הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הקפאה וצביעה חיסונית של רשתית העכבר

3K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/67622

⸱

28 בפברואר 2025

 ,  ,  ,  , 
1The Key Laboratory for Human Disease Gene Study of Sichuan Province and Department of Laboratory Medicine, Sichuan Provincial People's Hospital, School of Medicine, University of Electronic Science and Technology of China, 2Research Unit for Blindness Prevention of Chinese Academy of Medical Sciences (2019RU026), Sichuan Academy of Medical Sciences & Sichuan Provincial People's Hospital

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

מתואר פרוטוקול להכנת הקפאות רשתית של עכברים וביצוע צביעה חיסונית על קולטני אור. מאמר זה מאפשר לחוקרים לייצר באופן עקבי חלקים קפואים ברשתית של עכברים עם מורפולוגיה שמורה היטב ותוצאות צביעה חיסונית באיכות גבוהה.

תקציר

חתך רקמות ואימונוהיסטוכימיה הן טכניקות חיוניות במחקרים היסטולוגיים ופתולוגיים של מחלות רשתית באמצעות מודלים של בעלי חיים. שיטות אלו מאפשרות בחינה מפורטת של מורפולוגיות רקמות ולוקליזציה של חלבונים ספציפיים בתוך הרקמה, המספקות תובנות חשובות לגבי תהליכי ומנגנוני המחלה. עכברים הם הדגם הנפוץ ביותר למטרה זו. עם זאת, מכיוון שגלגלי העיניים של העכבר קטנים והרשתית של העכבר היא רקמות עדינות ביותר, השגת קטעי רשתית איכותיים ותמונות צביעה חיסונית מגלגלי עיניים של עכבר היא בדרך כלל מאתגרת. מחקר זה מתאר פרוטוקול משופר לכריתת רשתית עכברים וביצוע אימונוהיסטוכימיה. נקודה חיונית בפרוטוקול זה כוללת ציפוי גלגל העין בשכבת דבק סופר, המונעת עיוות של גלגלי העיניים במהלך תהליכי הסרת הקרנית, חילוץ העדשות והטבעה. שלב זה מבטיח ששלמות המורפולוגיה של הרשתית נשמרת היטב. פרוטוקול זה מדגיש שיקולים טכניים קריטיים ואסטרטגיות אופטימיזציה לייצור עקבי של מקטעי רשתית באיכות גבוהה והשגת תוצאות צביעה חיסונית מצוינות.

מבוא

הקפאה ואימונוהיסטוכימיה (IHC) הן טכניקות הכרחיות במחקר ביו-רפואי, במיוחד לחקר מבנים ביולוגיים מורכבים כגון רשתית1. מתודולוגיות מתקדמות אלו הן חלק בלתי נפרד מהבנת ההרכב התאי המורכב והארגון המולקולרי של הרשתית. הם מספקים לחוקרים את היכולת לחקור את תפקוד הרשתית והפתולוגיה ברמה מפורטת, ומציעים תובנות קריטיות לקידום הידע בתחום זה.

הקפאה ממלאת תפקיד חיוני בשמירה על השלמות המורפולוגית של רקמת הרשתית. זה מבטיח שהמבנה העדין של הרשתית יישאר שלם, ומאפשר להשתמש בקטעים במחקרים אימונו-פלואורסצנטיים הבאים עם דיוק ואמינות גבוהים. בהשוואה לשיטות אחרות, כגון הטמעת פרפין, להקפאה יש יתרונות משמעותיים מכיוון שהיא משמרת טוב יותר הן את המורפולוגיה של הרקמות והן את האנטיגניות, מה שהופך אותה למתאימה במיוחד לצביעה אימונוהיסטוכימית2. טכניקת החתך הקפוא מאומצת באופן נרחב לחקר מגוון רקמות מורכבות ואפילו מבנים תאיים עדינים3, ומאפשרת ניתוחים מדויקים של הארכיטקטורה שלהם.

IHC היא טכניקת מעבדה רבת עוצמה ורב-תכליתית המאפשרת הדמיה של לוקליזציה של חלבונים ספציפיים בתוך רקמות. טכניקה זו הפכה לאבן פינה במסגרות קליניות ומחקריות כאחד, שם נעשה בה שימוש נרחב לאבחון, ניטור מחלות וחקירות ביולוגיות. הצלחתו של ניסוי IHC תלויה במידה רבה בהכנת דגימה קפדנית, טיפול זהיר ברקמה ובקרה מדויקת של תנאי צביעה חיסונית. שינויים קטנים בפרוטוקול יכולים להשפיע מאוד על איכות התוצאות, ולהדגיש את החשיבות של סטנדרטיזציה ואופטימיזציה1.

בשילוב, הקפאה ו-IHC מציעים יתרונות שאין שני להם לחוקרים המבקשים לחקור את ההתפלגות המרחבית, רמות הביטוי והאינטראקציות התאיות של חלבונים שונים בתוך הרשתית. מתודולוגיות אלו מאפשרות חקירה מפורטת של המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס התפתחות הרשתית, תפקודה ומחלתה. תובנות כאלה חשובות במיוחד בחקר הפרעות ברשתית, כולל ניוון מקולרי הקשור לגיל, רטינופתיה סוכרתית ורטיניטיס פיגמנטוזה. על ידי הבהרת הפתופיזיולוגיה של מצבים אלה, הקפאה ו-IHC תורמים לזיהוי סמנים ביולוגיים פוטנציאליים ולפיתוח אסטרטגיות טיפוליות חדשות.

למרות התועלת שלה, עבודה עם רשתית עכבר מציבה אתגרים ייחודיים. עכברים נמצאים בשימוש נרחב כמודלים של בעלי חיים במחקר עיניים בשל הדמיון הגנטי שלהם לבני אדם ומבנה הרשתית המאופיין היטב שלהם. עם זאת, השגת הקפאה איכותית היא קשה מטבעה בגלל הגודל הקטן והאופי העדין של רקמת הרשתית של העכבר. מחקר זה מספק מתודולוגיה מפורטת לביצוע הקפאה וביצוע IHC על רשתית עכברים, תוך הדגשת שיקולים טכניים קריטיים והצעת אסטרטגיות אופטימיזציה להתמודדות עם אתגרים אלה. על ידי חידוד טכניקות אלה, חוקרים יכולים להשיג תוצאות עקביות ואיכותיות, ולקדם את חקר הביולוגיה והפתולוגיה של הרשתית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הנוהל עמד בהנחיות שנקבעו על ידי האגודה לחקר הראייה ורפואת העיניים לשימוש בבעלי חיים במחקר. האישור התקבל מהוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של בית החולים העממי של מחוז סצ'ואן. עכברי C57Bl/6J זכרים, בני חודשיים עד שלושה חודשים ומשקלם 25-30 גרם, שימשו לפרוטוקול זה. רשימה מקיפה של הריאגנטים והציוד המשמשים במחקר זה מסופקת בטבלת החומרים.

1. הכנת ריאגנטים

  1. 1x מאגר PBS
    1. שקלו 8 גרם NaCl, 1.42 גרם Na2HPO4, 0.42 גרם KH2PO4 ו-0.2 גרם KCl באמצעות משקל. העבירו אותם לכוס והוסיפו כמות מתאימה של מים מזוקקים כפולים (ddH2O) כדי להמיס את הרכיבים. שופכים את התמיסה לבקבוק נפחי של 1 ליטר ומכוונים את הנפח ל -1 ליטר עם ddH2O.
  2. תמיסת 4% פרפורמלדהיד (PFA)
    1. הוסף 0.4 גרם אבקת PFA ו-15 מיקרוליטר של 1 M NaOH לצינור חרוטי של 15 מ"ל המכיל 8 מ"ל של מאגר PBS 1x. הנח את הצינור באמבט מים המוגדר ל-60 מעלות צלזיוס כדי להמיס את אבקת ה-PFA לחלוטין. כוונן את עוצמת הקול הסופית ל-10 מ"ל עם 1x PBS.
  3. פתרון חסימת IHC
    1. שלב 1 מ"ל של סרום חמור רגיל, 20 מיקרוליטר של 20% NaN3, 200 מיקרוליטר של 20% טריטון X-100 ו-18.78 מ"ל של מאגר PBS 1x. מערבבים היטב.
  4. תמיסת סוכרוז 30%
    1. ממיסים 15 גרם סוכרוז ב-40 מ"ל של מאגר PBS 1x. כוונן את עוצמת הקול ל-50 מ"ל עם מאגר PBS 1x וערבב עד להמסה מלאה.
  5. תמיסת נוגדנים משנית IHC
    1. לדלל את הנוגדן נגד ארנב עזים מצומד Alexa Fluor 488 ביחס של 1:300 ו-DAPI ביחס של 1:2,000 באמצעות המאגר החוסם המוכן.

2. הקפאת גלגל העין של העכבר

  1. ניתוח גלגל העין
    1. להרדים עכבר C57Bl/6 בן 3 חודשים (כ-25 גרם) באמצעות הזרקה תוך-צפקית של 2% טריברומו-אתנול במינון של 15 מיקרוליטר/גרם משקל גוף. להקריב את העכבר באמצעות פריקת צוואר הרחם (בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי המוסד).
    2. סמנו את הצד העליון של גלגל העין עם סמן כחול על הסקלרה (איור 1A). הסר את גלגלי העיניים בעזרת מספריים.
    3. אם יש דם על פני גלגל העין, נגב אותו בעדינות באמצעות מגבון נטול מוך. תחת מיקרוסקופ מנתח, הסר בזהירות את השרירים החוץ-עיניים המחוברים לגלגלי העיניים.
  2. קיבוע
    1. העבירו את גלגלי העיניים המנותחים לצינור מיקרו-צנטריפוגה תחתון עגול בנפח 2 מ"ל המכיל 1 מ"ל של 4% PFA. תקן את גלגלי העיניים למשך 10 דקות. לאחר מכן, העבירו את גלגלי העיניים לצלחת פטרי הפוכה בגודל 3 או 6 ס"מ.
    2. תחת מיקרוסקופ מנתח, בצע חתך קטן (כ 1-2 מ"מ) על הקרנית בעזרת מלקחיים עדינים ומספריים עיניים. הכניסו את גלגלי העיניים בחזרה לתמיסת PFA של 4% למשך שעתיים נוספות של קיבוע על קרח (איור 1B).
  3. הגנה מפני הקפאה
    1. הסר את הקיבוע ושטוף את גלגלי העיניים שלוש פעמים עם תמיסת חיץ PBS 1x. העבירו את גלגלי העיניים לצינור מיקרוצנטריפוגה תחתון עגול בנפח 2 מ"ל המכיל 1 מ"ל של תמיסת סוכרוז של 30% להגנה מפני הקפאה ב-4 מעלות צלזיוס. הניחו לגלגלי העיניים להתיישב בתחתית הצינור או השאירו אותם למשך הלילה.
  4. ציפוי גלגל העין
    1. העבירו גלגל עין על צלחת פטרי הפוכה כשצד הקרנית פונה כלפי מעלה. כתם את התמיסה העודפת מהקרנית בעזרת מגבון נטול מוך. טובלים קטע של 2-3 ס"מ של חוט טניס לתוך הדבק (המורכב מציאנואקרילטים) הכלול בצינור מיקרו-צנטריפוגה של 0.2 מ"ל, ואז מסירים אותו במהירות.
    2. תחת מיקרוסקופ מנתח, חבר קצה אחד של חוט הטניס עם דבק סופר שיורי למרכז הקרנית הלחה. אפשר לדבק להתמצק במשך 10-20 שניות. אחוז בקצה השני של חוט הטניס וטבל את גלגל העין בצינור מיקרו-צנטריפוגה של 200 מיקרוליטר מלא בדבק סופר, מה שמבטיח שהסקלרה שקועה לחלוטין למשך כשנייה אחת.
    3. הסירו במהירות את גלגל העין וטבלו אותו ב-PBS (איור 1C). הדבק על משטח הסקלרה יתמצק מיד.
  5. הסרת הקרנית
    1. כתם את עודפי ה- PBS על פני הדבק המוצק באמצעות מגבון נטול מוך. תחת מיקרוסקופ מנתח, הסר את הקרנית בעזרת מספריים עיניים תוך החזקת חוט הטניס המצורף.
  6. הטבעה
    1. בעזרת מלקחיים יש לחלץ בזהירות את העדשה מכוס העין. יש לספוג את תמיסת הסוכרוז העודפת הכלואה בתוך גביע העין בעזרת רצועת מגבון נטול מוך. העבירו את גביע העיניים לתבנית הטבעה מלאה בתרכובת טמפרטורת החיתוך האופטימלית (OCT).
    2. מלאו את העיניים לחלוטין ב-OCT. מקמו את העין כך שהיא פונה לדופן של תבנית ההטבעה, וודאו שהמישור הסגיטלי מקביל לתחתית התבנית. השתמש בסימן הכחול על הסקלרה כהפניה. העבירו את תבנית ההטבעה המכילה את העין למקפיא של -80 מעלות צלזיוס (איור 1D). העיניים תוקפא תוך חמש דקות.
  7. הקפאה
    1. העבירו את העין הקפואה לקריוסטט המוגדר ל-20 מעלות צלזיוס והניחו לה להתייצב בתוך החדר למשך 30 דקות. חתכו את העין בעובי של 12 מיקרומטר. התקן את החלקים על מגלשות זכוכית טעונות חיובית לשימוש לאחר מכן.

3. צביעה אימונוהיסטוכימית

  1. אפייה
    1. מניחים את החלקים הקפואים על שקופיות ואופים אותם בתנור של 37 מעלות למשך 30-60 דקות כדי להבטיח הידבקות תקינה של הרקמה לשקופית.
  2. כביסה
    1. באמצעות עט PAP, צייר עיגול סביב המקטעים בשקופית. טבלו את השקופית בצנצנת קופלין המכילה 1x מאגר PBS. הניחו את צנצנת קופלין על שייקר איטי ושטפו את החלקים במשך 2 × 10 דקות כדי להסיר את תרכובת ה-OCT.
  3. חסימה וחדירות
    1. הנח את השקופית אופקית בתא לחות. הוסף את תמיסת החסימה לחלקים המעוגלים ואפשר חסימה וחדירה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
  4. דגירה ראשונית של נוגדנים
    1. שאפו את תמיסת החסימה בזהירות מהשקופית. הוסף את הנוגדן הראשוני, המדולל בתמיסת החסימה, לחלקים. דגרו את החלקים בתא הלחות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה כדי להבטיח קישור אופטימלי של הנוגדן לאנטיגן המטרה.
  5. דגירה משנית של נוגדנים
    1. שאפו את תמיסת הנוגדנים העיקרית ושטפו את השקופית פעמיים עם PBS 1x למשך 2 × 10 דקות. הוסף את הנוגדן המשני המתאים, מעורבב עם DAPI, ומדולל בתמיסת החסימה.
    2. דגרו את החלקים בתא לחות כהה בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת כדי לאפשר קשירת נוגדנים משנית וצביעה נגדית עם DAPI.
  6. הרכבה
    1. שאפו את תמיסת הנוגדנים המשנית ושטפו את השקף עם PBS 1x למשך 2 × 10 דקות. השתמש ב- Kimwipe כדי למחוק את כל ה- PBS שנותר בשקופית.
    2. מרחו כמות מתאימה של אמצעי הרכבה נגד דהייה על החלקים וכסו אותם בכיסוי. אחסן את הדגימות המותקנות ב-4 מעלות צלזיוס בחושך כדי לשמור על הקרינה ולמנוע פוטו-הלבנה.

4. הדמיה

  1. רכוש אותות פלואורסצנטיים מקטעי הרשתית המוכתמים במערכת החיסון באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי סורק לייזר. התאם את ההגדרות לרזולוציה ורגישות אופטימליות כדי ללכוד אותות פלואורסצנטיים ברורים ומובחנים.
  2. ודא שנעשה שימוש במסננים מתאימים כדי לזהות את אורכי הגל הספציפיים של הפלואורופורים המשמשים בניסוי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

בהתאם לפרוטוקול המתואר לעיל, עיניים של עכברי בר בני חודש מסוג C57Bl/6J נקבעו ב-4% PFA. הדגימות הקבועות הוטמעו לאחר מכן ב-OCT והוקפאו. החלקים הוכתמו במערכת החיסון בנוגדנים נגד PDE6B ונצבעו ב-DAPI כדי לסמן את הגרעין. PDE6B הוא חלבון פוטוטרנסדוקציה המתבטא במיוחד בתאי קולטני אור מוט4. בהשוואה לפרוטוקולים מסורתיים, פרוטוקול זה משפר משמעותית הן את המורפולוגיה של רשתית העכבר והן את איכות התמונות האימונו-פלואורסצנטיות, ומספק עקביות רבה. התוצאות המייצגות מדגימות צביעה חיסונית מוצלחת של קריוסקציה ברשתית באמ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מספר גורמים משפיעים על איכות קטעי הרקמות, כולל הרכב תמיסת הקיבוע, זמן הקיבוע והקפאה ושיטות ההטמעה5. כאשר מוציאים את גלגל העין מהעכבר, חיוני להסיר את השרירים החוץ-עיניים ורקמות חיבור אחרות המחוברות לגלגל העין. אם לא מוסרים כראוי, רקמות אלו עלולות לגרום לעיוות של גלגל העין במהלך העקירה מארובת העין, מה שעלול להוביל להיפרדות רשתית. בתהליך הקיבוע יש לבצע חתך בקרנית כדי לשחרר לחץ תוך עיני (IOP). ללא חתך זה, גלגל העין עלול להתכווץ, וכתוצאה מכך לעיוות והיפרדות רשתית. החדי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין קונפליקטים לחשוף.

תודות

פרויקט מחקר זה נתמך על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (82371059 (H.Z.), 82102470 (J.W.)), תוכנית המדע והטכנולוגיה של סצ'ואן (2023JDZH0002 (H.Z.)).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
-80 מעלות; מקפיא CHaierDW-86L626
שקופיות מיקרוסקופ הידבקותCITOTEST80312-3161
Alexa488-Goat Anti-RabbitProteintechSA00006-2
C57BL/6J עכברמעבדת ג'קסון664
מיקרוטום קריוסקציהLeicaN/A
טכנולוגיית איתות תאיםDAPI 4083S
מיקרוסקופ חיתוךZEISS3943030830
סרום חמורSolarbioS9100
תבניות הטמעהThermo Fisher Scientific1841
מספריים לדיסקציה עדינהRWDS13001-10
מלקחיים עדיניםRWDF11020-11
מדיום הרכבה מימי FluoromountSigma-AldrichF4680
חממתשנחאי YuejinN/A
KClSigma-Aldrich1049330500
KH2PO4Sigma-Aldrich1048771000
KimwipesThermo Fisher ScientificFIS-06666
מיקרוסקופ לייזר קונפוקליZEISSN/A
כיסוי מיקרוסקופ זכוכיתCITOTEST80340-3610
Na2HPO4Sigma-Aldrich1065860500
NaClSigma-AldrichS9888
NaOHSigma-Aldrich1091371003
תרכובת O.C.TSakura4583
עט פאפSigma-AldrichZ672548
PFASigma-Aldrich441244
ארנב אנטי-PDE6BProteintech22063-1-AP
שייקרSCILOGEX8042210200
מספריים אביבייםRWDS11036-08
סוכרוזBioFroxx1245GR500
סופר דבקמעדנייה7147S
מחרוזת טניס (1.24 מ"מ)גוסןTS761
טריברומו-אתנולמקליןT831042
טריטון X-100סולארביוIT9100
Cryostat LEICA N/A

מקורות

  1. Tokuyasu, K. T. Immunochemistry on ultrathin frozen sections. Histochem J. 12 (4), 381-403 (1980).
  2. Ramos-Vara, J. A., Miller, M. A., et al. When tissue antigens and antibodies get along: Revisiting the technical aspects of immunohistochemistry--the red, brown, and blue technique. Vet Pathol. 51 (1), 42-87 (2014).
  3. Usukura, E., et al. A cryosectioning technique for the observation of intracellular structures and immunocytochemistry of tissues in atomic force microscopy (AFM). Sci Rep. 7 (1), 6462(2017).
  4. Park, P. S. Supramolecular organization of rhodopsin in rod photoreceptor cell membranes. Pflugers Arch. 473 (9), 1361-1376 (2021).
  5. Boonstra, H., Oosterhuis, J. W., Oosterhuis, A. M., Fleuren, G. J. Cervical tissue shrinkage by formaldehyde fixation, paraffin wax embedding, section cutting and mounting. Virchows Arch A Pathol Anat Histopathol. 402 (2), 195-201 (1983).
  6. Stradleigh, T. W., Ishida, A. T. Fixation strategies for retinal immunohistochemistry. Prog Retin Eye Res. 48, 181-202 (2015).
  7. Thavarajah, R., Mudimbaimannar, V. K., Elizabeth, J., Rao, U. K., Ranganathan, K. Chemical and physical basics of routine formaldehyde fixation. J Oral Maxillofac Pathol. 16 (3), 400-405 (2012).
  8. Li, L., et al. An improved method for preparation of mouse retinal cryosections. Eur J Histochem. 64 (3), 3154(2020).
  9. Yang, J., et al. A quick protocol for the preparation of mouse retinal cryosections for immunohistochemistry. Open Biol. 11 (7), 210076(2021).
  10. Szel, A., et al. Unique topographic separation of two spectral classes of cones in the mouse retina. J Comp Neurol. 325 (3), 327-342 (1992).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

חיתוך קריו-סקשנינג של רשתית עכברצביעה אימונוהיסטוכימית של חיתכי רשתיתמודלים למחלות רשתיתאימונוהיסטוכימיה של הרשתיתחיתוך רקמותמורפולוגיה של רשתית עכברלוקליזציה של חלבונים ברשתיתקריו-הגנה של הרשתיתסימון נוגדנים ברשתיתדימיון פלואורסצנטי של הרשתית
הקפאה וצביעה חיסונית של רשתית העכבר
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.