מאמר שיטה

דיסוציאציה בתפוקה גבוהה והשתלה אורתוטופית של קסנוגרפים שמקורם בסרטן השד

1.6K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/67607

⸱

20 בדצמבר 2024

 ,  ,  , 
1Division of Exercise Physiology, Department of Health Professions, West Virginia University School of Medicine, 2Cancer Institute, West Virginia University School of Medicine, 33Department of Microbiology, Immunology, and Cell Biology, West Virginia University School of Medicine

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר שיטה יעילה ולא כירורגית להשתלה אורתוטופית של קסנוגרפים שמקורם בחולה סרטן השד בעכברים. הטכניקה כוללת דיסוציאציה אנזימטית של הגידול ואחריה הזרקה ישירה לרפידות השומן של החלב, מה שמאפשר השתלה בתפוקה גבוהה. אימות מקיף מבטיח נאמנות למודל, ומאפשר מחקרים קפדניים על פני תת-סוגים שונים של סרטן השד.

תקציר

קסנוגרפים שמקורם בחולה (PDXs) מספקים שיטה רלוונטית מבחינה קלינית לסיכום סוגי תאים המעורבים בגידול ומיקרו-סביבת הגידול, החיונית לקידום הידע על סרטן השד (BC). בנוסף, מודלים של PDX מאפשרים לחקור את ההשפעות המערכתיות של BC, דבר שאינו אפשרי בשימוש במודלים במבחנה. שיטות מסורתיות להשתלת xenografts BC כוללות בדרך כלל הרדמה והליכים כירורגיים סטריליים, שגוזלים זמן, פולשניים ומגבילים את יכולת ההרחבה של דגמי PDX במחקר BC. פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה וניתנת להרחבה להשתלה אורתוטופית של BC PDX בעכברים. זן העכברים חסר החיסון NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) שימש להשתלת PDX. דגימות BC אנושיות שהתקבלו מחולים בהסכמת IRB פורקו מכנית ואנזימטית, ולאחר מכן הושעו מחדש בתמיסה של תמצית קרום הבסיס (BME) ו-RPMI 1640. בעלי חיים היו מרוסנים על ידי קשקוש, וקרם הסרת שיער נמרח כדי להסיר שיער מכריות השומן בפטמה המפשעתית הרביעית, ולאחר מכן הזרקה. כ-2 מיליון תאים בתרחיף של 100 מיקרוליטר הוזרקו באופן אורתוטופי לתוך רפידות השומן החלביות באמצעות מחט 26 גרם. יש לציין כי לא היה צורך בהרדמה, וזמן ההליך הכולל היה פחות מ-5 דקות, מהכנת התא ועד להזרקה. לאחר תקופת גידול של מספר חודשים, הגידולים נכרתו ועובדו לצורך אימות. האימות כלל הערכת מצב הקולטן באמצעות אימונוהיסטוכימיה עם נוגדנים ספציפיים לקולטני BC מסורתיים (כלומר, ER, PR, HER2). מורפולוגיה של הגידול אושרה עם צביעת המטוקסילין ואאוזין (H&E), שפורשה על ידי פתולוג. הדמיון הגנטי לדגימת המטופל אומת באמצעות ריצוף RNA בתפזורת וניתוח חוזר טנדם קצר (STR). גישה זו להשתלה ואימות PDX תומכת בפיתוח קפדני של מודלים והשתלת גידול בתפוקה גבוהה, ומאפשרת מחקרים בעלי עוצמה טובה על פני תת-סוגים שונים של BC.

מבוא

סרטן השד (BC) מאובחן אצל למעלה מ-2 מיליון נשים ברחבי העולם מדי שנה1. על מנת לקדם את ההבנה הביולוגית הבסיסית של BC ולתרגם בהצלחה טיפולים חדשים לטיפולים מאושרים, יש צורך במודלים פרה-קליניים של בעלי חיים השומרים על המאפיינים המגדירים של גידולים חולים. הוכח כי קסנוגרפטים שמקורם בחולה (PDX) מסכמים הטרוגניות של גידול בנאמנות גבוהה כאשר הם מושתלים אורתוטופית, כולל היסטופתולוגיה, ביטוי קולטנים וסטיות גנטיות 2,3,4. חשוב לציין, הם גם שומרים על תאי סטרומה התורמים למיקרו-סביבה של הגידול, כגון כלי דם, תאי חיסון ופיברובלסטים הקשורים לסרטן. אם כי, הם מוחלפים בהדרגה על ידי תאי סטרומה מארחים של עכברים עם מעבר5. PDX מאפשרים גם לחקור סיבוכים מערכתיים הנובעים מגידול גידול, כגון עייפות 6,7, שאינה אפשרית כיום בשימוש במודלים במבחנה.

עם זאת, השתלת BC PDX מוצלחת דורשת זן עכבר חסר חיסון, כאשר הזן הנפוץ ביותר הוא NSG (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ). עכברי NSG נטולי חסינות נרכשת ומציגים חסינות מולדת פגומה מאוד8. השתלת BC PDX הושגה בזנים אחרים חסרי חיסון, כגון SCID/Beige (CB17.Cg-PrkdcscidLystbg-J/Crl), עם שיעורי השתלה דומים4.

שיטות מסורתיות להשתלת BC PDX כוללות השתלה כירורגית של שבר גידול בכרית השומן של החלב9, וגישה זו מובילה לחריטה מוצלחת בשיעורים נוחים. עם זאת, הצורך בהליכים כירורגיים סטריליים ושימוש בהרדמה הופך אותו לזמן רב, ובכך מגביל את מספר העכברים שניתן להשתיל בחלון זמן מסוים. בהתחשב ביתרונות החיזוי הפוטנציאליים של PDX של תגובות תרופתיות בגידולים ושימוש ברפואה מדויקת10, זרימת עבודה פשוטה וניתנת לשחזור להשתלת PDX באופן הומוגני על פני עכברים היא חיונית. מאמר זה מדגים את הדיסוציאציה של גידולי שד אנושיים לתרחיף תא בודד והזרקה אורתוטופית לאחר מכן לרפידות שומן חלב של עכברים חסרי חיסון.

פרוטוקול

פרוטוקול זה עומד בהנחיות שנקבעו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת מערב וירג'יניה (WVU). עכברי NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG), בני 8 שבועות ומעלה ובמשקל של כ-25 גרם, שימשו להזרקת תאי גידול. רקמת גידול סרטן השד נרכשה במכון הסרטן של אוניברסיטת מערב וירג'יניה (מורגנטאון, WV) ועל ידי רשת הרקמות האנושיות השיתופיות של NCI תחת פרוטוקול מועצת הסקירה המוסדית של WVU וועדת הסקירה והניטור של פרוטוקול מכון הסרטן של WVU. הסכמה מדעת בכתב התקבלה מהמטופלים. כל ההליכים נערכו בתנאים אספטיים בתוך ארון בטיחות ביולוגי Class II, בהתאם לפרוטוקולים מתאימים של ציוד מגן אישי (PPE). הפרטים של בעלי החיים, הריאגנטים והציוד ששימשו במחקר זה מסופקים בטבלת החומרים.

1. דיסוציאציה אנזימטית בתפוקה גבוהה של רקמת הגידול

  1. להפשיר ולשלב את האנזימים H, R ו-A מערכת דיסוציאציה של גידול אנושי בצינור C סטרילי. הוסף 200 מיקרוליטר של אנזים H, 100 מיקרוליטר של אנזים R ו-25 מיקרוליטר של אנזים A. הביאו את הנפח הסופי ל~5 מ"ל על ידי הוספת 4.7 מ"ל של מדיום RPMI 1640 סטרילי לצינור C.
    הערה: ניתן להשתמש במדיום הנשר השונה (DMEM) של Dulbecco במקום RPMI 1640.
  2. ניתן לחתוך ולהקפיא שברי גידול כמתואר בפרוטוקולים הקיימים9. מעבירים שברי גידול מופשרים ומדיום הקפאה נלווה למחצית צלחת תרבית סטרילית של 100 מ"מ. בעזרת מלקחיים סטריליים, העבירו את שברי הגידול למיקרו-צינור סטרילי של 5 מ"ל.
    הערה: מחט היפודרמית סטרילית עשויה לשמש כחלופה למלקחיים. ניתן להשתמש בצלחת 35 מ"מ במקום מיקרו-צינור של 5 מ"ל.
  3. שטפו את שברי הגידול עם 1-3 מ"ל של מי מלח סטריליים עם פוספט (PBS, 1x). תפעל את השברים בתמיסה באמצעות מלקחיים כדי להבטיח הסרה יסודית של אמצעי ההקפאה שנותר.
  4. העבירו את השברים השטופים למיקרו-צינור של 2 מ"ל בעזרת מלקחיים. מרחו 1 מ"ל של תמיסת אנטיביוטיקה משולשת (TAB) על שברי הגידול ודגרו למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
    הערה: ניתן לדלג על שלב זה אם תרצה. ניתן לייצר מלאי TAB פי 10 על ידי המסת 1% גנטמיצין, 1% קלינדמיצין ו-0.5% פולימיקסין B סולפט ב-PBS סטרילי 1x. יש לדלל לתמיסת TAB 1x ב-PBS סטרילי 1x.
  5. בעזרת מלקחיים סטריליים, העבירו את השברים המחוטאים למיקרו-צינור חדש של 5 מ"ל. בצע שטיפה שנייה עם 1-3 מ"ל PBS סטרילי. העבירו את השברים השטופים למחצית היבשה של צלחת התרבות 100 מ"מ משלב 1.2.
  6. בעזרת שני להבי אזמל סטריליים מס' 10, טוחנים היטב את רקמת הגידול. העבירו את שברי הגידול הטחון ללהב אחד והפקידו אותם בצינור C המכיל את תמיסת האנזים המוכנה. מהדקים היטב את מכסה הצינור עד שתורגש לחיצה אחרונה.
  7. הפוך את צינור ה-C מספר פעמים כדי להבטיח פיזור אחיד של שברי הגידול בתוך תמיסת האנזים.
  8. הנח את צינור ה-C במפריד המכני. הפוך את הצינור וודא שכל התוכן שקוע במדיום. הצינור יהיה במצב הפוך במכונה.
    1. אבטח את הצינור בחריץ כשהחלק השקוע פונה למפעיל. במידת הצורך, הנח את התנור סביב הצינור.
  9. בחר את התוכנית 37C_h_TDK_3 מממשק מסך המגע. תוכנית זו פועלת במשך 60 דקות ב-37 מעלות צלזיוס. עבור גידולים רכים יותר, ניתן להשתמש ב-37C_h_TDK_1 או 2.
    הערה: ליעילות הגדולה ביותר, מומלץ להכין את העכברים להזרקה בתקופת דיסוציאציה זו על ידי מריחת קרם אפילציה על אתרי ההזרקה.
  10. עם סיום תוכנית הדיסוציאציה, בדוק את תכולת הצינור. לא אמורים להישאר שברי גידול גלויים.
    הערה: אם קיימים שברים, ייתכן שיידרש זמן דיסוציאציה נוסף. במקרים כאלה, הפעל את התוכנית למשך 20-30 דקות נוספות.
  11. לאחר השגת דיסוציאציה נאותה, צנטריפוגה את צינור ה-C ב-200 x גרם למשך 5-8 דקות ב-4 מעלות צלזיוס כדי לגלול תאים מנותקים. הסר בזהירות את הסופרנטנט באמצעות שאיבת ואקום או פיפטה.
  12. השעו מחדש את גלולת התא ב-5-10 מ"ל של מדיום RPMI טרי. העבירו את מתלה התאים לצינור חרוטי של 15 מ"ל למניפולציה קלה יותר. צנטריפוגה את מתלה התא ב-200 x גרם למשך 5-8 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. שאפו בזהירות את הסופרנטנט.
    הערה: שלב זה עשוי להיות מושמט אם גלולת התא קטנה. במקרים כאלה, התאים מושעים ישירות בנפח המדיה הרצוי ולאחר מכן משולבים עם תמצית קרום הבסיס (Matrigel) כדי למזער את אובדן התאים.
  13. השעו מחדש את גלולת התא בנפח של RPMI 1640, שווה ערך למחצית מנפח ההזרקה הסופי הרצוי. RPMI 1640 ו-Matrigel ישולבו ביחס של 1:1 v/v, עם נפח הזרקה סופי של 100 μL לכל אתר הזרקה.
    הערה: להזרקה דו-צדדית ב-4 עכברים, הנפח הכולל הנדרש הוא 800 מיקרוליטר. לכן, השעו מחדש את התאים לפחות 400 מיקרוליטר של RPMI 1640. כדי לקחת בחשבון אובדן נפח פוטנציאלי, מומלץ להוסיף 20% נוספים לנפח הסופי, תוך שמירה על יחס של 1:1 v/v. לחלופין, ניתן להשתמש ב-DMEM או 1x PBS במקום RPMI 1640.
  14. ספרו את התאים התלויים באמצעות המוציטומטר או שיטה אוטומטית. יש לדלל לפי הצורך כדי להשיג את הריכוז הרצוי להזרקה. מוצעת נקודת התחלה של כ-1-2 מיליון תאים לכל אתר הזרקה.
  15. בצינור מיקרו-צנטריפוגה תחתון עגול של 2 מ"ל, שלב את הכמות הרצויה של תרחיף תאים מדולל ב-RPMI עם נפח שווה של מטריג'ל. מערבבים בעדינות את המתלים על ידי פיפטינג חוזר ונשנה כדי להבטיח הומוגניות.
    הערה: בהמשך לשלב הקודם, הוסף 400 מיקרוליטר של תרחיף תאים מדולל ל-400 מיקרוליטר של מטריגל. שקול את מספר מחטי ההזרקה שיש להשתמש בהן ולקחת בחשבון את הפסדי הנפח הנלווים. שמור את המטריגל על קרח כל הזמן. אל תפשיר אותו עד שתאים מושעים מחדש, מכיוון שהוא יתמצק במהירות. מומלץ לשמור על אליקוטים קטנים (למשל, 120 מיקרוליטר) להפשרה מהירה ושילוב בשפופרת של 2 מ"ל.
  16. שמור על תרחיף התאים על קרח עד שהוא מוכן להזרקה.

2. הזרקת כרית שומן חלב מפשעתי אורתוטופית של PDX מנותק

  1. קבע את המסה של כל עכבר באמצעות איזון מכויל. מרחו שכבה דקה של קרם אפילציה על אתר הזרקת המטרה. בעזרת צמר גפן סטרילי, עסו את הקרם בתנועות לסירוגין עם כיוון השעון ונגד כיוון השעון כדי להקל על הסרת פרווה מהירה.
    1. הסר עודפי פרווה וקרם אפילציה בעזרת ספוג גזה סטרילי ספוג במי מלח. הקפידו על הסרת שיער מלאה באזור ההזרקה.
      הערה: אין לחרוג מ-60 שניות של חשיפה לקרם אפילציה כדי למנוע גירוי בעור. ניתן לגלח עכברים לפני מריחת קרם אפילציה כדי למזער עוד יותר את זמן החשיפה. ניתן לבצע שלב זה במהלך דיסוציאציה של הגידול כדי לייעל את יעילות הזמן ולמזער את משך אחסון תרחיף התאים על קרח.
  2. ערכו בדיקה ויזואלית יסודית של כל עכבר כדי להעריך את כשירותו להזרקה. הערך אם יש סימנים של כאב, מצוקה, מחלה או התוויות נגד אחרות.
  3. בעזרת מזרק של 1 מ"ל ללא מחט מחוברת, שאפו בעדינות את תרחיף התאים למעלה ולמטה כדי להבטיח הומוגניות. חבר מחט 26 גרם למזרק 1 מ"ל ומשוך את נפח ההזרקה הרצוי. הסר בועות אוויר מהמזרק על ידי הקשה עדינה או החלקה.
    הערה: מומלץ לא לחרוג מ-600 מיקרוליטר למזרק כדי להקל על הזרקה ביד אחת.
  4. הנח את המזרק המוכן בצורה אופקית על גבי מיכל הקרח, כשהמחט מכוונת הרחק מהמפעיל. מקם את מיכל הקרח והמחט באותו צד של היד הדומיננטית של המפעיל או יד ההזרקה המועדפת. הסר את העכבר מביתו וחטא את אזור ההזרקה באמצעות כרית לניקוי אלכוהול.
  5. רסנו היטב את העכבר על ידי אחיזה בחוזקה בעור הגב בעורף ובגב. הקפידו על קיבוע מספיק כדי לחשוף בבירור את רפידות השומן החלביות. כרית השומן המפשעתית משתרעת מהפטמה ועד לחלק העליון של הירך. ניתן להבחין בו כרקמה רכה ורדרדה, באזור המתואר מתחת לעור.
    הערה: עוזר מפעיל עשוי להשתמש במלקחיים שטוחים כדי לצבוט ולהרים את העור המכיל את כרית השומן. טכניקה זו עוזרת להבטיח שהמפעיל המבצע את ההזרקה מכוון בהצלחה לכרית השומן.
  6. הנח את העכבר במצב שכיבה. הכנס את המחט (שיפוע כלפי מעלה) בזווית של 45 מעלות, מצביע לכיוון הירך כ-0.5-1 ס"מ זנב לכרית השומן, תוך התאמה לאורך המחט.
    1. מקדמים את המחט לתוך כרית השומן. בצורה מבוקרת, הזרקו את הנפח הרצוי של תרחיף התאים. מהירות הזרקה יעילה תעזור למזער את תסיסה של בעלי חיים מריסון ממושך.
      הערה: כדי למזער את מצוקת בעלי החיים, משך הזמן המרבי של ריסון ידני מתמשך לא יעלה על 30 שניות. אם משך הריסון עולה על 30 שניות, יש לשחרר את החיה לכלוב כדי להתאושש לפני ניסיון שני.
  7. לאחר ההזרקה, סובב את המחט 180 מעלות (שיפוע כלפי מטה). שמור על מיקום המחט לזמן קצר לפני נסיגה איטית כדי למזער את אובדן התאים מאתר ההזרקה. אם מתרחש דימום כלשהו, יש למרוח גזה רגילה או גזה המוסטטית לפי הצורך.
  8. חזור על שלבים 2.6 ו-2.7 עבור כרית השומן הנגדית אם יש צורך בזריקות דו-צדדיות. עבור בעלי חיים מרובים, חזור על שלבים 2.2-2.7 לפי הצורך.

3. נהלי מעקב

  1. השלך את כל החדים למיכלים חדים ייעודיים. השלך את כל שאר התכולה למיכלי פסולת מתאימים.
  2. אם מתרחש דימום במהלך ההזרקה, עקוב אחר עכברים לפחות שעה אחת לאחר מכן כדי להבטיח המוסטזיס.
  3. עקוב אחר מסת הגוף על בסיס שבועי. העריכו את נפח הגידול ברגע שהצמיחה הופכת מוחשית.

תוצאות

מחקר זה מתאר גישה יעילה ולא כירורגית להשתלה אורתוטופית של השתלות סרטן שד שמקורן בחולה בעכברים. רקמת גידול השד פורקה באמצעות אנזימים ספציפיים לאדם ותסיסה מכנית, הושעה מחדש ביחס של 1:1 v/v של Matrigel: RPMI 1640, והוזרקה אורתוטופית לתוך כריות השומן המפשעתי של עכברי NSG (איור 1 ואיור 2). כדי להבטיח את נאמנות המודלים של PDX, ההתאמה של דגימת הגידול המקורית של המטופל עם הגידולים העוברים אומתה בטכניקות היסטופתולוגיות וגנומיות מבוססות. ביטוי הקולטן נבדק באמצעות צביעה אימונוהיסטוכימית (IHC) של קולטנים סטנדרטיים לסרטן השד, כולל קולטן אסטרוגן (ER), קולטן פרוגסטרון (PR) וקולטן גורם גדילה אפידרמלי אנושי 2 (HER2) (איור 3). המורפולוגיה התאית הוערכה באמצעות צביעת המטוקסילין ואאוזין (H&E) של פרוסות גידול חתוכות ופרשנות פתולוגית מומחית של החלקים המוכתמים. שימור הנוף הגנטי ושימור תאים אנושיים אומתו באמצעות ריצוף RNA בתפזורת ואימות חוזר טנדם קצר (STR) (איור 4 וטבלה 1). בנוסף, בדיקות פתוגנים לא זיהו זיהום של המטופל או דגימות גידול מעבר, וזהו שלב אימות חיוני בהתחשב בשימוש בעכברים חסרי חיסון.

figure-results-1
איור 1: סקירה כללית של הפרוטוקול. ייצוג של דיסוציאציה של גידול וזרימת עבודה בהזרקה. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

עכברי NSG הוכנו להזרקה באמצעות קרם הסרת שיער שנמרח בתנועות לסירוגין עם כיוון השעון ונגד כיוון השעון כדי להסיר ביסודיות פרווה מאזור כרית השומן המפשעתי (איור 2A). עודפי קרם להסרת שיער ניגבו מעור בטן חשוף באמצעות גזה סטרילית, והאזור חוטא באמצעות פד אלכוהול (איור 2B). מחט סטרילית עמוסה בתאי גידול מנותקים הוצבה בזווית של כ-45 מעלות של 0.5-1 מ"מ זנב לרפידות השומן של פטמת החלב המפשעתית הרביעית (איור 2C). תאי הגידול הוזרקו בצורה מבוקרת לתוך כריות השומן של פטמת החלב המפשעתית הרביעית (איור 2D). גידול הגידול זוהה בתחילה על ידי מישוש דיגיטלי של רפידות השומן. לאחר מכן, התקדמות נפח הגידול הייתה במעקב כמותי באמצעות הדמיית תהודה מגנטית (MRI) (איור 2E). גם משקל הגוף (איור 2F) וגם נפחי הגידול (איור 2G) נמדדו מדי שבוע כדי לעקוב אחר תנודות במשקל והתקדמות נפחי הגידול. הגידולים נבדקו ויזואלית כדי לעקוב אחר פצעים כגון כיב שיחייב הפסקה מוקדמת. השתלה דו-צדדית מוצלחת של ה-PDX ברפידות השומן המפשעתיות מוצגת באיור 2H, וכריות השומן לאחר כריתת הגידולים מוצגות באיור 2I.

figure-results-2
איור 2: הכנת עכברים, הזרקת PDX ומעקב אחר התקדמות הגידול. (A) רפידות שומן החלב הוסרו ביסודיות. (ב) הצגת אתר ההזרקה עם נראות ברורה של אזורי הזרקת המטרה. (C) מיקום המזרק על כרית השומן, בדרך כלל 0.5-1 מ"מ זנב לכרית השומן כתלות באורך המחט. החץ הלבן מציין את אזור המטרה של המחט בעת ההחדרה. (D) תיאור של הזרקת תאים מנותקים לתוך כרית השומן של פטמת החלב המפשעתית הרביעית השמאלית. יש להחזיק את המחט בזווית של כ-45 מעלות כפי שמוצג להזרקה. (E) תמונת MRI מייצגת של גידולים שהושתלו דו-צדדית באתר ההזרקה. הגידולים מודגשים בירוק. (F) התקדמות מייצגת של משקל הגוף בגרמים לאחר הזרקת תאי גידול (n = 5). הקו הכחול הכהה מייצג רגרסיה ליניארית פשוטה, שאינה אפס באופן משמעותי (p < 0.0001); עכברים העלו בממוצע 22 מ"ג.יום-1. הצללה בכחול כהה היא רווח בר-סמך של 95%, הצללה בצבע תכלת היא מרווח חיזוי של 95%, וקווים כתומים הם מדידות משקל גוף אורכיות. (G) התקדמות מייצגת של נפחי גידול בודדים במ"מ3 לאחר הזרקת תאי גידול (n = 10). הקו הכחול הכהה מייצג רגרסיה אקספוננציאלית; זמן הכפלת נפח הגידול היה 19.08 ימים. הצללה בכחול כהה היא רווח בר-סמך של 95%, הצללה בצבע תכלת היא מרווח חיזוי של 95%, וקווים כתומים הם נפחי גידול אורכיים. (H) השתלה דו-צדדית מוצלחת של תאי PDX לתוך רפידות השומן המפשעתיות. שימו לב שניתן לראות כלי דם המספקים כל גידול. החצים הלבנים מזהים את הגידולים. (I) אזור כרית השומן המפשעתי לאחר כריתת הגידולים. (ח,י) היחידות על הסרגל הן בס"מ. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

ה-PDX המייצג (PEN_056) מקורו בנקבה קווקזית בת 31 עם קרצינומה פולשנית של שד שלב 3A. הגידול הראשוני, שנאסף מהשד הימני, היה בעל סטטוס קולטן של ER ו-PR שלילי, HER2 חיובי (ER-PR-HER2+). צביעת IHC עבור קולטני ER, PR ו-HER2 הראתה התאמה בין המטופל לגידולי PDX (איור 3). עם זאת, ה-PDX מראה ביטוי גדול יותר של HER2, שעשוי לנבוע מגידול סלקטיבי של תאי HER2+. הערכה פתולוגית של חתכים מוכתמים ב-H&E אישרה קרצינומה מובחנת בצורה גרועה עם מורפולוגיה וציטולוגיה עקביות הן בדגימות המטופל והן בדגימות PDX (איור 3).

figure-results-3
איור 3: קולטן IHC וצביעה של H&E. (עמודה שמאלית) צביעת IHC של קולטני ER, PR ו-HER2 וצביעה של H&E בגידול המטופל. כתמי ER ו-PR אינם מראים כתמים חיוביים ברורים, כצפוי. כתמי HER2 מראים חיוביות ל-HER2 (חום). (עמודה ימנית) צביעת IHC של קולטני ER, PR ו-HER2 וצביעת H&E בדגימת PDX המועברת. צביעת קולטנים דומה מאוד לזו שנראית בדגימת המטופל, אם כי HER2 מראה ביטוי גדול יותר לאחר המעבר. סרגל קנה מידה: 50 מיקרומטר; הגדלה: פי 20. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

גנוטיפ חוזר טנדם קצר (STR) אישר דמיון של >80% על פני 13 הלוקוסים האוטוזומליים שהוגדרו על ידי הנחיות הקונצנזוס של American Type Cell Culture Collection (ATCC) ASN-0002-2022 בתוספת 3 אתרים נוספים (טבלה 1). ריצוף RNA בתפזורת (RNA-seq) של דגימת הגידול של המטופל ו-PDX אישר רמות שוות ערך של יישור לגנום הייחוס האנושי העדכני ביותר (T2T CHM13v2.0), עם 82.3% ו-79.1% מהקריאות מיושרות, בהתאמה. יתר על כן, הגידול של החולה ו-PDX הראו מתאם חיובי חזק עם ערך פירסון r של 0.9559 (איור 4A). ניתוח העשרת מערך גנים המשווה PDX לעומת גידול מטופל גילה כי 10 המסלולים המועשרים באופן משמעותי מתהליכים ביולוגיים של אונטולוגיה גנטית היו בעיקר מערכי גנים אימונולוגיים, מה שמצביע על כך שרוב שונות השעתוק בין PDX לגידול החולה נובעת מהיעדר תאים חיסוניים בדגימת PDX (איור 4B).

D5S818D13S317D7S820VWAת'01AMTPOXCSF1POD3S1358D21S11D18S51Penta_EPenta_DD8S1179FGA
גידול בחולה12
13		8
8		8
9		17
17		9
9.3		X
X		8
10		15
16		29
31.2		16
19		12
13		14
14		10
14		21
25
גידול PDX13
14		8
8		8
9		17
17		9
9.3		X
X		10
10		15
15		29
29		16
19		12
13		14
14		10
14		21
25

טבלה 1: אימות חזרה כפולה קצרה (STR).

figure-results-4
איור 4: מתאם ריצוף RNA והעשרת מערך גנים. (A) תרשים פיזור שמדמה את הספירה המנורמלת של log2 למיליון (CPM) עבור כל הגנים מהגידול של המטופל (ציר x) ו-PDX (ציר y). נמצא מתאם חיובי חזק, עם ערך פירסון r של 0.9559. (B) תרשימי רכס עבור 10 מערכי הגנים הביולוגיים של אונטולוגיה של גנים מועשרים כאשר משווים PDX לעומת PDX. גידול המטופל. עקומות מתארות את התפלגות ניקוד ההעשרה עבור כל קבוצת גנים; צבע מייצג את ערך ה-Q של FDR עבור כל קבוצת גנים. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

דיון

מאמר זה מציג שיטה יעילה ובעלת תפוקה גבוהה להשתלה אורתוטופית של BC PDX לתוך כריות השומן המפשעתי של עכברים חסרי חיסון. זרימת עבודה אופטימלית זו מאפשרת לחוקר היחיד להשתיל PDX בעשרות עכברים ביום, ולתמוך במחקרים בקנה מידה גדול ובעלי עוצמה מספקת. היכולת לנתק ולהשתיל בו זמנית מספר PDX ייחודיים מאפשרת גם גישות אונקולוגיות מדויקות. מעבר ליעילות הזמן, הדיסוציאציה של הגידולים יוצרת תרחיף הומוגני של סוגי תאים המפוזר באופן שווה בין העכברים. מניסיוננו, הומוגניות זו תורמת לשיעורי השתלה וצמיחה עקביים של הגידול.

למרות שהוא יעיל בדרך כלל, פרוטוקול זה עשוי לדרוש שינויים בתרחישים מסוימים. לדוגמה, זמן הריצה הסטנדרטי של שעה אחת על הדיסוציאטור המכני מתגלה מדי פעם כלא מספיק לדיסוציאציה מלאה של רקמת הגידול. תוך כדי אחיזה חזקה בצינור C, החלק אותו כלפי מטה מספר פעמים כדי לצבור רקמה תועה בתחתית. אם נותרו שברי רקמה גלויים, המשך בדיסוציאציה ובדוק שוב במרווחים של 15 דקות. חשוב לציין כי רקמות מסוימות, במיוחד רקמות סיביות או שומן, עשויות להתנגד לדיסוציאציה ולדרוש הסרה ידנית כדי למנוע סתימת מחט במהלך ההזרקה.

אנו ממליצים להשתמש במחט הקטנה ביותר האפשרית (27 גרם או 26 גרם) כדי למזער את מצוקת בעלי החיים ולהפחית את הסיכון לזרימה חוזרת של תאים מאתר ההזרקה, מה שעלול להשפיע על הצלחת ההשתלה ושיעורי צמיחת הגידול. עם זאת, אם נותרו רקמה לא מנותקת או שברי שומן, ייתכן שיהיה צורך במחט גדולה יותר (16 G או 18 G), אם כי עם סיכונים מוגברים לדימום או אובדן תאים. ללא קשר למד המחט שנבחר, מיומנות הטיפול בבעלי חיים היא המרכיב החשוב ביותר בביצוע ההזרקות ביעילות. לא נעשה שימוש בהרדמה בפרוטוקול זה, ולמרות שזה חוסך זמן, זה גם מאפשר לבעל החיים מידה מסוימת של ניידות בעת ביצוע הזריקות. אם לא מושגת ריסון הולם בעת קשקוש, תנועות גפיים פתאומיות עלולות לגרום לניקוב כלי דם, ליצירת פצע יציאה המונע החזקת תאים או לנקב בדופן הבטן. מומלץ מאוד להזריק תרגול מספיק לפני הזרקת תאים יקרי ערך.

טכניקת הדיסוציאציה המתוארת ניתנת להעברה וניתן להשתמש בה בהשתלה של סוגי גידולים רבים אחרים עבור מודלים אורתוטופיים ותת עוריים כאחד. עם זאת, לפחות בהקשר של BC, יש להימנע מהשתלה תת עורית. הזרקת PDX אורתוטופית BC מביאה לכלי דם מארח מעולים של הגידול המושתל בהשוואה לתת-עורית, והשתלת כרית שומן מפשעתית מובילה לשיעורי חריטה גבוהים יותר מאשר כרית שומן בית החזה11. בנוסף, ל-PDX מושתלים אורתוטופיים יש זמן השתלה קצר יותר וקצב גדילה מהיר יותר בהשוואה לזריקות תת עוריות12. כמו כן, יש לציין כי בעוד שדיסוציאציה מקלה על הזרקה מהירה של תאי גידול, היא מביאה מטבעה לאובדן הקשר של תא לתא; לפיכך, ייתכן שזו לא גישה מתאימה בכל המקרים. במקרים הדורשים אינטראקציה אותנטית בין התאים (למשל, טרנסקריפטומיקה מרחבית של הגידולים), ניתן להעדיף הזרקת חלקי גידול טחונים או השתלת שברים.

אמנם השימוש בעכברים מדוכאי חיסון חיוני למחקרי PDX, אך טומן בחובו מגבלות מסוימות. מבחינה לוגיסטית, נדרשת סביבה סטרילית לחלוטין, כולל דיור, מזון ומים. זה מחייב עוד אזורי דיור ייעודיים לבעלי חיים חסרי חיסון כדי להפחית את הסיכון לזיהום, מה שעלול להגדיל את עלויות הדיור. רגישות מוגברת זו לזיהומים היא הסיבה לכך שמוצע שלב דגירה אנטיביוטי עבור שברי הגידול לפני דיסוציאציה. עם זאת, כמה מחקרים הראו ששימוש באנטיביוטיקה בתרבית תאים מוביל לשינויים בפרופילי ביטוי הגנים13. בהתחשב בכך, על החוקרים להעריך את השימוש באנטיביוטיקה עבור כל מחקר. בעוד שהיעדר יעיל של מערכת חיסון מאפשר ל-PDX להשתרש, הוא גם מונע את חקר ההשפעות הרבות של מערכת החיסון על התקדמות BC14.

שיטה זו מדגימה נאמנות גבוהה לדגימות הגידול של המטופל. אימות היסטופתולוגי אישר את ההתאמה של ה-PDX העובר ביחס לדגימת הגידול של המטופל, כצפוי. היישור הגבוה של קריאות לגנום האנושי מצביע על כך שה-PDX שומר על אחוז גבוה של תאים אנושיים לאחר המעבר. זה נתמך עוד על ידי הדמיון של >80% בפרופילי STR ומתאם חיובי חזק בנתוני RNA-seq בין הגידול של החולה ל-PDX. התאמות מולקולריות ברקמות היקפיות של עכברי PDX בעקבות צמיחת גידול בשד עולות בקנה אחד עם התאמות מולקולריות בחולי BC אנושיים. אנליזות RNA-seq ופרוטאומיות בתפזורת של שרירי השלד מעכברי BC PDX תואמות להפליא לשינויים מולקולריים בביופסיות שרירים שהתקבלו מחולים שאובחנו עם BC 6,7 בשלב מוקדם. באופן קולקטיבי, הדמיון בין פרופיל STR ו-RNA-seq, יחד עם התאמות עקביות ברקמות היקפיות, מספק נתונים משכנעים לשימוש בעכברי BC PDX בניסויים פרה-קליניים.

גילויים

המחברים מצהירים שאין להם ניגודי אינטרסים לחשוף.

תודות

ברצוננו להכיר בתרומתם הנדיבה של המטופלים שסיפקו דגימות גידול לפיתוח PDX. אמידיו פיסטילי מכיר בתרומתה הקודמת המשמעותית של חנה וילסון, MD/PhD. מחקר זה נתמך על ידי הארגונים הבאים: המכונים הלאומיים לדלקת פרקים, מחלות שרירים ושלד ועור (NIAMS) תחת פרס מספר R01AR079445 (Pistilli); מתקן הליבה הגנומי של WVU (U54GM104942); מתקן ההדמיה והמודל של בעלי החיים של WVU (P20GM121322, U54GM104942, P20GM144230, P30GM103488); המכונים הלאומיים למדעי הרפואה הכללית תחת פרס מספר P20GM121322 (לוקמן). איור 1 נוצר עם BioRender.com.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מזרק טוברקולין 1 מ"לBD305945סטרילי
1x פוספט חוצץ מלח, pH 7.4Gibco10010023
צינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי 2.0 מ"לEppendorf0030123620מחט סטרילית
26 גרם, ½ ב.BD305111מיקרו-צינור סטרילי
5.0 מ"לEppendorf0030119401NSG סטרילי
בן 8+ שבועות (NOD. עכברי Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ)מעבדת ג'קסון#005557
רפידות הכנה לאלכוהולפישר סיינטיפיק22-363-750
תמצית קרום מרתף סטרילית (Matrigel)Cultrex3632-005-02
אפליקטורים עם קצה כותנה, 6 אינץ'.פישר סיינטיפיק22-029-553
מלקחיים מעוקלים סטריליים עם קצות בינוניים לא משוננים, 152 מ"ממדעי מיקרוסקופיית אלקטרונים50-365-845
קרם הסרת שיערסטרילי Nair
gentleMACS C TubesMiltenyi Biotec130-093-237
gentleMACS Octo dissociator עם תנורי חימוםMiltenyi Biotec130-096-427
מס' 10 להבי אזמלפישר סיינטיפיק12-000-162
ספוגי גזה סטריליים לא ארוגים, 4x4 אינץ'פישר סיינטיפיק22-028-558
סטרילי RPMI 1640 1x + L-גלוטמיןGibco11875093
ערכת דיסוציאציה סטרילית של גידולאנושי Miltenyi Biotec130-095-929
,

מקורות

  1. Sung, H., et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 3 (3), 209-249 (2021).
  2. Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discov. 4 (9), 998-1013 (2014).
  3. DeRose, Y. S., et al. Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes. Nat Med. 17 (11), 1514-1520 (2011).
  4. Zhang, X., et al. A renewable tissue resource of phenotypically stable, biologically and ethnically diverse, patient-derived human breast cancer xenograft models. Cancer Res. 73 (15), 4885-4897 (2013).
  5. Yoshida, G. J. Applications of patient-derived tumor xenograft models and tumor organoids. J Hematol Oncol. 13 (1), 1-16 (2020).
  6. Wilson, H. E., et al. Human breast cancer xenograft model implicates peroxisome proliferator-activated receptor signaling as driver of cancer-induced muscle fatigue. Clin Cancer Res. 25 (7), 2336-2347 (2019).
  7. Wilson, H. E., et al. Skeletal muscle reprogramming by breast cancer regardless of treatment history or tumor molecular subtype. NPJ Breast Cancer. 6 (1), 18(2020).
  8. Shultz, L. D., et al. Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2Rγnull mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells. J Immunol. 174 (10), 6477-6489 (2005).
  9. DeRose, Y. S., et al. Patient-derived models of human breast cancer: Protocols for in vitro and in vivo applications in tumor biology and translational medicine. Curr Protoc Pharmacol. 14, Unit14.23(2013).
  10. Whittle, J. R., Lewis, M. T., Lindeman, G. J., Visvader, J. E. Patient-derived xenograft models of breast cancer and their predictive power. Breast Cancer Res. 17 (1), 17(2015).
  11. Fleming, J. M., Miller, T. C., Meyer, M. J., Ginsburg, E., Vonderhaar, B. K. Local regulation of human breast xenograft models. J Cell Physiol. 224 (3), 795-806 (2010).
  12. Okano, M., et al. Orthotopic implantation achieves better engraftment and faster growth than subcutaneous implantation in breast cancer patient-derived xenografts. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 25 (1), 27-36 (2020).
  13. Ryu, A. H., Eckalbar, W. L., Kreimer, A., Yosef, N., Ahituv, N. Use antibiotics in cell culture with caution: Genome-wide identification of antibiotic-induced changes in gene expression and regulation. Sci Rep. 1 (1), 7533(2017).
  14. Amens, J. N., Bahçecioglu, G., Zorlutuna, P. Immune system effects on breast cancer. Cell Mol Bioeng. 14 (4), 279-292 (2021).

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

PDXRPMI 1640
דיסוציאציה בתפוקה גבוהה והשתלה אורתוטופית של קסנוגרפים שמקורם בסרטן השד
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.