הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

העברת גנים יעילה ובטוחה לכליות העכבר באמצעות הזרקת אגן כליה רטרוגרדית איטית של וקטורים של וירוסים הקשורים לאדנו.

2.1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/67716

⸱

1 באוגוסט 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular and Medical Genetics, Oregon Health & Science University, 2Department of Molecular Microbiology and Immunology, Oregon Health & Science University, 3Division of Neuroscience, Oregon National Primate Research Center

במאמר זה

סיכום

דוח זה מפרט את שיטת ההזרקה המקומית של וקטורי AAV דרך אגן הכליה להעברת גנים יעילה ובטוחה לכליות העכבר.

תקציר

פיתוח כלים ושיטות יעילות in vivo להעברת גנים לכליה הוא חיוני לקידום מחקר כליות בסיסי וריפוי גנטי למחלות כליה. בנוסף, המודעות הגוברת למחלות כליה מונוגניות, המונעת על ידי בדיקות גנטיות מתקדמות, מדגישה את הפוטנציאל של ריפוי גנטי לטיפול ואף לריפוי מחלות כליה גנטיות קשות לטיפול. בהקשר זה, וקטורים של נגיף הקשור לאדנו (AAV) זכו לתשומת לב הולכת וגוברת כפלטפורמה חזקה להעברת גנים in vivo ; עם זאת, השיטה היעילה והבטוחה ביותר להעברת גנים בתיווך וקטור AAV לכל סוג תא רלוונטי מבחינה טיפולית בכליה עדיין לא הוכחה במלואה. כאן, מפורטת השיטה של הזרקת אגן כליה לאחור איטית (RP) של וקטורי AAV, והפוטנציאל הגבוה שלה להמיר כליות עכבר מודגם בשימוש עם קפסידים AAV שנבחרו כראוי. יתר על כן, שיטה זו הוכחה כיעילה לא רק עם וקטורים סטנדרטיים של AAV מטוהר צזיום כלוריד אולטרה-צנטריפוגה (CsCl AAV) אלא גם עם מיני-הכנות וקטוריות AAV (CU AAV) אולטרה-מסוננות צנטריפוגלית, שניתן להכין במהירות ובפשטות באמצעות טכניקות שאינן דורשות מומחיות מיוחדת בווקטור AAV. כדוגמה, מחקר זה מדגים הזרקת RP איטית של וקטורים CsCl ו-CU AAV-KP3 מביאה להתמרה חזקה של צינורות פרוקסימליים בכליות העכבר ללא נזק לרקמות לכאורה, בניגוד לגישות הידרודינמיות שדווחו בעבר שמובילות בהכרח לנזק לרקמות. לפיכך, מחקר זה מדגיש כי הזרקת RP לאחור איטית של וקטורים נבחרים שמקורם בקפסיד AAV היא שיטה יעילה ובטוחה להעברת גנים לכליה. שיטה זו תהיה ישימה בספקטרום רחב של מחקר כליות, כולל מחקרי ריפוי גנטי. השימוש במיני-הכנות וקטוריות של CU AAV יגדיל משמעותית את התפוקה וישפר את יעילות הזמן והעלות הדרושים להפקת נתונים ראשוניים וקבלת תובנות חיוניות.

מבוא

שיטות יעילות ובטוחות להעברת גנים לכליה בחיות ניסוי קטנות וגדולות מספקות הזדמנויות חיוניות לקדם מחקר בסיסי בכליות ולחקור גישות טיפוליות חדשניות. קביעת שיטות כאלה רלוונטית במיוחד לטיפול גנטי במחלות כליה שונות. ההתקדמות האחרונה בבדיקות גנטיות קליניות חשפה שכיחות גבוהה יותר של הפרעות כליות מונוגניות מההערכות הקודמות, המשפיעות על כ-30% מהחולים עם מחלות כליות כרוניות (CKDs)1. CKD מאופיין בנזק כלייתי מתקדם, המוביל בסופו של דבר לאי ספיקת כליות ללא טיפולים יעילים באמת לשינוי המחלה. המודיאליזה והשתלת כליה הם טיפולים זמינים כיום; עם זאת, יש להם מגבלות הפוגעות משמעותית באיכות החיים של חולים עם CKD2. לפיכך, ריפוי גנטי, גישה מוכחת קלינית לטיפול במחלות גנטיות, זכה לתשומת לב משמעותית בשנים האחרונות כדרך חדשה לטיפול יעיל במחלות כליה גנטיות המובילות ל-CKD 3,4,5,6. גישה זו יכולה לטפל ישירות בסיבות השורש של המחלות ואולי להציע תרופה.

למרות ההתקדמות המתמדת בתחום, העברת גנים לכליה נותרה אתגר משמעותי הן במסגרות המחקריות והן במסגרות הטיפוליות. התמקדות יעילה בתאי כליה עם גנים טיפוליים קשה בשל המבנה המורכב של האיבר והמחסומים הפיזיולוגיים הייחודיים, כולל מחסום הסינון הגלומרולרי, המורכב מתאי אנדותל גלומרולרי, קרום הבסיס הגלומרולרי ותהליכי כף הרגל הפודוציטים. אסטרטגיות שונות נחקרו להעברת גנים ממוקדת כליות, כולל הזרקה ישירה של קליפת הכליה (RC) 7,8, הזרקת עורק הכליה (RA) 9,10,11, הזרקת וריד כליה (RV) 12,13,14, הזרקת אגן הכליה (RP) 15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25 והזרקה תוך ורידית (IV) 19,26,27,28,29,30 של וקטורים להעברת גנים נגיפיים או לא ויראליים, כמו גם אולטרסאונד ואספקת חומצות גרעין בתיווך מיקרו-בועות 31,32. גישות אלו הדגימו יעילות טרנסדוקציה משתנה או תוצאות פונקציונליות, ולעתים קרובות הניבו תוצאות לא עקביות שקשה ליישב (נסקר בהפניות 3,33,34,35). העברת גנים לכליה עדיין אינה מפותחת, מה שהופך את ההשוואות הישירות בין מערכות וקטוריות ומתודולוגיות למאתגרות. עם זאת, שיטות אספקה מקומיות, המאפשרות מתן חומרים מרוכזים מאוד ישירות לכליה, השיגו בדרך כלל תוצאות טובות יותר מאשר מתן עירוי מערכתי. בנוסף, וקטורים של נגיף הקשור לאדנו (AAV), עם פרופילי הבטיחות החזקים שלהם והרקורד המוכח של תרגום קליני36,37, היו הנחקרים ביותר ונחשבים לבחירה המובילה להעברת גנים כלייתיים.

סרוטיפים נפוצים של AAV וקפסידים מהונדסים הוכיחו התמרה יעילה של תאים מזנגיאליים ומזנכימליים בכליה לאחר הזרקת IV בעכברים 28,30,38. יש לציין כי מחקרים אחרונים הראו כי מתן IV של AAV9 יכול להתמיר ביעילות פודוציטים במודלים של עכברים של תסמונת נפרוטית ותסמונת אלפורט, אם כי השפעה זו אינה נצפית בכליה בריאה38,39, וכי מתן IV של קפסיד AAV2 מהונדס יכול לכוון אך ורק לתאי אנדותל גלומרולרים בכליות בריאות ומודלקות בעכברים40. מבחינה היסטורית, צינוריות כליה היו מאתגרות להתמרה דרך נתיב הווריד. עם זאת, לאחרונה התגלה כי הזרקת RP של קפסידים נבחרים של AAV, כגון AAV-KP141, יכולה להשיג התמרה של צינוריות פרוקסימליות ברמות גבוהות יותר מסדר גודל מאלו שהושגו עם קפסיד AAV938. למרות שיש צורך בשיפורים נוספים, התקדמות זו פותחת אפיקים חדשים למחקר כליות בסיסי וריפוי גנטי, ומציעה הזדמנויות שבעבר לא היו ניתנות להשגה.

במאמר הנוכחי, הזרקת RP איטית לאחור של וקטורי AAV מפורטת כשיטה יעילה ובטוחה להעברת גנים לכליה של העכבר38. כדוגמה מייצגת לטכניקה זו, AAV-KP3 נבחר כקפסיד לדוגמה על סמך התגלית שהוא אחד מששת הקפסידים (כלומר, AAV-KP1, AAV-KP2, AAV-KP341, AAV-DJ42, AAV2G943 ו-AAV2.7m844) שהראו התמרה כלייתית משופרת בהשוואה ל-AAV9 לאחר הזרקת RP בעכברים38. יש לציין כי רקמות כליה איטיות שהוזרקו RP לאחור לא הראו נזק לרקמות בניגוד לאלו שטופלו בגישות הידרודינמיות שדווחו בעבר23,24. יתר על כן, וקטורים מיני-הכנה AAV45 מטוהרים בגסות על ידי אולטרה-סינון צנטריפוגלי מהיר ופשוט (כלומר, וקטורי CU AAV) השיגו רמות התמרה כלייתית של כ-70% מאלו שניתן להשיג על ידי תכשירי וקטור AAV מטוהרים על ידי אולטרה-צנטריפוגה שיפוע צזיום כלוריד סטנדרטית (CsCl) (כלומר, וקטורי CsCl AAV) כאשר הם ניתנים באותו טיטר גנום וקטורי. לפיכך, השיטה והתצפיות המוצגות כאן מספקות משאב יקר ערך ומעשי לחוקרים המבקשים לשפר את העברת הגנים לכליה בעכברים ובבעלי חיים גדולים יותר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל הניסויים בבעלי חיים המתוארים כאן אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת אורגון לבריאות ומדע (OHSU) ובוצעו בהתאם להנחיות לטיפול בבעלי חיים ב-OHSU. במחקר זה נעשה שימוש בעכברים זכרים בני שמונה שבועות C57BL/6J. הריאגנטים והציוד המשמשים במחקר זה מפורטים בטבלת החומרים.

1. ייצור וקטור AAV על ידי טרנספקציה של פלסמיד נטול אדנו-וירוס

  1. תרבית כליה עוברית אנושית (HEK) 293 תאים במדיום הנשר המותאם (DMEM) של Dulbecco - גלוקוז גבוה (4.5 גרם/ליטר) בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS), 1% תערובת פניצילין וסטרפטומיצין ו-1 מ"מ L-גלוטמין, באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני (CO2).
  2. ביום -2 (48 שעות לפני הטרנספקציה), צלחת 4 x 106 HEK 293 תאים לכל בקבוק T225 ב-40 מ"ל של מדיום התרבית כמתואר בשלב 1.1. זה מגיע ל~95% מפגש ביום 0.
    הערה: ניתן לכוונן את סולם התרבות בהתאם ליישום. עבור מיני-הכנה של AAV (שלב 2), הכינו מספר מתאים של צלוחיות על סמך טיטר המטרה וריכוז הווקטור, בהתחשב בכך שתהליך הטיהור מביא בדרך כלל לאובדן של כ-50% של חומר. כדי להשיג >6 x10 12 vg/mL של וקטורים AAV9 ו-AAV-KP3 להזרקת RP בעכברים במינון של 3 x 1011 vg/עכבר בתמיסה וקטורית של 50 μL, מומלץ לפחות 2 צלוחות. לייצור וקטור AAV בקנה מידה גדול יותר, כגון זה של וקטורי AAV מטוהרים בשיפוע צפיפות CsCl (CsCl AAVs), משתמשים בדרך כלל ב-25 צלוחיות או יותר.
  3. יום 0: טרנספקציה של DNA פלסמיד
    1. הכנה לטרנספקציה
      1. ודא שהתאים הגיעו למפגש ~95%.
      2. יש לחמם DMEM בתוספת תערובת פניצילין וסטרפטומיצין 1% ו-1 מ"מ L-גלוטמין אך ללא FBS (כלומר, מדיום נטול סרום) באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס.
      3. אפשר לתמיסת הפוליאתילנימין הליניארית (PEI) להגיע לטמפרטורת החדר.
    2. הכנת תערובת DNA פלסמיד
      1. מערבבים את הפלסמידים (15 מיקרוגרם כל אחד של pAAV-CAG-tdTomato, pRepCap ו-pHelper) ב-1 מ"ל של מי מלח עם חוצץ פוספט (PBS) ללא CaCl2 או MgCl2 בצינורות מיקרו-צנטריפוגה סטריליים של 1.5 מ"ל. הכמות הכוללת של דנ"א היא 45 מיקרוגרם/בקבוק.
        הערה: ניתן להתעלם מנפחי תמיסת DNA של פלסמיד אם הם מינימליים. עם זאת, מומלץ להתאים את עוצמת הקול אם נפח התמיסה הכולל הוא ≥225 μL. רצפי הפלסמידים ששימשו במחקר זה זמינים בקובץ משלים 1.
    3. טרנספקציה של PEI
      1. הוסף 90 מיקרוליטר של תמיסת PEI (1 מ"ג/מ"ל) ל-1 מ"ל של PBS וערבב עם תערובת ה-PBS-פלסמיד DNA (שהוכנה כאמור לעיל) בצינור פוליפרופילן של 50 מ"ל. הנפח הסופי הוא כ -2 מ"ל (נפח 5% ממדיום התרבות).
      2. מערבל את הצינורות למשך 5 שניות וסובב בקצרה את הצינורות עם צנטריפוגה כדי לאסוף את הנוזל לתחתית הצינורות.
    4. שמור בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות ליצירת קומפלקסים של פלסמיד DNA-PEI.
    5. לאחר השלמת הדגירה של 15 דקות, הוסף את 40 מ"ל של מדיום נטול סרום מחומם מראש שהוכן בשלב 1.3.1.2 למתחמי ה-DNA-PEI של הפלסמיד. הנפח הוא כ-42 מ"ל.
    6. החלף את מדיום התרבות של בקבוק T225 במתחמי DNA-PEI פלסמיד המכילים מדיום נטול סרום המתואר בשלב 1.3.4.
    7. שמור על התאים במדיום טרנספקציה זה עד הקציר ביום 5 (אין צורך בשינוי מדיום).
    8. ביום השני, התבונן בתאים שהועברו עם הפלסמיד המבטא חלבונים פלואורסצנטיים (למשל, pAAV-CAG-tdTomato) תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך כדי להעריך את יעילות טרנספקציה של פלסמיד.
      הערה: התנאים שתוארו לעיל מביאים בדרך כלל ליעילות טרנספקציה העולה על 70%. ניתן להבחין בשינויים מורפולוגיים מסוימים (למשל, התארכות תאים), ככל הנראה בשל הסביבה נטולת הסרום.
    9. בימים 3 עד 5, המשיכו לתרבית את התאים המועברים באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2.
    10. ביום החמישי, אספו גם תאים וגם מדיום המכיל נגיף לתוך צינור פוליפרופילן של 50 מ"ל.
    11. אחסן את הדגימות בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד לשימוש.

2. טיהור אולטרה-סינון צנטריפוגלי (CU) של וקטורי AAV (AAV miniprep)

  1. הפשירו את הדגימה הקפואה משלב 1.3.11 באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס.
  2. שמור 1 מ"ל של ליזאט גולמי בצד לבדיקת כתם נקודות DNA (משמש כשבר 1).
  3. הוסף 80 מיקרוליטר של 1M מגנזיום כלוריד (MgCl2, ריכוז סופי של 2 מ"מ), 160 מיקרוליטר של 0.1M נתרן הידרוקסיד (NaOH, ריכוז סופי של 0.4 מ"מ), ו-16 מיקרוליטר של Serratia marcescens endonuclease (ריכוז סופי של 100 יחידות/מ"ל) לתוך צינור של 50 מ"ל. יש לדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה. מערבולת את הדגימה כל 15 דקות במהלך הדגירה.
  4. אסוף את הדגימה שטופלה באנדונוקלאז של Serratia marcescens לבקבוק צנטריפוגה של 250 מ"ל וצנטריפוגה ב-10,000 x גרם ב-4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
  5. העבירו את הסופרנטנט לצינור פוליפרופילן של 50 מ"ל באמצעות פיפטה סרולוגית של 50 מ"ל.
  6. סנן את ה-supernatant כדי להסיר פסולת באמצעות מסנן מזרק PVDF של 0.45 מיקרומטר. שמור 1 מ"ל של דגימה מסוננת של 0.45 מיקרומטר בצד לבדיקת כתם נקודות DNA (משמש כשבר 2).
  7. הוסף 10 מ"ל של מים בדרגה מולקולרית לצינור אולטרה-סינון צנטריפוגלי במשקל מולקולרי של 100 kDa (MWCO) וצנטריפוגה ב-2,000 x גרם ב-4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. הסר את הזרימה.
  8. הוסף 15 מ"ל של 5% סורביטול ב-PBS לצינור האולטרה-סינון הצנטריפוגלי ולצנטריפוגה ב-2,000 x גרם ב-4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. הסר את הזרימה.
  9. הוסף עד 15 מ"ל של דגימה מסוננת של 0.45 מיקרומטר כמתואר בשלב 2.6 וצנטריפוגה ב-2,000 x גרם ב-4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות לריכוז עד להשגת נפח היעד של כ-500 מיקרוליטר. שמור 1 מ"ל של זרימה בצד לבדיקת כתם נקודות DNA (משמש כשבר 3).
    הערה: לפני כל צנטריפוגה, השעו מחדש את השמירה בעזרת פיפטה כדי לשבש את שיפוע הריכוז. אל תיגע בקרום עם קצה הפיפטה. אם נפח היעד לא מושג לאחר צנטריפוגה של 15 דקות, הרחב את הצנטריפוגה לפי הצורך על ידי התאמת משך הזמן על סמך הנפח שנותר בצינור.
  10. חזור על שלב 2.9 עד לסינון הדגימה כולה, ומגיע לנפח היעד של כ-500 מיקרוליטר. שמור 1 מ"ל של הזרימה מהאיטרציה הראשונה והשנייה של שלב 2.10 בצד לבדיקת כתם נקודות DNA (משמש כשבר 4 ושבר 5).
    הערה: ניתן להשתמש בצינור אולטרה-סינון צנטריפוגלי יחיד לעיבוד דגימות המתקבלות משתי צלוחיות או יותר.
  11. הוסף 15 מ"ל של סורביטול 5% ב-PBS וצנטריפוגה ב-2,000 x גרם ב-4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות עד להשגת נפח היעד של כ-500 מיקרוליטר. שמור 1 מ"ל של זרימה בצד לבדיקת כתם נקודות DNA (משמש כשבר 6).
  12. חזור על שלב 2.11 (משמש כשבר 7).
    הערה: אם נדרשים טיטרים גבוהים יותר של AAV לניסויים במורד הזרם, ניתן להפחית עוד יותר את נפח היעד הסופי ל-150 מיקרוליטר.
  13. העבר את וקטור ה-AAV האולטרה-מסונן לצינור מכסה בורג של 2 מ"ל עם טבעת O. שמור 10 מיקרוליטר של וקטור AAV אולטרה-מסונן בצד לבדיקת כתם נקודות DNA (משמש כשבר 8).
  14. קבע טיטרים של AAV על ידי בדיקת כתם נקודות DNA כפי שתואר קודם לכן46.
    הערה: וקטורים מטוהרים-CU (CU AAV) מכילים רמות גבוהות יותר של זיהום קפסיד ריק וזיהומים שמקורם בתאי מארח בהשוואה לווקטורים מטוהרים CsCl (CsCl AAV). גורמים אלה עשויים להשפיע על יעילות הטרנסדוקציה והתגובות החיסוניות, הדורשים התייחסות מדוקדקת בפרשנות הנתונים.

3. טיהור שיפוע צפיפות CsCl של וקטורי AAV

  1. הפשירו את הדגימה הקפואה משלב 1.3.11 באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס.
  2. צנטריפוגה ב-10,000 x גרם ב-4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות להסרת פסולת התא.
  3. אסוף את וקטורי ה-AAV הסופרנטנט וזרז בסופרנטנט על ידי הוספת פוליאתילן גליקול 8000 (PEG, ריכוז סופי של 8%) ונתרן כלורי (ריכוז סופי של 500 מ"מ).
  4. דגירה על קרח למשך 3 שעות.
  5. צנטריפוגה ב-10,000 x גרם ב-4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות כדי להשיג את הכדורים המכילים AAV.
  6. הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש את הכדורים עם 10 מ"ל סרקוזיל המכיל מאגר השעיה מחדש (50 מ"מ HEPES, 150 מ"מ NaCl, 1% סרקוזיל, pH 8.0).
  7. העבירו את מתלה הגלולה לצינור פוליפרופילן של 15 מ"ל ושמרו אותו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
  8. למחרת, יש לטפל בתרחיף הגלולה עם Serratia marcescens endonuclease (ריכוז סופי של 200 יחידות/מ"ל) ו-MgCl2 (ריכוז סופי של 2 מ"מ).
  9. יש לדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה.
  10. צנטריפוגה ב-10,000 x גרם ב-4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
  11. אוספים את הסופרנטנט ומוסיפים צזיום כלוריד (CsCl, ריכוז סופי של מקדם שבירה (RI) = 1.3710 +/- 0.0005) ו-EDTA (ריכוז סופי של 20 מ"מ).
  12. טען את הדגימה לתוך צינור אולטרה-צנטריפוגה של 29.9 מ"ל והוסף תמיסת ציפוי (50 מ"מ HEPES, 150 מ"מ NaCl, 20 מ"מ EDTA, CsCl (RI = 1.3710 +/- 0.0005), pH 8.0) עד שהיא מלאה.
  13. צנטריפוגה ב-41,000 x גרם ב-12 מעלות צלזיוס למשך 22 שעות.
  14. נקב חורים בתחתית ובצד של צינור האולטרה-צנטריפוגה כדי לאסוף בסך הכל 15 שברים של 2 מ"ל כל אחד.
  15. השתמש ב-10 מיקרוליטר מכל שבר כדי לבדוק RI ולבצע את בדיקת כתם נקודות ה-DNA46.
  16. בהתבסס על תוצאות בדיקת כתם נקודות RI ו-DNA, קבע את 5 השברים הטובים ביותר המכילים וקטורי AAV.
  17. שלב את 5 השברים הטובים ביותר (סה"כ כ-10 מ"ל) והתאם את RI ל-1.3710 +/- 0.0005.
  18. טען את הדגימה לתוך צינור אולטרה-צנטריפוגה של 11.2 מ"ל והוסף את תמיסת הציפוי עד שהיא מלאה.
  19. צנטריפוגה ב-65,000 x גרם ב-12 מעלות צלזיוס למשך 12 שעות.
  20. נקב חורים בתחתית ובצד של צינור האולטרה-צנטריפוגה בנפח 11.2 מ"ל כדי לאסוף בסך הכל 18 שברים של 0.5 מ"ל כל אחד.
  21. השתמש ב-10 מיקרוליטר מכל שבר כדי לבדוק RI ולבצע את בדיקת כתם נקודות ה-DNA46.
  22. בהתבסס על תוצאות בדיקת כתם נקודות RI ו-DNA, קבע את 6 השברים הטובים ביותר המכילים וקטורי AAV.
  23. שלב את 6 השברים הטובים ביותר (סה"כ כ -3 מ"ל) וטען אותם לקלטת דיאליזה.
  24. צף את קלטת הדיאליזה ב-1.3 ליטר של מאגר דיאליזה (מאגר PBS בתוספת 0.001% חומר פעילי שטח לא יוני) עם מוט ערבוב למשך שעתיים כדי להסיר את ה-CsCl.
  25. חזור על שלב 3.24 פעמיים (סה"כ 6 שעות דיאליזה).
  26. העבירו את הקסטה ל-500 מ"ל של 5% סורביטול במאגר PBS בתוספת 0.001% פעילי שטח למשך שעתיים להחלפת חיץ.
  27. אסוף את הדגימה מקלטת הדיאליזה בעזרת מזרק וסנן את הדגימה שנאספה באמצעות מסנן מזרק PVDF של 0.22 מיקרומטר.
  28. טיטרים AAV שנקבעו על ידי בדיקת כתם נקודה כמותית46.

4. הערכת איכות של תכשירי וקטור AAV על ידי SDS-PAGE ואחריה צביעת כסף

  1. מערבבים תכשירים וקטוריים, 1 x 1010 vg עבור וקטורים CsCl AAV, ו-1 x 109 ו-1 x10 10 vg עבור וקטורים של CU AAV, עם מאגר Laemmli 6x בסך הכל 18 מיקרוליטר (הכנה וקטורית: 6x Laemmli = 15:3) ומחממים אותם ב-100 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
  2. טען את תכשירי וקטור ה-AAV שטופלו בחום על ג'ל SDS-PAGE 7.5% ואלקטרופורזה את הדגימות ב-20 mA באמצעות מאגר ריצה של ג'ל Tris-glycine-SDS.
  3. מוציאים את הג'ל מקלטת הג'ל, שוטפים אותו במים טהורים במיוחד ומכתימים אותו באמצעות ערכת צביעה כסופה לפי הוראות היצרן.
  4. דגרו את הג'ל הטעון בווקטורי CsCl AAV בתמיסת המפתח למשך 7 דקות, ואילו דגרו את הג'ל הטעון בווקטורי CU AAV למשך 2 דקות כדי למנוע רוויה של האות.
    הערה: תכשירי וקטור CU AAV מכילים רמות גבוהות יותר של זיהומי חלבון בהשוואה לווקטורים של CsCl AAV. לכן, ג'לים עמוסים בווקטורים CsCl AAV ו-CU AAV הופרדו לאחר הפעלת ג'ל ונצבעו בכסף בנפרד כדי למנוע רוויית אות עקב הרגישות הגבוהה של שיטת הצביעה.

5. זיהוי חלבוני AAV VP בתכשירים וקטוריים של CU AAV על ידי כתם מערבי

  1. מערבבים 1 x 109 vg של תכשירי וקטור CU AAV עם מאגר Laemmli 6x בסך הכל 18 מיקרוליטר (הכנה וקטורית: 6x Laemmli = 15:3) ומחממים אותם ב-100 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
  2. טען את תכשירי וקטור ה-AAV שטופלו בחום על ג'ל SDS-PAGE 7.5% ואלקטרופורזה את הדגימות ב-20 mA באמצעות מאגר ריצה של ג'ל Tris-glycine-SDS.
  3. העברת חלבונים בג'ל על קרום פוליווינילידן דיפלואוריד (PVDF), המופעל במתנול, באמצעות מערכת העברה חצי יבשה.
  4. חסמו את הממברנה עם חלב דל שומן 5% בתמיסת מלח 1x Tris-buffered עם Tween 20 (TBST) בטמפרטורת החדר למשך שעה.
  5. דגרו את הממברנה החסומה עם תמיסת נוגדנים ראשונית (נוגדן אנטי-VP רב-שבטי של ארנב, מדולל ל-1:1000 עם 5% חלב דל שומן ב-1x TBST) ב-4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
  6. שוטפים את הממברנה עם 1x TBST למשך 10 דקות, 3 פעמים.
  7. דגרו את הממברנה עם תמיסת נוגדנים משנית (נוגדן IgG נגד ארנב עזים מצומד עם פרוקסידאז חזרת, מדולל ל-1:5000 עם 5% חלב דל שומן ב-1x TBST) בטמפרטורת החדר למשך שעה.
  8. שוטפים את הממברנה עם 1x TBST למשך 10 דקות, 3 פעמים.
  9. דמיין אותות על הממברנה באמצעות מערכת הדמיה של כתם מערבי.

6. הזרקת אגן כליה (RP).

  1. הגדרה והרדמה לפני הניתוח
    1. מדוד את משקל הגוף של כל עכבר בכוס פלסטיק בסולם משקל מדויק עד 0.1 גרם.
    2. יש לתת מלוקסיקם (5 מ"ג/ק"ג) באופן תת עורי בהתאם למשקל הגוף כדי לספק משככי כאבים לפני הניתוח.
    3. לדלל את תמיסת וקטור ה-AAV לריכוז של 6.0 x10 12 vg/mL עם 5% סורביטול ב-PBS ולשמור אותו על קרח.
      הערה: הכן 40 מיקרוליטר יותר תמיסת AAV מנפח ההזרקה הכולל (50 מיקרוליטר x מספר העכברים שיש להזריק) כדי לקחת בחשבון שטח מת במזרק זכוכית אטום לגז ובצינור פוליאתילן PE-10.
    4. כופפו ושברו רק את קצה המחט ממחט של 30 גרם באמצעות מחזיק מחט.
    5. תחת סטריאומיקרוסקופ, חבר את קצה המחט 30 G, 15 ס"מ של צינור PE-10, מחט 30 G ומזרק זכוכית אטום לגז בסדר זה מהקצה (איור 1D).
    6. הנח את מזרק הזכוכית האטום לגז המחובר על משאבת מזרק עירוי.
    7. שאפו 90 מיקרוליטר של תמיסת וקטור AAV שהוכנה בשלב 6.1.3 לתוך מזרק הזכוכית האטום לגז באמצעות משאבת מזרק עירוי.
    8. הגדר את מצב העירוי של משאבת המזרק באופן הבא: נפח היעד של 50 מיקרוליטר וקצב זרימה של 50 מיקרוליטר לדקה.
    9. הנח עכבר בתא פלסטיק מלא באיזופלורן 4% המועבר ב-100% חמצן בקצב זרימה של 1.5 עד 3.0 ליטר לדקה עד להרדמה מלאה.
    10. הנח את חוטם העכבר לתוך חרוט אף עם זרימת איזופלוראן של 1.5% עד 3.0%. עקוב אחר עומק ההרדמה על ידי רפלקס צביטה לאורך כל ההליך הכירורגי.
    11. כסו את העיניים במשחה עיניים באמצעות אפליקטור עם קצה כותנה למניעת ייבוש הקרנית.
    12. הסר את הפרווה מהצד האחורי השמאלי של העכבר בעזרת מסיר שיער בעזרת אפליקטור עם קצה כותנה.
      הערה: יש להסיר לחלוטין את קרם האפילציה באמצעות שטיפה כדי למנוע גירוי בעור.
    13. הנח את העכבר במצב רוחבי על כרית חום בלולאה סגורה המחוברת למשאבת טיפול בחום כדי לשמור על טמפרטורת הגוף על 37 מעלות צלזיוס (אין צורך לאבטח אותו עם סרט דבק).
    14. יש לחטא את האזור המגולח בשלוש מריחות לסירוגין של פובידון-יוד ואתנול 70% באמצעות אפליקטור עם קצה כותנה בתנועה מעגלית החל ממקום החתך.
    15. מכסים את העכבר בווילון כירורגי סטרילי.
  2. הזרקת RP לכליה השמאלית
    1. צובטים את העור בעזרת מלקחיים לרקמות ומבצעים חתך של כ-1 ס"מ לשכבת העור בעזרת מספריים כירורגיים בגובה זווית ה-costovertebral במיקום הכליה השמאלית.
    2. לאחר ביצוע חתך בעור, חותכים את שכבת השריר באותו אורך.
      הערה: אם אורך החתך קצר מדי, לא ניתן לחשוף את הכליה, ובמקום זאת, הטחול, הקטן יותר בגודלו, עלול להיחשף בטעות. מצד שני, אם אורך החתך ארוך מדי, הכליה לא תישמר במקומה על ידי החתך עצמו ותחליק ללא הרף חזרה לבטן דרך החתך.
    3. לחצו בעדינות על הבטן עם האצבעות, בלי לגעת ישירות בכליה, כך שהכליה תיחשף דרך אזור החתך (איור 1A).
    4. הסר באופן מינימלי את השומן שמסביב כך שאגן הכליה נראה כאזור לבן קטן.
    5. ראשית, מהדקים את השופכן בעזרת קליפ מיקרו כלי מסוג ישר, ולאחר מכן את עורק הכליה ווריד הכליה יחד עם קליפ מיקרו כלי מעוקל.
      הערה: צבע הכליה הופך לאדום כהה, מה שמאשר את החסימה המוצלחת של זרימת הדם לתוך הכליה והחוצה ממנה (איור 1B).
    6. הכנס את מחט ה-30 G המחוברת למשאבת המזרק כ-3 מ"מ לתוך חלל האגן עם מלקחיים מעוקלים והתחל הזרקה של 50 μL של תמיסת וקטור AAV באמצעות משאבת מזרק עירוי בקצב זרימה של 50 μL/min במשך דקה אחת (איור 1C).
    7. שמור את המחט והמהדק למשך 5 דקות כדי להגביר את חשיפת הכליה המוזרקת לווקטור ה-AAV.
      הערה: זמן השהייה המתאים עשוי להשתנות ותלוי בקפסידים של AAV. זמן שהייה של 5 דקות הוכח כמספיק להתמרה עם וקטור AAV-KP1 או AAV-KP3.
    8. לאחר השלמת הדגירה של 5 דקות, הסר את המהדקים.
      הערה: צבע הכליה משתנה מיד מאדום כהה לאדום דם, מה שמאשר את שיקום זרימת הדם בכליה.
    9. משוך את מחט ההזרקה בזהירות ובאטיות, ובמקביל הנח אפליקטור עם קצה כותנה על מקום ההזרקה בלחץ. וודאו כי אין דימום ממקום ההזרקה. אין צורך במריחת תיקון המוסטטי.
    10. הנח בעדינות את הכליה בחזרה לחלל הצפק.
    11. לתפור את שכבת השריר בתפר נספג 6-0 ואת העור בתפר מונופילמנט 5-0.
    12. יש לתת 1 מ"ל של מי מלח תת עוריים לתוך גב העכברים לתמיכה בנוזלים.
    13. החלף את קצה המחט המשומש של 30 גרם בקצה שהוכן לאחרונה, השלך את מחט ה-30 גרם המשומשת בהתאם להנחיות המוסד לניהול פסולת כימית מסוכנת, וטען 50 מיקרוליטר של תמיסת וקטור AAV באמצעות משאבת מזרק עירוי למתן לעכבר הבא.
    14. חזור על שלבים 6.2.12-6.2.13 עבור כל העכברים בקבוצה, למעט האחרון, שעבורו שלב 6.2.13 אינו נדרש.
    15. לאחר השלמת כל ההזרקות המתוכננות, השליכו את המחטים המזוהמות וצינורות הפוליאתילן בהתאם להנחיות המוסד לניהול פסולת כימית מסוכנת.
  3. ניטור וטיפול לאחר הניתוח
    1. יש לתת מלוקסיקם (5 מ"ג/ק"ג) תת עורי לחלק האחורי של עכברים לשיכוך כאבים לאחר ניתוח 24 שעות ו-48 שעות לאחר הזרקת RP.
    2. יש לתת 1 מ"ל של מי מלח תת עוריים לתוך גב העכברים לתמיכה בנוזלים 24 שעות לאחר הזרקת RP.
    3. עקוב אחר משקל הגוף והמראה הכללי של עכברים מוזרקים מדי יום במשך שבוע לאחר הניתוח. אם מתרחשת ירידה של 10% במשקל הגוף, יש לתת 1 מ"ל מי מלח תת עוריים לגב העכברים שלוש פעמים בשבוע למשך שבוע. אם לא נצפה שיפור, עכברים מושפעים מורדמים.

7. קצירת רקמות והקפאה

  1. הכנת פתרון קיבוע והגנה מפני הקפאה.
    1. 0.2 מ' מאגר פוספט (סה"כ 1 ליטר)
      1. הכינו 800 מ"ל מים טהורים במיוחד בכוס זכוכית של 1 ליטר.
      2. הוסף לתמיסה 6.4 גרם נתרן פוספט מונו-בסיסי (NaH2PO4) ו-21.8 גרם נתרן פוספט דו-בסיסי (Na2HPO4).
      3. התאם את ה-pH ל-7.4 עם חומצה הידרוכלורית.
      4. ממלאים במים טהורים במיוחד עד 1 ליטר.
      5. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
    2. תמיסת 4% פרפורמלדהיד (PFA) (סה"כ 40 מ"ל)
      1. מערבבים 10 מ"ל של 16% PFA, 20 מ"ל של 0.2M מאגר פוספט שהוכן בשלב 7.1.1 ו-10 מ"ל מים טהורים במיוחד.
      2. יש לשים 10 מ"ל לתוך צינור פוליפרופילן של 15 מ"ל.
        הערה: הכינו תמיסת PFA של 4% ממש לפני השימוש לקיבוע זלוף.
    3. תמיסת סוכרוז 30% (סה"כ 40 מ"ל).
      1. מערבבים 30 מ"ל PBS עם 12 גרם סוכרוז.
      2. לאחר המסה מלאה, מלאו ב- PBS עד 40 מ"ל.
  2. קיבוע זלוף וקצירת רקמות.
    זהירות: יש לבצע קיבוע זלוף במכסה אדים מכיוון שתמיסת PFA 4% היא כימיקל מזיק חזק בשאיפה.
    1. להרדים את העכבר עם איזופלורן, להניח אותו במצב שכיבה ולאשר את היעדר ההיענות המוחלט על ידי צביטה עדינה של הגפיים.
    2. לאחר הרדמת העכבר, בצע חתך באמצעות מספריים כירורגיים מהבטן הזנבית לקסיפואיד. לאחר מכן, בצע שני חתכים רוחביים משני צידי עצם החזה והחזר את דופן החזה מלפנים כדי לחשוף את הלב וכלי הדם העיקריים.
    3. פתח את האטריום הימני באמצעות דיסקציה חדה כדי לשחרר את מערכת הדם. הכנס מחט פרפר 25 גרם לחדר השמאלי והחדיר 50 מ"ל PBS בקצב של כ-10 מ"ל לדקה, ומכוון את הזרימה לעבר אבי העורקים העולה.
      הערה: הוצאה חשובה להשגת תמונות אימונופלואורסצנטיות באיכות גבוהה (IF) מכיוון שהדם מציג אוטופלואורסצנטיות. כדי להבטיח הסרה מלאה של הדם, נעשה שימוש ב-50 מ"ל של PBS במחקר זה, אם כי נעשה שימוש נפוץ ב-20-30 מ"ל.
    4. יש להחדיר 20 מ"ל של תמיסת PFA 4% שהוכנה בשלב 7.1.2 באותו קצב, כדי להבטיח שלא יוכנס אוויר במהלך החלפת התמיסות.
    5. קצרו רקמות ושמרו אותן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה בצינור פוליפרופילן של 15 מ"ל מלא בתמיסת PFA של 4% לאחר הקיבוע. כאשר חלבון פלואורסצנטי מתבטא ברקמה שנאספה, יש לכסות את הצינור בנייר אלומיניום כדי להגן עליו מפני אור.
  3. הקפאה
    1. העבירו את הרקמה לצינור פוליפרופילן בנפח 15 מ"ל מלא בתמיסת סוכרוז 30% שהוכנה בשלב 7.1.3 להגנה מפני קריו.
    2. יש לשמור בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד שהרקמות שוקעות לחלוטין לתחתית הצינורות.
    3. העבירו את הרקמה לקריומולד פלסטיק עם מלקחיים בדוגמה סטנדרטית.
    4. הנח את תרכובת ה-OCT על הרקמה תוך הקפדה על כיוון נכון של הרקמה ושטוף עם תחתית הקריומולט.
    5. מלאו את החלק העליון בתרכובת OCT. הסר את כל הבועות בעזרת קצה פיפטה.
    6. הנח את קריומולד הפלסטיק באמבט קריוגני המכיל 2-מתילבוטן, מקורר עם קרח יבש כתוש בדלי קרח, עד שתרכובת ה-OCT קפואה לחלוטין (תרכובת ה-OCT תהפוך ללבנה).
    7. אחסן את גושי הטישו בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
  4. הקפאה
    1. העבירו את גושי הרקמה הקפואים למיקרוטום קריוסטט בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס לפני החיתוך ואפשרו לטמפרטורה של גושי הרקמה הקפואים להתאזן
    2. חתכו כל גוש רקמה קפוא לעובי הרצוי (בדרך כלל 5 מיקרומטר) באמצעות מיקרוטום קריוסטט. הנח את חלקי הרקמה על שקופית זכוכית מיקרוסקופ לצביעה אימונופלואורסצנטית.
    3. ניתן לאחסן חלקים בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס לשימוש מאוחר יותר.

8. צביעה אימונופלואורסצנטית

  1. יבש מגלשות קפואות בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
  2. יש לבודד את החלק בעזרת עט חוסם נוזלים ולייבש בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
  3. לחות חלקים עם 150 מיקרוליטר PBS למשך 10 דקות.
  4. הניחו את השקופיות על משטח ישר והוסיפו על השקופיות 150 מיקרוליטר של אלבומין סרום בקר 1% (BSA) מדולל ב-PBS לכל חתך. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 45 דקות לחסימה.
  5. יש להוסיף 150 מיקרוליטר של תמיסת נוגדנים ראשונית (נוגדן נגד גידול וילמס 1 (WT1), מדולל ל-1:100 עם 1% BSA; נוגדן אנטי-Na-K-2Cl קוטרנספורטר 2 (NKCC2), מדולל ל-1:100 עם 1% BSA; או נוגדן אנטי-אקוופורין 2 (AQP2), מדולל ל-1:100 עם 1% BSA) ולדגור ב-4 מעלות צלזיוס למשך הלילה מתחת לתא.
  6. שוטפים את החלקים עם PBS בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות, 3 פעמים.
  7. הוסף 150 מיקרוליטר של נוגדן משני (נוגדן נגד ארנב IgG Alexa Fluor 647, מדולל ל-1:500 עם 1% BSA) ולקטין לוטוס טטרגונולבוס (LTL)-פלואורסצאין (מדולל ל-1:200 עם 1% BSA), ודגירה בטמפרטורת החדר למשך 60 דקות.
  8. שוטפים את החלקים עם PBS בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
  9. הניחו את השקופיות על משטח ישר והוסיפו 150 מיקרוליטר של Hoechst 33342 (מדולל ל-1:10,000 עם PBS) לצביעה גרעינית. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות, מוגנת מפני אור.
  10. שוטפים את החלקים עם PBS בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
  11. הרכיבו את השקופיות עם 20 מיקרוליטר של מדיום ההרכבה וזכוכית כיסוי. שמור את השקופיות בחושך בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד לביצוע הדמיה.

9. מיצוי DNA מרקמה

  1. מיצוי DNA מרקמות באמצעות ערכה זמינה מסחרית (ראה טבלת חומרים).
    1. העבירו את הרקמה לתוך צינור חרוז קרמי והוסיפו 400 מיקרוליטר של מאגר מיצוי DNA (100 מ"מ NaCl, 20 מ"מ EDTA, 1% SDS ו-50 מ"מ Tris-HCl, pH 8.0).
    2. הומוגניזציה של הרקמה במהירות של 5 מ'/שניה למשך 20 שניות ב-3 מחזורים באמצעות הומוגנייזר.
    3. צנטריפוגה ב -2,000 x גרם בטמפרטורת החדר למשך 2 דקות.
    4. אספו 200 מיקרוליטר של הסופרנטנט באמצעות פיפטה P200 והוסיפו 10 מיקרוליטר של תמיסת פרוטאינאז K (ריכוז סופי של 1 מ"ג/מ"ל).
    5. מערבבים על ידי מערבולת במשך 15 שניות ודוגרים בחום של 55 מעלות צלזיוס למשך שעה.
    6. הוסף 200 מיקרוליטר של מאגר ליזה מערכת מיצוי ה-DNA.
    7. מערבבים על ידי מערבולת במשך 15 שניות ודוגרים בחום של 55 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
    8. הוסף 250 מיקרוליטר של 100% אתנול.
    9. מערבבים על ידי מערבולת במשך 15 שניות ודוגרים בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
    10. מרחו את הליזאט על עמודת הספין של מיצוי ה-DNA.
    11. צנטריפוגה בטמפרטורה של 6,000 x גרם בטמפרטורת החדר למשך דקה אחת.
    12. הנח את עמוד הסיבוב בצינור איסוף חדש של 2 מ"ל. הוסף 500 מיקרוליטר של מאגר הכביסה הראשון מערכת מיצוי ה-DNA.
    13. צנטריפוגה בטמפרטורה של 6,000 x גרם בטמפרטורת החדר למשך דקה אחת.
    14. הנח את עמוד הסיבוב בצינור איסוף חדש. הוסף 500 מיקרוליטר של מאגר הכביסה השני מערכת מיצוי ה-DNA.
    15. צנטריפוגה בטמפרטורה של 6,000 x גרם בטמפרטורת החדר למשך דקה אחת.
    16. הנח את עמוד הסיבוב בצינור איסוף חדש של 2 מ"ל. הוסף 500 מיקרוליטר של 100% אתנול.
    17. צנטריפוגה בטמפרטורה של 6,000 x גרם בטמפרטורת החדר למשך דקה אחת.
    18. הנח את עמוד הסיבוב בצינור איסוף חדש של 2 מ"ל וצנטריפוגה בטמפרטורה של 20,000 x גרם בטמפרטורת החדר למשך 3 דקות.
      הערה: שלב זה מבטיח ייבוש מלא של קרום עמוד הסיבוב, שכן העברת אתנול לתוך האלואט עלולה להפריע ליישומים במורד הזרם.
    19. הנח את עמוד הסיבוב בצינור מיקרוצנטריפוגה חדש בנפח 1.5 מ"ל. הוסף 35 מיקרוליטר של מאגר פליטה מערכת מיצוי ה-DNA לעמודת הספין.
      הערה: נפח הפליטה המוחזרת הוא בדרך כלל כ-5 מיקרוליטר פחות מנפח מאגר הפליטה שהוחל בתחילה על העמודה.
    20. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
    21. צנטריפוגה בטמפרטורה של 20,000 x גרם בטמפרטורת החדר למשך דקה.
    22. מדוד את ריכוז ה-DNA.
  2. כימות מספר עותק גנום וקטורי על ידי PCR כמותי (qPCR)
    1. יש לדלל את ה-DNA המופק שהוכן בשלב 9.1 לריכוז של 25 ננוגרם/מיקרוליטר במים ברמה מולקולרית.
    2. תכנן זוג פריימר qPCR לכימות הגנום הווקטורי (tdTomato שימש במחקר זה) וזוג פריימר qPCR עבור גן הייחוס של העכבר שישמש לכימות הגנום הדיפלואידי בדגימות ה-DNA שחולצו (הגן אגוטי של העכבר שימש במחקר זה).
      הערה: רצפי הפריימר ששימשו במחקר זה הם כדלקמן;
      tdTomato פורוורד: 5'-TATGAACGGAGCGAGGGGAG-3'
      tdTomato הפוך: 5'-TTCCACTAGACCCTGAGCCG-3'
      העבר את העכבר קדימה: 5'-GGCGTGGTCAGTGGTTGTG-3'
      עכבר הפוך: 5'-TTTAGCTTCCACTAGGTTTCCTAGAAA-3'
    3. לתגובת qPCR של 25 מיקרוליטר, מערבבים 4 מיקרוליטר של דגימת DNA מדוללת בשלב 9.2.1 (סה"כ 100 ננוגרם DNA בתערובת תגובה של 25 מיקרוליטר), 12.5 מיקרוליטר של מאגר תגובה 2x qPCR, 0.5 מיקרוליטר של 20 מיקרומטר ראשוניים קדימה ואחורה שהוכנו בשלב 9.2.2 (ריכוז סופי של 400 ננומטר מכל פריימר), ו-7.5 מיקרוליטר של מים בדרגה מולקולרית.
    4. מדוד את ריכוז ה-DNA של תקני הפלסמיד עבור qPCR ארבע פעמים וקבע את הערך הממוצע של ריכוז ה-DNA.
      הערה: פלסמיד pAAV-CAG-tdTomato מעגלי סופר-סליל ופלסמיד מעגלי סופר-סליל המכיל את רצף המטרה PCR שמקורו בגן אגוטי העכבר שימשו לכימות ונורמליזציה של גנום וקטור, בהתאמה, במחקר זה.
    5. הכן סדרה של דילולים סדרתיים של 1:10 של תקני DNA פלסמיד המכסים טווח דינמי של 106.
      הערה: יש לנתח כל מדגם ותקן לפחות בכפולות.
    6. בצע qPCR באמצעות תנאי הרכיבה התרמית הבאים: שלב הפעלת חום ראשוני ב-95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, ואחריו 35 מחזורי דנטורציה ב-95 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות, וחישול/הארכה ב-60 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות.
    7. לאחר השלמת תגובת ה-qPCR והשגת ערכי מספר העותקים הדו-גדיליים (ds) של גנום וקטור וגן הייחוס של העכבר בדגימות, קבע את מספרי העותקים של גנום וקטור ds לכל מקבילה גנומית דיפלואידית (ds-vg/dge) על ידי נורמליזציה של מספרי העותק של גנום וקטור ds למספר עותק גן הייחוס בכל דגימה בהתבסס על עקומות סטנדרטיות שנוצרו מריכוזים ידועים הן של הגנום הווקטורי והן של גן הייחוס.
      הערה: ניתן לקבוע Ds-vg/dge על סמך הקירוב הבא ש-100 ננוגרם של DNA גנומי של עכבר מייצג 16,900 תאי עכבר דיפלואידים (2N) (כלומר, 5.92 pg של DNA לכל תא עכבר דיפלואידי).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

מחקר שנערך לאחרונה זיהה תת-קבוצה קטנה של קפסידים AAV המציגה שיפור יוצא דופן של התמרה כלייתית בהשוואה ל-AAV9 לאחר הזרקת RP38. תת-הקבוצה שזוהתה כוללת AAV-KP3, קפסיד AAV כימרי שנוצר על ידי ערבוב DNA41. לכן, AAV-KP3 נבחר להזרקת RP במחקר זה, יחד עם AAV9 כאמת מידה. וקטור AAV9-CAG-tdTomato (AAV9) ווקטור AAV-KP3-CAG-tdTomato (KP3) הופקו בתאי HEK293 בשיטת טרנספקציה של פלסמיד נטול אדנו-וירוס וטוהרו על ידי אולטרה-צנטריפוגה בשיפוע צפיפות CsCl (CsCl AAV...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

דוח זה פירט הזרקת RP איטית לאחור של וקטורי AAV כשיטת ניהול מקומית להעברת גנים לכליות העכבר. שלב קריטי אחד לביצוע בטוח של הזרקת RP הוא התאמת קצב ההזרקה של וקטורי AAV כדי למנוע נזק פרנכימלי לכליות המוזרקות. בדוח קודם על הזרקת אגן כליה הידרודינמי, 100 מיקרוליטר של תמיסת DNA פלסמיד הוזרקה לכליה של העכבר תוך 3 שניות24 בלבד. הזרקה מהירה זו חיונית להגברת חדירות קרום התא החולף להעברת DNA יעילה אך עלולה לגרום לפגיעה ברקמות24. כדי להפחית סיכון זה, הו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

H.N. מקבל תמלוגים על טכנולוגיות הקשורות ל-AAV ברישיון Takara Bio Inc. ו-Capsigen Inc., משמש כיועץ לחברות ביוטכנולוגיה, הוא מייסד שותף של Capsigen Inc., ומחזיק במניות של Capsigen Inc. ו-Sphere Gene Therapeutics.

תודות

אנו מודים לגואנגפינג גאו וג'יימס מ. וילסון על שסיפקו לנו את הפלסמיד המסייע של AAV9 ולקטיה פקרון ומארק א. קיי עבור הפלסמיד המסייע של AAV-KP3.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.45 μm PVDF syringe filterMilliporeSigmaSLHVR33RS
1.5 mL microcentrifuge tube Fisher Scientific05-408-129
15 mL polypropylene tubeCorning352097
16% paraformaldehyde (PFA)Electron Microscopy Sciences15710
250 mL centrifuge bottleFisher Scientific055641S24
2F Silicone tubingSai Infusion TechnologiesSIL-2-50 
25G butterfly needleMedex Supply26708
2-methylbutaneMilliporeSigmaMX0760
2x qPCR reaction bufferFisher Scientific43-676-59Power SYBR Green PCR Master Mix
30G needleBecton-Dickinson & Co305106
50 mL polypropylene tubeCorning430291
5-0 monofilament sutureEthiconY463G
5 M NaClLonza51202
6-0 absorbable sutureEthiconJ489G
7.5% Mini-PROTEAN TGX Precast
Protein Gels, 10-well, 30 µL		Bio-Rad4561023
Amersham ImageQuant 800 Western
Blot Imaging System (Cytiva)		Cytiva29459405
Amicon 100 kDa MWCO, 15 mL tubeMillipore SigmaUFC910024
Anti-aquaporin 2 (AQP2) antibodyAbcamab199975A marker for collecting duct cells
Anti-Na-K-2Cl cotransporter 2
(NKCC2) antibody		StressMarq BiosciencesSPC-401A marker for thick ascending limb
cells
Anti-rabbit IgG Alexa Fluor 647
antibody		Jackson ImmunoResearch111-605-144
Anti-Wilms Tumor 1 (WT1) antibodyAbcamab89901A marker for podocytes
Beckman Coulter OptiSeal Tube,
Polypropylene, 29.9 mL		Fisher ScientificNC9691210
Beckman Coulter OPTISEAL TUBESFisher ScientificNC9611575
BenzonaseSigma-Aldrich1016970001
Bovine serum albumin (BSA)Sigma-Aldrich5470
Centrifugal ultrafiltration tubeMilliporeSigmaUFC9100Amicon 100 kDa MWCO, 15 mL
Ceramic bead tubeFisher Scientific15-340-154
Cesium chlorideSigma-AldrichC3032-1KG
Clamp applying forcepsFine Science Tools00071-14
Closed-loop heat padStryker Medical8002-062-012
Cotton-tipped applicatorPuritan806-WC
Cover glassFisher Scientific12-541B
Cryostat microtomeTanner ScientificTN50
Curved forcepsFine Science Tools11052-10
Curved-type micro vessel clipKleinert-Kutz65145Clamp for the renal artery and renal
vein
Dialysis cassetteFisher ScientificPIA52976
DNA extraction kitQiagen57704QIAamp MinElute Virus Spin Kit
D-SorbitolSigma-AldrichS6021-1KG
Dulbecco's Modified Eagle Medium-
high glucose		Corning15-013-CVDMEM-high glucose (4.5 g/L)
EDTAFisher Scientific15-575-020
EthanolDecon Laboratories2716GEA
Fetal bovine serum (FBS)VWR89510-186
Gas-tight glass syringeHamilton1710 TLL
Glutaraldehyde solutionSigma-AldrichG6257
Heat therapy pumpKent ScientificHTP-1500
HEPESSigma AldrichH4034-100G
Hoechst 33342InvitrogenH3570
HomogenizerFisher Scientific15-340-163
Human embryonic kidney (HEK) 293
cells		Agilent240073
Ice bucketFisher Scientific07-210-104
Infusion syringe pumpHarvard Apparatus70-4507
IsofluranePiramal Critical CareNDC 66794-017-10
L-glutamineFisher Scientific25030-081
Liquid blocker penTed Pella22309
Lotus tetragonolobus lectin (LTL)-
Fluorescein		Vector LaboratoriesFL-1321-2A marker for proximal tubules
Magnesium chloride (MgCl2)MilliporeSigmaM1028
MeloxicamVetOneNDC 86136-012-10Analgesic
Microscope glass slideFisher Scientific12-550-15
Mounting mediumSouthernBiotech0100-01
Needle holderFine Science Tools12501-13
OCT compoundSakura Finetek4583
Ophthalmic ointmentBausch & LombNDC 24208-313-34
PE-10 polyethylene tubeBD427401Inner diameter: 0.28 mm
Penicillin & Streptomycin MixFisher Scientific15140-122
Phosphate-buffered saline (PBS)Fisher Scientific10010-049
Plastic cryomoldSakura Finetek4566
Poloxamer 188 Non-ionic Surfactant
(10%)		Fisher Scientific24-040-032
Polyethylene Glycol 8

מקורות

  1. Groopman, E. E., et al. Diagnostic utility of exome sequencing for kidney disease. N Engl J Med. 380 (2), 142-151 (2019).
  2. Hussien, H., Apetrii, M., Covic, A. Health-related quality of life in patients with chronic kidney disease. Expert Rev Pharmacoecon Outcomes Res. 21 (1), 43-54 (2021).
  3. Peek, J. L., Wilson, M. H. Cell and gene therapy for kidney disease. Nat Rev Nephrol. 19 (7), 451-462 (2023).
  4. Khare, V., Cherqui, S. Targeted gene therapy for rare genetic kidney diseases. Kidney Int. 106 (6), 1051-1061 (2024).
  5. Medaer, L., Veys, K., Gijsbers, R. Current status and prospects of viral vector-based gene therapy to treat kidney diseases. Hum Gene Ther. 35 (5-6), 139-150 (2024).
  6. Tavakolidakhrabadi, N., Ding, W. Y., Saleem, M. A., Welsh, G. I., May, C. Gene therapy and kidney diseases. Mol Ther Methods Clin Dev. 32 (4), 101333(2024).
  7. Miyazaki, M., Yamashita, T., Miyazaki, T., Taira, H., Suzuki, A. Gene delivery to renal tubular epithelial cells using adeno-associated virus vector in domestic cats. Res Vet Sci. 87 (3), 408-412 (2009).
  8. Qi, Y. F., et al. Comparison of the transduction efficiency of tyrosine-mutant adeno-associated virus serotype vectors in kidney. Clin Exp Pharmacol Physiol. 40 (1), 53-55 (2013).
  9. Takeda, S., et al. Successful gene transfer using adeno-associated virus vectors into the kidney: Comparison among adeno-associated virus serotype 1-5 vectors in vitro and in vivo. Nephron Exp Nephrol. 96 (4), e119-e126 (2004).
  10. Zhong, F., et al. Protein S Protects against Podocyte Injury in Diabetic Nephropathy. J Am Soc Nephrol. 29 (5), 1397-1410 (2018).
  11. Chen, S., et al. Gene delivery in renal tubular epithelial cells using recombinant adeno-associated viral vectors. J Am Soc Nephrol. 14 (4), 947-958 (2003).
  12. Rocca, C. J., Ur, S. N., Harrison, F., Cherqui, S. rAAV9 combined with renal vein injection is optimal for kidney-targeted gene delivery: Conclusion of a comparative study. Gene Ther. 21 (6), 618-628 (2014).
  13. Wang, P., et al. Long noncoding RNA lnc-TSI inhibits renal fibrogenesis by negatively regulating the TGF-β/Smad3 pathway. Sci Transl Med. 10 (462), eaat2039(2018).
  14. Haddad, G., et al. Renal AAV2-mediated overexpression of long non-coding RNA H19 attenuates ischemic acute kidney injury through sponging of microRNA-30a-5p. J Am Soc Nephrol. 32 (2), 323-341 (2021).
  15. Asico, L. D., et al. Nephron segment-specific gene expression using AAV vectors. Biochem Biophys Res Commun. 497 (1), 19-24 (2018).
  16. Chung, D. C., et al. Adeno-associated virus-mediated gene transfer to renal tubule cells via a retrograde ureteral approach. Nephron Extra. 1 (1), 217-223 (2011).
  17. Ito, K., et al. Adeno-associated viral vector transduction of green fluorescent protein in kidney: Effect of unilateral ureteric obstruction. BJU Int. 101 (3), 376-381 (2008).
  18. Konkalmatt, P. R., et al. Renal rescue of dopamine D2 receptor function reverses renal injury and high blood pressure. JCI Insight. 1 (8), e85888(2016).
  19. Rubin, J. D., Nguyen, T. V., Allen, K. L., Ayasoufi, K., Barry, M. A. Comparison of gene delivery to the kidney by adenovirus, adeno-associated virus, and lentiviral vectors after intravenous and direct kidney injections. Hum Gene Ther. 30 (12), 1559-1571 (2019).
  20. Saito, S., et al. rAAV6-mediated miR-29b delivery suppresses renal fibrosis. Clin Exp Nephrol. 23 (12), 1345-1356 (2019).
  21. Shen, X., et al. Transparenchymal renal pelvis injection of recombinant adeno-associated virus serotype 9 vectors is a practical approach for gene delivery in the kidney. Hum Gene Ther Methods. 29 (6), 251-258 (2018).
  22. Wang, J. N., et al. Inhibition of METTL3 attenuates renal injury and inflammation by alleviating TAB3 m6A modifications via IGF2BP2-dependent mechanisms. Sci Transl Med. 14 (640), eabk2709(2022).
  23. Woodard, L. E., et al. Kidney-specific transposon-mediated gene transfer in vivo. Sci Rep. 7, 44904(2017).
  24. Woodard, L. E., et al. Hydrodynamic renal pelvis injection for non-viral expression of proteins in the kidney. J Vis Exp. (131), e56324(2018).
  25. Yadav, M. K., Yoo, K. W., Atala, A., Lu, B. Lentiviral vector mediated gene therapy for type Dent disease ameliorates Dent disease-like phenotypes for three months in CIC-5 null mice. Mol Ther Methods Clin Dev. 27, 149-166 (2022).
  26. Hillestad, M. L., Guenzel, A. J., Nath, K. A., Barry, M. A. A vector-host system to fingerprint virus tropism. Hum Gene Ther. 23 (10), 1116-1126 (2012).
  27. Zincarelli, C., Soltys, S., Rengo, G., Rabinowitz, J. E. Analysis of AAV serotypes 1-9 mediated gene expression and tropism in mice after systemic injection. Mol Ther. 16 (6), 1073-1080 (2008).
  28. Ikeda, Y., Sun, Z., Ru, X., Vandenberghe, L. H., Humphreys, B. D. Efficient gene transfer to kidney mesenchymal cells using a synthetic adeno-associated viral vector. J Am Soc Nephrol. 29 (9), 2287-2297 (2018).
  29. Williams, R. M., et al. Mesoscale nanoparticles selectively target the renal proximal tubule epithelium. Nano Lett. 15 (4), 2358-2364 (2015).
  30. Lang, J. F., Toulmin, S. A., Brida, K. L., Eisenlohr, L. C., Davidson, B. L. Standard screening methods underreport AAV-mediated transduction and gene editing. Nat Commun. 10 (1), 3415(2019).
  31. Koike, H., et al. An efficient gene transfer method mediated by ultrasound and microbubbles into the kidney. J Gene Med. 7 (1), 108-116 (2005).
  32. Ishida, R., et al. Kidney-specific sonoporation-mediated gene transfer. Mol Ther. 24 (1), 125-134 (2016).
  33. Davis, L., Park, F. Gene therapy research for kidney diseases. Physiol Genomics. 51 (9), 449-461 (2019).
  34. Rubin, J. D., Barry, M. A. Improving molecular therapy in the kidney. Mol Diagn Ther. 24 (4), 375-396 (2020).
  35. Huang, S., et al. Application of ultrasound-targeted microbubble destruction-mediated exogenous gene transfer in treating various renal diseases. Hum Gene Ther. 30 (2), 127-138 (2019).
  36. Wang, D., Tai, P. W. L., Gao, G. Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery. Nat Rev Drug Discov. 18 (5), 358-378 (2019).
  37. Wang, J. H., Gessler, D. J., Zhan, W., Gallagher, T. L., Gao, G. Adeno-associated virus as a delivery vector for gene therapy of human diseases. Signal Transduct Target Ther. 9 (1), 78(2024).
  38. Furusho, T., et al. Enhancing gene transfer to renal tubules and podocytes by context-dependent selection of AAV capsids. Nat Commun. 15 (1), 10728(2024).
  39. Ding, W. Y., et al. Adeno-associated virus gene therapy prevents progression of kidney disease in genetic models of nephrotic syndrome. Sci Transl Med. 15 (708), eabc8226(2023).
  40. Wu, G., et al. Adeno-associated virus-based gene therapy treats inflammatory kidney disease in mice. J Clin Invest. 134 (17), e174722(2024).
  41. Pekrun, K., et al. Using a barcoded AAV capsid library to select for clinically relevant gene therapy vectors. JCI Insight. 4 (22), e131610(2019).
  42. Grimm, D., et al. In vitro and in vivo gene therapy vector evolution via multispecies interbreeding and retargeting of adeno-associated viruses. J Virol. 82 (12), 5887-5911 (2008).
  43. Shen, S., et al. Engraftment of a galactose receptor footprint onto adeno-associated viral capsids improves transduction efficiency. J Biol Chem. 288 (40), 28814-28823 (2013).
  44. Dalkara, D., et al. In vivo-directed evolution of a new adeno-associated virus for therapeutic outer retinal gene delivery from the vitreous. Sci Transl Med. 5 (189), 189ra176(2013).
  45. Gomes, M. M., Wang, L., Jiang, H., Kahl, C. A., Brigande, J. V. A rapid, cost-effective method to prepare recombinant adeno-associated virus for efficient gene transfer to the developing mouse inner ear. Methods Mol Biol. 1427, 43-57 (2016).
  46. Powers, J. M., Chang, X. L., Song, Z., Nakai, H. A Quantitative dot blot assay for AAV titration and its use for functional assessment of the adeno-associated virus assembly-activating proteins. J Vis Exp. (136), e56766(2018).
  47. Adachi, K., Enoki, T., Kawano, Y., Veraz, M., Nakai, H. Drawing a high-resolution functional map of adeno-associated virus capsid by massively parallel sequencing. Nat Commun. 5, 3075(2014).
  48. Lu, Z. Y., et al. Constitutive and conditional gene knock-out mice for the study of intervertebral disc degeneration: Current status, decision considerations, and future possibilities. JOR Spine. 6 (1), e1242(2023).
  49. Kaspar, B. K., et al. Adeno-associated virus effectively mediates conditional gene modification in the brain. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (4), 2320-2325 (2002).
  50. Werfel, S., et al. Rapid and highly efficient inducible cardiac gene knock-out in adult mice using AAV-mediated expression of Cre recombinase. Cardiovasc Res. 104 (1), 15-23 (2014).
  51. Jinek, M., et al. A Programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  52. Wang, X., Huang, X., Fang, X., Zhang, Y., Wang, W. CRISPR-Cas9 system as a versatile tool for genome engineering in human cells. Mol Ther Nucleic Acids. 5 (11), e388(2016).
  53. Ueki, K., et al. Establishment of pancreatic -cell-specific gene knock-out system based on CRISPR-Cas9 technology with AAV8-mediated gRNA delivery. Diabetes. 72 (11), 1609-1620 (2023).
  54. Marichal-Gallardo, P., et al. Single-use capture purification of adeno-associated viral gene transfer vectors by membrane-based steric exclusion chromatography. Hum Gene Ther. 32 (17-18), 959-974 (2021).
  55. Guo, P., et al. Rapid and simplified purification of recombinant adeno-associated virus. J Virol Methods. 183 (2), 139-146 (2012).
  56. Chen, S. H., et al. A simple, two-step, small-scale purification of recombinant adeno-associated viruses. J Virol Methods. 281, 113863(2020).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

וקטורי AAVהזרקה רטרוגרדית לכליהתרפיה גנית לכליהטרנסדוקציה של התrubule הפרוקסימליAAV ב-CsClAAV ב-CUמודלים למחלות כליהטרנסדוקציה in vivo
העברת גנים יעילה ובטוחה לכליות העכבר באמצעות הזרקת אגן כליה רטרוגרדית איטית של וקטורים של וירוסים הקשורים לאדנו.
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.