מאמר שיטה

מודל תכנות מחדש של מקרופאגים שמקורם במונוציטים אנושיים לבדיקות חוץ גופיות

DOI:

10.3791/67651

⸱

18 באפריל 2025

 , 
1Instituto de Medicina Experimental (IMEX), Academia Nacional de Medicina-CONICET, 2Instituto de Farmacología, Facultad de Medicina, Universidad de Buenos Aires

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מונוציטים ומקרופאגים הם תאים חיסוניים פלסטיים מאוד וניתנים לתכנות מחדש החיוניים לבריאות ולמחלות. הם חשים ומגיבים למגוון רחב של גירויים על ידי אימוץ תוכניות בידול ופנוטיפים ספציפיים. תקננו מודל מבחנה לחקר קיטוב ותכנות מחדש של מקרופאגים, ומספק כלי רב ערך למחקר.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תאים משושלת מונוציטים-מקרופאגים הם רב-תכליתיים ונמצאים כמעט בכל רקמות הגוף. הם מתאמים את שלבי ההתחלה והפתרון של חסינות מולדת ונרכשת, ומשפיעים באופן משמעותי על חסינות ההגנה ופגיעה פתולוגית בתיווך חיסוני. בעוד שמקרופאגים שוכני רקמות הם שחקני מפתח בשמירה על הומאוסטזיס במצב יציב, כמויות גדולות של מונוציטים מגויסות מהדם ההיקפי לרקמה בעקבות נזק או עלבונות דלקתיים. מקרופאגים שמקורם במונוציטים (M-DM) יכולים להתמיין לתת-סוגים דינמיים רבים, והפנוטיפים והתפקודים שלהם תלויים בסביבת הרקמה המקומית.

כדי להשוות גירויים או תנאים סביבתיים שונים במהלך התמיינות וקיטוב M-DM, תיקננו מודל מבחנה של M-DM M0 אנושי לא מקוטב וכמה מקרופאגים מקוטבים ציטוקינים קרדינליים, M1 שמקורו ב-IFNγ/LPS, M2a נגזר מ-IL-4 ו-IL-10 או M2c שמקורו בדקסמתזון, כדי לנתח תכנות מחדש של M-DM על ידי ציטומטריית זרימה ו-PCR בזמן אמת. מצאנו ש-CD64, CD206, CD163, CD14 ו-MERTK יכולים להבחין בבירור בין M0 לא מקוטב ו-M1, M2a ו-M2c מקוטבים על ידי ציטומטריית זרימה. יתר על כן, הגדרנו IRF1 ו-CXCL10 כגנים ספציפיים עבור תעתיקים קלאסיים של M1-, IRF4-, CCL22-, ו-TGM2 שמקורם ב-IFNγ/LPS עבור M2a שמקורו ב-IL-4, וגן MERTK עבור M2c שמקורו בדקסמתזון. לסיכום, פרוטוקול ה-M-DM הסטנדרטי שלנו יכול לתת את המפה הקרדינלית במבחנה כדי לנתח את ההתמיינות והקיטוב של M-DM אנושי תחת גירויים מגוונים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מקרופאגים, שזוהו לראשונה על ידי מצ'ניקוף בשל יכולתם הפגוציטית, הם תאים עתיקים הבסיסיים לחיים מטזואנים. הם נמצאים בכל מקום ביונקים בוגרים, ומציגים מגוון אנטומי ותפקודי יוצא דופן. כחלק מהמערכת הפגוציטית החד-גרעינית, לצד תאים דנדריטיים ומונוציטים, מקרופאגים ממלאים תפקידים מכריעים בתהליכים ביולוגיים שונים, החל מהתפתחות והומאוסטזיס ועד לתגובות חיסוניות כנגד פתוגנים1,2. מקרופאגים תושבים, המתמחים במיקרו-סביבות הרקמה שלהם, פועלים כזקיפים, מנטרים את בריאות הרקמות ומגיבים לשינויים פיזיולוגיים ואיומים חיצוניים. הפלסטיות המוגבלת שלהם נחשבת להסתגלות אבולוציונית לשמירה על הומאוסטזיס של רקמות. לעומת זאת, מונוציטים מגויסים הם גמישים יותר ויכולים להתמיין לפנוטיפים מגוונים של מקרופאגים במהלך דלקת. השפעה כפולה זו של דלקת ונישת רקמות מעצבת את המגוון התפקודי של מקרופאגים3. לפיכך, בהתאם לסביבת הרקמה המקומית, מקרופאגים שמקורם במונוציטים (M-DM) יכולים להתמיין לתת-סוגים רבים. המטבוליטים המקומיים, גורמי הגדילה, הציטוקינים והאינטראקציה בין תאים4,5,6 מתארים את הפנוטיפים והפונקציות שלהם. יתר על כן, מקרופאגים הם יצרנים מרכזיים של גורמים המדכאים דלקת ומניעים כלי דם מחדש ותיקון רקמות7,8.

בהתחשב בכך שלפחות שלושה קיטוב בקרת זרועות עיקריים (תנאי סביבה חיצוניים, פנימיים ורקמות), יש לראות את קיטוב המקרופאגים כרב מימדי2. המכשולים והמלכודות העיקריים בתיאור התמיינות וקיטוב מקרופאגים הם תנאי הניסוי ההטרוגניים בספרות והיעדר הסכמה על הגדרת מונחי מקרופאגים בניסויים in vitro ו-in vivo9. עם זאת, החל איחוד מסוים של תקני ניסוי עבור תרחישי ניסוי מגוונים.

כדי להבין טוב יותר את שדה המקרופאגים האנושיים, אנו זקוקים למודלים סטנדרטיים ומוגדרים היטב של M-DM כדי לקשר, בידול, קיטוב, פנוטיפ ותכנות מחדש, כמו גם פונקציות ספציפיות. המטרה שלנו הייתה להגדיר מודל סטנדרטי במבחנה של M-DM M0 אנושי לא מקוטב ומקרופאגים מקוטבים ציטוקינים כדי לחקור תכנות מחדש של M-DM על ידי זרימה ציטומטרית ו-PCR בזמן אמת. למרות שקיטוב מקרופאגים הוא תהליך דינמי בגלל הפלסטיות הגבוהה שלהם ויכולתם לשלב אותות מרובים מסביבתם, אפיינו כאן את ה-M-DM הלא מקוטב (M0) וכמה מצבי קיטוב במבחנה, כפרו-דלקתיים קלאסיים, המוכרים בדרך כלל גם כ-M1, המושרה עם IFNγ ו-LPS. באופן דומה, ניתן להגדיר את המקרופאגים לתיקון רקמות ווויסות M2 כ-M2a כאשר הם מושרים עם IL-4 ו-M2c כאשר הם מגורים עם דקסמתזון או IL-10. מצבי קיטוב אלה לוכדים תמונת מצב של הספקטרום הרחב של סביבת M-DM בזמן ובמרחב, אך נותנים לנו כמה נקודות קרדינליות כדי לקבוע את המפה האנליטית היכן לאתר את תנאי הבדיקה.

למרות השילוב המורכב והדינמי של סמני פני השטח ותוכניות שעתוק, בעת ניתוח M-DM במבחנה, קבענו ש-CD64, CD206, CD163, CD14 ו-MERTK יכולים להפריד בין מצב M0 לא מקוטב, מ-M1 המושרה על ידי IFNγ/LPS, M2a המושרה על ידי IL-4 ו-IL-10 או דקסמתזון המושרה על ידי ציטומטריית זרימה. יתר על כן, ביטוי הגנים IRF1 ו-CXCL10 הוגדר כספציפי ל-M1 המושרה על ידי IFNγ/LPS; תעתיקים ספציפיים ל-IRF4, CCL22 ו-TGM2 עבור M2a שמקורו ב-IL-4; וגן MERTK ל-M2c שמקורו בדקסמתזון, תוך קביעת נקודות קרדינליות נוספות להשוואת התכנות מחדש של M-DM המאותגר עם גירויים שונים או אפילו בתרבית משותפת עם סוגי תאים אחרים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל תורמי הדם המתנדבים הבריאים סיפקו הסכמה מדעת בכתב, והמחקר אושר על ידי ועדת האתיקה המוסדית של האקדמיה הלאומית לרפואה (IMEX-CONICET-ANM) ארגנטינה. עיין בטבלת החומרים לפרטים על כל החומרים והריאגנטים המשמשים בפרוטוקול זה.

1. בידוד תאים חד-גרעיניים בדם היקפי (PBMCs)

הערה: PBMCs מבודדים מ-40 מ"ל של דם היקפי נוגד קרישה עם נתרן ציטראט ב-3.8% ובאמצעות צנטריפוגה של שיפוע צפיפות Ficoll-Hypaque (1077). פרוטוקול זה מבוצע בתנאים סטריליים בארון בטיחות ביולוגית BSL2.

  1. העבר את דגימת הדם ההיקפית נוגדת הקרישה שהתקבלה לצינורות מתאימים של 15 מ"ל או 50 מ"ל לצנטריפוגה.
  2. דגימות דם צנטריפוגות ב-200 × גרם למשך 15 דקות (תאוצה: 4 האטה: 2, כאשר המקסימום הוא 5) בטמפרטורת החדר כדי לקבל פלזמה עשירה בטסיות דם (PRP) בחלק העליון והסלולרי, כולל תאי דם אדומים ולבנים למטה. ראה איור 1.
  3. העבירו את השבר העליון (PRP) לצינורות של 15 מ"ל (אם תאוחסן פלזמה), וצנטריפוגה ב-600 × גרם למשך 10 דקות (תאוצה והאטה מקסימלית) כדי להשיג את שבר הפלזמה הסופי ללא טסיות דם. אחסן פלזמה בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
  4. לדלל את החלק הסלולרי המתקבל מהצנטריפוגה הראשונה, פי 2 (מינימום) עד פי 3 (מקסימום) באמצעות תמיסת מלח סטרילית 1x פוספט (1x PBS) שחוממה מראש בטמפרטורת החדר. הומוגניזציה בעדינות והשתמש בשבר המדולל הזה עבור צנטריפוגת שיפוע צפיפות Ficoll-Hypaque.
  5. העבירו 15 מ"ל של Ficoll-Hypaque לצינור סטרילי של 50 מ"ל. לאחר מכן, הוסיפו בזהירות ובאטיות 30 מ"ל של דם מדולל על גבי הפיקול, הימנעו מערבוב השלבים. אם עובדים עם 10 מ"ל או פחות של דם מדולל, העבירו 4 מ"ל של Ficoll-Hypaque לתוך שפופרת של 15 מ"ל ולאחר מכן הוסיפו את 10 מ"ל דגימת הדם המדוללת.
    הערה: שלב זה הוא קריטי להשגת השבר החד-גרעיני.
  6. צנטריפוגה הצינור המכיל את הפיקול פלוס דם מדולל ב-600 × גרם למשך 25 דקות (תאוצה: 1; האטה: 0) בטמפרטורת החדר.
  7. הסר חלק מהשכבה העליונה הצהובה בעזרת פיפטה פסטר סטרילית בנפח 3 מ"ל. לאחר מכן, אספו בזהירות את הממשק (שבר "טבעת" חד-גרעיני) שנוצר בין השכבה העליונה הצהובה לשכבת פיקול בעזרת פיפטה פסטר סטרילית. "טבעת" זו מכילה את התאים החד-גרעיניים (PBMC) המעניינים.
    הערה: ניתן לאסוף חלק משלב הפלזמה הנותר, אך הקפד להימנע משלב Ficoll, מכיוון שהוא עלול להיות רעיל עבור PBMCs.
  8. העבר את ה-PBMCs שנאספו לצינור חדש של 15 מ"ל המכיל מינימום של 3 מ"ל של PBS סטרילי 1x. לאחר מכן, מלא את הנפח המתאים של 1x PBS סטרילי עד 12-15 מ"ל. צנטריפוגה את ה-PBMCs ב-600 × גרם (תאוצה והאטה מקסימלית) למשך 10 דקות.
  9. השליכו את הסופרנטנט ושטפו שוב את ה-PBMCs. השעו מחדש את גלולת התא על ידי הוספת 1 מ"ל של PBS סטרילי 1x, ולאחר מכן מלאו עד 12-14 מ"ל עם PBS סטרילי נוסף 1x. צנטריפוגה את הצינורות ב-600 × גרם (תאוצה והאטה מקסימלית) למשך 10 דקות.
  10. השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את גלולת ה-PBMC ב-PBS סטרילי 1x המכיל 2% של סרום בקר עוברי מומת (1x PBS-2% FBS) והביאו את הנפח עד 10 מ"ל. השתמש במונה תאים אוטומטי או ספור את התאים, הכין תרחיף תאים 1:5 מדולל ב-PBS קר סטרילי 1x ולאחר מכן (1:2) ב-Trypan Blue כדי לקבל דילול סופי של 1:10. השתמש במיקרוסקופ אור לספירה.
  11. סובב את תרחיף ה-PBMC ב-300 × גרם למשך 5 דקות ב-8-10 מעלות צלזיוס. השאירו את התאים הללו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד לשלב הבא.
    הערה: אם PBMCs שנאספו לא ישמשו באותו יום, מומלץ להקפיא בבקבוקון קריוגני ב-108 תאים/מ"ל במצע הקפאה מתאים (90% מה-FBS מכילים 10% של דימתיל סולפוקסיד, DMSO). יש לאחסן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס במיכל פוליאתילן גליקול למשך הלילה כדי לאפשר לתאים לקפוא לאט, ובכך למזער את הנזק לתאים. למחרת, העבירו את התאים לקופסת אחסון והשאירו אותם בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס למשך מספר ימים או העבירו למיכל חנקן נוזלי לתקופת אחסון ארוכה.

2. מיון מונוציטים CD14+ באמצעות חרוזים מגנטיים

הערה: כמות המונוציטים CD14 המצויים ב-PBMCs של תורמים בריאים משתנה בהתאם לגיל ולמין. כאשר זמין, השתמש במונה תאים כדי להשיג את אחוז המונוציטים בכל דגימה ולאחר מכן חשב את מספר ה-PBMCs הדרושים למיון מונוציטים CD14 הנדרשים. אם אין מונה תאים זמין, 10% מהמונוציטים לדגימת PBMC יכולים להיחשב כגישה רחבה4,6,7,10,11,12,13.

CD14+ מונוציטים מבודדים באמצעות ערכת בחירה חיובית CD14 אנושית5. תיקננו את פרוטוקול הבידוד באמצעות 1 עד 2 × 107 PBMCs ב-100 מיקרוליטר של תגובה; השתמש ביחס זה למספרים גבוהים יותר. נפח התגובה המינימלי המוצע הוא 100 מיקרוליטר, אפילו עם מספר תאים נמוך יותר מ-1 ×-10 7 PBMCs.

  1. הכן תרחיף תאי PBMC בריכוז של 1-2 × 108 תאים/מ"ל ב-1x PBS-2% FBS המכיל 1 מ"מ של חומצה אתילנדיאמינטטראצטית (1x PBS-2% FBS-1 מ"מ EDTA) והעביר את הכמות הרצויה של PBMCs לתוך צינור פוליסטירן עגול תחתון של 5 מ"ל.
  2. הוסף 10 מיקרוליטר של קוקטייל בחירה חיובית לכל 100 מיקרוליטר של תרחיף תאים, ערבב היטב ודגר בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.
  3. הוסף 10 מיקרוליטר של ננו-חלקיקים מגנטיים לכל 100 מיקרוליטר של תרחיף תאים, פיפטה במרץ למעלה ולמטה יותר מפי 5 כדי להשעות באופן אחיד את הננו-חלקיקים המגנטיים, ולדגור בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.
    הערה: מערבולת אינה מומלצת.
  4. הוסף 1x PBS-2% FBS-1 mM EDTA buffer כדי להעלות את הנפח הכולל של מתלה התא ל-2.5 מ"ל. פיפטה בעדינות את התאים בצינור למעלה ולמטה פי 2-3. הכנס את הצינור לתוך סדרן המגנטים והניח אותו בנפרד למשך 5 דקות.
  5. קח את המגנט והפוך אותו ואת הצינור בתנועה רציפה אחת, והשליך את השבר העל-טבעי. התאים המסומנים מגנטית יישארו בתוך הצינור. השאר את המגנט והצינור הפוכים למשך 2-3 שניות, ולאחר מכן סובב אותם אנכית זקופה.
    הערה: השאירו טיפות תלויות מפי הצינור; אין לנער או למחוק אותם.
  6. הסר את הצינור מהמגנט והוסף שוב 2.5 מ"ל של מאגר 1x PBS-2% FBS-1 mM EDTA לתוך הצינור. פיפטה בעדינות את מתלה התא למעלה ולמטה פי 2-3 כדי לערבב אותו. הכנס את הצינור בחזרה למגנט והפריד אותו למשך 5 דקות.
  7. בתנועה רציפה אחת, הפוך גם את המגנט וגם את הצינור, והשליך את השבר העל. הסר את הצינור מהמגנט והשהה מחדש את התאים בכמות מתאימה של 1x PBS-2% FBS buffer (ללא EDTA). התאים שנבחרו באופן חיובי מוכנים כעת לשימוש.
    הערה: בסך הכל נדרשות שתי הפרדות של 5 דקות במגנט.
  8. שטפו תאי CD14 ממוינים תוך שימוש במאגר PBS-2% FBS אחד, מה שמביא את תרחיף התאים ל-12-14 מ"ל כדי לדלל את כל ה-EDTA שנותר, ולאחר מכן צנטריפוגה ב-600 × גרם (תאוצה והאטה מקסימלית) למשך 10 דקות.
  9. השליכו את הסופרנטנט וחזרו על הכביסה על ידי השעיה מחדש של כדור התא עם 1 מ"ל של 1x PBS-2% FBS מאגר תחילה ולאחר מכן הגדילו את הנפח ל-12-14 מ"ל. צנטריפוגה את הצינורות ב-600 × גרם (תאוצה והאטה מקסימלית) למשך 10 דקות.
  10. השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את המונוציטים החיוביים שנבחרו CD14 ב-2 מ"ל של מאגר FBS 1x PBS-2%. השתמש במונה התאים האוטומטי או ספור את התאים על ידי דילול תרחיף התאים (1:5) ב-PBS סטרילי קר 1x ולאחר מכן (1:2) בטריפן כחול באמצעות מיקרוסקופ אור. השאירו את התאים על הקרח עד להכנת התרבית.
    הערה: ניתן לבדוק את טוהר התא על ידי ציטומטריית זרימה, לקיחת 50 מיקרוליטר מתרחיף התא וצביעה לתאי CD14+ (שיבוט HCD14). מומלץ טוהר של יותר מ-90%.
  11. לצורך תרבית, סובב את תרחיף התא ב-300 × גרם למשך 5 דקות ב-8-10 מעלות צלזיוס. השהה מחדש את הגלולה בריכוז של 106 תאים/מ"ל באמצעות RPMI 1640 בתוספת 10% FBS מומת ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין (RPMI-10% FBS-1% P/S).< /> הערה: זה קריטי להשתמש ב-FBS איכותי, בעל אנדוטוקסין נמוך, מנוטרל בחום. שמור תמיד על קרח כדי למנוע הידבקות מונוציטים לקיר הפלסטיק לפני הציפוי.

3. התמיינות וקיטוב של מקרופאגים שמקורם במונוציטים (M-DM)

הערה: תרבית M-DM מתבצעת על ידי ציפוי מונוציטים של 2.5 × 105 CD14+ בצלחות של 48 בארות המכילות 500 מיקרוליטר של RPMI-10% FBS-1% P/S ומתורבת בחממה לחה ב-37 מעלות צלזיוס עם CO2 (5%) למשך 7 ימים. בחר צלחות מטופלות כדי לשפר את היצמדות המונוציטים לצלחת.

  1. הגדר את כל תנאי הניסוי להפעלה, כולל בארות ל-M-DM בסיסי (M0), ה-M1 הדלקתי, תיקון הרקמות M2a, ה-M2c הרגולטורי ותנאי הבדיקה הרצויים.
  2. פיפטה 250 מיקרוליטר של תרחיף התאים שהוכנה בשלב 2.11 לזרע 2.5 × 105 מונוציטים CD14+ בכל באר.
  3. הוסף 250 מיקרוליטר של RPMI-10% FBS-1% P/S בתוספת 50 ננוגרם/מ"ל של M-CSF לכל באר כדי להשלים את הנפח הכולל של 500 מיקרוליטר.
  4. דגרו את צלחת תרבית התאים באינקובטור לח בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2 למשך 4 ימים כדי לאפשר את השלב הראשון של התמיינות מקרופאגים.
    הערה: בדוק מעת לעת את התמיינות תרבית התאים כדי לראות אם התרחשו שינויים מורפולוגיים כצפוי או אם קיימים תאים לא מחוברים לא רצויים.
  5. החלף מחצית ממצע התרבית (250 מיקרוליטר של RPMI-10% FBS-1% P/S) ביום הרביעי של תרבית M-DM. הוסף ציטוקינים או ריאגנטים לתנאי הקיטוב ותרבית אותם למשך 3 ימים (נקודת הסיום היא יום 7): LPS (1 ננוגרם/מ"ל) בתוספת IFNγ (50 ננוגרם/מ"ל) עבור M1, IL-4 (40 ננוגרם/מ"ל) עבור M2a, IL-10 (50 ננוגרם/מ"ל) או דקסמתזון (0.1 מיקרומטר) עבור M2c.
  6. קציר M-DM ביום 7 כדי לבצע אפיון פנוטיפי, לאסוף אותם לביטוי mRNA כפי שמצוין בשני השלבים הבאים, או לבצע בדיקה פונקציונלית.

4. אפיון פנוטיפ פני השטח ב-M-DM מקוטב על ידי ציטומטריית זרימה

  1. השלך את הנפח הבינוני הכולל של התרבות (500 מיקרוליטר של צלחת של 48 בארות) והוסף 200 מיקרוליטר של מאגר EDTA 1x PBS-2% FBS-1 mM לקצירת תאים. דגירה למשך 20 דקות על קרח ולאחר מכן הוסף 200 מיקרוליטר של 1x PBS-2% FBS כדי לדלל את מאגר ה-EDTA. אסוף את ה-M-DM על ידי פיפטינג למעלה ולמטה במיקרו-צינורות של 1.5 מ"ל. שטפו את התאים שנקטפו פעם אחת עם 1x PBS-2% FBS וצנטריפוגה בחום של 800 × גרם למשך 3 דקות.
  2. השעו מחדש את גלולת ה-M-DM עם 200 מיקרוליטר של 1x PBS-5% FBS והעבירו אותם למיקרו-פלטה תחתונה עגולה של 96 בארות לחסימה בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות×.
  3. הכן את השילוב המתאים של נוגדנים מצומדים ישירות ב-1x PBS- 2% FBS. יש לצבוע כל באר או מצב (1x) ב-50 מיקרוליטר של לוח הנוגדנים ולדגור בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות בחושך.
    הערה: כאן, פאנל הנוגדנים כלל CD11b-APC/Cy7, CD64-APC, CD163-PerCP/Cy5.5, CD206-AlexaFluor 488, CD14-PECy7 ו-MERTK-ביוטין בתוספת סטרפטווידין-PE. ריכוז הנוגדנים המוקדמים מופיע בטבלה 1.
  4. שטפו את ה-M-DM המוכתם על ידי הוספת 150 מיקרוליטר של 1x PBS וצנטריפוגטה ב-800 × גרם למשך 3 דקות.
  5. כדי למדוד את כדאיות התא, הוסף 100 מיקרוליטר של צבע הכדאיות הניתן לתיקון זומבי סגול (1:1,000 ב-1x PBS) ודגר ב-4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות בחושך.
  6. שטפו את התאים המוכתמים על ידי הוספת 100 מיקרוליטר של 1x PBS וצנטריפוגה בטמפרטורה של 800 × גרם למשך 3 דקות. חזור על הליך הכביסה באמצעות 200 מיקרוליטר של 1x PBS.
  7. תקן על ידי השעיית כדור ה-M-DM עם 100 מיקרוליטר של המגיב המקבע (מערכת הקיבוע/חדירה) ודגירה למשך 20 דקות על קרח ובחושך.
    הערה: כדי להשיג קיבוע מתאים, חיוני להומוגניזציה נכונה של גלולת התא
    8. .
  8. שטפו את ה-M-DM על ידי הוספת 100 מיקרוליטר של 1x PBS-2% FBS וצנטריפוגה ב-800 × גרם למשך 3 דקות. חזור על הליך הכביסה באמצעות 200 מיקרוליטר של 1x PBS-2% FBS.
  9. השעו מחדש את גלולת ה-M-DM ב-200 מיקרוליטר של 1x PBS והפעל את התאים המוכתמים בציטומטר הזרימה.

5. פרופיל תוכנית גנים להבחנה בין קיטוב M-DM על ידי qPCR

הערה: ביום השביעי של התרבית, ניתן לקצור 2.5 × 105 M-DM באמצעות מגיב מיצוי RNA לבידוד של RNA כולל באיכות גבוהה. ניתן לבצע בידוד RNA גם בשיטות חלופיות, כגון מיצוי RNA מבוסס עמודות וערכת שטיפה.

  1. השלך את נפח התרבות הכולל ואת ה-M-DM הליזי על ידי הוספה ישירה של 350 מיקרוליטר של מגיב המיצוי. הומוגניזציה והעברת תרחיף תאים זה למיקרו-צינור נטול RNase / DNase בנפח 1.5 מ"ל והמשך בבידוד ה- RNA.
    הערה: אם בידוד RNA לא יבוצע באותו יום, ניתן לאחסן את הדגימה משלב 5.1 בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה או -20 מעלות צלזיוס עד שנה.
  2. כדי לאפשר דיסוציאציה מוחלטת של קומפלקס הנוקלאופרוטאינים, דגרו את הדגימות ההומוגניות משלב 5.1 למשך 5 דקות ב-25 מעלות צלזיוס
  3. הוסף 70 מיקרוליטר כלורופורם לכל דגימה. יש לכסות היטב כל צינור כדי למנוע דליפה ולערבב היטב את התכולה על ידי ניעור הצינור. דגרו את הדגימות למשך 2-3 דקות ולאחר מכן, צנטריפוגה את הדגימות ב-12,000 × גרם למשך 15 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. שלב זה יפריד את השלבים באופן מלא לשלב פנול-כלורופורם תחתון, אינטרפאזה ושלב מימי עליון חסר צבע.
    הערה: נפח הכלורופורם מבוסס על יחס של 0.2 מ"ל כלורופורם לכל 1 מ"ל של מגיב מיצוי המשמש בשלב הליזיס.
  4. העבירו את הפאזה המימית המכילה את ה-RNA למיקרו-שפופרת חדשה של 1.5 מ"ל RNase-/DNase.
    הערה: השאירו מאחור נפח קטן בעת נטילת השלב המימי כדי למנוע העברת כל אחת מהשכבות הבין-פאזיות או האורגניות.
  5. הוסף 175 מיקרוליטר של איזופרופנול לכל דגימה כדי לזרז את ה-RNA. יש לדגור למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס או לחילופין למשך הלילה בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס><. הערה: נפח האיזופרופנול מבוסס על יחס של 0.5 מ"ל איזופרופנול למ"ל של מגיב מיצוי ראשוני.
  6. צנטריפוגה את הדגימות ב-12,000 × גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. כדור לבן דמוי ג'ל של RNA כולל ישקע בתחתית הצינור. הסר בזהירות והשליך את הסופרנטנט באמצעות מיקרופיפטה.
  7. שטפו את ה-RNA על ידי השעיית הגלולה הלבנה דמוית הג'ל ב-350 מיקרוליטר של 75% אתנול (1 מ"ל לכל 1 מ"ל של מגיב מיצוי (v/v) המשמש לליזה).
    הערה: ניתן לאחסן את ה-RNA ב-75% אתנול עד שנה ב-20 מעלות צלזיוס או עד שבוע ב-4 מעלות צלזיוס.
  8. מערבל בקצרה את הגלולה והצנטריפוגה המושעה ב-7,500 × גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. הסר והשליך את הסופרנטנט באמצעות מיקרופיפטה. יבש באוויר או שואב את כדור ה-RNA למשך 5-10 דקות.
    הערה: כדי להמיס את ה-RNA, הימנע מייבוש יתר של כדור ה-RNA.
  9. השהה מחדש את הגלולה ב-20-30 מיקרוליטר של מים נטולי RNase על ידי צנרת למעלה ולמטה. דגירה באמבט מים או בלוק חום המוגדר על 55-60 מעלות צלזיוס למשך 10-15 דקות. המשך למדוד את ריכוז ה-RNA ולאחסן את ה-RNA ב-70 מעלות צלזיוס.
  10. בצע את השעתוק ההפוך (עותק cDNA) באמצעות 100-500 ננוגרם של RNA (מינימלי ומקסימלי, בהתאמה) בנפח תגובה של 20 מיקרוליטר על ידי שימוש בערכת סינתזה של cDNA.
  11. הפעל את תגובות ה-PCR בזמן אמת באמצעות 1 מיקרוליטר של cDNA (5-25 ננוגרם).
    1. הכן את תערובת התגובה לכל צינור (1x) באמצעות 5 מיקרוליטר של תערובת ירוקה SYBR (2x), 0.2 מיקרוליטר מכל פריימר (קדימה ואחורה) ו-3.6 מיקרוליטר מים נטולי נוקלאז. קנה מידה של כל הרכיבים בהתאם למספר המדגם. מערבבים היטב את תערובת התגובה ומוציאים 9 מיקרוליטר לכל צינור qPCR ולבסוף את 1 מיקרוליטר של cDNA כדי להגיע לנפח הכולל הסופי של 10 מיקרוליטר.
    2. תכנת את פרוטוקול הרכיבה התרמית במכשיר PCR בזמן אמת באופן הבא: 2-3 דקות ב-98 מעלות צלזיוס (1x); 5-15 שניות ב-98 מעלות צלזיוס ועוד 15-30 שניות ב-60 מעלות צלזיוס (35-40x); לבסוף כלול ניתוח עקומת התכה (65-95 מעלות צלזיוס) עם מרווח של 0.5 מעלות צלזיוס ב-2-5 שניות לצעד או השתמש בהגדרת ברירת המחדל של המכשיר.< /> הערה: תגובה זו הייתה סטנדרטית תוך שימוש בתערובת האוניברסלית SYBR Green. פריימרים המומלצים לניתוח קיטוב M-DM מפורטים בטבלה 2.
  12. נרמל את התוצאות באמצעות כגן הייחוס גורם התארכות התרגום האיקריוטי 1 אלפא 1 (EEF1A1), ובדוק את הספציפיות של התוצרים המוגברים באמצעות ניתוח עקומות הדיסוציאציה.
    הערה: ניתוח עקומת הדיסוציאציה מאפשר לאשר את נוכחותו של תוצר הגברה qPCR אחד בלבד בתגובה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בהתבסס על עבודתנו באפיון מקרופאגים במשך מספר שנים, קבענו שילוב מדויק של סמנים המבדיל בבירור בין תת-הקבוצות השונות של M-DM במבחנה. סמני הפנוטיפ נבחרו על סמך הספרות וההקרנה הקודמת הרחבה שביצענו בעבר9,14,15,16,17. יתר על כן, קבענו ש-CD64, CD206, CD163, CD14 ו-MERTK יכולים לעזור להבחין בבירור בין M-DM לא מקוטב (M0), M1 מקוטב המושרה על ידי IFNγ/LPS, M2a המ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

התמיינות, הפעלה וקיטוב של מקרופאגים הפכו למוקד מרכזי באימונולוגיה, הומאוסטזיס של רקמות, פתוגנזה של מחלות ופתרון דלקות. בנוסף, התמונה המתהווה לפיה מקרופאגים ברקמות עשויים להיגזר ממונוציטים במחזור בתנאים של הומאוסטזיס משובש מדגישה את הצורך במודלים מדויקים של M-DM המאופיינים בפנוטיפים מוגדרים, תוכניות שעתוק ומסלולי הפעלה.

יש לדון כאן בכמה שלבים קריטיים בפרוטוקול זה לצורך יישומו המוצלח. ראשית, יש לציין כי דגימות דם שמהן נוצרות תרביות M-DM ראשוניות עשויות להיות הטרוגניות מבחינת גיל, מין, רקע גנטי א...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי אינטרסים לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי הסוכנות הלאומית לקידום המדע והטכנולוגיה (ANPCyT-FONCYT) באמצעות מענקים PICT 2018-3070 ו-2021-I-A-00807 ל-E.A.C.S. ו-PICT 2021-I-A-00716 ל-A.E.E, ועל ידי המועצה הלאומית למחקר מדעי וטכני (CONICET) באמצעות המענק PIP 2022-0763 ועל ידי אוניברסיטת בואנוס איירס באמצעות Proyectos de Investigación y Desarrollo en Áreas Estratégicas con Impacto Social (PIDAE) 2022 ל A.E.E. E.A.C.S. ו-A.E.E. הם חוקרי קריירה ב-CONICET.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
אלקסה פלואור 488 עכבר אנטי אנושי  שיבוט נוגדנים CD206 15-2BioLegend, סן דייגו, קליפורניה, ארה"ב.חתול# 321113; RRID:AB_571874
עכבר APC אנטי אנושי CD64 נוגדן שיבוט 10.1BioLegend, סן דייגו, קליפורניה, ארה"ב.חתול# 305013; RRID:AB_1595539
APC/Cy7 חולדה נגד עכברים/שיבוט נוגדנים CD11b אנושי M1/70BioLegend, סן דייגו, קליפורניה, ארה"ב.חתול# 101226; RRID:AB_830642
BD Cytofix/CytopermBD Biosciences, סן חוזה, קליפורניה, ארה"בCat# 554714ערכת קיבוע/חדירה
ביוטין אנטי אנושי MERTK נוגדן 590H11G1E3BioLegend, סן דייגו, קליפורניה, ארה"ב.חתול# 367616; RRID:AB_2721500 
ציוד CFX-Connect Bio-Rad, הרקולס, קליפורניה, ארה"ב
ערכת בחירה חיובית CD14 אנושית EasySep; קוקטייל בחירה חיובית של EasySep; ננו-חלקיקים מגנטיים של EasySep; Easy Sep MagnetSTEMCELL Technologies, ונקובר, קנדהCat# 18058
FACS Canto cytometer בקטון דיקינסון, פרנקלין לייקס, ניו ג'רזי, ארה"ב.
סרום בקר עוברי, מוסמך, ניו זילנד גיבקו וטרייד;   תרמו פישר סיינטיפיק
וולת'אם, מסצ'וסטס, ארה"ב 		Cat# 10091148
Ficoll-Paque PLUS CytivaGE Healthcare - מדעי החיים, ארה"בCat# 17144003
FlowJoFlowJo LLC.RRID:SCR_008520
GraphPad פריזמה   תוכנת GraphPad בע"מRRID:ערכת
iScript, כוללת תערובת תגובת שעתוק הפוכה פי 5, iScript טרנסקריפטאז הפוך, מים נטולי נוקלאזBio-Rad, הרקולס, קליפורניה, ארה"בCat# 1708891
Partec CyFlow Space Cytometer Sysmex Partec, גרמניה
PE StreptavidinBioLegend, סן דייגו, קליפורניה, ארה"ב.Cat# 405203
PE/Cy7 עכבר אנטי אנושי CD14 נוגדן שיבוט HCD14BioLegend, סן דייגו, קליפורניה, ארה"ב.חתול# 325618; RRID:AB_830691
שיבוט נוגדנים CD163 אנטי-אנושי של עכבר PerCP/Cy5.5 GHI/61BioLegend, סן דייגו, קליפורניה, ארה"ב.חתול# 333607; RRID:AB_1134006
RPMI 1640 בינוניGibco™   תרמו פישר סיינטיפיק
וולת'אם, מסצ'וסטס, ארה"ב 		Cat# 11875119
SsoAdvanced אוניברסלי SYBR Green Supermix, הוא מכיל התחלה חמה בתיווך נוגדנים Sso7d fusió n פולימראז, dNTPs, MgCl2, SYBR Green I Dye, משפרים, מייצבים ותערובת של צבעי ייחוס פסיביים (כולל ROX ופלואורסצאין).Bio-Rad, הרקולס, קליפורניה, ארה"בCat# 1725271
TriZol ReagentThermo Fisher Scientific
Life Sciences Solutions
קרלסבד, קליפורניה, ארה"ב 		Cat#  15596026ריאגנט מיצוי RNA
זומבי סגול ערכת כדאיות ניתנת לתיקוןBioLegend, סן דייגו, קליפורניה, ארה"ב.Cat# 423113
סינתזת cDNA SCR_002798

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. Macrophage biology in development, homeostasis and disease. Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).
  2. Murray, P. J. Macrophage polarization. Annu Rev Physiol. 79, 541-566 (2017).
  3. Guilliams, M., Svedberg, F. R. Does tissue imprinting restrict macrophage plasticity. Nat Immunol. 22 (2), 118-127 (2021).
  4. Nowak, W., et al. Pro-inflammatory monocyte profile in patients with major depressive disorder and suicide behaviour and how ketamine induces anti-inflammatory m2 macrophages by nmdar and mtor. EBioMedicine. 50, 290-305 (2019).
  5. Carestia, A., et al. Platelets promote macrophage polarization toward pro-inflammatory phenotype and increase survival of septic mice. Cell Rep. 28 (4), 896-908.e5 (2019).
  6. Olexen, C. M., et al. Increased axl(high) myeloid cells as pathognomonic marker in Langerhans cell histiocytosis and langerin expression dependence of mtor inhibition. Clin Immunol. 263, 110203(2024).
  7. Ortiz Wilczynski, J. M., et al. The synthetic phospholipid C8-C1P determines pro-angiogenic and pro-reparative features in human macrophages restraining the proinflammatory M1-like phenotype. Front Immunol. 14, 1162671(2023).
  8. Das, A., et al. Monocyte and macrophage plasticity in tissue repair and regeneration. Am J Pathol. 185 (10), 2596-2606 (2015).
  9. Murray, P. J., et al. Macrophage activation and polarization: Nomenclature and experimental guidelines. Immunity. 41 (1), 14-20 (2014).
  10. Carrera Silva, E. A., et al. CD207(+)CD1a(+) cells circulate in pediatric patients with active Langerhans cell histiocytosis. Blood. 130 (17), 1898-1902 (2017).
  11. Ferrer, M. F., et al. Junin virus triggers macrophage activation and modulates polarization according to viral strain pathogenicity. Front Immunol. 10, 2499(2019).
  12. Gattas, M. J., et al. A heterotypic tridimensional model to study the interaction of macrophages and glioblastoma in vitro. Int J Mol Sci. 22 (10), 5105(2021).
  13. Ortiz Wilczynski, J. M., et al. Gas6 signaling tempers Th17 development in patients with multiple sclerosis and helminth infection. PLoS Pathog. 16 (12), e1009176(2020).
  14. Ambarus, C. A., et al. Systematic validation of specific phenotypic markers for in vitro polarized human macrophages. J Immunol Methods. 375 (1-2), 196-206 (2012).
  15. Martinez, F. O., Gordon, S. The M1 and M2 paradigm of macrophage activation: Time for reassessment. F1000Prime Rep. 6, 13(2014).
  16. Martinez, F. O., et al. Genetic programs expressed in resting and IL-4 alternatively activated mouse and human macrophages: Similarities and differences. Blood. 121 (9), e57-e69 (2013).
  17. Vogel, D. Y., et al. Human macrophage polarization in vitro: Maturation and activation methods compared. Immunobiology. 219 (9), 695-703 (2014).
  18. Tiemessen, M. M., et al. CD4+CD25+FOXP3+ regulatory T cells induce alternative activation of human monocytes/macrophages. Proc Natl Acad Sci USA. 104 (49), 19446-19451 (2007).
  19. Bosurgi, L., et al. Macrophage function in tissue repair and remodeling requires IL-4 or IL-13 with apoptotic cells. Science. 356 (6342), 1072-1076 (2017).
  20. Sanin, D. E., et al. A common framework of monocyte-derived macrophage activation. Sci Immunol. 7 (70), eabl7482(2022).
  21. Rigamonti, E., Chinetti-Gbaguidi, G., Staels, B. Regulation of macrophage functions by PPAR-alpha, PPAR-gamma, and LXRS in mice and men. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 28 (6), 1050-1059 (2008).
  22. Zizzo, G., Hilliard, B. A., Monestier, M., Cohen, P. L. Efficient clearance of early apoptotic cells by human macrophages requires M2c polarization and MerTK induction. J Immunol. 189 (7), 3508-3520 (2012).
  23. Mccoll, A., et al. Glucocorticoids induce protein S-dependent phagocytosis of apoptotic neutrophils by human macrophages. J Immunol. 183 (3), 2167-2175 (2009).
  24. Xue, J., et al. Transcriptome-based network analysis reveals a spectrum model of human macrophage activation. Immunity. 40 (2), 274-288 (2014).
  25. Murray, P. J., et al. Macrophage activation and polarization: Nomenclature and experimental guidelines. Immunity. 41 (1), 14-20 (2014).
  26. Murray, P. J. Macrophage polarization. Annu Rev Physiol. 79, 541-566 (2017).
  27. Gordon, S. Alternative activation of macrophages. Nat Rev Immunol. 3 (1), 23-35 (2003).
  28. Hawley, K. L., et al. IFNgamma enhances CD64-potentiated phagocytosis of Treponema pallidum opsonized with human syphilitic serum by human macrophages. Front Immunol. 8, 1227(2017).
  29. Akinrinmade, O. A., et al. CD64: An attractive immunotherapeutic target for M1-type macrophage mediated chronic inflammatory diseases. Biomedicines. 5 (3), 56(2017).
  30. Martinez, F. O., Gordon, S. The M1 and M2 paradigm of macrophage activation: Time for reassessment. F1000Prime Rep. 6, 13(2014).
  31. Sudan, B., Wacker, M. A., Wilson, M. E., Graff, J. W. A systematic approach to identify markers of distinctly activated human macrophages. Front Immunol. 6, 253(2015).
  32. Martinez, F. O., et al. Genetic programs expressed in resting and IL-4 alternatively activated mouse and human macrophages: Similarities and differences. Blood. 121 (9), e57-e69 (2013).
  33. Platanitis, E., Decker, T. Regulatory networks involving STATs, IRFs, and NFkappab in inflammation. Front Immunol. 9, 2542(2018).
  34. Laplante, M., Sabatini, D. M. mTOR signaling in growth control and disease. Cell. 149 (2), 274-293 (2012).
  35. Covarrubias, A. J., Aksoylar, H. I., Horng, T. Control of macrophage metabolism and activation by mTOR and Akt signaling. Semin Immunol. 27 (4), 286-296 (2015).
  36. Shahbazian, D., Parsyan, A., Petroulakis, E., Hershey, J., Sonenberg, N. Eif4b controls survival and proliferation and is regulated by proto-oncogenic signaling pathways. Cell Cycle. 9 (20), 4106-4109 (2010).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Monocyte Derived MacrophagesMacrophage PolarizationIn Vitro ModelFlow CytometryReal Time PCRCytokine PolarizationPBMC IsolationCD14 MonocytesMacrophage DifferentiationPhenotypic Characterization

מאמרים קשורים