מאמר שיטה

גישות בביולוגיה מבנית וכימיה אנליטית לאפיון אנזימים מטבוליים של C-גליקוזיד במיקרוביוטה של המעי האנושי

1.3K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/67629

⸱

23 במאי 2025

 ,  ,  ,  , 
1The School of Life Science, Beijing University of Chinese Medicine

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

מחקרים אחרונים מדגישים את תפקידם של אנזימי מיקרוביוטה של המעי האנושי בחילוף חומרים של C-גליקוזידים. כאן, אנו מציגים מתודולוגיה מקיפה המשלבת טכניקות כימיה אנליטית (LC-MS/MS ו-NMR) עם גישות ביולוגיה מבנית כדי לאפיין באופן שיטתי את שרשראות התגובה המבניות והאנזימטיות של אנזימים מטבוליים C-גליקוזידים אלה.

תקציר

מיקרוביוטת המעיים התגלתה כמודולטור מרכזי לבריאות המארח, במיוחד בגלל יכולתה לבצע חילוף חומרים של גליקוזידים תזונתיים. בעוד ש-C-גליקוזידים מפגינים יציבות כימית מעולה ועמידות בפני מחשוף אנזימטי בהשוואה ל-O-גליקוזידים, חיידקי מעיים מיוחדים יכולים לבצע חילוף חומרים סלקטיבי שלהם, ולשפר את הזמינות הביולוגית שלהם. מאז הזיהוי של אנזימי C-glycosidase מיקרוביאליים, מנגנוני התגובה המדויקים נותרו לא מובנים לחלוטין, ומתודולוגיות סטנדרטיות לחקר תהליכים אלה עדיין אינן מבוססות היטב. כדי להתמודד עם פער זה, הצגנו גישה רב-תחומית משולבת המשלבת ביולוגיה מבנית, אנזימולוגיה וטכניקות אנליטיות, כולל כרומטוגרפיה נוזלית-ספקטרומטריית מסה טנדם (LC-MS/MS) ותהודה מגנטית גרעינית (NMR), כדי לאפיין באופן שיטתי את הפעילויות האנזימטיות הללו. גישה מקיפה זו מאפשרת אפיון מדויק של חילוף החומרים של C-glycoside ברמה המולקולרית, האנזימטית והמטבולית.

מבוא

לאחרונה מיקרוביוטת המעי האנושית זכתה לתשומת לב רבה בזכות תפקידה החיוני בתמיכה בבריאות המארח 1,2. קהילות מיקרוביאליות אלה מטבוליות תרכובות שמקורן במארח, ומייצרות מטבוליטים פעילים ביולוגית 1,2,3. לדוגמה, פלבנואידים, בין התרכובות הטבעיות הנפוצות ביותר בתזונה היומית שלנו, קיימים בעיקר כגליקוזידים O- או C, אשר בעצמם נספגים בצורה גרועה במעיים האנושיים4. עם זאת, מיקרוביוטת המעיים יכולה להפוך את הגליקוזידים הללו לנגזרות ביו-אקטיביות יותר, כגון גליקוזידים משניים או אגליקונים, להפחית את מסיסותם ולשפר את ספיגתם, ובכך לשפר את הפעילות הביולוגית שלהם בהשוואה לצורתם המקורית 5,6.

מבחינה היסטורית, מנגנוני ההידרוליזה של O-glycosides נחקרו בהרחבה 7,8. ה-C-גליקוזידים, המאופיינים בקשרים הגליקוזידיים C-C שלהם, מציגים יציבות כימית ועמידות רבה יותר בפני מחשוף 9,10. למרות זאת, חיידקי מעיים מסוימים פיתחו את היכולת לדה-גליקוזילט C-גליקוזידים 11,12. בשנת 1988, האטורי ועמיתיו הראו לראשונה כי חיידקי מעיים מסוימים יכולים להסיר קבוצות גליקוזיל מ-C-גליקוזידים13. מחקרים מאוחרים יותר בודדו את זן החיידקים הראשון המסוגל לפעילות זו, מה שאפשר חקירה נוספת של מנגנוני הדבקה של C-glycoside14. עם זאת, עד כה זוהו ואופיינו רק מספר מוגבל של זני חיידקי מעיים ואנזימים מטבוליים של C-גליקוזיד 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26. מחקרים אחרונים הראו כי אנזימי הדגליקוזילציה puerarin (daidzein-8-C-glucoside) (DgpA/B/C) בזן PUE מסוגלים לבקע את puerarin לדאידזין וגלוקוז באמצעות תהליכים דו-שלביים: DgpA, אוקסידורדוקטאז ממשפחת Gfo/Idh/MocA, מחמצן את הפוארארין ל-3''-oxo-puerarin, אשר לאחר מכן עובר תגובת חיסול β המתווכת על ידי קומפלקס DgpB/C כדי להניב את האגלקון והגלוקוז 10, 26. עם זאת, המאפיינים המבניים והתפקודיים של אנזימים מטבוליים של C-glycoside, במיוחד מערכת DgpA/B/C, נותרו לא מובנים במלואם, ויש צורך במתודולוגיות מתקדמות יותר, במיוחד שילוב של אסטרטגיות ביולוגיות וכימיות, כדי לקדם את המחקרבתחום זה.

כדי להתמודד עם פער זה, אנו משתמשים בגישות רב-תחומיות משולבות כדי לחקור את התגובה המטבולית של מיקרוביוטת המעי האנושית DgpA/B/C. בתגובה זו, DgpA מזרז את חמצון הגליקוזיל של C-גליקוזידים, ולאחר מכן, DgpB ו-DgpC יוצרים קומפלקס DgpB/C המבקע באופן ספציפי את תוצרי ה-C-גליקוזיד המחומצנים 10,26,27. תחילה ביצענו ביטוי רקומביננטי וטיהור של DgpA ו-DgpB/C בנפרד. לאחר מכן התגבשו חלבוני DgpA ו-DgpB/C המטוהרים, והמבנים התלת-ממדיים שלהם נקבעו על ידי קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן. לבסוף, בנינו מחדש את פונקציית המחשוף C-glycoside באמצעות מערכת האנזימים השלמה DgpA/B/C, עם ניתוח מטבולי מקיף שנערך באמצעות ספקטרוסקופיה משולבת LC-MS/MS ו-NMR27. בהתבסס על גישות אלה, חקרנו את חילוף החומרים של C-glycoside המזורז על ידי מערכת האנזים DgpA/B/C.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. ייצור וטיהור חלבון

  1. בניית וקטור ביטוי
    הערה: במחקר זה, הגנים DgpA, DgpB ו-DgpC ממיקרוביוטת המעי האנושית, זן PUE , משמשים כמערכת מודל. השלב הראשון כולל שימוש בפלסמידים לביטוי כדי לייצר את החלבונים הרקומביננטיים המתאימים.
    1. השג את רצף אשכול הגנים DgpA/B/C (GenBank: LC422372.1) מ-NCBI. לאחר מכן, לסנתז באופן מסחרי את ה-DNA DgpA/B/C ולשכפל בנפרד את הגנים DgpA, DgpB ו-DgpC לווקטור pET-28a שונה, אשר יפיק את חלבון המטרה עם ה-SUMO הטרמינלי N ותג 6×His (תג His-SUMO)28.
    2. הפוך כל אחד מהפלסמידים DgpA, DgpB או DgpC לתאים מוכשרים E. coli BL21 (DE3). לאחר מכן, תרבית חיידקים במדיום LB עם 50 מיקרוגרם/מ"ל קנמיצין ב-37 מעלות צלזיוס.
    3. הוסף 0.2 מ"מ IPTG למדיום כאשר צפיפות החיידקים (OD600) מגיעה ל-0.6. תרבית את החיידקים בטמפרטורה של 16 מעלות צלזיוס למשך 16 שעות.
    4. צנטריפוגה כל אחת מה-DgpA, DgpB ו-DgpC המבטאת תרבית חיידקים ב-4,000 x גרם למשך 20 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. השעו מחדש את כדור התא ב-20 מ"ל של מאגר A (טבלה 1) עבור כל 1 ליטר של תרבית חיידקים.
  2. טיהור חלבון
    הערה: כמויות מספיקות של אנזימים רקומביננטיים בטוהר גבוה חיוניות לאפיון תפקודי ולמחקרי ביולוגיה מבנית. DgpB ו-DgpC יוצרים קומפלקס חלבון יציב (יוצרים באופן ספונטני קומפלקס DgpB/C במהלך הליך הליזיס) לפונקציונליות10,26. לאחר מכן מתבצע טיהור של חלבון DgpA וקומפלקס DgpB/C.
    1. הוסף 1 מ"מ PMSF להשעיית החיידקים. מערבבים את התרחיף החיידקי DgpB ו-DgpC משלב 1.1.4 יחד ולאחר מכן מרססים את התרחיף החיידקי DgpA או את תערובת DgpB ו-DgpC (ליצירת קומפלקס DgpB/C פונקציונלי) באמצעות משבש תאים קולי.
    2. צנטריפוגה את הליזאט החיידקי ב-48,000 x גרם למשך 40 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. שמור על הסופרנטנט המכיל את החלבון והשליך את גלולת החיידקים.
    3. טהר קומפלקס DgpA או DgpB/C מהסופרנטנט באמצעות עמודת כרומטוגרפיה של זיקה ניקל (Ni-NTA). לחסל את החלבונים הקשורים על ידי החלת שיפוע ריכוז אימידזול של 0 - 50% עם מאגר A ומאגר B (טבלה 1) במטהר ÄKTA.
    4. קח 10 מיקרוליטר של דגימות מנומקות וערבב אותן עם 2 מיקרוליטר של 5 × צבע חלבון, ולאחר מכן בצע אלקטרופורזה SDS-PAGE ב-220 וולט למשך 45 דקות באמצעות מערכת אלקטרופורזה אנכית, ואחריה צביעה כחולה של Coomassie כדי להמחיש רצועות חלבון. אסוף שברים המכילים DgpA או קומפלקס DgpB/C על סמך ניתוח SDS-PAGE לשימוש עתידי.
      הערה: פס DgpA (44 kDa) עם תג His-SUMO (17 kDa) נודד בסביבות 61 kDa (איור 2D), בעוד ש-DgpC (33 kDa) עם תג His-SUMO (17 kDa) נודד בסביבות 50 kDa, ו-DgpB (15 kDa) עם תג His-SUMO (17 kDa) נודד בסביבות 33 kDa (איור 2J).
    5. דיאליזה של דגימות מורכבות DgpA או DgpB/C משלב 1.2.3 באמצעות קרום דיאליזה במשקל מולקולרי של 10 kDa כנגד Buffer C להסרת אימידזול, ועם פרוטאז דמוי יוביקוויטין 1 (ULP1; טבלת חומרים) אנזים להסרת His-SUMO tag29.
    6. טען את דגימת החלבון הדיאליזה במאגר C (טבלה 1) דרך עמודת הכרומטוגרפיה של חילופי יונים (עמודת Q). לאחר מכן, יש להוציא את החלבון הקשור מהעמודה באמצעות שיפוע ריכוז נתרן כלורי הנע בין 100 מ"מ ל-600 מ"מ, שהוכן עם Buffer C ו-Buffer D (טבלה 1) במטהר ÄKTA.
    7. בצע את ניתוח SDS-PAGE של קומפלקס DgpA ו-DgpB/C שנפלט מהעמודה Q כשלב 1.2.3, תוך ציון המשקלים המולקולריים: תג His-SUMO (17 kDa), DgpA (44 kDa), רצועות אוליגומריות של DgpA (מעל 95 kDa) (איור 2E), DgpB (15 kDa), DgpC (33 kDa), רצועות אוליגומריות של DgpB ו-DgpC (בין 53 kDa ל-95 kDa) (איור 2K).
    8. טהר את החלבון באמצעות עמודת אי הכללת גודל (SEC) עם מאגר E (טבלה 1). בצע ניתוח SDS-PAGE באמצעות חלבונים ממקטע הפליטה, ואחריו צביעה כחולה של Coomassie כדי להמחיש רצועות חלבון. אסוף את השברים המכילים את קומפלקס חלבון המטרה DgpA או DgpB/C לאחר ניתוח על ידי SDS-PAGE.
      הערה: פס DgpA נראה בסביבות 44 kDa עם פס DgpA אוליגומרי מעל 95 kDa (איור 2F), בעוד ש-DgpC נמצא בסביבות 33 kDa, ו-DgpB הוא בסביבות 15 kDa עם DgpB ו-DgpC אוליגומריים (בין 53 kDa ל-95 kDa) (איור 2L).
    9. מדוד את ריכוז החלבון של קומפלקס DgpA או DgpB/C באמצעות ננו-טיפה ב-280 ננומטר. לאחר מכן, רכז את קומפלקס DgpA או DgpB/C לכ-20 מ"ג/מ"ל עם צינורות אולטרה-סינון, הוציא אותם והקפיא אותם עם חנקן נוזלי. אחסן קומפלקס DgpA או DgpB/C בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס לשימוש עתידי.
  3. איסוף נתוני ספקטרום דיכרואיזם מעגלי (CD)
    הערה: מכיוון שחמצון הגליקוזיל המזרז על ידי DgpA משמש כשלב ההתחלה המכריע במסלול המטבולי, ספקטרוסקופיה CD שימשה במיוחד כדי לאמת הן את מצב הקיפול התקין והן את השלמות המבנית המשנית של DgpA. פרמטרים מבניים אלה חשובים ביותר הן לפעילות אנזימטית והן להתגבשות חלבון מוצלחת.
    1. לדלל חלבון DgpA ל-0.2 מ"ג/מ"ל עם 1 x מאגר PBS (pH 7.4) (טבלה 1).
    2. טען מאגר PBS 1x (pH 7.4) לקובט קוורץ והקלט את ספקטרום התקליטורים הבסיסי מעל 200 - 260 ננומטר באמצעות ספקטרומטר CD כדי לזהות ברגישות מבנה משני והבדלי מצב קיפול27.
    3. החלף את קוביית החיץ בדגימות חלבון מ-1.3.1, הקלט את ספקטרום ה-CD מעל 200 - 260 ננומטר, והחסר את קו הבסיס של המאגר כדי לקבל את ספקטרום ה-CD עבור דגימת החלבון.
    4. אסוף שלוש סריקות לדיוק ונתח את הנתונים עבור תכונות מבנה משני ומצב קיפול חלבון (איור 3G, 3H).

2. קריסטלוגרפיה של חלבונים וקביעת מבנה

הערה: לאחר אישור ש-DgpA שמר על קיפול תקין ושלמות מבנית, נעשה שימוש בגישות ביולוגיה מבנית כדי לקבוע את המבנים התלת מימדיים של שני ה-DgpA. בהתחשב בכך שהיכולת הקטליטית של קומפלקס DgpB/C אושרה ביוכימית באמצעות בדיקות תפקודיות קודמות 10,26,27, שלב האימות הספקטרלי של CD הושמט.

  1. צמיחה ואופטימיזציה של גבישי חלבון
    1. מערבבים 0.5 מיקרוליטר של DgpA מטוהר (20 מ"ג/מ"ל) או קומפלקס DgpB/C (20 מ"ג/מ"ל) עם נפח שווה (0.5 מיקרוליטר) של תמיסת מאגר מערכות התגבשות על לוחות גביש של 48 בארות בשיטת טיפת ישיבה30. העבירו את לוחות הקריסטל ל-16 מעלות צלזיוס לצמיחת גבישים.
      הערה: התבונן בטיפות הישיבה הללו במיקרוסקופ כדי לזהות את התנאים (כולל ריכוז חלבון ומשקעים, כגון PEG 3350, פורמט מגנזיום וכו') לצמיחת גבישים מורכבים DgpA או DgpB/C.
    2. בצע אופטימיזציה של התגבשות הן עבור DgpA והן עבור קומפלקס DgpB/C באמצעות שיטת דיפוזיה של אדי טיפה תלויה30.
    3. עבור DgpA, התחל עם המצב שזוהה בשלב 2.1.1 (פורמט מגנזיום 20 מ"מ, 20% PEG3350) ויישם גישת אופטימיזציה אורתוגונלית על ידי בדיקת שישה שיפועי ריכוז PEG3350 (17%, 18%, 19%, 20%, 21% ו-22%) כנגד ארבעה שיפועי ריכוז מגנזיום פורמט (16 מ"מ, 18 מ"מ, 20 מ"מ ו-22 מ"מ)30.
    4. הכן טיפות התגבשות על ידי ערבוב של 0.8 מיקרוליטר של תמיסת חלבון DgpA (10 או 20 מ"ג/מ"ל) עם 0.8 מיקרוליטר של תמיסת מאגר על כיסויי זכוכית סילניים. לאחר מכן הפוך את החלקות הכיסוי על לוחות התגבשות של 24 בארות ודגירה בטמפרטורה של 16 מעלות צלזיוס לצמיחת גבישים.
    5. עבור אופטימיזציה של קומפלקס DgpB/C, עקוב אחר אותה גישה: ערבב 0.8 מיקרוליטר של קומפלקס חלבון (10 או 20 מ"ג/מ"ל) עם 0.8 מיקרוליטר של תמיסת מאגר המכילה מגנזיום אצטט (16, 18, 20 או 22 מ"מ) ו-PEG 8000 (8%, 9%, 10%, 11%, 12% או 13%). באופן דומה, הגדר טיפות תלויות על כיסויים סילניים מעל צלחות של 24 בארות ודגירה בטמפרטורה של 16 מעלות צלזיוס.
    6. תנו לגבישי החלבון של קומפלקס DgpA ו-DgpB/C לגדול לגודל מלא עד שהם מפסיקים לגדול, ולאחר מכן העבירו את הגבישים לתמיסת השרייה המכילה מאגר מאגר ו-5 מ"מ של תרכובות הסובסטרט (גלוקוז ופוארארין) של קומפלקס DgpA ו-DgpB/C ב-16 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
    7. העבירו את הגבישים, כולל DgpA (עם גלוקוז או ללא מצע) וקומפלקס DgpB/C (ללא מצע), לתמיסה קריופרוטקטנטית המכילה את תנאי חיץ ההשריה בתוספת 25% גליצרול ואחסנו אותם מיד בחנקן נוזלי לאיסוף נתונים.
      הערה: למרות שגם גבישי DgpA וגם גבישי קומפלקס DgpB/C היו ספוגים במצעים (גלוקוז ופוארארין), רק גלוקוז שולב בהצלחה במרכז הקטליטי של DgpA. כתוצאה מכך, התקבלו שלוש צורות גבישים נפרדות לניתוח מבני: DgpA עם גלוקוז (איור 3E); DgpA ללא מצע (איור 3B-C); וקומפלקס DgpB/C ללא מצע (איור 3D). תמיסת ההגנה מפני הקפאה מגנה על גבישי חלבון על ידי מניעת היווצרות קרח במהלך קירור בזק בחנקן נוזלי, ובכך שומרת על שלמותם המבנית וממזערת את הנזק הנגרם מקרינה. התמיסה מנוסחת בדרך כלל באמצעות משקה האם כבסיס, והיא מתווספת לריכוזים אופטימליים של חומרים קריופרוטקטנטים (למשל, גליצרול או אתילן גליקול).
  2. איסוף נתונים וקביעת מבנה
    1. אסוף את נתוני עקיפה של קרני רנטגן של הגביש עבור DgpA עם גלוקוז או בצורות נטולות מצע, וקומפלקס DgpB/C בצורה נטולת מצע במתקן קרינת הסינכרוטרון בשנחאי (SSRF) של המתקן הלאומי למדעי החלבון בשנחאי (NFPS) עם אורך גל תקרית של 0.978 Å.
    2. עבד את שלושת הקבוצות של נתוני עקיפה של קרני רנטגן, כולל קומפלקס DgpA ו-DgpB/C, באמצעות תוכנת עיבוד נתונים קריסטלוגרפית31. ראשית, טען את הנתונים הגולמיים, ולאחר מכן בצע ברצף את פונקציות האינדקס, האינטגרציה וקנה המידה על ידי לחיצה על הכפתורים המתאימים בתוכנה. צור קובץ פלט מעובד (output.sca) המתאים לקביעת המבנה הבא.
    3. קבעו את המבנים של DgpA עם גלוקוז או בצורות נטולות סובסטרט (איור 3B-C, 3E), וקומפלקס DgpB/C ללא מצע (איור 3D) באמצעות שיטת ההחלפה המולקולרית (טבלת החומרים). ואז לחדד את המבנים ואת מפות האלקטרונים על ידי שילוב ליגנדים רלוונטיים (כגון גלוקוז, Mn2+, H2O וכו')31.

3. ניטור פעילות תגובה וקביעת פרמטרים קינטיים

הערה: מערכת DgpA/B/C מתווכת טרנספורמציות C-glycoside באמצעות מפל דו-שלבי מוגדר: DgpA יוזם קטליזה על ידי חמצון חלק הסוכר, ויוצר חומר ביניים שלאחר מכן קומפלקס DgpB/C מבקע או משווה 10,26,27. במחקר זה, DgpA/B/C מתייחס לאנזימים האחראים למפל תגובה זה, בעוד שיש לציין כי לא מתרחשת אינטראקציה ישירה בין DgpA לקומפלקס DgpB/C. ניתן לכמת את הפעילות המשולבת הזו בקפדנות באמצעות שלוש גישות משלימות: ניתוח מוצר HPLC, מבחנים ספקטרופוטומטריים מצומדים DCPIP המנטרים את העברת האלקטרונים, או אפיון קינטי מפורט של פרמטרי התגובה27,32. באופן ספציפי, תוצרי המחשוף C-glycoside (daidzein) שנוצרו על ידי קטליזה DgpA/B/C נותחו על ידי HPLC (זיהוי UV ב-265 ננומטר). היווצרות המוצר כומתה באמצעות עקומת כיול סטנדרטית (השיטה לקביעת העקומה הסטנדרטית מתוארת בפירוט בהערה תחת שלב 3.3.2.), ופרמטרים קינטיים נקבעו על ידי התאמת שיעורי היווצרות המוצר למודל מיכאליס-מנטן באמצעות ניתוח רגרסיה לא ליניארית27,32. בדיקת העיכוב המודדת את השפעת הגלוקוז על מחשוף הקשר הגליקוזידי C-puerarin סיפקה ראיות תומכות לכך שסכרידים יכולים לשמש כסובסטרט ל-DgpA. לאחר מכן, בדיקת DCPIP עוקבת אחר תגובות חמצון סוכר על ידי מדידת ההפחתה של 2,6-דיכלורופנולינדופנול בצבע כחול (DCPIP) ללאוקו-DCPIP חסר צבע מכיוון שהוא מקבל אלקטרונים מסוכרים מחומצנים33, ובכך משקף את הפעילות הקטליטית של DgpA.

  1. ניטור פעילות DgpA/B/C על ידי HPLC
    1. בצע את תגובת המחשוף או האיזומריזציה של C-glycoside מזורז DgpA/B/C ב-500 מיקרוליטר של Buffer F (טבלה 1) המכיל 20 מיקרומטר DgpA וקומפלקס DgpB/C (משלב 1.2.7), ו-0.1 מ"מ של אחד מהם: puerarin או genistein-8-C-glucoside לתגובות מחשוף, או daidzin או genistin לתגובות איזומריזציה27. בצע את התגובות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 8 שעות וסיים אותן על ידי הוספת 1.5 מ"ל מתנול לתערובת התגובה.
    2. צנטריפוגה תמיסת התגובה ב-16,000 × גרם למשך 15 דקות כדי להסיר את משקעי החלבון שנוצרו עקב דנטורציה של אנזים המושרה על ידי מתנול. מסננים את הסופרנטנט באמצעות קרום פילטר של 0.22 מיקרומטר.
    3. בצע ניתוח HPLC עם פליטת שיפוע, בקצב זרימה של 1 מ"ל/דקה עם נפח הזרקה של 10 מיקרוליטר ואורך גל זיהוי של UV 265 ננומטר.
      הערה: השלבים הניידים היו אצטוניטריל (שלב נייד A) וחומצה אצטית מימית 0.1% (שלב נייד B), עם פליטת שיפוע. השיפוע של פליטת הפאזה הניידת הוא כדלקמן: 5%-20% A ב-0-5 דקות, 20%-45% A ב-5-15 דקות, 45%-52% A ב-15-18 דקות, 52%-55% A ב-18-19 דקות, 55%-5% A ב-19-21 דקות ו-5% A ב-21-23 דקות. מערכת האנזימים DgpA/B/C מציגה יעילות קטליטית שונה באופן ניכר כלפי סובסטרטים כגון דאידזין וגניסטין, וכתוצאה מכך שינויים משמעותיים בשיעורי היווצרות המוצר שלהם. כדי להעריך כמותית את קינטיקה של המרת הסובסטרט ודינמיקת הצטברות המוצרים, בוצע ניתוח מקיף של מהלך זמן באמצעות HPLC במרווחים של 0, 2, 4, 6, 12, 16, 20, 24, 36 ו-48 שעות.
  2. ניטור פעילות DgpA עם בדיקת 2,6 -dichlorophenol indophenol (DCPIP)
    הערה: בדיקת DCPIP עוקבת אחר חמצון הסוכר על ידי מדידת ההפחתה של DCPIP כחול ל-leuco-DCPIP חסר צבע מכיוון שהוא מקבל אלקטרונים מסוכרים מחומצנים33. כאן, נעשה שימוש במבחן מדווח DCIPIP כדי לתעד את פעילות החמצון של DgpA כלפי תרכובות גליקוזיליות שונות, חד סוכרים, דו-סוכרים או פוליסכרידים. נעשה שימוש ב-DgpA מסוג Wildtype ובמוטציות הפגומות של קשירת הסוכר שלו כולל D182A, Δ(308-316) ו-Δ(311-316)27.
    1. דגירה של 0.8 מ"מ DCPIP, חלבון 50 מיקרומטר כולל DgpA מסוג בר ושלושת המוטציות הפגומות שלו קושרות סוכר (DgpA D182A, DgpA Δ(308-316), או DgpA Δ(311-316)), עם מצעים של 10 מ"מ כולל פורארין, ויטקסין, גניסטין, עמילן מסיס, מלטוטריוז, לקטוז, סוכרוז, גלוקוז או מלטוז במאגר PBS 1x (pH 7.4).
    2. לאחר 20 שעות של תגובה, רשום את שינוי הספיגה של DCPIP ב-600 ננומטר באמצעות קורא מיקרו-פלטות33.
  3. קביעת קצב העיכוב של גלוקוז בתגובת מחשוף הקשר C-glycosidic של puerarin
    הערה: DgpA שייך למשפחת אנזימי הסוכר אוקסידורדוקטאז, המסוגל לחמצן את חלק הסוכר של C-גליקוזידים. איור 3E מדגים כי גלוקוז קשור למרכז הקטליטי DgpA, והפרוטוקול לקביעת מבנה ה-DgpA מפורט בשלב 2.2.3. כדי לבחון את הקישור התחרותי של DgpA בין גלוקוז לפוארארין C-גליקוזיד, נערכו הניסויים הבאים.
    1. בצע את התגובה במאגר PBS של 1 × (pH 7.4). הוסף ריכוזים שונים של גלוקוז (1 מ"מ, 5 מ"מ, 10 מ"מ, 20 מ"מ, 50 מ"מ, 80 מ"מ ו-100 מ"מ) למערכת תגובת המחשוף C-glycoside (puerarin) כמתואר בשלב 3.1. בצע את התגובה ב-37 מעלות צלזיוס למשך 12 שעות.
    2. לבצע אנליזה כמותית של המוצר (daidzein) באמצעות עקומת הכיול HPLC עבור תרכובת הייחוס (daidzein סטנדרטי). חשב את קצב העיכוב על ידי קביעת ההבדל בתפוקת המוצר בין תגובות המכילות ריכוזי גלוקוז משתנים ותגובות מחשוף C-גליקוזיד לא מעוכבות (ללא גלוקוז), ולאחר מכן חלוקת הבדל זה בתפוקת המוצר מהתגובה הבלתי מעוכבת.
      הערה: כדי ליצור עקומת כיול לניתוח HPLC כמותני, הכינו דילול סדרתי של תקן ייחוס (למשל, puerarin או daidzein) על פני טווח ריכוז (למשל, 0.1-1 מ"מ, במרווחים של 0.1 מ"מ). לנתח כל ריכוז על ידי HPLC, לרשום את אזורי השיא ולשרטט אותם מול הריכוזים הסטנדרטיים המתאימים. בצע ניתוח רגרסיה ליניארית (y = mx + b, כאשר y = שטח שיא, x = ריכוז) כדי לקבוע את העקומה הסטנדרטית. לאחר מכן ניתן להשתמש במשוואת הרגרסיה כדי לשלב ריכוזי דגימות לא ידועים מאזורי השיא הנמדדים שלהם.
  4. קביעת פרמטרים קינטיים
    הערה: הפרמטרים הקינטיים מוכרים באופן נרחב כתקני זהב קריטיים להערכה כמותית של יעילות קטליטית אנזימטית. כדי להעריך כמותית תגובות מזורזות DgpA/B/C, נקבעו הפרמטרים הקינטיים לתגובות מחשוף הפורארין C-glycoside המזרזות על ידי DgpA/B/C.
    1. הכן שיפועי ריכוז C-glycoside (puerarin) של מצע (נע בין 0.01 ל-4 מ"מ במרווחים של פי 2) לתגובת מחשוף C-glycoside מזורזת DgpA/B/C.
    2. בצע את התגובה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 8 שעות על פי השיטה המתוארת בשלב 3.1. בצע ניתוח כמותי של המוצר (daidzein) באמצעות עקומת כיול HPLC של daidzein סטנדרטי. לאחר מכן חשב את קצב התגובה (קצב היווצרות המוצר) על ידי חלוקת הכמות הכמותית בזמן התגובה.
    3. קבע את הפרמטרים הקינטיים של Km ו- kcat על ידי התאמת קצב התגובה המחושב וריכוז הסובסטרט למודל Michaelis-Menten באמצעות תוכנה סטטיסטית (טבלת חומרים).

4. הכנה וזיהוי של תוצר ביניים לתגובה

הערה: מעבר לפעילות המחשוף של C-גליקוזיד, DgpA/B/C גם מזרז את האיזומריזציה של O-גליקוזידים ל-C-גליקוזידים. לכן, כאשר O-גליקוזידים משמשים כמצעים ל-DgpA/B/C, תוצרי הביניים ייוצרו כ-C-גליקוזידים איזומריים. כדי לאפיין את תוצר הביניים (puerarin), תרכובת הביניים טוהרה ולאחר מכן נותחה באמצעות כלים כימיים אנליטיים, כולל ספקטרוסקופיה LC-MS/MS ו-NMR.

  1. הכנת תוצר ביניים של תגובה בתגובת איזומריזציה C-גליקוזיד מזורזת DgpA/B/C 27
    1. הכן את תגובת האיזומריזציה של DgpA/B/C מזורזת O- ל-C-glycoside באמצעות 0.2 מ"מ O-גליקוזיד (daidzin) כסובסטרטים וקומפלקס DgpA ו-DgpB / C של 20 מיקרומטר בנפח תגובה של 90 מ"ל, בהתאם לפרוטוקול המתואר בשלב 3.1 לעיל.
    2. טהר את תוצר הביניים C-glycoside (puerarin) באמצעות HPLC מכין באסטרטגיית פליטת השיפוע (הערה).
      הערה: השלבים הניידים היו אצטוניטריל (שלב נייד A) וחומצה אצטית מימית 0.1% (שלב נייד B), עם פליטת שיפוע. השיפוע של פליטת הפאזה הניידת הוא כדלקמן: 5%-20% A ב-0-5 דקות, 20%-45% A ב-5-15 דקות, 45%-52% A ב-15-18 דקות, 52%-55% A ב-18-19 דקות, 55%-5% A ב-19-21 דקות ו-5% A ב-21-23 דקות.
    3. חשב את הריכוז של תוצר הביניים המטוהר באמצעות עקומת הכיול הסטנדרטית HPLC בשלב 3.3.2, קבל כ-6 מ"ג במערכת התגובה של 90 מ"ל בשלב 4.1.1, ולאחר מכן יבש את מוצרי הביניים המטוהרים עם רכז צנטריפוגלי ואקום לשימוש עתידי.
  2. אפיון תוצר ביניים של תגובה עם LC-MS/MS
    1. אוספים את מוצרי הביניים המיובשים משלב 4.1.3. שקלו 100 מיקרוגרם של חומרי הביניים שמקורם בדאידזין, ולאחר מכן ממיסים אותו ב-2 מ"ל מתנול כדי להשיג ריכוז סופי של 50 מיקרוגרם/מ"ל. צנטריפוגה ב-13,500 x גרם למשך 10 דקות ואוספים את הסופרנטנט לניתוח LC-MS/MS.
    2. השתמש באותה תוכנית שיפוע HPLC בשלב 4.1.2 לניתוח LC-MS/MS עם נפח הזרקה של 5 μL.
  3. אפיון תוצר ביניים של תגובה באמצעות תמ"ג
    1. ממיסים 4 מ"ג מתוצרי הביניים המטוהרים מתגובת הדאידזין ב-340 מיקרוליטר של דימתיל סולפוקסיד-d 6 עבור ספקטרוסקופיה של 1H ו-13C NMR. הגדר את פרמטרי המכשיר כדלקמן: טמפרטורה ב-298 K, shim 3 פעמים, רוחב דופק 18 מיקרון, עיכוב הרפיה 1.5 שניות, 48 סריקות, עם פרמטרים אחרים בהגדרות ברירת המחדל27.
    2. אסוף את ספקטרום ה-NMR 1H ו-13C באמצעות מכשיר NMR של 600 מגה-הרץ.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

ביצוע הנהלים המפורטים ב איור 1ביטאנו לראשונה את הגנים DgpA, DgpB ו-DgpC ב-, E. coli תאי BL21(DE3). מכיוון ש-DgpB ו-DgpC יוצרים קומפלקס אנזימים יציב (קומפלקס DgpB/C)10,26,27,34תאים המבטאים את שני החלבונים הללו שולבו לטיהור משותף., לאחר ליזה של תאים, הסופרנטנט נאסף על ידי צנטריפוגה ב-48,000 xg למשך 40 דקות בטמפרטורה ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

נכון לעכשיו, המאפיינים המבניים והתפקודיים של אנזימי חילוף החומרים C-glycoside בשטח נותרו לא ברורים, ושיטות מחקר מתאימות חסרות 10,24,26. על ידי מינוף היתרונות המשמעותיים של כימיה וביוטכנולוגיה משולבות 40,41,42,43,44,45, המחקר מציע מתודולוגיית מחקר המשתמשת בביולוגיה מבנית, אנזימולוגיה וטכניקות ביוטכנולוגיות אחרות לצד טכנולוגיות כימיות כגון LC-MS/MS ו-NMR כדי לחקור את המבנה והמאפ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.

תודות

מחקר זה ממומן על ידי תוכנית קרן הסטארט-אפ באוניברסיטת בייג'ינג לרפואה סינית (BUCM) (90011451310011) ל-W.M., תוכנית קרן החירום נגד COVID-19 ב-BUCM (1000061223476) ל-W.M., צוות החדשנות ותוכנית טיפוח הכישרונות של המינהל הלאומי של הרפואה הסינית המסורתית (ZYYCXTD-C-202006) ל-W.M. ופרויקט המחקר העצמאי לסטודנטים לתארים מתקדמים ב-BUCM(ZJKT2023012) ל-H.P. אנו מודים לכל חברי המעבדה במעבדת וונפו מא על הדיון המועיל.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
2,6-דיכלורואינדופנול (DCPIP)Solarbio מדע וטכנולוגיהD6350
2-מרקפטואתנול(&בטא;-ME)סיגמא-אולדריץ'08168
  5 & פעמים; טעינת חלבון צבעסנגון ביוטקC508320
חומצה אצטיתשנחאי MACKLINA111247
אצטוניטרילתרמו פישר מדעי ומסחרי;? InvitrogenA12147
Bruker Avance III HD 700 MHz ספקטרומטר NMRBruker AVANCEIII HD 700MHz
Bruker Ultrashield 400 Plus 400MHzBrukerAVANCE III 400 MHz
צנטריפוגה 5424REppendorf022620601
Chirascan™ בתוספת ספקטרומטר CDפוטופיזיקה יישומיתChirascan™  
DaidzeinShanghai Yuanye Bio-TechnologyB20227
DaidzinShanghai Yuanye Bio-TechnologyB20226
Dithiothreitol (DTT)Solarbio Science and TechnologyD8220
E. coli BL21 (DE3) תאים מוכשריםThermo Fisher Scientific™? InvitrogenEC0114
Genisteinשנחאי Yuanye Bio-TechnologyS31565
Genistein-8-C-glucosideShanghai Yuanye Bio-TechnologyBP2095
GenistinShanghai Yuanye Bio-TechnologyS31591
גלוקוזSigma-AldrichG8270
GraphPad פריזמה 9תוכנתGraphPadגירסה? פריזמה 9חשב את הפרמטרים הקינטיים Km ו-kcat
HiLoad Superdex 200 pg preparative SEC columnsCytiva28989335
HisTrap HP עמודות טיהור החלבון שלוCytiva17524802
HiTrap Q FF עמודת כרומטוגרפיה של חילופי אניוניםCytiva17515601
HKL-3000HKL Research Inc  גרסה 723
עמודת HPLC TC-C18(2), 170Å, 5 µ מ', 4.6 x 250 מ"מAgilent Technologies518925-902
איזופרופיל &בטא;-D-1-thiogalactopyranoside? IPTG)Sigma-AldrichPHG0010
לקטוזSigma-Aldrich17814
LC-20AT, כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהיםShimadzuLC20AT
MaltoseSigma-Aldrich47288
MaltotrioseSigma-Aldrich443713
מנגן כלורידשנחאי Yuanye Bio-TechnologyS31112
מתנולתרמו פישר מדעי ומסחרי;? InvitrogenM23142
NAD+Solarbio מדע וטכנולוגיהN8110
אולימפוס SZX12 מיקרוסקופ סטריאוOLYMPUS SZX7
פניל-מתיל-סולפוניל פלואוריד (PMSF)סיגמא-אולדריץ'P7626 
פניקסצוות הפיתוח של פניקס1.21.2פניקס הוא חבילת תוכנה מקיפה לקביעת מבנה גבישי חלבון, המשלבת שיטות SAD (פיזור אנומלי באורך גל יחיד) ו-MR (החלפה מולקולרית) עם תוכנת Phaser.
הכנה לביצועים גבוהים כרומטוגרףנוזלי מים2545/2998
ערכת הקרנת קריסטל חלבוןהמפטון מחקרHR2-110 / HR2-112 / HR2-144 / HR2-126 / HR2-098
Puerarinשנחאי Yuanye ביו-טכנולוגיהB20446
חממת טלטולשנחאי Zhichu Instrument Co., Ltd  ZQZY-AF8
SnakeSkin ומסחר; קרום דיאליזה, 10 kDa MWCO, 35 מ"מתרמו פישר מדעי ומסחרי;? Invitrogen88245
עמילן מסיסSigma-AldrichS9765
Sorvall LYNX 6000 צנטריפוגה סופרספידתרמו פישר מדעי ומסחרי;
SpectraMax i3x קורא מיקרו-פלטות רב-מצביהתקנים מולקולרייםSpectraMax i3x 
ספקטרופוטומטר מיקרו-נפח SpectraMax QuickDrop מפרט מכשיריםמולקולרייםQuickDrop
SucroseSigma-AldrichS5016
SunFire C18 OBD הכנה עמודמים186002741
תרמו פישר מדעי Q EXACTIVEתרמו פישר מדעי ומסחרי;? InvitrogenIQLAAEGAAPFALGMBDK
פרוטאז דמוי יוביקוויטין 1תרמו פישר מדעי ומסחרי;? Invitrogen12588018
מקפיא בטמפרטורה נמוכה במיוחדThermo Fisher Scientific905GP-ULTS
רכז צנטריפוגלי ואקוםבייג'ינג JM TechnologyCV600
VitexinSigma-Aldrich49513
75006590

מקורות

  1. Gomaa, E. Z. Human gut microbiota/microbiome in health and diseases: a review. Antonie Van Leeuwenhoek. 113 (12), 2019-2040 (2020).
  2. Thursby, E., Juge, N. Introduction to the human gut microbiota. Biochem J. 474 (11), 1823-1836 (2017).
  3. Nie, Q., et al. Gut symbionts alleviate MASH through a secondary bile acid biosynthetic pathway. Cell. 187 (11), 2717-2734.e33 (2024).
  4. Xie, L., et al. Comparison of flavonoid O-glycoside, C-glycoside and their aglycones on antioxidant capacity and metabolism during in vitro digestion and in vivo. Foods. 11 (6), (2022).
  5. Zhang, S. -J., Guo, J. -R., Kang, A., Di, L. -Q. Advance in studies on gut microbiota in de-glycosylation of traditional Chinese medicine glycosides. Zhongguo Zhong yao za zhi= Zhongguo Zhongyao ZazhiChina Journal of Chinese Materia Medica. 38 (10), 1459-1466 (2013).
  6. Xie, G. -Z., Hui, H. -Y., Peng, M. -J., Tan, Z. -J. Biotransformation of glycosides in herbal medicine by gut microbiota. World Chinese Journal of Digestology. 26 (4), 221(2018).
  7. Vuong, T. V., Wilson, D. B. Glycoside hydrolases: catalytic base/nucleophile diversity. Biotechnol Bioeng. 107 (2), 195-205 (2010).
  8. Davies, G., Henrissat, B. Structures and mechanisms of glycosyl hydrolases. Structure. 3 (9), 853-859 (1995).
  9. Ito, T., Fujimoto, S., Shimosaka, M., Taguchi, G. Production of C-glucosides of flavonoids and related compounds by Escherichia coli expressing buckwheat C-glucosyltransferase. Plant Biotechnology. 31 (5), 519-524 (2014).
  10. Wei, B., et al. Discovery and mechanism of intestinal bacteria in enzymatic cleavage of C-C glycosidic bonds. Appl Microbiol Biotechnol. 104, 1883-1890 (2020).
  11. Che, Q. M., Akao, T., Hattori, M., Kobashi, K., Namba, T. Metabolism of aloesin and related compounds by human intestinal bacteria: a bacterial cleavage of the C-glucosyl bond and the subsequent reduction of the acetonyl side chain. Chem Pharm Bull (Tokyo). 39 (3), 704-708 (1991).
  12. Wei, B., et al. Discovery and mechanism of intestinal bacteria in enzymatic cleavage of C-C glycosidic bonds. Appl Microbiol Biotechnol. 104 (5), 1883-1890 (2020).
  13. HATTORI, M., et al. Metabolism of barbaloin by intestinal bacteria. Chem Pharm Bull (Tokyo). 36 (11), 4462-4466 (1988).
  14. Che, Q. -M., Akao, T., Hattori, M., Kobashi, K., Namba, T. Isolation of a human intestinal bacterium capable of transforming barbaloin to aloe-emodin anthrone1. Planta medica. 57 (01), 15-19 (1991).
  15. Braune, A., Blaut, M. Deglycosylation of puerarin and other aromatic C-glucosides by a newly isolated human intestinal bacterium. Environ Microbiol. 13 (2), 482-494 (2011).
  16. Braune, A., Blaut, M. Intestinal bacterium Eubacterium cellulosolvens deglycosylates flavonoid C-and O-glucosides. Appl Environ Microbiol. 78 (22), 8151-8153 (2012).
  17. Hasanah, U., Miki, K., Nitoda, T., Kanzaki, H. Aerobic bioconversion of C-glycoside mangiferin into its aglycone norathyriol by an isolated mouse intestinal bacterium. Biosci Biotechnol Biochem. 85 (4), 989-997 (2021).
  18. Kim, D. -H., et al. Intestinal bacterial metabolism of flavonoids and its relation to some biological activities. Arch Pharm Res. 21, 17-23 (1998).
  19. Kim, M., Lee, J., Han, J. Deglycosylation of isoflavone C-glycosides by newly isolated human intestinal bacteria. J Sci Food Agric. 95 (9), 1925-1931 (2015).
  20. Tao, Z., et al. Isolation and identification of Enterococcus gallinarum P581a, a strain of intestinal bacteria deglycosylating flavone C-glycosides. J Gen Appl Microbiol. 68 (3), 125-133 (2022).
  21. Wang, S., et al. A newly isolated human intestinal strain deglycosylating flavonoid C-glycosides. Arch Microbiol. 204 (6), 310(2022).
  22. Xu, J., et al. Application of ultra-performance liquid chromatography coupled with quadrupole time-of-flight mass spectrometry to determine the metabolites of orientin produced by human intestinal bacteria. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 944, 123-127 (2014).
  23. Zheng, S., et al. A newly isolated human intestinal bacterium strain capable of deglycosylating flavone C-glycosides and its functional properties. Microb Cell Fact. 18, 1-10 (2019).
  24. Braune, A., Engst, W., Blaut, M. Identification and functional expression of genes encoding flavonoid O-and C-glycosidases in intestinal bacteria. Environ Microbiol. 18 (7), 2117-2129 (2016).
  25. Kumano, T., et al. FAD-dependent C-glycoside-metabolizing enzymes in microorganisms: Screening, characterization, and crystal structure analysis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 118 (40), e2106580118(2021).
  26. Nakamura, K., Zhu, S., Komatsu, K., Hattori, M., Iwashima, M. Deglycosylation of the isoflavone C-glucoside puerarin by a combination of two recombinant bacterial enzymes and 3-oxo-glucose. Appl Environ Microbiol. 86 (14), e00607-e00620 (2020).
  27. He, P., et al. Structural mechanism of a dual-functional enzyme DgpA/B/C as both a C-glycoside cleaving enzyme and an O- to C-glycoside isomerase. Acta Pharm Sin B. 13 (1), 246-255 (2023).
  28. Wang, Z., et al. Pro isomerization in MLL1 PHD3-bromo cassette connects H3K4me readout to CyP33 and HDAC-mediated repression. Cell. 141 (7), 1183-1194 (2010).
  29. Mossessova, E., Lima, C. D. Ulp1-SUMO crystal structure and genetic analysis reveal conserved interactions and a regulatory element essential for cell growth in yeast. Mol Cell. 5 (5), 865-876 (2000).
  30. Delucas, L. J., et al. Protein crystallization: virtual screening and optimization. Prog Biophys Mol Biol. 88 (3), 285-309 (2005).
  31. Minor, W., Cymborowski, M., Otwinowski, Z., Chruszcz, M. HKL-3000: the integration of data reduction and structure solution--from diffraction images to an initial model in minutes. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 62 (Pt 8), 859-866 (2006).
  32. Li, M., et al. An efficient C-glycoside production platform enabled by rationally tuning the chemoselectivity of glycosyltransferases. Nat Commun. 15 (1), 8893(2024).
  33. Peters, B., et al. Characterization of membrane-bound dehydrogenases from Gluconobacter oxydans 621H via whole-cell activity assays using multideletion strains. Appl Microbiol Biotechnol. 97 (14), 6397-6412 (2013).
  34. Nasseri, S. A., et al. An alternative broad-specificity pathway for glycan breakdown in bacteria. Nature. 631 (8019), 199-206 (2024).
  35. Rose, J. P., Wang, B. C. SAD phasing: History, current impact and future opportunities. Arch Biochem Biophys. 602, 80-94 (2016).
  36. Abramson, J., et al. Accurate structure prediction of biomolecular interactions with AlphaFold 3. Nature. 630 (8016), 493-500 (2024).
  37. Taberman, H., Parkkinen, T., Rouvinen, J. Structural and functional features of the NAD(P) dependent Gfo/Idh/MocA protein family oxidoreductases. Protein Sci. 25 (4), 778-786 (2016).
  38. Jahn, B., et al. Understanding the chemistry of the artificial electron acceptors PES, PMS, DCPIP and Wurster's Blue in methanol dehydrogenase assays. J. Biol. Inorg. Chem. 25, 199-212 (2020).
  39. Yu, L., et al. Biotransformation of puerarin into puerarin-6 ″-O-phosphate by Bacillus cereus. J Ind Microbiol Biotechnol. 39 (2), 299-305 (2012).
  40. Lin, H., et al. Lysineless HiBiT and NanoLuc tagging systems as alternative tools for monitoring targeted protein degradation. ACS Med Chem Lett. 15 (8), 1367-1375 (2024).
  41. Ma, K., et al. A Widespread Radical-Mediated Glycolysis Pathway. J Am Chem Soc. 146 (38), 26187-26197 (2024).
  42. Yang, L., Lei, S., Xu, W. Rising above: exploring the therapeutic potential of natural product-based compounds in human cancer treatment. Tradit Med Res. 10 (3), 18(2025).
  43. Zhu, C., Cook, S. P. A concise synthesis of (+)-artemisinin. J Am Chem Soc. 134 (33), 13577-13579 (2012).
  44. Schade, A. E., et al. AKT and EZH2 inhibitors kill TNBCs by hijacking mechanisms of involution. Nature. , 1-9 (2024).
  45. Karpinska, K., et al. Selective degradation of MLK3 by a novel CEP1347-VHL-02 PROTAC compound limits the oncogenic potential of TNBC. J Med Chem. 67 (17), 15012-15028 (2024).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

CLC MSNMR

מאמרים קשורים