליים של מח עצם עכבר (ראה טבלת חומרים) משמשת לעתים קרובות על פי ההנחיות.

  1. מניחים את סרום הבקר העוברי (מרכיב בערכה, המכונה סרום) במקרר של 4 מעלות צלזיוס למשך 6 שעות לפחות לפני ההפשרה המלאה.
  2. יש להניח את תוסף A-I (רכיב הערכה) במקרר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס לפחות 30 דקות לפני ההכנה; יש להניח את תוסף A-II (רכיב הערכה) בטמפרטורת החדר עד להפשרה מלאה.
  3. הפוך או הקש בעדינות על צינור המגיב כדי לערבב את התוכן.
  4. צנטריפוגה את צינור המגיב של Supplement A-II ב-300 × גרם למשך 30 שניות בטמפרטורת החדר כדי להבטיח שהמגיב נאסף בתחתית לשליפה קלה.
  5. נקו היטב את האריזה החיצונית של כל הרכיבים עם 75% אלכוהול רפואי ופתחו אותם בארון בטיחות ביולוגית.
  6. הוסף סרום, תוספת A-I ותוספת A-II למדיום.
    הערה: כדי להבטיח פירוק תקין, יש לחמם מראש את המדיום הבסיסי (רכיב בערכה) ל-37 מעלות צלזיוס, אחרת תוספת A-II עלולה לשקע עקב חשיפה לקור.
  7. השתמש בכמות קטנה של מדיום בזאלי כדי לשטוף כל בקבוק ושפופרת, והקפד להעביר את כל הרכיבים למדיום הבסיסי.
  8. יש להדק את הפקק על בקבוק Basal Medium ולנער בעדינות כדי לערבב היטב.
  9. אוטמים את הבקבוק בניילון פרפין, עוטפים אותו בנייר אלומיניום ומסמנים אותו עם השם, תאריך ההכנה ופרטים נוספים.

12. הכנת מדיה התמיינות אינדוקציה אדיפוגנית B עבור BMSCs

  1. הכניסו את סרום הבקר העוברי למקרר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 6 שעות לפחות לפני ההפשרה המלאה.
  2. הכניסו את תוסף B (מרכיב של הערכה) למקרר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד להפשרה מלאה במשך 30 דקות לפחות לפני ההכנה.
  3. הפוך או הקש בעדינות על צינור המגיב כדי לערבב את התוכן.
  4. צנטריפוגה בצינור התוסף B כדי לרכז את המגיב בתחתית לאיסוף קל יותר.
  5. נקו היטב את האריזה החיצונית של כל הרכיבים עם 75% אלכוהול רפואי ופתחו אותם בארון בטיחות ביולוגית.
  6. יש להוסיף סרום ותוסף B למדיום הבסיסי.
  7. השתמש בחלק קטן של המדיום הבסיסי כדי לשטוף כל בקבוק וצינור, וודא שכל הרכיבים מועברים במלואם למדיום.
  8. יש להדק את הפקק על בקבוק Basal Medium ולנער בעדינות כדי לערבב היטב.
  9. אוטמים את הבקבוק עם פרפילם, עוטפים אותו בנייר אלומיניום ומסמנים אותו עם השם, תאריך ההכנה ופרטים נוספים.

13. בידול אדיפוציטים של BMSCs

  1. מוסיפים 1 מ"ל של 0.1% ג'לטין לצלחת של שש בארות, מנערים אותה לציפוי אחיד של תחתית כל באר.
  2. מניחים את צלחת שש הבארות המצופה בג'לטין 0.1% במכסה מנוע סטרילי או בחממת CO2 למשך 30 דקות לפחות.
  3. שאפו את הג'לטין, והצלחת מוכנה לזריעת תאים, או המתינו לייבוש הבארות לפני הזריעה לאחר 30 דקות.
  4. זרע את ה-P3 BMSCs בצפיפות של 4 ×10 4 תאים/ס"מ2 בכל באר של צלחת שש הבארות, והוסף 2 מ"ל של מדיום שלם לכל באר.
  5. דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחממת CO2 עם 5% CO2 ולחות רוויה.
  6. שאפו את המדיום בזהירות והוסיפו 2 מ"ל של מדיום אינדוקציה התמיינות אדיפוגנית A לכל באר כאשר התאים מגיעים למפגש של 100%.
  7. שאפו מדיום A מהבארות לאחר 3 ימי אינדוקציה, והוסיפו 2 מ"ל של מדיום התמיינות אדיפוגני B.
  8. שאפו את מדיום B לאחר יום אחד, וחזרו לבינוני A לאינדוקציה נוספת.
  9. לסירוגין בין מדיום A ל-B, ולהתבונן בתאים מדי יום. אם התכווצות תאים או מוות מתרחשים במהלך האינדוקציה עם מדיום A, עבור מיד לבינוני B.
  10. חזור על תהליך האינדוקציה והתחזוקה עד להופעת מספר מספיק של טיפות שומן בגודל מתאים, ולאחר מכן התכוננו לצביעה.

14. מכתים אדום שמן O (ORO)

הערה: בצע את כל ההליכים בעדינות ככל האפשר כדי למנוע ניתוק של טיפות השומנים.

  1. שאפו את מדיום התמיינות האינדוקציה האדיפוגנית מצלחת 6 הבארות לאחר השלמת התמיינות האינדוקציה האדיפוגנית ושטפו בעדינות עם 1×PBS 2-3 פעמים.
  2. הוסף 2 מ"ל של פורמלין ניטרלי 10% חוצץ לכל באר, וקבע למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
  3. הכן את תמיסת העבודה Oil Red O על ידי ערבוב מלאי Oil Red O עם מים מזוקקים ביחס של 3:2. לאחר הערבוב, צנטריפוגה בחום של 250 × גרם למשך 4 דקות והשתמש בסופרנטנט.
  4. שאפו את הקיבוע ושטפו בעדינות עם PBS 2-3 פעמים, תוך הקפדה על הסרה יסודית של הקיבוע.
  5. הוסף 0.8 מ"ל תמיסת כתם O אדום לכל באר, השאיר בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
  6. שאפו את תמיסת הכתמים, שטפו פעמיים עם 1 מ"ל 75% אתנול.
  7. הוסף 1 מ"ל של כתם נגד המטוקסילין לכל באר למשך 2 דקות, ולאחר מכן שאוף.
  8. הוסף 2 מ"ל PBS לכל באר וצפה בתוצאות הצביעה האדיפוגנית במיקרוסקופ.
  9. אוטמים את צלחת שש הבארות המוכתמת עם פרפילם ומאחסנים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
    הערה: אין לאחסן יותר משבוע. טיפות השומנים עלולות להתמזג ולאבד את מצב הצביעה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

BMSCs שמקורם בעכבר בודדו ותרבו במשך כשבועיים כדי ליצור את המעבר השלישי (P3) BMSCs (איור 3). כפי שמוצג באיור 3A, תאים שזה עתה חולצו ממח העצם נשארו חד-גרעיניים עם טיפות שומן גלויות. תאים בצורת ציר הופיעו בצלחת התרבית, והגיעו למפגש של 60%-80% ביום התרביתהחמישי (איור 3B,C). מה-P1-P3 (איור 3D-F), ה-BMSCs הציגו ציר ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טיפול בתאי גזע זכה לעניין רב בשל הפוטנציאל שלו לחולל מהפכה ברפואה הרגנרטיבית. מחקרים פרה-קליניים סיפקו ראיות משמעותיות התומכות ביישום הקליני של תאי גזע, במיוחד BMSCs13. עם זאת, אתגרים כמו תפוקת תאים נמוכה, זיהום וצמיחה איטית עיכבו את היישום הקליני שלהם. לכן, יש צורך דחוף במחקר המתמקד בסטנדרטיזציה של תהליכי הכנת BMSC כדי לשפר את תפוקת התאים והפונקציונליות, ובכך להרחיב את השימוש הקליני בהם2.

שיטה זו מציגה מספר יתרו...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים ביחס למחקר זה.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מתוכנית המו"פ הלאומית של סין (2020YFE0201600) והקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (82174408 ו-82374477).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
מזרק 1 מ"ל (מחט מזרק 22 גרם)קבוצה חביבה (KDL)60017031
שלב אחד NBT/BCIP פירס ביוטכנולוגיה בע"מ34042צביעת פוספטאז אלקליין
10% פורמלין ניטרלי חומציוקסיס5200250קיבוע תאים
צלחת 6 בארותמעבדה11110תרבית תאים
צלחת 24 בארותמעבדה11310תרבית תאים
40 μ מסננת תאים mקורניג352340סינון להסרת אגרומרטים
מזרק 50 מ"לקבוצה חביבה (KDL)60017040
75% אתנול שנחאי NianYue ביוטכנולוגיה ושות', בע"מ31009001חיטוי עור העכברים
אליזרין אדום Sסיגמא-אולדריץ' א5533איתור מרבצי סידן וגושים מסויידים
נוגדן חד שבטי APC CD44 (שיבוט: IM7)מדע אלקטרוני17-0441-82ציטומטריית זרימה 
APC עכברוש IgG2b עם בקרת איזוטיפ (שיבוט: eB149/10H5)מדע אלקטרוני17-4031-82ציטומטריית זרימה 
אוטוקלאבחברת היריאמה היפניתHVE-50מכשירים כירורגיים לעיקור
אינקובטור CO2תרמו פישר טכנולוגיה (סין) ושות', בע"מ300583057תרבית תאים
זרימה ציטופלקסבקמן קולטר א00-1-1102ציטומטריית זרימה 
דקסמתזוןסיגמא-אולדריץ' D4902התמיינות אוסטאוגנית של BMSCs
צלחת (100 מ"מ)קורנינג430167תרבית תאים
צלחת (60 מ"מ)קורנינג430166הרגעה לדוגמא במהלך ההשתלה 
כדורי צמר גפן מחטאיםשנחאי Honglong תעשייתי ושות', בע"מ20230627חיטוי עור העכברים
כפפות סטריליות חד פעמיותשנחאי Honglong תעשייתי ושות', בע"מYT21131פעולה סטרילית
דיאטת מכרסמים מוקרנים של אריה כפולSuzhou Shuangshi ניסיוני הזנת בעלי חיים טכנולוגיה ושות', בע"מג'יגה-בייט 14924.3מזון לבעלי חיים
סרום בקר עוברי שנחאי ביוסון מדע & טק ושות', בע"מBS-0002-500תרבית תאים
FITC אוגר נגד חולדות CD29 (שיבוט: Ha2/5)BD Biosciences555003ציטומטריית זרימה 
FITC אוגר IgM, λ 1 בקרת איזוטיפ (שיבוט: G235-1)BD Biosciences553960ציטומטריית זרימה 
ג'לטין (0.1%)אורי סלGLT-11301לשפר את יכולת ההדבקה של התאים
IVCs כלוב עכבריםSuzhou Monkey King ציוד ניסיוני לבעלי חיים טכנולוגיה ושות', בע"מHH-MMB-2מחסום בעלי חיים
חומצה L-אסקורביתסיגמא-אולדריץ' א8960התמיינות אוסטאוגנית של BMSCs
עט סימוןזברה סחר (שנזן) ושות', בע"מ YYST5סמן את המידע הסלולרי על צלחת הפטרי
שינוי MEM אלפא (1X)שנחאי NianYue ביוטכנולוגיה ושות', בע"מSH30265תרבית תאים
מח עצם עכבר תאי גזע מזנכימליים ערכת התמיינות אדיפוגניתצרפתMUXMX-90031BMSCs התמיינות אדיפוגנית 
Nikon Eclipse Ti2 מיקרוסקופ הפוך Synstemיפן Nikon CorporatinTi2-Uהתבונן בתאים וצלם תמונות
מספריים לעיניים שנחאי NianYue ביוטכנולוגיה ושות', בע"מY00030 JZחותכים את העור
פינצטה לעינייםשנחאי NianYue ביוטכנולוגיה ושות', בע"מBS-ZER-S-100 ביושארפהשג רקמת עצם עכבר.
פסטר פיפטהשנחאי NianYue ביוטכנולוגיה ושות', בע"מBS-XG-03Mשאפו את המדיום התרבותי
PE Rat נגד עכבר CD31 (שיבוט: Ha2/5)BD Biosciences553373ציטומטריית זרימה 
PE עכברוש IgG2a, κ בקרת איזוטיפ (שיבוט: R35-95)BD Biosciences553930ציטומטריית זרימה 
PE-Cyanine7 Ly-6A/E (Sca-1) נוגדן חד-שבטי (שיבוט: D7)מדע אלקטרוני25-5981-82ציטומטריית זרימה 
PE-Cyanine7 חולדה IgG2a ובקרת איזוטיפ (שיבוט: eBR2a)מדע אלקטרוני25-4321-82ציטומטריית זרימה 
פניצילין-סטרפטומיציןשנחאי NianYue ביוטכנולוגיה ושות', בע"מ2585636תרבית תאים
PerCP-CY5.5 נגד עכבר חולדה CD45 (שיבוט: Ha2/5)BD Biosciences561869ציטומטריית זרימה 
PerCP-Cy5.5 חולדה IgG2b, κ בקרת איזוטיפ (שיבוט: A95-1)BD Biosciences550764ציטומטריית זרימה 
אזמלמפעל מכשירים כירורגיים oמכשירים רפואיים בשנחאי? קבוצה ושות' בע"מ J11010-10# JZבודד את הגפיים האחוריות והגו של העכבר, והסר רקמות זרות מהעצם
מכסה מנוע סטריליתרמו פישר טכנולוגיה (סין) ושות', בע"מECO0.9שולחן ניתוחים כירורגי
וילונות כירורגיים סטרילייםהנאן Huayu ציוד רפואי ושות', בע"מ20160900לספק אזור ניתוח סטרילי
צינור (50 מ"ל)שנחאי Baisai, ביוטכנולוגיה ושות', בע"מ BLD-BL2002500אחסן את תמיסת התאים המסוננים
טריפסין-EDTA (0.25%)ג'יבקו25200056לעכל תאים דבקים
&בטא;-גליצרופוספטסיגמא-אולדריץ' G5422התמיינות אוסטאוגנית של BMSCs

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chu, D. -T., et al. An update on the progress of isolation, culture, storage, and clinical application of human bone marrow mesenchymal stem/stromal cells. Int J Mol Sci. 21 (3), 708(2020).
  2. Huang, S., et al. An improved protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse bone marrow. J Orthop Transl. 3 (1), 26-33 (2015).
  3. Li, M., et al. Extracellular vesicles from apoptotic BMSCs ameliorate osteoporosis via transporting regenerative signals. Theranostics. 14 (9), 3583-3602 (2024).
  4. Maridas, D. E., Rendina-Ruedy, E., Le, P. T., Rosen, C. J. Isolation, culture, and differentiation of bone marrow stromal cells and osteoclast progenitors from mice. J Vis Exp. (131), e56750(2018).
  5. Chu, D. -T., et al. Adipose tissue stem cells for therapy: An update on the progress of isolation, culture, storage, and clinical application. J Clin Med. 8 (7), 917(2019).
  6. Qin, L., et al. Mesenchymal stem cells in fibrotic diseases—the two sides of the same coin. Acta Pharmacol Sin. 44 (2), 268-287 (2023).
  7. Carbone, L., et al. Assessing cervical dislocation as a humane euthanasia method in mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 51 (3), 352-356 (2012).
  8. Swamydas, M., Lionakis, M. S. Isolation, purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments. J Vis Exp. (77), e50586(2013).
  9. Grossner, T., Haberkorn, U., Hofmann, J., Gotterbarm, T. Effects of different basal cell culture media upon the osteogenic response of hMSCs evaluated by 99mTc-HDP labeling. Int J Mol Sci. 23 (11), 6288(2022).
  10. Janda, C. Y., et al. Surrogate Wnt agonists that phenocopy canonical Wnt and β-catenin signalling. Nature. 545 (7653), 234-237 (2017).
  11. Bernar, A., Gebetsberger, J. V., Bauer, M., Streif, W., Schirmer, M. Optimization of the Alizarin Red S assay by enhancing mineralization of osteoblasts. Int J Mol Sci. 24 (1), 723(2022).
  12. Wang, C., et al. Restoration of osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells in mice inhibited by cyclophosphamide with psoralen. Chin J Tissue Eng Res. 29 (1), 16-23 (2025).
  13. Papaccio, F., et al. Concise review: Cancer cells, cancer stem cells, and mesenchymal stem cells: Influence in cancer development. Stem Cells Transl Med. 6 (12), 2115-2125 (2017).
  14. Kolf, C. M., Cho, E., Tuan, R. S. Mesenchymal stromal cells. Biology of adult mesenchymal stem cells: Regulation of niche, self-renewal and differentiation. Arthritis Res Ther. 9 (1), 204(2007).
  15. Soleimani, M., Nadri, S. A protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse bone marrow. Nat Protoc. 4 (1), 102-106 (2009).
  16. Abdallah, B. M., et al. A simple and reliable protocol for long-term culture of murine bone marrow stromal (mesenchymal) stem cells that retained their in vitro and in vivo stemness in long-term culture. Biol Proced Online. 21 (1), 3(2019).
  17. Liu, S., et al. Single cell sequencing reveals gene expression signatures associated with bone marrow stromal cell subpopulations and time in culture. J Transl Med. 17 (1), 23(2019).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Bone Marrow Mesenchymal Stem CellsMesenchymal Stem CellsFlow CytometryCell PurificationCell ExpansionMouse Bone MarrowCell PhenotypingCD29 MarkerCD44 MarkerSca 1 Marker

Related Articles