הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

אורגנואידים דו-ממדיים במעי חזיר המשקפים את התכונות הפיזיולוגיות של המעיים הטבעיים

1.5K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/67666

⸱

31 בינואר 2025

 ,  ,  , 
1Institute for Physiology and Cell Biology, University of Veterinary Medicine Hannover, 2Center for Systems Neuroscience (ZSN)

במאמר זה

סיכום

מחקר זה מתאר פרוטוקול ליצירת חד-שכבות דו-ממדיות של אורגנואידים חזיריים שמקורם במעי הדק והגס. הצמיחה של חד-שכבות אלו מסומנת על ידי הגדלת ערכי TEER, המעידים על שלמות אפיתל חזקה. בנוסף, חד-שכבות אלה מציגות תגובות הפרשה פיזיולוגיות בניסויי תא אוסינג לאחר יישום פורסקולין.

תקציר

מערכת העיכול (GIT) משמשת הן לעיכול מזון והן לספיגת חומרים מזינים, אך גם כמחסום מגן מפני פתוגנים. באופן מסורתי, המחקר בתחום זה הסתמך על ניסויים בבעלי חיים, אך יש ביקוש הולך וגובר לשיטות חלופיות הדבקות בעקרונות 3R - החלפה, הפחתה וליטוש. אורגנואידים חזיריים התגלו ככלי מבטיח, המציע שכפול מדויק יותר במבחנה של תנאי in vivo מאשר מודלים תאיים מסורתיים. אתגר מרכזי אחד עם אורגנואידים במעי הוא המשטח האפיקלי הפונה פנימה והמשטח הבסיסי הפונה כלפי חוץ. ניתן להתגבר על מגבלה זו על ידי יצירת שכבות אורגנואידים דו-ממדיות (2D) על תוספות טרנסוול (מכאן ואילך המכונה תוספות), המספקות גישה לשני המשטחים. במחקר זה, פיתחנו בהצלחה תרביות דו-ממדיות של ג'ג'ונום חזירי ואורגנואידים של המעי הגס. תהליך הגידול כולל שני שלבים מרכזיים: ראשית, היווצרות חד-שכבת תאים, ולאחר מכן התמיינות התאים באמצעות מדיה מותאמת. מעקב אחר צמיחת התאים מתבצע על ידי מדידת ההתנגדות החשמלית הטרנס-אפיתליתלית, המתייצבת ביום 8 עבור אורגנואידים במעי הגס וביום 16 עבור אורגנואידים של ג'ג'ונום. לאחר שלב התמיינות של יומיים, האפיתל מוכן לניתוח. כדי לכמת ולעקוב אחר תהליכי הובלה אלקטרוגניים פעילים, כגון הפרשת כלוריד, אנו משתמשים בטכניקת תא אוסינג. שיטה זו מאפשרת מדידה בזמן אמת ואפיון מפורט של תהליכי הובלת אפיתל. מודל חדשני זה במבחנה , בשילוב עם טכניקות מבוססות כמו תא האוסינג, מספק פלטפורמה חזקה לאפיון פיזיולוגי של ה-GIT החזירי במסגרת 3R. זה גם פותח הזדמנויות לחקירת מנגנונים פתופיזיולוגיים ולפיתוח אסטרטגיות טיפוליות פוטנציאליות.

מבוא

ה-GIT ממלא תפקיד מרכזי בעיכול, ספיגת חומרים מזינים והפרשת פסולת דרך צואה1. בנוסף, הוא מתפקד כמחסום מפני פתוגנים, תפקיד הנתמך על ידי הרכב תאים מגוון, כולל תאי גזע, תאי גביע המייצרים ריר, תאים אנטרואנדוקריניים ואנטרוציטים סופגים2. הומאוסטזיס במעי יכול להיות מופרע על ידי גורמים שונים, כגון זיהומים חיידקיים3 או תהליכים דלקתיים4, מה שמוביל להשלכות חמורות על האורגניזם, כגון תת ספיגה, שלשול או אפילו מוות5. חקירת תרחישים פתופיזיולוגיים כאלה נעשית בדרך כלל באמצעות חיות מעבדה או, בהתאם לעקרון 3R6, תרביות תאים שמקורן במינים שונים. חיזוי מדויק ויכולת העברה של תוצאות הם חיוניים בעת שימוש במודלים ספציפיים למינים7. למרות הצורך הזה, יש מחסור בולט בתרביות תאים שמקורן בחזירים המשחזרות כראוי את המורכבות והפונקציונליות של מערכת העיכול.

כדי להתמודד עם אתגר זה, הרלוונטי גם למינים אחרים, פותחו אורגנואידים תלת מימדיים (תלת מימדיים) בניסיון לשכפל את המורכבות הפיזיולוגית של GIT8. בתחילה, אורגנואידים נוצרו ממעיים אנושיים ועכברים; עד כה, אורגנואידים חזיריים מחזירים צעירים ובוגרים פותחו וטופחו בהצלחה 9,10. מאז הקמתם, אורגנואידים חזיריים אלה שימשו במספר מחקרים, שהתמקדו בעיקר בזיהומי מעיים 11,12,13,14. מחקר שמטרתו לאפיין תכונות פיזיולוגיות, כגון הובלת חומרים מזינים או תהליכי הפרשה, נותר מוגבל15. ייתכן שהסיבה לכך היא האוריינטציה של אורגנואידים במעי, כאשר המשטח האפיקלי פונה פנימה והצד הבסיסי כלפי חוץ, מה שמגביל את הנגישות למשטח האפיקלי. מגבלה זו טופלה על ידי טיפוח מוצלח של אורגנואידים חזיריים בפורמט דו-ממדי16, שיטה שקודמה עוד יותר באמצעות שימוש ברקמה קפואה כדי לייצר אותם17.

הגידול הדו-ממדי של אורגנואידים חזיריים מספק גישה לשני צידי האפיתל, ומאפשר יישום של שיטות מבוססות היטב לחקר תהליכי הובלה על פני שכבת האפיתל. שיטה אחת כזו היא תא אוסינג18, המאפשר תצפית בזמן אמת על תהליכי ספיגה והפרשה אלקטרוגניים על פני האפיתל. שימוש נרחב במערכת זו סיפק הבנה מקיפה של תפקוד המעי החזירי in vivo, המכסה את כל ציר המעי. זה כולל מחקרים על הובלה או הובלה של חומצות שומן קצרות שרשרת או תגובות למטבוליטים צמחיים משניים כמו רסברטרול המשפיעים על מאפייני הובלת המעיים 19,20,21,22,23,24. גוף הנתונים המשמעותי ממחקרים אלה מאפשר השוואות ישירות בין תנאי in vivo המאופיינים היטב לבין הסביבה החוץ גופית של אורגנואידים חזיריים, ומשפר את הבנתנו את הרלוונטיות הפיזיולוגית שלהם.

במחקר זה, אנו מציגים פרוטוקול ליצירה וטיפוח של חד-שכבות דו-ממדיות מאורגנואידים חזיריים תלת-ממדיים. בנוסף, אנו מפרטים את הגישה המתודולוגית לכימות תהליכי הובלת מעיים באמצעות טכניקת תא אוסינג. הפרוטוקול מציע כלים לחקר מאפייני ספיגה והפרשה במבחנה באורגנואידים של ג'ג'ונום ומעי הגס, המאפשרים השוואה ישירה עם תנאי in vivo מאופיינים היטב. יישומים עתידיים של פרוטוקול זה עשויים לכלול חקירת ההשפעות של חומרים פרמקולוגיים או טוקסיקולוגיים, כמו גם חקירת אינטראקציות בין האפיתל לפתוגנים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

לצורך פרוטוקול זה, שני חזירים בריאים (חזיר שחור בנטהיים; זכר אחד, נקבה אחת; בן 4.5 חודשים; כ-65 ק"ג) הוקרבו על ידי ירי בריח בשבי ודימום. על פי חוק צער בעלי חיים, הדבר (שחיטה והוצאת רקמות) אינו מוגדר כניסוי בבעלי חיים אלא יש להודיע על כך לפקיד צער בעלי חיים (מס' רישום). TiHo-T-2023-15) של קרן האוניברסיטה לרפואה וטרינרית בהנובר.

1. ציפוי תוספות

הערה: כל השלבים מתבצעים עם חומרים סטריליים מתחת לארון בטיחות. כל שלבי הפרוטוקול מבוצעים על קרח אם לא צוין אחרת.

  1. הפשירו את קרום המרתף הקפוא על קרח למשך שעה לפחות בטמפרטורת החדר או לילה על הקרח בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. מערבבים את קרום המרתף 1:40 (v/v) עם מי מלח סטריליים קרים כקרח (PBS) בצינור חרוטי.
  2. הסר את הלוחות הסטריליים עם תוספות מהאריזה. הוסף 200 מיקרוליטר של תערובת קרום הבסיס לתא האפיקלי של כל תוספת.
  3. החזר את מכסה צלחת הבאר ודגירה למשך שעה וחצי לפחות בחום של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 בחממה.
  4. שאפו את התמיסה בזהירות לפני זריעת התאים. ודא שהקצה אינו נוגע בקרום במהלך השאיפה.

2. יצירת חד-שכבות אורגנואיד דו-ממדיות

הערה: אורגנואידים של המעי הגס החזירי נוצרים ומעובדים כמתואר עבור אורגנואידים חזיריים25. לאחר יצירת אורגנואידים תלת מימדיים יש לגדל אותם לפחות 3-4 שבועות תוך כדי מעבר שבועי כדי להבטיח צמיחה עקבית. מספר התאים בתוך כל כיפה המכילה אורגנואידים תלת מימדיים, המומסים בשלבים הבאים, מספיק כדי לכסות מסנן טרנסממברני יחיד. לפני היצירה החד-שכבתית, האורגנואידים התלת-ממדיים היו נתונים לבקרת איכות אופטית כדי לבדוק את הגידול הקודם ואת הזיהום האפשרי (איור 1).

figure-protocol-1
איור 1: אורגנואידים תלת-ממדיים מייצגים. אורגנואידים תלת מימדיים (A) jejunum ו-(B) במעי הגס נבדקים בקפידה תחת המיקרוסקופ לפני יצירת חד-שכבות. תשומת לב מיוחדת ניתנת להערכת דפוסי גידול קודמים, שלמות מבנית ונוכחות של זיהומים או זיהום. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

  1. הסר את המדיום האורגנואיד (טבלה 1) מהבארות עם אורגנואידים קריפטה תלת מימדיים. הוסף 1 מ"ל PBS קר כקרח לבאר וממיס בעדינות את קרום המרתף על ידי צנרת למעלה ולמטה עם קצה p1000.
  2. אסוף את כל האורגנואידים המומסים בצינור של 15 מ"ל מלא מראש ב-10 מ"ל PBS קר כקרח. צנטריפוגה את הצינור ב-250 x גרם, 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. שאפו את הסופרנטנט.
  3. השהה את הגלולה ב-1 מ"ל של טריפסין/EDTA חם (37 מעלות צלזיוס) 0.05% (v/v) (ניתן לאגד 2 צינורות בשלב זה). יש לדגור למשך 5 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באמבט מים ולהניח ישירות על קרח לאחר מכן כדי לעצור את התגובה.
  4. תלו על קרח 20x עם קצה p1000, ועוד 15x עם קצה p1000 + קצה p200 למעלה. הוסף 10 מ"ל של DMEM קר כקרח בתוספת 10% (v/v) סרום עגל עוברי (FCS).
  5. צינור צנטריפוגה ב-1,000 x גרם, 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. השליכו את ה-supernatant והשעו מחדש את הגלולה ב-1 מ"ל של מדיום חד-שכבתי (טבלה 1).
  6. קבע את מספר התאים החיים למ"ל באמצעות תא נויבאואר בהתאם להוראות היצרן.
  7. הסר את תמיסת הציפוי בשלב זה מהתא האפיקלי והחלף אותה ב-500 מיקרוליטר של מדיום חד-שכבתי חם (37 מעלות צלזיוס). הוסף 3 מ"ל של מדיום חד שכבתי לתא הבסיסי.
  8. קבע את ההתנגדות הריקה (TEER) של כל תוספת Transwell ריקה, כמתואר בפירוט בשלב 3. הזמן שבו אין מדיום בתא האפיקלי צריך להיות קצר ככל האפשר כדי למנוע מהתאים להתייבש.
  9. הסר את המדיום החד-שכבתי האפיקלי והוסף לתרבית הדו-ממדית של הג'ג'ונל 2 x 105 תאי אפיתל ולתרבית הדו-ממדית של המעי הגס 1.5 x 105 תאי אפיתל ב-500 מיקרוליטר של מדיום חד-שכבתי בתא האפיקלי של כל טרנסוול.
  10. החלף מדיום ומדוד TEER כל 2-3 ימים. מדוד TEER לפני החלפת המדיום. שאפו בזהירות את המדיום של התא האפיקלי והבזאלי והחליפו אותו ב-500 מיקרוליטר או 3 מ"ל של מדיום טרי וחם (37 מעלות צלזיוס).
    1. עבור אורגנואידים של ג'ג'ונום: ביום 16, לאחר הזריעה, שנה ממדיום חד-שכבתי למדיום התמיינות (טבלה 1). עבור אורגנואידים במעי הגס: יש לשנות את המדיום ביום השביעי למדיום התמיינות.
  11. שנה את מדיום הבידול מדי יום ובצע מדידת TEER במהלך כל שינוי מדיום. ביום ה-18 (עבור אורגנואידים של ג'ג'ונל) או ביום התשיעי (עבור אורגנואידים במעי הגס), לאחר הזריעה, המשיכו בניסויים פונקציונליים.

3. מדידת התנגדות חשמלית טרנסאפיתל (TEER)

הערה: כל המדידות מבוצעות מתחת לארון בטיחות כדי למנוע זיהום. לפני זריעת התאים, כל טרנסוול מצופה ריק נמדד כדי לקבל ערכים ריקים בודדים. מד הוולט-אוהם מאחסן ערכים בהתקן USB שהוכנס.

  1. נקו את האלקטרודה עם אתנול 70% (v/v) והניחו לאלקטרודה להתייבש לחלוטין. בינתיים, הוציאו את הצלחת מהחממה והניחו אותה מתחת לארון.
  2. הכניסו את הזרוע הקצרה של אלקטרודת מקלות האכילה לתא האפיקלי של התוספות ואת הזרוע הארוכה לתא הבסיסי של התוספת. הימנע ממגע של הזרוע הקצרה עם שכבת התא.
  3. מדוד את ההתנגדות החשמלית הטרנס-אפיתליאלית של כל טרנסוול. אפשר למד הוולט-אוהם להתאזן כדי להבטיח מדידה יציבה. מדוד ערכי TEER על ידי לחיצה על כפתור החנות.
  4. המשך בשלבים 3.2 ו- 3.3 עם הבארות הנותרות. לאחר שהגיע לבאר האחרונה, מד הוולט-אוהם פותח בקשה לאחסון הנתונים בהתקן USB. לחץ על שמור.
  5. נקו את האלקטרודה לאחר כל צלחת ובסיום המדידה והניחו לה להתייבש לחלוטין לפני האחסון.
  6. הפחיתו ערכים ריקים שנקבעו לפני זריעת התאים מהערכים התאיים הנמדדים.

4. מחקרי הובלה אלקטרופיזיולוגיים בטכניקת תא אוסינג

הערה: קביעת מחקרי הובלה אלקטרופיזיולוגיים מתבצעת באמצעות תא אוסינג המורכב משני תאים תאיים, המחולקים על ידי האפיתל. תא זה מחובר לכרךtagclamp על ידי אלקטרודות Ag/AgCl. טכניקה זו מאפשרת מעקב אחר תהליכי הובלה אלקטרוגניים פעילים של האפיתל באמצעות השינויים בזרם הקצר (Isc) הנגרמים על ידי מהדק המתח וכן התנגדות הרקמות (Rt) המחושבת על ידי חוק אוהם. Isc ו-Rt נרשמים כל 6 שניות במהלך כל הניסוי. במהלך הניסוי הרקמה הנחקרת מאווררת עם קרבוגן ומודגרת בתמיסות קרבס-הנסלייט מותאמות כדי להבטיח תנאים ברי קיימא. אינדומתצין (10 מיקרומטר) מתווסף לתמיסות חיץ כדי לעכב סינתזת פרוסטגלנדין26.

  1. חימום תמיסות חיץ ריריות וסרוזליות ל-37 מעלות צלזיוס ואוורור עם קרבוגן. הרכיבו את התאים הבודדים באמצעות תוספת ריקה לכל תא בודד. ודא שהצדדים האפיקליים של הטרנסבארים פונים כולם לאותו כיוון.
  2. מלאו את כל התאים ב-5 מ"ל של תמיסת חיץ רירית מחוממת מראש (טבלה 2). חבר את כל האלקטרודות מהמתח clamp לתאים הבודדים בהתאם להוראות היצרן. ודא שאין בועות גז מפריעות לאלקטרודות כדי להבטיח מדידה נכונה.
  3. כייל את תוכנת תא ה-Ussing בתנאים אלה על ידי לחיצה על כפתור Rf/dpI בכרךtagמהדק התוכנה. ההתנגדות של כל התוספות הריקות המשומשות צריכה להיות שווה (~ 70 אוהם), והזרם צריך להיות בסביבות 0 mV (± 5 mV). אם זה לא המקרה עבור חדרים מסוימים, בדוק את המיקום הנכון של אלקטרודות או בועות במערכת.
  4. הסר את כל האלקטרודות והשליך את תמיסת החיץ המשומשת. פתח את כל התאים הבודדים והסר את התוספות הריקות. וודאו כי סדר התאים הבודדים נשמר.
  5. העבר את צלחת הבאר עם תוספות מהחממה לארון הבטיחות. שאפו בזהירות את המדיום הבסיסי והאפיקלי.
  6. שטפו את התאים על ידי הוספת 500 מיקרוליטר של מאגר רירי חם (37 מעלות צלזיוס) לתא האפיקלי ו-3 מ"ל של מאגר סרוזלי לתא הבסיסי. שאפו את המאגרים וחזרו על הפעולה פעמיים.
  7. הסר את התוספות מהצלחת. הסר בעדינות את תומכי התוספות. הנח את התוספות בתאי ה-Ussing, וודא שכיוון התוספות זהה לשלב הכיול. הרכיבו את התאים הבודדים כפי שמוצג באיור 2.
  8. מלאו את התאים הפונים לצד הבסיסי של התאים ב-5 מ"ל של מאגר סרוזלי (טבלה 2) ואת החדר הפונה לתא האפיקלי ב-5 מ"ל של מאגר רירי.
  9. חבר את האלקטרודות וצינורות האוורור לכל תא בנפרד. התחל מדידה בתוכנת Uussing. אפשר שיווי משקל למשך 15 דקות.
  10. שנה את התנאים ממעגל פתוח לתנאי קצר. שיווי משקל למשך 5 דקות עד 10 דקות. הוסף 10 מיקרומטר של פורסקולין לתא הסרוסל.
    הערה: תוספת של פורסקולין עשויה להיות מוחלפת בסוכן/חומרים אחרים בהתאם לקטעי מעיים בודדים ולשאלות מחקר.
  11. לאחר 15 דקות, הוסיפו חומרים נוספים באותו אופן כמו פורסקולין או הפסיקו את המדידה. הסר צינורות אוורור ואלקטרודות מתאים בודדים. שופכים את תמיסות החיץ של שני התאים לקערה.
  12. לפרק את התאים ולהשליך את התוספות או להשתמש בהם לניתוח מעקב (למשל, אימונוהיסטוכימיה או ניתוח ביטוי)

figure-protocol-2
איור 2: מבנה סכמטי של תא האוסינג. מוצגים שני התאים המחולקים על ידי הממברנה עם השכבה הדו-ממדית הגדלה. שני התאים מאווררים עם קרבוגן; מתח וזרם מנוטרים על ידי שתי אלקטרודות לכל תא. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

5. ניתוח נתונים שנוצרו על ידי מערך תא אוסינג

  1. ייבא את הנתונים שנוצרו על ידי תוכנת מהדק המתח לעורך גיליונות אלקטרוניים מתאים.
  2. כדי לקבוע ערכי Isc ו-Rt בזאליים, חשב את הממוצע של 10 נקודות נתונים רצופות שצולמו 10 דקות לאחר אתחול תנאי הקצר. כל תא בודד משמש כהעתק טכני, בעוד שכל מעבר של אורגנואידים משמש כשכפול ביולוגי.
  3. כדי להעריך את ההשפעות של חומרים מיושמים, חשב את הממוצע של 10 נקודות נתונים רצופות מיד לפני הוספת הסוכן. השווה ממוצע זה לערך המקסימלי (או המינימלי) שנצפה לאחר הפעלת הסוכן. הנתונים המתקבלים מוצגים כממוצע ± סטיית תקן (SD).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

פרוטוקול זה מקל על יצירה אמינה של חד-שכבות דו-ממדיות חזיריות על ידי פירוק אורגנואידים תלת-ממדיים שמקורם בג'ג'ונום ובמעי הגס של חזירים. במהלך תקופת טיפוח של 16 יום לאורגנואידים של ג'ג'ונום ו-9 ימים לאורגנואידים במעי הגס, נוצרות חד-שכבות שלמות. לאחר מכן ניתן להשתמש בשכבות חד-שכבתיות אלה כדי להעריך תכונות הובלה אלקטרוגניות ופיזיולוגיות באמצעות טכניקת תא אוסינג.

לאחר פירוק האורגנואידים התלת-ממדיים, תאים בודדים נזרעים על גבי תוספות מצופות. צמיחת התאים מנוטרת על ידי מדידת ערכי התנגדות חשמלית טרנסאפי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

פרוטוקול זה מתאר שיטה להמרת אורגנואידים תלת-ממדיים של חזירים לתאים בודדים, אשר לאחר מכן נזרעים על ממברנות טרנסוול ליצירת שכבה חד-שכבתית שלמה. תצורה זו מעניקה גישה לצד האפיקלי של התאים, ומקלה על השימוש בתאי Ussing לניטור תהליכי ספיגה והפרשה.

השלב הראשוני והמכריע בתהליך רב-שלבי זה הוא פירוק מדויק של האורגנואידים התלת-ממדיים. השגת זריעה אחידה של התאים הבודדים חיונית ליצירת חד-שכבתי פונקציונלית27. לכן, יש צורך במעקב קפדני אחר תהליך ההתפרקות...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

אין לנו שום ניגוד אינטרסים להצהיר עליו.

תודות

אנו מודים למשרד המזון והחקלאות הפדרלי (BLE# 28N-2-071-00) על המימון.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
צלחת 24 בארSARSTEDT AG & Co. KG8,33,922
A83-01MedChemExpress, ניו ג'רזי, ארה"חנות HY-10432ב -20 & מעלות צלזיוס. להפשיר בעת הצורך
accujet SBrand GmbH + Co KG, ורטהיים, גרמניה26351
מתקדם DMEM/F12 בינוניתרמו פישר סיינטיפיק, וולת'אם, ארה"בחנות 12634010ב-4 מעלות;
תוסף C B27Thermo Fisher Scientific, וולת'אם, ארה"ב17504044לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס. להפשיר בעת הצורך
CaCl2.2 H2OMerck KGaA, דרמשטדט, גרמניהC3306יש לאחסן בטמפרטורת החדר
D(+)-גלוקוז (wasserfrei)Merck KGaA, דרמשטדט, גרמניה1.08337לאחסן בטמפרטורת החדר
DAPTMedChemExpress, ניו ג'רזי, ארה"HY-13027חנות בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס הפשרה בעת הצורך
D-MannitolMerck KGaA, דרמשטדט, גרמניהM4125חנות בטמפרטורת החדר
DMSOSigma-Aldrich, Schnelldorf, Germany154938אחסן בטמפרטורת החדר
סט אלקטרודות (AgCl/PtIr/Std.)מכשירים מדעיים, סימראת', גרמניה#1316
מחקר אפנדורף פלוס Eppendorf SE, Hamburg, Gemany3123000063
Eppendorf Research plus Eppendorf SE, Hamburg, Gemany3123000047
EVOM3 ידני אפיתל וולט אוהם מטרמכשירים מדויקים עולמיים, סרסוטה, ארה"בEVM-MT-03-01
FBSסיגמא-אולדריץ', שנלדורף, גרמניהF7524חנות ב -20 °C. הפשרה בעת הצורך
ForskolinSigma-Aldrich, Schnelldorf, גרמניהF6886חנות ב -20 °C. הפשרה בעת הצורך
gasprofi 1 SCS microWLD-TEC GmbH, ארסנהאוזן, גרמניה60,04,000
Gastrin 1MedChemExpress, ניו ג'רזי, ארה"HY-P1097ב -20 & מעלות צלזיוס להפשיר בעת הצורך
GlutamaxThermo Fisher Scientific, וולת'אם, ארה"בחנות 35050061ב -4 °C. 
HClSigma-Aldrich, Schnelldorf, גרמניה1090571000חנות בטמפרטורת החדר
HEPESSigma-Aldrich, Schnelldorf, גרמניהH0887חנות ב-4 מעלות; C
Herasafe 2025 Class II ארון בטיחות ביולוגיThermo Fisher Scientific, וולת'אם, ארה"בחממת 51033316
ICO105Memmert GmbH + Co.KG, שוואבאך, גרמניה62,20,143
IndomethacinMerck KGaA, דרמשטדט, גרמניהI7378חנות בטמפרטורת החדר
KClMerck KGaA, דרמשטדט, גרמניה1.04936אחסן בטמפרטורת החדר
L-GlutaminSigma-Aldrich, שנלדורף, גרמניהG7513חנות ב -20 & מעלות צלזיוס להפשיר בעת הצורך
LWRN Supernatantתוצרת עצמית יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס ולהפשיר בעת הצורך. תוסף LWRN מיוצר על פי Miyoshi et al. (2012)
Matrigel Basement Membrane Matrix, ללא LDEV, 10 מ"לCorning Incorporated - Life Sciences354234יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס. להפשיר בזהירות על קרח בעת הצורך
Megafuge 1.ORHeraeus Instruments, Osterode, Germany75003060
MgCl2.6 H2OMerck KGaA, דרמשטדט, גרמניה1.05833יש לאחסן בטמפרטורת החדר
Na2HPO4.2H2OMerck KGaA, דרמשטדט, גרמניה1.06580יש לאחסן בטמפרטורת החדר
N-Acetyl-L-cysteineSigma-Aldrich, Schnelldorf, גרמניהA7250לאחסן בטמפרטורה של -20 & deg;C. להפשיר בעת הצורך
NaClMerck KGaA, דרמשטדט, גרמניה1.06404יש לאחסן בטמפרטורת החדר
NaH2PO4. H2OMerck KGaA, דרמשטאדט, גרמניה1.06346אחסן בטמפרטורת החדר
NaHCO3Merck KGaA, דרמשטדט, גרמניה1.06329אחסן בטמפרטורת החדר
Neubauer תא משופרGlaswarenfabrik Karl Hecht, Sondheim vor der Rhö n, גרמניה40442712
Olympus IX70 iverted MicroscopeOlympus Corporation, המבורג, גרמניה
Pen/StrepThermo Fisher Scientific, Waltham, USA15140122חנות ב -20 & deg; C. להפשיר בעת הצורך
PolymyxinBSigma-Aldrich, Schnelldorf, גרמניהP4932-1MUחנות ב -20 & deg; C. להפשיר בעת הצורך
מעמד מיקרוסקופ Primovert עם צינור צילום דו-עיניZeiss415510-1101-000
rm EGFPrepotech, ניו ג'רזי, ארה"ב315-09חנות ב-20 °C. הפשרה בעת הצורך
SB202190MedChemExpress, ניו ג'רזי, ארה"בחנות HY-10295ב-20 °C. הפשרה בעת הצורך
Snapwell 3801Corning Incorporated - Life Sciences3801
Trypsin/EDTAThermo Fisher Scientific, וולת'אם, ארה"ב25300054
מערכת בסיס Ussing, סימראת', גרמניה#1317
של תא דיפוזיה של Ussing, סימראת', גרמניהמק"ט 1307
מהדק מתח/זרם VCC6מכשירים מדעיים, סימראת', גרמניהמק"ט 1310
Y27632MedChemExpress, ניו ג'רזיארה"HY-10583חנות ב -20 & מעלות צלזיוס להפשיר בעת הצורך
ב ב ב חנות מכשירים מדעיים שלמכשירים מדעייםב

מקורות

  1. Hornbuckle, W. E., Tennant, B. C. Clinical Biochemistry of Domestic Animals. , Academic Press. 367-406 (1997).
  2. Peterson, L. W., Artis, D. Intestinal epithelial cells: regulators of barrier function and immune homeostasis. Nat Rev Immunol. 14 (3), 141-153 (2014).
  3. Pham, T. A., Lawley, T. D. Emerging insights on intestinal dysbiosis during bacterial infections. Curr Opin Microbiol. 17 (100), 67-74 (2014).
  4. Garrett, W. S., Gordon, J. I., Glimcher, L. H. Homeostasis and inflammation in the intestine. Cell. 140 (6), 859-870 (2010).
  5. Ternhag, A., Torner, A., Svensson, A., Ekdahl, K., Giesecke, J. Short- and long-term effects of bacterial gastrointestinal infections. Emerg Infect Dis. 14 (1), 143-148 (2008).
  6. Russell, W. M. S., Burch, R. L. The principles of humane experimental technique. , Methuen & Co. Limited. London. (1959).
  7. Zietek, T., Boomgaarden, W. A. D., Rath, E. Drug screening, oral bioavailability and regulatory aspects: A need for human organoids. Pharmaceutics. 13 (8), 1280(2021).
  8. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  9. Gonzalez, L. M., Williamson, I., Piedrahita, J. A., Blikslager, A. T., Magness, S. T. Cell lineage identification and stem cell culture in a porcine model for the study of intestinal epithelial regeneration. PLoS One. 8 (6), e66465(2013).
  10. Khalil, H. A., et al. A novel culture system for adult porcine intestinal crypts. Cell Tissue Res. 365 (1), 123-134 (2016).
  11. Derricott, H., et al. Developing a 3D intestinal epithelium model for livestock species. Cell Tissue Res. 375 (2), 409-424 (2019).
  12. Li, L., et al. Porcine intestinal enteroids: a new model for studying enteric coronavirus porcine epidemic diarrhea virus infection and the host innate response. J Virol. 93 (5), e01682-e01718 (2019).
  13. Min, S., Kim, S., Cho, S. W. Gastrointestinal tract modeling using organoids engineered with cellular and microbiota niches. Exp Mol Med. 52 (2), 227-237 (2020).
  14. Yin, L., et al. Aminopeptidase N expression, not interferon responses, determines the intestinal segmental tropism of porcine deltacoronavirus. J Virol. 94 (14), e00480-e00520 (2020).
  15. van der Hee, B., Madsen, O., Vervoort, J., Smidt, H., Wells, J. M. Congruence of transcription programs in adult stem cell-derived jejunum organoids and original tissue during long-term culture. Front Cell Dev Biol. 8, 375(2020).
  16. van der Hee, B., et al. Optimized procedures for generating an enhanced, near physiological 2D culture system from porcine intestinal organoids. Stem Cell Res. 28, 165-171 (2018).
  17. Mussard, E., et al. Culture of piglet intestinal 3D organoids from cryopreserved epithelial crypts and establishment of cell monolayers. J Vis Exp. (192), e64917(2023).
  18. Ussing, H. H., Zerahn, K. Active transport of sodium as the source of electric current in the short-circuited isolated frog skin. Acta Physiologica Scandinavica. 23 (2-3), 110-127 (1951).
  19. Dengler, F., Kraetzig, A., Gabel, G. Butyrate protects porcine colon epithelium from hypoxia-induced damage on a functional level. Nutrients. 13 (2), 305(2021).
  20. Guschlbauer, M., et al. Trans-resveratrol and epsilon-viniferin decrease glucose absorption in porcine jejunum and ileum in vitro. Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 165 (3), 313-318 (2013).
  21. Herrmann, J., Hermes, R., Breves, G. Transepithelial transport and intraepithelial metabolism of short-chain fatty acids (SCFA) in the porcine proximal colon are influenced by SCFA concentration and luminal pH. Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 158 (1), 169-176 (2011).
  22. Klinger, S., Breves, G. Resveratrol inhibits porcine intestinal glucose and alanine transport: Potential roles of Na(+)/K(+)-ATPase activity, protein kinase A, AMP-activated protein kinase and the association of selected nutrient transport proteins with detergent resistant membranes. Nutrients. 10 (3), 302(2018).
  23. Leonhard-Marek, S., Hempe, J., Schroeder, B., Breves, G. Electrophysiological characterization of chloride secretion across the jejunum and colon of pigs as affected by age and weaning. J Comp Physiol B. 179 (7), 883-896 (2009).
  24. Schroeder, B., et al. Preventive effects of the probiotic Escherichia coli strain Nissle 1917 on acute secretory diarrhea in a pig model of intestinal infection. Dig Dis Sci. 51 (4), 724-731 (2006).
  25. Hoffmann, P., et al. Intestinal organoid-based 2D monolayers mimic physiological and pathophysiological properties of the pig intestine. PLoS One. 16 (8), e0256143(2021).
  26. Ferreira, S. H., Moncada, S., Vane, J. R. Indomethacin and aspirin abolish prostaglandin release from the spleen. Nat New Biol. 231 (25), 237-239 (1971).
  27. Dykstra, G. D., Kawasaki, M., Ambrosini, Y. M. Advancements in bovine organoid technology using small and large intestinal monolayer interfaces. J Vis Exp. (208), e67010(2024).
  28. Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. J Lab Autom. 20 (2), 107-126 (2015).
  29. Hoffmann, P., et al. Caco-2/HT29-MTX co-cultured cells as a model for studying physiological properties and toxin-induced effects on intestinal cells. PLoS One. 16 (10), e0257824(2021).
  30. Beduneau, A., et al. A tunable Caco-2/HT29-MTX co-culture model mimicking variable permeabilities of the human intestine obtained by an original seeding procedure. Eur J Pharm Biopharm. 87 (2), 290-298 (2014).
  31. Markov, A. G., Veshnyakova, A., Fromm, M., Amasheh, M., Amasheh, S. Segmental expression of claudin proteins correlates with tight junction barrier properties in rat intestine. J Comp Physiol B. 180 (4), 591-598 (2010).
  32. Pearce, S., et al. Marked differences in tight junction composition and macromolecular permeability among different intestinal cell types. BMC Biology. 16 (1), 19(2018).
  33. Legen, I., Salobir, M., Kerc, J. Comparison of different intestinal epithelia as models for absorption enhancement studies. Int J Pharm. 291 (1-2), 183-188 (2005).
  34. Moeser, A. J., et al. Stress signaling pathways activated by weaning mediate intestinal dysfunction in the pig. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 292 (1), G173-G181 (2007).
  35. Moeser, A. J., Ryan, K. A., Nighot, P. K., Blikslager, A. T. Gastrointestinal dysfunction induced by early weaning is attenuated by delayed weaning and mast cell blockade in pigs. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 293 (2), G413-G421 (2007).
  36. Seamon, K. B., Padgett, W., Daly, J. W. Forskolin: unique diterpene activator of adenylate cyclase in membranes and in intact cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 78 (6), 3363-3367 (1981).
  37. Herrmann, J., et al. Segmental diversity of electrogenic glucose transport characteristics in the small intestines of weaned pigs. Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 163 (1), 161-169 (2012).
  38. Wright, E. M., Martin, M. G., Turk, E. Intestinal absorption in health and disease--sugars. Best Pract Res Clin Gastroenterol. 17 (6), 943-956 (2003).
  39. Crane, R. K. Na+ -dependent transport in the intestine and other animal tissues. Fed Proc. 24 (5), 1000-1006 (1965).
  40. Inagaki, A., Yamaguchi, S., Ishikawa, T. Amiloride-sensitive epithelial Na+ channel currents in surface cells of rat rectal colon. Am J Physiol Cell Physiol. 286 (2), C380-C390 (2004).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

אורגנואידים דו-ממדיים במעי חזיר המשקפים את התכונות הפיזיולוגיות של המעיים הטבעיים
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.