מאמר שיטה

תאי פסגה עצבית גולגולתית פרוטוקול התמיינות תלת מימדי במבחנה לבדיקה מרובבת

DOI:

10.3791/67695

⸱

14 בפברואר 2025

 ,  , 
1Université Paris Cité, CNRS, Inserm, Institut Cochin

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מציגים פרוטוקול התמיינות תלת מימדי (תלת מימדי) במבחנה המייצר נוירוספירות בגודל הניתן לשחזור כדי לייצר תאי פסגה עצבית גולגולתית מתאי גזע עובריים של עכברים. אנו מראים כי מתודולוגיה זו מפחיתה את השונות בהשוואה לפרוטוקולים קודמים וכיצד ניתן להשתמש בה לבדיקה מרובה לחקר התפתחות תאי פסגה עצבית גולגולתית.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עם יכולתם המדהימה לייצר נגזרות אקטודרמליות ומזנכימליות כאחד, תאי פסגה עצבית גולגולתית (CNCC) משכו עניין רב בחקר המנגנונים המווסתים את החלטות גורל התא והפלסטיות. מקורה בנוירו-אפיתל הגבי, אוכלוסיית תאים זו היא חולפת ונדירה יחסית בעובר המתפתח - מה שהופך בדיקות פונקציונליות, מסכים גנומיים ובדיקות ביוכימיות למאתגרות לביצוע in vivo. כדי להתגבר על מגבלות אלה, פותחו מספר שיטות למודל פיתוח CNCC במבחנה. שיטות תרבות מבוססות נוירוספירה (NS) מספקות מיקרו-סביבה מורכבת המסכמת את הנוירואפיתל הקדמי המתפתח בתלת מימד. מערכות אלו מאפשרות גידול של NS רבים באותה צלחת כדי לייצר כמות גדולה של CNCC, אך ה-NS המיוצר מציג שונות גבוהה בצורה, בגודל ובמספר ה-CNCC שנוצרו - מה שמקשה על ביצוע בדיקות כמותיות. פרוטוקול זה מתאר שיטה הניתנת לשחזור ליצירת NS מתאי גזע עובריים של עכברים (mESC) בפורמט של 96 בארות. NS המיוצר בצלחות של 96 בארות מייצר תאי פסגה עצבית גולגולתית (CNCC), אותם ניתן לתרבית נוספת. על ידי שליטה במספר התאים ההתחלתיים, גישה זו מפחיתה את השונות בגודל ובצורה בין NS ומגבירה את יכולת השחזור בין ניסויים. לבסוף, מערכת תרבית זו ניתנת להתאמה למספר יישומים ומציעה רמה גבוהה יותר של גמישות, מה שהופך אותה לניתנת להתאמה אישית ומתאימה לריבוי תנאי ניסוי.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תאי פסגה עצבית גולגולתית (CNCC) הם אוכלוסיית תאים דמוית גזע המתעוררת בחלק הקדמי ביותר של העובר המתפתח, בגבול בין הצלחת העצבית לאקטודרם פני השטח1. לאחר מכן CNCC עוברים מעבר אפיתל למזנכימלי (EMT), מתפרקים מהנוירו-אפיתל ונודדים גב-וונטרלי לעבר מקומות שונים בעובר שם הם מתמיינים למגוון רחב של סוגי תאים2. חקר אוכלוסיית תאים זו מעניין מאוד מכיוון שיש לה פלסטיות יוצאת דופן3 ויכולת ייחודית להתמיין לנגזרות אקטודרמליות ומזנכימליות כאחד, כגון עצמות גולגולת וסחוסים4. למרות ש-CNCC נגישים יחסית בעובר, הם אוכלוסייה חולפת עם מספר נמוך של תאים, מה שמקשה על ביצוע מחקרים מכניסטיים מערכתיים in vivo. קווי תאי CNCC בודדו ואופיינו בשנים האחרונות כדי להתגבר על מגבלות אלה. בפרט, קו התאים O9-1 CNCC הוא כלי נהדר לחקר התפתחות הפסגה העצבית הנודדת ופוסט-נדידה 5,6; עם זאת, קו תאים זה אינו מאפשר לחקור את האירועים המוקדמים לפני ההגירה המובילים לאינדוקציה ומפרט של פסגה עצבית. בהקשר זה, חלו התפתחויות משמעותיות בפיתוח פרוטוקולי התמיינות במבחנה כדי להבדיל CNCC בצלחת באמצעות שימוש במבנים תלת מימדיים הדומים לנוירואפיתל המתפתח הנקרא נוירוספרות (NS)7,8 - המתקבל לאחר התמיינות של מושבות תאי גזע עובריים (ESC). פרוטוקולים תלת-ממדיים אלה מייצרים באופן חזק מספרים גבוהים של CNCC, ומאפשרים ביצוע מחקרים מכניסטיים ביוכימיים וגנומיים 9,10. NS מתורבתים על לוחות חיבור נמוכים במדיום תוסף N2B27, יחד עם גורם גדילה פיברובלסטים (FGF) וגורם גדילה אפידרמיס (EGF)10,11 כדי לעורר את התפשטות התאים. פרוטוקולים אלה מבוצעים בצלחות פטרי, ומטפחים NS רבים באותה צלחת. בתוך ה-NS, התאים מצטברים וממשיכים להתחלק - ומגיעים לקוטר של 100-200 מיקרומטר עם הבגרות. בבגרות (בערך ביום 5), NS נצמד למצע ומתמיין ל-CNCC הדומה למקביליהם in vivo 9,12. לאחר מכן, CNCC אלה עוברים EMT ומתפרקים על פני הצלחת. ניתן להבחין בהבדלים מורפולוגיים בהתאם לגודל ה-NS, שכן כדורים גדולים יותר ייראו כהים יותר בליבה עקב זמינות נמוכה יותר של חומרים מזינים וחמצן, מה שמוביל לתאים לעבור אפופטוזיס13. בעוד שהליך מסוג זה מייצר מספר רב של CNCC בנקודת הקצה של ההתמיינות, הוא מציג מספר מגבלות, מה שהופך את חקר הדינמיקה המולקולרית השונה המתרחשת במהלך תהליך ההתמיינות לכמעט בלתי אפשרי. ראשית, השימוש במושבות ESC - המשתנות בגודלן - מקשה על שליטה במספר התאים ההתחלתי עבור כל ניסוי. התוצאה היא יצירת NS בצורות וקטרים שונים המתפתחים באופן שונה על ידי הפעלת מסלולי איתות ספציפיים, מה שמוביל לשינוי בהתמיינות התאים ובכך לא ליצור דגימה אחידה בנקודת זמן נתונה. שנית, תרבית מספר NS באותה צלחת מובילה לעתים קרובות להתמזגות שלהם יחד14 ופוטנציאלית לשחרר מולקולות איתות המשפיעות על המיקרו-סביבה של שכניהם ובכך על התפתחותם. בסך הכל, נהלים אלה מייצרים שונות רבה בין דגימות לניסויים.

כאן, אנו מציגים אסטרטגיה להתגברות על קשיים אלה המייצרים NS יחיד - המסוגל לייצר CNCC - על ידי צבירת ESC (mESC) של עכבר בלוחות 96 בארות עם תחתית U שאינה מטופלת ב-TC. התחלה מ-mESC מאפשרת ללמוד את תהליך האפיון והשלבים המוקדמים של פיתוח CNCC בהשוואה להתחלה מקווי תאי פסגה עצבית שכבר הוקמו. פרוטוקול זה מתחיל בפירוק מושבות mESC כדי להשיג תרחיף תא בודד, ואחריו זריעה של מספר מסוים של mESC בכל באר של צלחת 96 בארות עם תחתית U שאינה מטופלת ב-TC. התאים נותרים לצבירה למשך יומיים ולאחר מכן מועברים לצלחת עם תחתית שטוחה של 96 בארות שאינה מטופלת ב-TC, בה NS יוכל להתחבר לתחתית הצלחת. על ידי שליטה במספר התאים ההתחלתי ובמיקרו-סביבה של כל NS במהלך תהליך ההתמיינות, פרוטוקול זה מפחית את שונות הדגימה, מה שמגדיל את יכולת השחזור הניסיוני. אנו מאמינים שזו תהיה פלטפורמה נוחה לתכנון ניסויים מרובים, כגון בדיקת ההשפעה של תנאי תרבית שונים או ביצוע מסכי הפרעות גנים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. יצירת מתלה חד תאי ממושבות ESC של עכברים

הערה: פרוטוקול זה מותאם לשימוש ב-CK35 mESC (קו mESC המוסמך להעברת קו נבט, כדי שתהיה לו אפשרות לפתח דגמי in vivo 15) הגדלים על מזינים מושבתים בצלחת 6 בארות מצופה ג'לטין. באר אחת של צלחת 6 בארות שטופלה ב-TC אמורה להניב כ-1.5 ×-106 mESC, וזה מספיק לשאר הפרוטוקול. ניתן להגדיל זאת במידת הצורך. התאם את השלבים הראשוניים בהתאם לשיטת זן ה-ESC ותרבית התחזוקה שנבחרה, כמו גם למדיום התרבות המתאים. פרוטוקול זה אמור להתבצע בתנאים סטריליים. עיין בטבלת החומרים לפרטים הקשורים לכל החומרים, הריאגנטים והציוד המשמשים בפרוטוקול זה.

  1. התחל מ-mESC במפגש של 70%-80% שגדל במדיום תרבית mESC. ראה טבלה 1 להרכב המדיום של תרבית mESC המשמש במחקר זה.
    הערה: אל תתנו ל-mESC לגדול מעל 80% מפגש, מכיוון שהם יתחילו להתמיין, וזה ישפיע על תהליך הצבירה. מושבות חייבות להיות קומפקטיות ולהראות מורפולוגיה בריאה (ללא סדקים או גלים, ניגוד מובהק של ציטופלזמה גרעינית).
  2. הכן מדיום התמיינות CNCC. ראה טבלה 1 להרכב מדיום התמיינות CNCC.
    הערה: לאחר הוספת גורמי גדילה, ניתן לאחסן את המדיום עד 3 שבועות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. ודא שהמדיום מוגן מפני אור.
  3. הכינו תמיסת קולגנאז טרייה בריכוז של 2 מ"ג/מ"ל במדיום DMEM-Knockout.
    הערה: השימוש בקולגנאז מבטיח שרק המושבות מנותקות ולא המזינים, מכיוון שנוכחותם בשלבים הבאים תפריע לצבירת NS. סנן תמיסת קולגנאז לפני השימוש עם מסנן 0.22 מיקרומטר.
  4. שאב את מדיום ה- ESC מ- mESC.
  5. מוסיפים בעדינות 1 מ"ל PBS לצד הבאר. נדנד את הצלחת בעדינות כדי להבטיח כביסה אחידה.
  6. הסר PBS והחלף ב-2 מ"ל תמיסת קולגנאז. יש לדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30-45 דקות.
    1. בדוק את הצלחת תחת מיקרוסקופ אור בהגדלה של פי 10 לאחר 20 הדקות הראשונות ולאחר מכן כל 5 דקות.
    2. כאשר המושבות מראות קצוות מגולגלים, הקש במרץ על צד הצלחת, והמושבות יתנתקו.
  7. בעזרת פיפטה סרולוגית של 5 מ"ל, אוספים את המושבות ומעבירים אותן לצינור חרוטי של 15 מ"ל.
    הערה: בדוק את הצלחת תחת מיקרוסקופ אור לאיתור שאריות מושבות. ניתן לאסוף אותם עם שטיפת PBS.
  8. צנטריפוגה של המושבות בטמפרטורה של 16 × גרם למשך 3 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
  9. שאפו כמה שיותר מדיום מהצינור החרוטי, והקפידו לא להפריע למושבות בתחתית הצינור.
  10. הוסף 1 מ"ל של תמיסת טריפסין 0.05% ודגר את הצינור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
  11. להפריד מושבות בצינור על ידי פיפטינג נמרץ למעלה ולמטה, תחילה עם p1000 ולאחר מכן עם מיקרופיפטה p200.
    הערה: זה מבטיח שמירה על מתלה חד-תאי.
  12. הוסף 2 מ"ל של מדיום תרבית mESC כדי לחסום את הטריפסין, וצנטריפוגט ב-160 × גרם למשך 3 דקות ב-RT. הסר את הסופרנטנט והוסף 1 מ"ל של מדיום התמיינות CNCC.
  13. ספור תאים באמצעות מכשיר אוטומטי לספירת תאים או מערכת סטנדרטית תחת המיקרוסקופ, בהתאם להוראות היצרן.
  14. לאחר הספירה, יש לדלל עם מדיום התמיינות CNCC מספיק כדי לקבל ריכוז של 3000 תאים חיים לכל 50 מיקרוליטר.
  15. בעזרת מיקרופיפטה p200, זרעו 50 מיקרוליטר של תרחיף התא בכל באר של צלחת U-bottom 96 שאינה מטופלת ב-TC, ואז מלאו את הבאר עד 200 מיקרוליטר עם מדיום התמיינות CNCC.
    הערה: בזמן מילוי הצלחת, השעו מעת לעת את תרחיף התא הבודד עם מיקרופיפטה p1000 כדי לקבל ריכוז הומוגני.
  16. דגירה למשך הלילה באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2.

2. העברה לצלחת שטוחה עם 96 בארות לבידול CNCC

  1. למחרת (יום 1), התבוננו בלוח תחת מיקרוסקופ אור. ודא שאשכול תאים קטן אחד עם גבולות ברורים גלוי בתחתית כל באר. החזירו את הצלחת לחממה למשך הלילה.
    הערה: יתכנו כמה תאים סביב הצבר הראשי, חלקם מתים. זה לא יפריע לצבירת NS.
  2. ביום השני, הסר לאט 100 מיקרוליטר של מדיום מכל באר.
    1. בעת שאיבת מדיום, היזהר לא להסיר את ה-NS. כדי להימנע מכך, הנח את קצה הפיפטה קרוב לפני השטח ורחוק מהתחתית.
  3. חותכים את קצה המיקרופיפטה p200 בסביבות 3-4 מ"מ מהקצה. השתמש בזה כדי לשאוף את ה-NS עם המדיום הנותר.
    הערה: כדי להקל על איסוף ה-NS, פיפטה בעדינות למעלה ולמטה כמה פעמים לפני השאיבה.
  4. העבירו את NS ואת המדיום הנותר לצלחת שטוחה של 96 בארות שאינה מטופלת ב-TC וודאו את ההעברה תחת מיקרוסקופ אור, ואז מעל כל באר חדשה 100 מיקרוליטר של מדיום התמיינות CNCC שחומם מראש. השאירו את NS בחממה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2, עד היום הרביעי.
  5. ביום הרביעי, הסר 100 מיקרוליטר של מדיום מכל באר והחלף אותו ב-100 מיקרוליטר של מדיום התמיינות CNCC שחומם מראש.
    הערה: כדי למנוע הפרעה לחיבור NS בתחתית הצלחת, שאפו לאט והחליפו את המדיום.
  6. בימים 5 ו-6, בדוק את חיבור ה-NS מתחת למיקרוסקופ האור. ודא שתאים קלים יותר - דלמינציה מה- NS - מתחילים להקיף את הגוף העיקרי של ה- NS.
  7. ביום 7, שנה את המדיום כמתואר ב-2.5. החלף את המדיום באותו הליך כל יומיים עד לסיום המחקר.

3. מעבר ותחזוקה של CNCC

הערה: ניתן לבצע מעבר CNCC ברגע שיש כמות מספקת של תאים הנראית סביב NS. זה יכול להיות כבר ביום השביעי, מכיוון שנקודות זמן מוקדמות יותר אינן מספקות כמות מספקת של CNCC.

  1. הכן מדיום תחזוקה CNCC. ראה טבלה 1 להרכב מדיום תחזוקת CNCC.
    1. לפני הוספתו למדיום, סנן BSA לאחר המסה דרך מסנן של 0.22 מיקרומטר. לאחר הוספת גורמי גדילה, יש לאחסן את המדיום עד 3 שבועות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. ודא שהמדיום מוגן מפני אור.
  2. הכן פיברונקטין ב-7.5 מיקרוגרם/מ"ל ב-PBS. מערבבים במרץ.
  3. מצפים את הבארות של צלחת 96 בארות שאינה מטופלת ב-TC על ידי הוספת 100 מיקרוליטר של תמיסת פיברונקטין לבאר. הניחו לציפוי מתחת למכסה המנוע למשך 30 דקות ב-RT.
    הערה: אם CNCC מיועדים לצביעה אימונופלואורסצנטית, הנח כיסוי זכוכית סטרילית בתחתית הבאר לפני הציפוי. ודא שהמגלשה נשארת בתחתית הבאר ואינה צפה כדי למנוע ציפוי הצד הנגדי לזה שישמש. עקוב אחר ההוראות בסעיף 5 לקיבוע והרכבה של CNCC.
  4. בינתיים, בצלחת 96 בארות שטוחה שאינה מטופלת ב-TC, שאפו כמה שיותר מדיום התמיינות CNCC מהבארות והחליפו ב-50 מיקרוליטר אקוטאז. יש לדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
  5. לאחר הדגירה, הוסף 100 מיקרוליטר של אמצעי תחזוקה CNCC לכל באר כדי להרוות את האקוטאז. הסר פיברונקטין מהבארות של צלחת 96 בארות שטוחה שאינה מטופלת ב-TC. סנן את ה-CNCC המנותק לאחר הנדידה על ידי העברתם דרך מסנן של 40 מיקרומטר על גבי הבאר של צלחת 96 בארות שטוחה שאינה מטופלת ב-TC.
    הערה: פעולה זו תסנן גושי תאים או NS שנותרו שלא הוסרו בעבר. ניתן לאגור CNCC שגדל באותו מצב בצינור אחד של 50 מ"ל ואז לזרוע אותו באותה באר של צלחת 6 בארות שטופלה ב-TC. במקרה זה, יש לצפות את הבאר ב-1 מ"ל פיברונקטין ולהשתמש ב-1 מ"ל של אמצעי תחזוקה CNCC כדי להרוות את האקוטאז.
  6. הניחו ל-CNCC לאחר הנדידה להיצמד למשך 15-30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. השלך את המדיום והחלף ב-100 מיקרוליטר של אמצעי תחזוקה CNCC. החלף מדיום כל יומיים.
    הערה: הוסף בעדינות מדיום מכיוון שזרימה מהירה גורמת להתמיינות של CNCC לנגזרות עצביות. אם עובדים בפורמט של 6 בארות, השתמש ב-1 מ"ל של מדיום תחזוקה CNCC.

4. קיבוע והרכבה של NS לאימונופלואורסצנציה

  1. בנקודת הזמן הרצויה, העבירו את ה-NS מהצלחת השטוחה של 96 בארות שאינה מטופלת ב-TC לתוך צינור של 2 מ"ל בעל קשירה נמוכה של DNA על ידי חיתוך הקצה של מיקרופיפטה p200 וצינור בעדינות למעלה ולמטה כדי להרים את ה-NS.
    הערה: בנקודות זמן מאוחרות יותר (יום 7 ואילך), NS יהיה גדול מספיק כדי להיראות בעין אך גם יהיה קשה יותר לניתוק.
  2. הניחו ל-NS להתיישב בשפופרת למשך 3 דקות ב-RT, הסירו כמה שיותר מדיום ושטפו עם 1 מ"ל PBS קר.
    הערה: אם מעבירים NS קטן מנקודות זמן מוקדמות (לפני ימים 3-4), סובב ב-16 × גרם למשך 3 דקות כדי להבטיח שה-NS יתיישב לתחתית.
  3. הסר PBS ובמכסה מנוע כימי, החלף ב-2 מ"ל של 4% PFA ב-PBS. דגירה למשך 20 דקות ב-RT.
    1. הפוך את הצינור לאט לאחר הוספת תמיסת PFA 4% ותן לו לנוח במהלך הקיבוע בצד. המטרה היא לפזר מעט את ה-NS כך שהם לא יידבקו זה לזה בשלב זה.
  4. הסר תמיסת PFA 4% (בקולט האדים הכימי) ושטוף NS עם 1 מ"ל PBS קר/0.5% Tween20. תן לזה להתיישב ב-RT למשך 3 דקות. חזור על פעולה זו 3 פעמים בסך הכל.
    הערה: NS יתיישב בתחתית.
  5. הסר PBS/0.5% Tween20 והוסף 2 מ"ל של PBS/0.1% Triton X-100. הפוך את הצינור ותן לו לנוח על הצד. דגירה למשך שעה ב-RT.
  6. שטפו NS 3 פעמים ב-PBS קר/0.5% Tween20, כפי שמצוין בשלב 4.4.
  7. הסר PBS/0.5% Tween20 וחסום עם 2% BSA ב-PBS ב-4 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת לפחות, רצוי למשך הלילה.
    הערה: ניתן לאחסן דגימות ב-2% BSA/PBS עד שבוע ב-4 מעלות צלזיוס. יש להגן מפני אור.
  8. הכן תמיסת נוגדנים ראשונית על ידי הוספת הדילול הנכון של הנוגדן הראשוני ל-2% BSA/PBS בנפח סופי של 500 מיקרוליטר. לתמהיל הנוגדנים העיקרי ששימש במחקר זה, ראה טבלה 2.
  9. הסר כמה שיותר מתמיסת החסימה והעביר את ה-NS לצינור של 0.5 מ"ל על ידי חיתוך קצה של מיקרופיפטה p200.
  10. הוסף את תמיסת הנוגדנים העיקרית ופיפטה למעלה ולמטה לאט כדי להשעות מחדש את ה-NS. דגירה למשך הלילה על מסובב בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
  11. שטפו NS 3 פעמים ב-PBS קר למשך 5 דקות ב-RT.
  12. הכן את תמיסת הנוגדנים המשנית על ידי דילול הנוגדנים המשניים לבחירה ב-2% BSA/PBS והוספת 1/1000 DAPI. לתערובת הנוגדנים המשנית ששימשה במחקר זה, ראה טבלה 2.
    הערה: שמור על הצינורות מוגנים מפני אור.
  13. החלף PBS ב-500 מיקרוליטר של תמיסת נוגדנים משנית ועטוף את הצינור בנייר אלומיניום כדי להגן עליו מפני אור. דגירה למשך שעה אחת על המסובב ב-RT.
  14. יש לשטוף את NS 3 פעמים ב-PBS קר, כפי שמצוין בשלב 4.11.
  15. הסר כמה שיותר PBS מבלי לשאוב את ה-NS, החלף ב-50 מיקרוליטר של חומר ניקוי ופעל לפי הוראות היצרן.
  16. דגירה למשך הלילה ב-RT, מוגנת מאור.
  17. הכן תאי הרכבה.
    1. על שקופית מיקרוסקופ, הניחו שלוש שכבות של סרט דו צדדי. השתמש בסרט שקוף ונטול סיבים כדי למנוע שאריות בתא ההרכבה.
    2. בעזרת סכין גילוח חותכים חלון בגודל 3 מ"מ × 8 מ"מ בסרט הכפול.
      הערה: מידות החדר תלויות בנקודת הזמן של המדגם. דוגמה זו מתאימה לאירוח של 50 μL של מדיום הרכבה, שהוא אופטימלי עבור 10-20 NS בודד בנקודות זמן מאוחרות יותר (ימים 7-9).
  18. תחת סטריאוסקופ, העבירו בזהירות את ה-NS בחומר הניקוי לתא ההרכבה על ידי חיתוך קצה מיקרופיפטה p200 עם הידבקות נמוכה. השתמש בהגדלה בין 2x ל-4x כדי לספק שדה ראייה של כל החדר והגדלה מספקת כדי לזהות את ה-NS. אם הסטריאוסקופ מצויד להדמיה פלואורסצנטית, עבודה עם מסנן פלואורסצנטי כחול תקל על זיהוי ה-NS, שכן צביעת ה-DAPI תגרום ל-NS השקוף אחרת לבלוט.
    הערה: ודא שהמדיום יוצר מניסקוס קמור קל מעל החדר. זה יבטיח שלא יהיו בועות בתא.
  19. הניחו כיסוי על פני השטח ולחצו קלות על דפנותיו כדי שיידבק. בצע שלב זה תחת הסטריאוסקופ וודא שה-NS אינו נדחף מחוץ לתא.
  20. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס מוגן מאור עד להדמיה.

5. קיבוע והרכבה של CNCC לאימונופלואורסצנציה

  1. הסר את אמצעי התחזוקה של CNCC מהבארות ושטוף אותם עם PBS. הוסף PBS בעדינות על ידי פיפטינג בצד הבאר.
  2. המשך בקיבוע, חדירות וצביעה כמתואר בשלבים 4.3-4.14.
  3. הרכיבו כיסויים על מגלשת זכוכית מיקרוסקופית על ידי הוספת אמצעי הרכבה על המגלשה, אחיזה וסיבוב של הכיסוי בעזרת פינצטה כך ש-CNCC לאחר הנדידה פונה למגלשת הזכוכית, והנחתו על הטיפה.
    1. אופציונלי: אטום את הכיסוי עם לק או מערכות איטום נפוצות אחרות.
  4. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס מוגן מאור עד להדמיה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בעקבות הפרוטוקול, מושבות mESC פורקו, ו-3000 תאים נזרעו בצלחות U-bottom של 96 בארות שאינן מטופלות ב-TC. ביום השני, NS מצטבר הועבר ללוחות 96 בארות שטוחים שאינם מטופלים ב-TC כדי לאפשר להם להתחבר. הדמיה פשוטה של פרוטוקול צבירת NS מסופקת באיור 1A. NS עברו תרבית עד היום התשיעי ולאחר מכן עובדו לצביעה אימונופלואורסצנטית. תאים שנדדו מה-NS אל הצלחת הועברו לתלושי כיסוי להדמיה ותרבית עד היום ה-13 במדיום התחזוקה של CNCC. במקביל, הפרוטוקול ליצירת NS בצלחת פטרי בוצע כנקודת התייחסות והשוואה. המטרה הכוללת של...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מודלים של התמיינות תלת מימדית במבחנה מאפשרים ניתוח אינטראקציות מורכבות בין תאים שעלולות להיות קשות - או לא יכולות להיות - בתרבית תאים דו-ממדית. מספר מודלים פותחו כדי לחקור את התפתחות CNCC במבחנה. אלה נגזרים בדרך כלל ישירות ממושבות ESC 7,21 או מצמחי רקמה22,23. למרות שמערכות אלו הוכחו כיעילות ליצירת תאי פסגה עצבית, שיטות כאלה מראות רגישות משמעותית לשיטת הת...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין ניגוד עניינים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לד"ר רמי חאווייר קו על ייעוץ בתכנון פריימרים ומומחיות בתרבית תאים. עבודה זו נתמכה על ידי מועצת המחקר האירופית (ERC Start Grant 101039995 - REGENECREST) והקרן למחקר רפואי (Amorçage - AJE202205015403).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.22 μ מסנני מזרקm ClearLine146560
15 מ"ל צינור חרוטי פוליפרופילן בהירות גבוההבז352096
200 ומיקרו; L ClearLine Plus טיפים מסננים מחייבים נמוכיםDutscher713263
40 µ m מסנניםFalcon352340
5 מ"ל פיפטה סרולוגיתStarstedt86.1253.001
50 מ"ל צינור חרוטי פוליפרופילן בהירות גבוההFalcon352070
AccutaseMerck-SigmaA6964
Alexa Fluor 488 חמור אנטי ארנב IgG (H+L)Thermofisher ScientificA21206
Alexa Fluor 594 donkey anti עכבר IgG (H+L)Thermofisher ScientificA21203
Alexa Fluor 647 חמור אנטי עז IgG (H+L)Thermofisher ScientificA31571
תמיסה אנטיביוטית-אנטי-מיקוטית תוסף Merck-SigmaA5955
B27 PLUSThermofisher Scientific17504044
אלבומין סרום בקר (BSA)Merck-SigmaA9418
כלורופורםקרלו ארבה438601
קולגנאז סוג IVThermofisher Scientific, Gibco17104019
Costar 6 צלחות-באר מרובות שטופלו היטב ב-TCקורנינג3516
משקפי כיסוי,VWRnbsp; 630-2113 
DMEM KnockOutThermofisher Scientific10829018
DMEM/F12+GlutamaxThermofisher Scientific10565018
DMEM גלוקוז גבוהMerck-SigmaD0822
DNA LoBind  צינורות, 2 מ"לEppendorf30108078
DNase/RNase מים מזוקקיםThermofisher Scientific10977-035
Dulbecco' s Phosphate Buffered Saline (PBS)Thermofisher Scientific14190144
צינורות נעילה בטוחה של Eppendorf, 0.5 מ"לצינורות נעילה בטוחה של Eppendorf30121023
Eppendorf, 2 מ"לEppendorf30120094
ESGRO mLIF תוסף תזונה בינוניMerck-SigmaESG1107
אתנול 70%Carlo Erba528170
עוברי סרום בקרMerck-SigmaF7524
פיברונקטיןMerck-SigmaF085-2MG
Fluoromount-GInvitrogen00-4958-02
תמיסת ג'לטיןMerck-SigmaES-006-B
GlutaMAXThermofisher Scientific35050061
Human EGFPeprotechAF-100-15-500UG
אנושי FGF-בסיסיPeprotech100-18B
אנושי SOX9 נוגדןמו"פ & DsystemsAF3075
אינסולין מלבלב בקרMerck-SigmaI6634
iScript cDNA ערכת סינתזהBiorad1708891
עכבר אנטי אנושי AP-2 אלפא נוגדן חד שבטי, נוגדן חד שבטי לא מצומדDSHB3B5
עכבר אנטי אנושי PAX7
Thermofisher Scientific17502048
Neurobasal MediumThermofisher Scientific21103049
צלחת מטופלת בתרבית ללא רקמות, 96 באר,פלקון351172
צלחת מטופלת בתרבית ללא רקמות, 96 באר,תמיסה של פלקון
Paraformaldehyde 16%,מדעי מיקרוסקופיה אלקטרוניתבדרגה 15710
Propan-2-olCarlo Erba415154
מטוהר נגד טובולין ובטא; 3 (TUJ1) נוגדןBiolegendMMS-435P
RapiClear 1.47Sunjin LabRC147001
RapiClear 1.52Sunjin LabRC152001
סקוטש דו-צדדי 12.7 מ"מ ופעמים; 22.8 מ'סרט דו-צדדי שקוף ללא סיבים
SensiFAST SYBR No-ROX ערכתMeridian BioscienceBIO-98020
אזמל כירורגי חד פעמי סטריליSwann-Morton05XX
Superfrost Plus שקופיות מיקרוסקופ הידבקותEprediaJ1800AMNZ
Triton X-100ThermofisherScientific A16046.
TRIzol ReagentFisherScientific15596026
Trypsine-EDTA (0.05%)Thermofisher Scientific25300054
Tween-20Fisher Scientific10113103
TWIST1 Rabbit mAb (IF Formulated)טכנולוגיית איתות תאיםE7E2G
β-mercaptoethanolThermofisher Scientific
עגול& ללא , תוסף DSHB PAX7 N2 לא מצומד תחתון שטוח U-bottom 351177 AP31350010

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rothstein, M., Bhattacharya, D., Simoes-Costa, M. The molecular basis of neural crest axial identity. Dev Biol. 444, S170-S180 (2018).
  2. Smeriglio, P., Zalc, A. Cranial neural crest cells contribution to craniofacial bone development and regeneration. Curr Osteoporos Rep. 21 (5), 624-630 (2023).
  3. Zalc, A., et al. Reactivation of the pluripotency program precedes formation of the cranial neural crest. Science. 371 (6529), eabb4776(2021).
  4. Perera, S. N., Kerosuo, L. On the road again: Establishment and maintenance of stemness in the neural crest from embryo to adulthood. Stem Cells. 39 (1), 7-25 (2021).
  5. Nguyen, B. H., Ishii, M., Maxson, R. E., Wang, J. Culturing and manipulation of O9-1 neural crest cells. J Vis Exp. (140), e58346(2018).
  6. Ishii, M., Arias, A. C., Liu, L., Chen, Y. B., Bronner, M. E., Maxson, R. E. A stable cranial neural crest cell line from mouse. Stem Cells Dev. 21 (17), 3069-3080 (2012).
  7. Rada-Iglesias, A., Bajpai, R., Prescott, S., Brugmann, S. A., Swigut, T., Wysocka, J. Epigenomic annotation of enhancers predicts transcriptional regulators of human neural crest. Cell Stem Cell. 11 (5), 633-648 (2012).
  8. Cederquist, G. Y., et al. Specification of positional identity in forebrain organoids. Nat Biotechnol. 37 (4), 436-444 (2011).
  9. Rada-Iglesias, A., Bajpai, R., Swigut, T., Brugmann, S. A., Flynn, R. A., Wysocka, J. A unique chromatin signature uncovers early developmental enhancers in humans. Nature. 470 (7333), 279-283 (2011).
  10. Prescott, S. L., et al. Enhancer divergence and cis-regulatory evolution in the human and chimp neural crest. Cell. 163 (1), 68-83 (2015).
  11. Chaddah, R., Arntfield, M., Runciman, S., Clarke, L., van der Kooy, D. Clonal neural stem cells from human embryonic stem cell colonies. J Neurosci. 32 (23), 7771-7781 (2012).
  12. Bajpai, R., et al. CHD7 cooperates with PBAF to control multipotent neural crest formation. Nature. 463 (7283), 958-962 (2010).
  13. Sipahi, R., Zupanc, G. K. Stochastic cellular automata model of neurosphere growth: Roles of proliferative potential, contact inhibition, cell death, and phagocytosis. J Theor Biol. 445, 151-165 (2018).
  14. Mori, H., et al. Effect of neurosphere size on the growth rate of human neural stem/progenitor cells. J Neurosci Res. 84 (8), 1682-1691 (2006).
  15. Kress, C., Vandormael-Pournin, S., Baldacci, P., Cohen-Tannoudji, M., Babinet, C. Nonpermissiveness for mouse embryonic stem (ES) cell derivation circumvented by a single backcross to 129/Sv strain: establishment of ES cell lines bearing the Omd conditional lethal mutation. Mamm Genome. 9 (12), 998-1001 (1998).
  16. Simões-Costa, M., Bronner, M. E. Establishing neural crest identity: a gene regulatory recipe. Development. 142 (2), 242-257 (2015).
  17. Memberg, S. P., Hall, A. K. Dividing neuron precursors express neuron-specific tubulin. J Neurobiol. 27 (1), 26-43 (1995).
  18. Kim, C. N., Shin, D., Wang, A., Nowakowski, T. J. Spatiotemporal molecular dynamics of the developing human thalamus. Science. 382, eadf9941(2023).
  19. Grimaldi, A., Comai, G., Mella, S., Tajbakhsh, S. Identification of bipotent progenitors that give rise to myogenic and connective tissues in mouse. ELife. 11, e70235(2022).
  20. To, K., et al. A multiomic atlas of human early skeletal development. Nature. 635 (8039), 657-667 (2024).
  21. Bajpai, R., et al. Molecular stages of rapid and uniform neuralization of human embryonic stem cells. Cell Death Differ. 16 (6), 807-825 (2009).
  22. Kerosuo, L., Nie, S., Bajpai, R., Bronner, M. E. Crestospheres, Long-term maintenance of multipotent, premigratory neural crest stem cells. Stem Cell Reports. 5 (4), 499-507 (2015).
  23. Abe, S., Yamaguchi, S., Sato, Y., Harada, K. Sphere-derived multipotent progenitor cells obtained from human oral mucosa are enriched in neural crest cells. Stem Cells Transl Med. 5 (1), 117-128 (2016).
  24. Jensen, J. B., Parmar, M. Strengths and limitations of the neurosphere culture system. Mol Neurobiol. 34 (3), 153-161 (2006).
  25. Ziegler, L., Grigoryan, S., Yang, I. H., Thakor, N. V., Goldstein, R. S. Efficient generation of Schwann cells from human embryonic stem cell-derived neurospheres. Stem Cell Rev Rep. 7 (2), 394-403 (2011).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Neural CrestNeurosphereEMT96

מאמרים קשורים