מאמר שיטה

מתודולוגיה משופרת לחקר אוסטאוגנזה לאחר לידה באמצעות אוסיפיקציה אינטרמברנית במודל פגיעה במח עצם של עכברים

DOI:

10.3791/67727

⸱

7 בפברואר 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Orthopedic Surgery, UConn School of Medicine, 2Department of Neuroscience, UConn School of Medicine

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מודל הפגיעה במח העצם של העכברים הוא כלי שימושי לחקר אוסטאוגנזה לאחר לידה באמצעות התעצמות פנימית. פרוטוקול כירורגי פשוט זה מתאר את הליך אבלציה של מח העצם להערכה במורד הזרם של היווצרות עצם חדשה ותגובות תאיות לאחר פציעה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פציעות עצם ארוכות נרפאות באמצעות מסלולי היווצרות עצם אנדוכונדרליים או פנימיים. בניגוד למסלול האנדוכונדרלי הדורש תבנית סחוס, תהליך ההתעצמות הפנימית כרוך בהמרה ישירה של תאי גזע ואב שלד (SSPCs) לאוסטאובלסטים יוצרי עצם. ישנן שיטות כירורגיות מוגבלות למידול תהליך זה בעכברי ניסוי. כאן, שיפרנו את מודל הפגיעה במח העצם בעכברים כדי להקל על מחקר תיקון העצם באמצעות אוסיפיקציה אינטרמברנית ולהעריך את הרגולטורים לאחר הלידה של אוסטאוגנזה. שיטה זו ניתנת לשחזור וידידותית מאוד למשתמש, והיא מאפשרת הערכה זמנית של היווצרות עצם חדשה בתקופה קצרה (3-7 ימים לאחר הפציעה) באמצעות טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת (μCT) והיסטולוגיה של חתכים קפואים. יתר על כן, ניתן להעריך בקלות את התרומות של SSPCs ואוסטאובלסטים בוגרים באמצעות שילוב של עכברים מדווחים פלואורסצנטיים ומודל פגיעה במח עצם פנימי זה. בהקשרים קליניים, היווצרות עצם פנימית רלוונטית לריפוי פגמים בגודל קריטי, שברים מיוצבים, פגמים בקליפת המוח, טראומה מכריתת גידול והחלפת מפרקים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פציעות עצם ארוכות מחלימות דרך מסלול היווצרות העצם האנדוכונדרלית או הפנימית. בניגוד למסלול האנדוכונדרלי, הדורש שלב מבשר סחוס, תיקון עצם באמצעות התעצמות אינטרמברנית כרוך בהמרה ישירה של תאי גזע ואב שלד (SSPCS) לאוסטאובלסטים יוצרי עצם1. מבחינה קלינית, תהליך זה רלוונטי לריפוי עצם במגוון הקשרים, כולל פגמים בגודל קריטי, שברים מיוצבים, פגמים בקליפת המוח, אוסטאוגנזה של הסחת דעת, טראומה מכריתת גידול ואוסאואינטגרציה של שתלים להחלפת מפרקים 2,3. מעניין לציין שבמחקרים על חולים עם שברים ארוכים בעצמות, ל-66%-82% היו שברים עקורים, שדרשו מכשירי קיבוע לייצוב העצם 4,5. עצמות מיוצבות נוקשות אלה מחלימות בעיקר באמצעות התעצמות פנימית כאשר קצוות העצם השבורים באים במגע ישיר זה עם זה 6,7. עם זאת, הוויסות המכניסטי של התחדשות העצם הפנימית נותר יחסית לא נחקר בהשוואה להיווצרות עצם דרך המסלולים האנדוכונדרליים. טיפולים שאושרו על ידי מינהל המזון והתרופות (FDA) להגברת ריפוי העצם מעוכבים על ידי יעילות קלינית מוגבלת ועלויות גבוהות וקשורים לתופעות לוואי משמעותיות8.

אבלציה מכנית של מח עצם מספקת מודל רב ערך לחקר היווצרות עצם פנימית. מודל פציעה פשוט זה מאפשר לחקור את התחדשות העצם במח העצם מבלי לשבש את עצם קליפת המוח. לאחר אבלציה של BM, תהליך הריפוי כולל שלבים נפרדים אך חופפים. השלב הראשוני מתרחש ב-1 עד 5 הימים הראשונים וכולל היווצרות קרישים ודלקת, כאשר תאים דלקתיים וציטוקינים מתחילים ריפוי. מימים 3 עד 14, השלב השני מאופיין בהתחדשות, כולל ניאו-וסקולריזציה, נדידה והתפשטות של תאי גזע מזנכימליים (MSC), התמיינות אוסטאובלסטית ויצירת עצם ארוגה. שלב השיפוץ הסופי מתחיל כ-10 ימים לאחר הניתוח, כאשר רקמת העצם עוברת התבגרות ובנייה מחדש עד לשיקום מלא של מח העצם ביום 56-9. ציר הזמן המהיר הזה של ריפוי הופך את מודל האבלציה של BM לאידיאלי לחקר תגובות מוקדמות לתיקון עצם, במיוחד בתקופות הקריטיות של דלקת, גיוס תאי אב והתמיינות אוסטאובלסטים. באמצעות טכניקות כמו היסטולוגיה, ציטומטריית זרימה וניתוח μCT כמותי, ניתן להעריך תגובות תאיות והיווצרות עצם בשלבי תיקון מוקדמים. באמצעות הטכניקות שהוזכרו לעיל, מודל אבלציה של BM יכול לספק תובנה לגבי מנגנונים של התחדשות עצם פנימית ולסייע בזיהוי יעדים טיפוליים מרכזיים לשיפור ריפוי העצם.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ההליכים הבאים בוצעו באישור הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של מרכז הבריאות של אוניברסיטת קונטיקט (IACUC). כל הניתוחים בוצעו בתנאים סטריליים כפי שמתואר בהנחיות המכונים הלאומיים לבריאות (NIH). הכאב והסיכון לזיהומים נוהלו באמצעות משככי כאבים וחומרי חיטוי מתאימים כדי להבטיח תוצאה מוצלחת.

1. הכנת אזור ניתוח ומכשירים

  1. הכן את חדר ההליכים הכירורגיים על ידי חיטוי משטחי עבודה עם חומר ניקוי חיטוי ברמה קלינית.
    הערה: על המנתח ללבוש ציוד מגן אישי מתאים (PPE), כולל כפפות חד פעמיות סטריליות, מצנפת שיער, חלוק ומסכה.
  2. הכינו כרית חימום מכוסה בפד כירורגי סטרילי. אסוף וסדר את כל המכשירים והריאגנטים הסטריליים (טבלת חומרים) עם גישה נוחה.

2. הרדמה טרום ניתוחית

  1. שקלו את כל העכברים לפני הניתוח. חשב את נפחי משכך הכאבים לשימוש על סמך הפורמולה הזמינה של בופרנורפין.
  2. הרכיבו יחידת הרדמה לבעלי חיים בתוך חלל העבודה הסטרילי, הכולל תא אינדוקציה ומכלול חרוט אף. הגדר את תפוקת החמצן ל-2 ליטר דקה-1 ואת איזופלורן ל-1.5-3% (v/v) בהתאם לגיל העכבר ולמשקלו.
  3. לאחר הרגעת העכבר, הוציאו את החיה מתא האינדוקציה והניחו אותה על כרית כירורגית סטרילית במצב שכיבה. יש למרוח חומר סיכה לעיניים על שתי העיניים. הנח את חרוט האף מעל הראש. בדוק שהעכבר מורדם כראוי על ידי צביטה עדינה של הבוהן. ודא שאין תגובת רפלקס בגפיים האחוריות לפני שתמשיך.
  4. לפני הניתוח, הסר לזמן קצר את העכבר מחרוט האף כדי להזריק את המינון הכולל של בופרנורפין בשחרור מושהה דרך הנתיב התת עורי; המינון הכולל הוא 3.25 מ"ג/ק"ג.

3. תיאור הליך כירורגי

הערה: הליך כירורגי זה משתמש בעכברים זכרים ונקבות C57BL/6 בגילאי 10 שבועות עד 24 שבועות. ניתן לבצע את ההליך בעכברים מגיל 6 שבועות עד 33 שבועות ועל זנים מולדים שונים, כפי שהוכח על ידי אחרים10,11. עכברים צעירים עשויים לדרוש אורכי מחט קצרים יותר, בעוד שעכברים מבוגרים או גדולים יותר עשויים לדרוש מחט ארוכה יותר.

  1. מלאו מזרק של 3 מ"ל המצויד במחט 26 גרם במי מלח סטריליים. הניחו את זה בצד.
  2. הסר את הפרווה מהגפה האחורית שעליה יבוצע ההליך עם קוצץ חשמלי או סוללה (להב #40) והסר כל פרווה רופפת משדה הניתוח. בעזרת אפליקטורים סטריליים עם קצה כותנה, טפלו באתר הניתוח עם קרצוף על בסיס יוד (10% פובידון-יוד), ואחריו 70% אלכוהול איזופרופיל. שפשפו את אתר הניתוח החל ממרכז הברך ובצעו טאטוא מעגלי כלפי חוץ. הניחו לאתר להתייבש. חזור על שלבי הקרצוף 3 פעמים.
  3. הנח את העכבר על גבו וכופף את ברך הרגל הניתוחית. החזק את רגל העכבר ביד הלא דומיננטית כך שהברך כפופה מעל האצבע האמצעית, האצבע השנייה מונחת על עצם הירך והאגודל מונח על השוקה.
  4. בצע חתך אופקי קטן ורדוד ממש מתחת לפיקה בעזרת אזמל.
    הערה: שלב זה משפר את התצוגה החזותית של אתר ההכנסה. עם ניסיון, ניתן לדלג על שלב זה.
  5. אתר את חלל המפרק על ידי הנחת המחט אופקית על הברך הכפופה ומישוש הרווח בין עצם הירך לשוקה. השתמש באתר אנטומי זה כדי להדריך, קח מחט 25 גרם וקדח ידנית (על ידי סיבוב המחט ובו זמנית הפעלת לחץ מתון על המחט) לתוך עצם הירך הדיסטלית מהברך לכיוון הצד הפרוקסימלי. הכנס את המחט דרך הפיקה או סביבה.
  6. צילום רנטגן של העכבר כדי לוודא שהמחט הוצבה כראוי בחלל המדולרי, קרוב ככל האפשר למרכז (איור 1).
  7. הסר את מחט ה-25 גרם והכנס מיד מחט של 26 גרם לאותו חור בתוך חלל המח. דחפו את דפנות החלל המדולרי בתנועה סיבובית לפחות 5 פעמים עד שהוא מרגיש חלק. שמור על עקביות במספר תנועות הקידוח בין כל עכבר.
    הערה: שלבים 3.5 ו-3.7 עלולים לגרום לפגיעה במחט למנתח אם לא יטופל בזהירות.
  8. הסר את מחט ה-26 גרם והחלף את מחט ה-26 גרם המחוברת למזרק המלח. שטפו את החלל עד שהזרימה החוזרת תתבהר. זה בדרך כלל דורש 1.5-2 מ"ל מי מלח. הסר את המזרק והמחט והשליך אותם בבטחה למיכל חד.
    הערה: לא אמורה להיות התנגדות בעת דחיפת הנוזל. אם כן, הכנס מחדש את המחט כדי לוודא שהיא נמצאת בתוך החלל. יתכן שיהיה צורך לשלוף את המחט באמצע הדרך.
  9. סגור את פצע העור באמצעות תפר דבק מקומי.

4. טיפול לאחר הניתוח

  1. מיד לאחר הניתוח, יש לתת את מחצית המנה הנותרת של בופרנורפין בשחרור מושהה במינון משלב 2.4.
    הערה: בופרנורפין בשחרור מושהה מספק הקלה בכאבים למשך עד 72 שעות.
  2. עקוב אחר בעלי החיים על כרית החימום לאיתור סימנים לנשימה רגילה וללא הפרעה עד שהם מתעוררים מהניתוח. לאחר האמבולטוריה, החזירו עכברים לכלוב שלהם.
  3. המשך לעקוב אחר העכברים פעם ביום במשך 3 ימים לאחר הניתוח כדי לוודא שהם מחלימים כראוי ובעלי ניידות מלאה, תוך מעקב אחר סימני כאב.

5. עיבוד עצמות לסריקה וניתוח μCT

  1. המתת חסד של העכברים על פי שיטת המתת החסד ההומאנית המוסדרת ומאושרת על ידי IACUC או מדיניות מוסדית רלוונטית אחרת. כאן נעשה שימוש בשיטת המתת החסד העיקרית של שאיפת CO2 , ואחריה שיטה משנית של פריקת צוואר הרחם.
  2. קצור את עצם הירך על ידי קילוף העור סביב הגפיים האחוריות והסרת כל הגפה במפרק הירך.
  3. סנדוויץ' כל איבר בין שני ספוגים בקלטת הטמעה. מעבירים את העצמות בקלטות לתמיסת פורמלין של 10% ומקבעים אותן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 5-7 ימים, בהתחשב בגיל וגודל העכבר.
    הערה: גם קיבוע יתר וגם תת-קיבוע גורמים לרזולוציית מח ירודה.
  4. לאחר הקיבוע יש לשטוף את הקלטות במי מלח חוצץ פוספט (PBS) למשך 5 דקות 3 פעמים.
  5. הסר את הגפיים מהקסטות וקצץ את השרירים באמצעות אזמל לפי הצורך.
    הערה: בהתאם ליישומים במורד הזרם, טיפול גס עלול לשבש את שכבת העצם הפריאוסטאלית.
  6. הפרד את עצם הירך בברך על ידי חיתוך זהיר של הרצועות באמצעות מספריים כירורגיים קטנים או אזמל.
    הערה: ניתן להשתמש בטיביה ליישומים אחרים או להשליך.
  7. העבירו את עצם הירך לצינורות חרוטיים של 1.7 מ"ל או 15 מ"ל לתמיסת אתנול של 70%. עצמות יכולות להישאר ב-70% אתנול ב-4 מעלות צלזיוס עד שהן מוכנות לסריקת μCT.
  8. לסרוק ולהעריך את עצם הירך לאיתור פרמטרים טרבקולריים, ולהפיק נתונים איכותיים וכמותיים.

6. עיבוד עצמות לחיתוך קפוא והיסטולוגיה

הערה: ניתן לעבד עצמות לצורך חתך קפוא והיסטולוגיה לאחר ביצוע סריקת μCT. הסריקה אינה משפיעה על תיוג פלואורסצנטי או על צביעת נוגדנים לאחר מכן.

  1. העבירו את העצמות מ-70% אתנול ל-PBS ושטפו 3 פעמים, 5 דקות לכל שטיפה.
  2. דגירה בסדרה של תמיסות סוכרוז מ-10%, 20% עד 30% ב-PBS ב-4 מעלות צלזיוס למשך הלילה בכל ריכוז. אחסן את העצמות ב-30% סוכרוז עד 5 ימים ב-4 מעלות צלזיוס או בתמיסה זו ב-20 מעלות צלזיוס למשך 6-12 חודשים עד שהן מוכנות להטמעה.
    הערה: שימוש בשיפוע סוכרוז מביא לחדירה טובה יותר לרקמות. לאחר שלב 6.1, ניתן להכניס את העצמות ישירות לתמיסת סוכרוז 30% למשך הלילה.
  3. הטמיעו עצמות בתרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT) באמצעות תבניות הטבעה בהקפאה. יש לאחסן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד שמוכן לחתך.
  4. חתך עצמות משובצות בשיטת סרט קריופילם עם טמפרטורת קריוסטט שנקבעה בין -24 מעלות צלזיוס ל-26 מעלות צלזיוס.
  5. הדביקו את החלקים על הקריופילם לשקופית דביקה באמצעות דבק אופטי ורפא אותו עד להתקשות באמצעות צולב אולטרה סגול (UV).

7. עיבוד לזרימה ציטומטרית

הערה: פרוטוקול זה תואם למגוון נוגדנים. לאפיון תאי גזע שלד ואב, מומלץ לאגד 3-4 עצמות יחד מכיוון שמדובר באוכלוסיות תאים נדירות במח העצם.

  1. הכן חומרי צביעה (FSM) למיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות (FACS). להכנת תמיסה של 1000 מ"ל של FSM, שלבו: 100 מ"ל של תמיסת מלח מאוזנת (HBSS) של הנקס, 10 מ"ל של 4-(2-הידרוקסיאתיל)-1-פיפראזין-אתן-חומצה סולפונית (HEPES), 20 מ"ל של סרום בקר עוברי (FBS), 870 מ"ל של dd H2O. העבירו את פתרון FSM דרך מסנן של 0.2 מיקרומטר.
  2. לפני קצירת רקמות, מלאו צלחות פטרי ב 4-5 מ"ל PBS סטרילי ללא סידן ומגנזיום.
  3. הכן את אמצעי העיכול
    1. על כל 4-6 עצם הירך, הכינו תערובת עיכול ב -10 מ"ל PBS המכילה 0.005 גרם קולגנאז P ו -0.02 גרם היאלורונידאז. מערבבים במערבולת עדינה ומעבירים את התערובת דרך פילטר של 0.22 מיקרומטר.
  4. קצירת עצמות ביום השלישי לאחר הניתוח כמתואר בשלב 5.2. הסר את כל השרירים ורקמות החיבור בעזרת להב אזמל.
  5. ממלאים צלחת פטרי ב -5 מ"ל אמצעי עיכול. מניחים 4-6 עצמות באמצעי העיכול. קוצצים כל עצם דק, ומבצעים את החיתוך הראשון לאורך ולרוחב.
  6. מעבירים רקמה לצינור תחתון עגול של 14 מ"ל וחותמים עם פרפילם. מכסים צינורות בנייר אלומיניום.
  7. יש לנער בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות על ידי השארת הצינור אופקית על השייקר.
  8. הסר את הצינור מהשייקר. תאים יהיו גושים בתחתית. אוספים בעדינות את החומר המעוכל מבלי להפריע לתאים בתחתית, ומעבירים את העיכול דרך פילטר של 70 מיקרומטר. אוספים את המסנן בצינור חדש של 50 מ"ל המכיל 10 מ"ל FSM קר ושומרים אותו על קרח.
  9. לתאים מוסיפים את 5 מ"ל הנותרים מתערובת העיכול. אוטמים שוב עם פרפילם ומכסים בנייר אלומיניום. נענע את הצינור כמתואר לעיל. חזור על שלבים 7.7-7.8.
  10. לאחר הדגירה של 20 דקות ב-37 מעלות צלזיוס, העבירו את העיכול לאותו צינור המכיל את העיכול משלב 7.8, ועברו דרך מסנן של 70 מיקרומטר עם עוד 10 מ"ל FSM.
  11. צנטריפוגה את המתלים ב-274 x g ב-4 מעלות צלזיוס. שאפו את הסופרנטנט ואספו את כדור התא. עקור את הגלולה על ידי הקשה עדינה על הצינור.
    הערה: הכוח הצנטריפוגלי (g) מבוסס על רדיוס רוטור של 170 מ"מ. אנא בדוק את רדיוס הרוטור והתאם את המהירות בהתאם.
  12. כדי לבצע את ליזיס תאי הדם האדומים, הוסף 1 מ"ל של מאגר אמוניום-כלוריד-אשלגן (ACK). שמור את כל הריאגנטים והתאים על קרח.
  13. דגרו על התאים ב-ACK למשך כ-5 דקות ב-RT. אין לחרוג מ-5 דקות כדי למנוע ליזה מוגזמת של התאים.
  14. הוסף 9 מ"ל FSM. צנטריפוגה ב-274 x גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
  15. שאפו את הסופרנטנט. שברו את כדור התא על ידי גריפה עדינה של הצינור על מתלה צינורות.
  16. הוסף 10 מ"ל FSM (נפח ל -4 עצמות, ניתן לכוונן על סמך מספר העצמות המשולבות) והשהה מחדש.
  17. קח ציטוט של כל דגימה והוסף פרופידיום יודיד (PI) לפי הוראות היצרן. ספור תאים חיים וסה"כ עם מונה תאים.
  18. המשך עם צביעת נוגדנים של דגימות באמצעות סמנים רצויים לניתוח ציטומטריית זרימה 12,13,14.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ההצלחה של הליך אבלציה מכנית של מח עצם (BM) אומתה על ידי הדמיית רנטגן, בעוד שמחט 26G הוחדרה לחלל המדולרי (איור 2A). כאשר הדמיית רנטגן הצביעה על כך שהמחט הוחדרה בזווית לא נכונה או חדרה דרך העצם, המחט הוחדרה מחדש בזווית הנכונה וצולמה מחדש כדי לאשר מיקום מדויק. כאשר לא ניתן היה להשיג עמדה מוצלחת, החיה לא נכללה בניתוח. בעוד שהדמיה רדיוגרפית דו-ממדית (2D) יכולה לאשר שהמחט הוכנסה לחלל ה-BM, יש צורך בהדמיה תלת מימדית (3D) כדי לאשר את נתיב המחט המדויק. היקף הפציעה ומיקומה הוערכו עוד יותר עם קצירת הרק...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המטרה הייתה לבסס שיטה אמינה וניתנת לשחזור לחקר התהליכים המולקולריים והתאים השולטים בתיקון עצם, תוך התמקדות בהמרה ישירה של תאי גזע ואב שלד (SSPCs) לאוסטאובלסטים מפקדי עצם בחלל/חלל מח העצם. שיטת אבלציה מכנית של מח עצם המתוארת כאן היא פרוטוקול אופטימלי ותוקף לאבלציה של מח עצם על ידי פגיעה מכנית, המאפשר חקירה של היווצרות עצם פנימית. מספר שלבים בפרוטוקול זה הם קריטיים כדי להבטיח היווצרות עצם חזקה לאחר פציעה ושחזור הטכניקה. הראשון הוא החדרה מדויקת של המחט לחלל המדולרי של עצם הירך. חוסר יישור ב...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין גילוי נאות לדווח.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המימון ניתן על ידי NIH/NIDCR R01-DE030716-01 ו-NIH/NIAMS R01-DE030716-01S1 ל-AS, NIH/NIAMS R01AR080131 ל-RG, ומענק התכנסות UConn REP ל-RG ו-AS.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
10% תמיסת פורמלין סיגמא-אולדריץ'HT501128
25 גרם 0.625 באייר-טיט EZ Flo מחט היפודרמיתAit Tite / Fisher Scientific14-817-239; ref #NEZ25058
26 גרם 1/2 אינץ' מחטים היפודרמיות חד פעמיותExel International / Fisher Scientific14-840-83; ref #26402ניתן להחליף כל מחטי 26 גרם, חייבות להיות ניתנות להסרה מהמזרק 
מזרק סטרילי 3 מ"לפישרברנד/ פישר סיינטיפיק 14-955-457
AB פד סטריליMcKesson/ Fisher ScientificNC0593755לחלופין יכול להשתמש ברפידות סופגות הניתנות לחיטוי 
חומצה אצטית, GlacialMillipore SigmaAX0073צריך להיות מדולל ל-1%
אמוניום-כלוריד-אשלגן (ACK) חוצץ ליסינגGibco/ Thermo Fisher Scientific A1049201משמש לליזה של כדוריות דם אדומות כהכנה לזרימה ציטומטרית 
תא אינדוקציה להרדמה 2 ליטרVetEquip941444
תמיסת בטדין (פרובידון-יוד) פן אספקה וטרינרית בע"מ / פישר סיינטיפיקNC0158124
הזרקת בופרנורפין HCL 0.3 מ"ג/מ"ל כללי / Covetrus59122חייב לקבל רישיון DEA מדינתי ופדרלי לרכישת חומר מבוקר
Calcein-AMSigma Aldrich206700-1MG
קולגנאז P 11249002001 רושמשמש לעיכול
עצמות צמר גפן ואפליקטוריםפישרברנד / פישר סיינטיפיק 22-363-172
Cryofilm Type II C(10), מעבדת חתך 3.5 ס"מ, יפןCFS 105
DAPI תמיסת צביעה Abcamab228549
סולם גרם דיגיטליToprime / AmazonB06X6LW4V9יכול להשתמש בכל סולם מותג כדי לשקול עכברים
ניתוח מלקחיים פישרברנד/ פישר סיינטיפיק 08-953E; 08-953F
מספריים לניתוח פישרברנד/ פישר סיינטיפיק 08-940
לסבול להבי קריוסטט/מיקרוטום בפרופיל נמוךשיזוף TNR315LP
Ethiqa XR בופרנורפין שחרור מורחב 1.3 מ"ג/מ"לEthiqa XR/ Cevetrus72117חייב לקבל רישיון DEA מדינתי ופדרלי לרכישת חומר מבוקר
Fast Green, 0.2%Electron Miscroscopy Sciences EMS50-319-57
חום סרום בקר עוברי מושבת Gibco / Thermo Fisher Scientific A5256801משמש לייצור פתרון הרכבה של חומרי צביעה FACS (FSM)
Fluoromount-G סאות'רן ביוטק 0100-01
GLUSEAL דבק מקומי לעור AD כירורגי GLU-550
עז אנטי-ארנב Alexa 647Thermo FisherA212441:300 דילול
תמיסת מלח מאוזנת של הנקס (HBSS)Gibco/Thermo Fisher Scientific14065056משמש לייצור חומרי צביעה FACS (FSM)
כרית חימום (גדולה)Boncare/ AmazonB0CLHSWXSXיכול להשתמש בכל כרית חימום של מותג, להסיר את מכסה הבד 
המטוקסיליןמיליפורסיגמא / פישר סיינטיפיקM1051740500
HyaluronidaseMilliporeSigmaHX0514משמש לעיכול
עצם איזופלורן מערכת הרדמה לבעלי חייםVetEquip901810
KUBTEC פרמטר 2D ארון מערכת רנטגןOncoMed SolutionsN/Aניתן להשתמש בכל מערכת הדמיה של ארון רנטגן
מיקרוצנטריפוגה צינורותקורנינג/ תומאס סיינטיפיק 8600A52
זכוכית כיסוי מיקרוסקופ, 18 מ"מ x 18 מ"מ, # 1 עוביגלובוס מדעי1414-10
N-2-הידרוקסיאתיל פיפרזין-N-2-אתאן חומצה סולפונית HEPES (1M) Gibco / Thermo Fisher Scientific156300-80משמש לייצור חומרי צביעה FACS (FSM)
דבק אופטי נורלנד NO61Edmund Optical37-322משמש להדבקת קטעי קריופילם לשקופית 
Osterix Rabbit נוגדן חד שבטי Abcamab2094841:500 דילול
פרוקסיגרד מוכן לשימוש בחומר חיטוי צעד אחדVirox Technologies29101ניתן להחליף בכל חומר חיטוי אחר בדרגה קלינית/מעבדתית
Propidium Iodide (PI) Invitrogen / תרמו פישר סיינטיפיק P1304MPכתם פלואורסצנטי גרעיני המשמש לאיתור תאים מתים לספירת חיוניות
גוזם חשמלי נטעןWahl / AmazonB001FWXKUEניתן להשתמש בכל קוצץ, גוזם בגודל קטן יותר יקל על גילוח בעלי חיים קטנים יותר
חרוט אף מכרסםVetEquip921609
Safranin O, 85% טהור, מוסמךFisher ScientificAC419211000
Seal'N להקפיא תבניות מרובעות Cryotray אלקטרוניםמדעי מיסקרוסקופיה EMS62642-01בשימוש להטמעה, ניתן להשתמש בתבניות הטבעה אחרות. לדגם הספציפי הזה יש תבנית עמוקה יותר, כמו גם מכסה לאיטום הבלוק 
כסף חנקתיסיגמא אולדריץ'S6506כסף חנקתי לכתם פון קוסה
פוספט סטרילי חוצץ מלח (PBS)Gibco/ Thermo Fisher Scientific10010023לחלופין, ניתן להשתמש ב-PBS טרי שהוכן שעבר סינון וחיטוי
אזמל סטנדרטי סטריליIntegra Miltex/ Fisher Scientific12-460-455
אזמלסטנדרטי סטריליאינטגרה מילטקס / פישר סיינטיפיק12-460-455
אבקת סוכרוז 1 ק"גתרמו פישר סיינטיפיק036508-A1
סופרפרוסט פלוס שקופיות מיסקרוסקופפישרברנד / פישר סיינטיפיק 1255015שקופיות דבק
Sure-Tek עיבוד רקמות / הטמעת קלטותפישרברנד היסטוזט / פישר סיינטיפיק22-048-141
רקמות פלוס טמפרטורת חיתוך אופטימלית תרכובת O.C.T תרכובתפישר סיינטיפיק23-730-571
ספוגי רקמותאפרדיה / פישר סיינטיפיק84-53ספוגי רקמות מגנים על רקמות מפני התפתחות יתר 
AC348600050טולואידין בלופישר
מדעי מדעי

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bahney, C. S., et al. Cellular biology of fracture healing. J Orthop Res. 37 (1), 35-50 (2019).
  2. Ko, F. C., Sumner, D. R. How faithfully does intramembranous bone regeneration recapitulate embryonic skeletal development. Dev Dyn. 250 (3), 377-392 (2021).
  3. Patt, H. M., Maloney, M. A. Bone marrow regeneration after local injury: a review. Exp Hematol. 3 (2), 135-148 (1975).
  4. Chitnis, A., et al. Long bone fractures: treatment patterns and factors contributing to use of intramedullary nailing. Expert Rev Med Devices. 17 (7), 731-737 (2020).
  5. Singaram, S., Naidoo, M. The physical impact of long bone fractures on adults in KwaZulu-Natal. S Afr J Physiother. 76 (1), 1393(2020).
  6. Kim, T., et al. Orthopedic implants and devices for bone fractures and defects: past, present and perspective. Eng Regen. 1, 6-18 (2020).
  7. Marsell, R., Einhorn, T. A. The biology of fracture healing. Injury. 42 (6), 551-555 (2011).
  8. Katagiri, T., et al. morphogenetic protein-induced heterotopic bone formation: what have we learned from the history of a half century. Jpn Dent Sci Rev. 51 (2), 42-50 (2015).
  9. Wise, J. K., et al. Temporal gene expression profiling during rat femoral marrow ablation-induced intramembranous bone regeneration. PLoS One. 5 (10), e12987(2010).
  10. Chen, X. D., et al. Biglycan-deficient mice have delayed osteogenesis after marrow ablation. Calcified Tissue Int. 72 (5), 577-582 (2003).
  11. Moran, M. M., et al. Intramembranous bone regeneration differs among common inbred mouse strains following marrow ablation. J Orthop Res. 33 (9), 1374-1381 (2015).
  12. Jeffery, E. C., Mann, T. L. A., Pool, J. A., Zhao, Z., Morrison, S. J. Bone marrow and periosteal skeletal stem/progenitor cells contribute distinct to bone maintenance and repair. Cell Stem Cell. 29 (11), 1547-1561.e6 (2022).
  13. Loopmans, S., Stockmans, I., Carmeliet, G., Stegen, S. Isolation and in vitro characterization of murine young-adult long bone skeletal progenitors. Front Endocrinol. 13, 930358(2022).
  14. Chan, C. K. F., et al. Identification and specification of the mouse skeletal stem cell. Cell. 160 (1-2), 285-298 (2015).
  15. Moran, M. M., et al. Intramembranous bone regeneration in diversity outbred mice is heritable. Bone. 164, 116524(2022).
  16. Lybrand, K., Bragdon, B., Gerstenfeld, L. Mouse models of bone healing: fracture, marrow ablation, and distraction osteogenesis. Curr Protoc Mouse Biol. 5 (1), 35-49 (2015).
  17. Cooper, G. M., et al. Testing the critical size in calvarial bone defects: revisiting the concept of a critical-size defect. Plast Reconstr Surg. 125 (6), 1685-1692 (2010).
  18. Yu, Y., Bahney, C., Hu, D., Marcucio, R. S., Miclau, T. Creating rigidly stabilized fractures for assessing intramembranous ossification, distraction osteogenesis, or healing of critical sized defects. J Vis Exp. (62), e3552(2012).
  19. Wu, X., et al. Enhancing calvarial defects repair with PDGF-BB mimetic peptide hydrogels. J Control Release. 370, 277-286 (2024).
  20. Stanton, E., et al. A murine calvarial defect model for the investigation of the osteogenic potential of newborn umbilical cord mesenchymal stem cells in bone regeneration. Plast Reconstr Surg. 153 (3), 637-646 (2023).
  21. Manassero, M., et al. Establishment of a segmental femoral critical-size defect model in mice stabilized by plate osteosynthesis. J Vis Exp. (116), e52940(2016).
  22. Petersen, A., et al. A biomaterial with a channel-like pore architecture induces endochondral healing of bone defects. Nat Commun. 9 (1), 4430(2018).
  23. Xiao, X., et al. Spatial transcriptomic interrogation of the murine bone marrow signaling landscape. Bone Res. 11 (1), 59(2023).
  24. Yu, V. W. C., Scadden, D. T. Heterogeneity of the bone marrow niche. Curr Opin Hematol. 23 (4), 331-338 (2016).
  25. Matsushita, Y., Ono, W., Ono, N. Growth plate skeletal stem cells and their transition from cartilage to bone. Bone. 136, 115359(2020).
  26. Mizuhashi, K., et al. Resting zone of the growth plate houses a unique class of skeletal stem cells. Nature. 563 (7730), 254-258 (2018).
  27. Muruganandan, S., et al. A FoxA2+ long-term stem cell population is necessary for growth plate cartilage regeneration after injury. Nat Commun. 13 (1), 2515(2022).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Skeletal Stem CellsBone RegenerationMurine Bone ModelOsteoblast DifferentiationMicro Computed TomographyFrozen Section HistologyBone Repair Mechanisms

מאמרים קשורים