הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

אוסף אקסוזומים המשתחררים באופן טבעי מרקמת הגידול

599 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/67739

⸱

10 ביוני 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Medicine and Engineering Interdisciplinary Research Laboratory of Nursing & Materials, West China Hospital, Sichuan University/West China School of Nursing, Sichuan University, 2Department of Occupational Diseases, The Second Affiliated Hospital of Chengdu Medical College Nuclear Industry 416 Hospital, 3Department of Plastic and Burn Surgery, West China School of Medicine, West China Hospital, Sichuan University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מדגים שיטה חדשה לחילוץ אקסוזומים מרקמות הגידול על ידי שחרורם באופן טבעי ואיסופם שוב ושוב כדי לספק בסיס ניסיוני לחקר תפקודם של אקסוזומים בהתפתחות הגידול.

תקציר

כשלפוחיות המופרשות על ידי תאים, אקסוזומים סוגרים ומעבירים חומצות גרעין, חלבונים ושומנים שונים, ומשתתפים בתקשורת בין תאים שונים. אקסוזומים במיקרו-סביבת הגידול ממלאים תפקיד חשוב במאפיינים הביולוגיים של תאי הגידול ויכולים להשפיע מאוד על מצבם של תאים אחרים. לכן, כדי להמשיך ולחקור את הפונקציות הספציפיות של אקסוזומים בהתפתחות גידולים, אין ספק שיש צורך לחלץ ולבודד אקסוזומים מרקמות הגידול. מיצוי ישיר של אקסוזומים מרקמת הגידול מפחית את הצורך בתרבית תאים במבחנה , ואקסוזומים מרקמת הגידול עשויים להיות דומים יותר לאלה במצב הטבעי. לכן, שמירה על המצב הטבעי של אקסוזומים ברקמת הגידול היא המפתח לתהליך המיצוי. עיכול אנזימטי משולב לעתים קרובות עם אולטרה-צנטריפוגה כדי לחלץ אקסוזומים מרקמות הגידול. כאן, אנו מספקים שיטה חדשה לחילוץ אקסוזומים מרקמת הגידול. השתמשנו במדיום נטול סרום כדי לדגור חתיכות רקמת גידול קטנות על שולחן טלטול, אספנו וחילצנו שוב ושוב אקסוזומים ששוחררו באופן טבעי מרקמת הגידול, וזיהינו את המבנה, הריכוז והמאפיינים של האקסוזומים שחולצו, וסיפקנו שיטה חדשה לחוקרים החוקרים את תפקודם של אקסוזומים בהתפתחות הגידול.

מבוא

אקסוזומים הם תת-סוג של שלפוחיות חוץ-תאיות המופרשות על ידי תאים, בדרך כלל בגודל של 30 ננומטר עד 200 ננומטר 1,2. הם משתתפים בתקשורת בין-תאית ומעבירים מולקולות איתות שונות, כולל חומצות גרעין (למשל, חומצה דאוקסיריבונוקלאית (DNA), RNA שליח (mRNA), חומצה מיקרו ריבונוקלאית (miRNA), RNA ארוך שאינו מקודד (lncRNA), RNA מעגלי (circRNA)), חלבונים ושומנים 1,3,4,5, לתאים הנמענים כדי להשפיע על תפקודיהם הפיזיולוגיים 6,7. אקסוזומים, שזוהו לראשונה ברטיקולוציטים של כבשים8, זוהו מאז בנוזלי גוף שונים, כולל דם, רוק, שתן, נוזל מוחי שדרתי, מיימת, מי שפיר וחלב אם 9,10,11,12,13,14,15,16 . יתר על כן, אקסוזומים יכולים להיות מופרשים על ידי סוגים רבים של תאים, כולל לימפוציטים, מקרופאגים, תאי פיטום, תאי שומן ותאי גידול17. עם תפוצתם הרחבה, אקסוזומים ממלאים תפקיד קריטי בתהליכים פתולוגיים שונים, במיוחד סרטן, ובתהליכים פיזיולוגיים שונים, כולל התפתחות עוברית, תיקון והתחדשות רקמות וויסות חיסוני 18,19,20.

בשנים האחרונות הוכח כי אקסוזומים מקדמים התרחשות גידול, פלישה, גרורות, עמידות לכימותרפיה וחסינות נגד או בעד גידול 20,21,22. אקסוזומים שמקורם בסרטן יכולים להפעיל ביטוי גנים בקולטנים או בתאי סרטן שכנים כדי לשנות את הפנוטיפים הביולוגיים שלהם, ותאי סרטן יכולים לקיים אינטראקציה עם תאי סטרומה במיקרו-סביבת הגידול כדי לקדם התפשטות, פלישה ואנגיוגנזה של תאי סרטן 23,24,25. אקסוזומים המשתחררים על ידי תאי גידול יכולים לעזור להם להפריש תרופות רעילות, ואקסוזומים שמקורם בתאי סטרומה יכולים לקדם היווצרות תאים סרטניים20. אקסוזומים שמקורם בסרטן מעורבים בשלבים שונים של גרורות של תאי סרטן, כולל פלישה לרקמות שכנות, העברה דרך מערכת הדם והתפשטות לאיברים מרוחקים20. לבסוף, אקסוזומים מבצעים גם פונקציות של הפעלה חיסונית וגם של דיכוי חיסוני בסרטן, בהתאם לליגנדים, חלבונים ו-miRNA שהם נושאים20. בשל הפונקציות החשובות של אקסוזומים שמקורם ברקמת הגידול, הם מראים ערך יישום פוטנציאלי באבחון מוקדם, טיפול מדויק וניטור פרוגנוסטי של גידולים21,22.

בהתחשב בחשיבותם של אקסוזומים שמקורם ברקמת הגידול, חוקרים רבים ניסו לחלץ אותם כדי לחקור עוד יותר את תכונותיהם ותפקודיהם. מיצוי ישיר של אקסוזומים מרקמות הגידול לא רק מפחית את הצורך בתרבית תאים במבחנה, אלא גם דומה יותר למצב הטבעי של אקסוזומים. לכן, שמירה על המצב הטבעי של אקסוזומים ברקמת הגידול היא המפתח לתהליך המיצוי. התכונות הפיזיקליות של אקסוזומים הן הבסיס לשיטות מיצוי נפוצות, ולעתים רחוקות נלקחים בחשבון השינויים במרכיבי האקסוזום הנגרמים על ידי גירוי במהלך תהליך המיצוי. למעשה, איכות האקסוזומים מושפעת מאוד מהליכי מיצוי אקסוזומים שונים26,27. נכון לעכשיו, רקמות הגידול מתעכלות על ידי אנזימים ונתונות לשיטות כגון צנטריפוגה של שיפוע צפיפות, אולטרה-צנטריפוגה, אולטרה-סינון, כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל (SEC), משקעים פולימרים, כרומטוגרפיה חיסונית ושיטות מיקרופלואידיות, לפני ההפרדה 2,21,28,29 . כאן, אנו מספקים שיטה לחילוץ אקסוזומים מרקמת הגידול. השתמשנו במדיום נטול סרום כדי לתרבית בלוקים קטנים של רקמת גידול בשייקר, ואז אספנו וחילצנו אקסוזומים ששוחררו באופן טבעי על ידי רקמת הגידול וזיהינו את הריכוז והמאפיינים של האקסוזומים שחולצו, וסיפקנו חומרים בסיסיים וראיות ניסיוניות לחקר תפקוד האקסוזומים בהתפתחות הגידול.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל הניסויים הקשורים לאקסוזומים ברקמת הגידול נערכו על פי ההנחיות והתקנות הרלוונטיות. מחקר זה אושר ונערך על ידי ההנחיות של ועדת האתיקה של בית החולים מערב סין, אוניברסיטת סצ'ואן (20220301101). ארבעה שבועות לאחר החיסון בתאי SGC-7901, עכבר עירום אחד (BALB/c, זכר, בן 8 שבועות, 26 גרם) הורדם באמצעות פריקת צוואר הרחם.

1. רכישת רקמת גידול

  1. משרים ב 75% אלכוהול למשך 5 דקות.
  2. עברו לשולחן ניתוחים סטרילי, השתמשו במספריים כירורגיים סטריליים כדי לפתוח את העור החיצוני של הגידול החוץ-רחמי.
  3. מקלפים את רקמת הגידול החוץ-רחמי, ואז חותכים ושוקלים לקבלת שתי חתיכות במשקל שווה.
    הערה: חתיכה אחת של רקמת גידול משמשת למיצוי אקסוזום תחת פרוטוקול זה, וחתיכה נוספת של רקמת גידול במשקל שווה משמשת למיצוי אקסוזום על ידי עיכול אנזימים30.

2. התניה מוקדמת של רקמת הגידול

הערה: בצע שלבים אלה על קרח ובסביבה סטרילית.

  1. פיפטה 10 מ"ל של מי מלח פוספט מקורר מראש (PBS) (0.01 מ') לשטיפת רקמת הגידול להסרת דם ושומן על פני השטח.
  2. חותכים את רקמת הגידול (~400 מ"מ3) לחתיכות של 1-2 מ"מ בעזרת מספריים עיניים ב-20 מ"ל של PBS עם 2 מ"מ אתילן דיאמין חומצה טטראצטית (EDTA) בצלחת פטרי סטרילית בגודל 10 ס"מ. מעבירים את התערובת הנ"ל לצינור חרוטי של 50 מ"ל.

3. שחרור אקסוזומים

  1. צנטריפוגה את הצינור משלב 1.2 ב-200 × גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
  2. יש להשליך את הסופרנטנט ולהשעות מחדש את הגלולה עם 20 מ"ל של מדיום Minimum Essential Medium α (α-MEM). דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ב-100 סל"ד למשך שעה בשייקר טמפרטורה קבועה.
  3. צנטריפוגה ב-200 × גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
  4. השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את הגלולה עם 10 מ"ל של מדיום α-MEM. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ב-100 סל"ד למשך 6 שעות בשייקר טמפרטורה קבועה.
    הערה: היו עדינים בכל השלבים. דגירה קצרה ושטיפה אחת עם מדיום α-MEM מספיקים כדי להסיר רכיבים תוך תאיים שדולפים עקב חיתוך, כולל שלפוחיות ואברונים תוך תאיים.
  5. צנטריפוגה בטמפרטורה של 200 × גרם למשך 5 דקות, 4 מעלות צלזיוס ואוספים את הסופרנטנט בצינור חדש.
  6. השעו מחדש את רקמת הגידול עם 10 מ"ל של מדיום α-MEM.
  7. חזור על הדגירה משלב 2.4 ואחריו שלב 2.5.
  8. מערבבים את הסופרנטנטים הבינוניים שנאספו בשלבים 2.5 ו-2.7.
    הערה: היו עדינים בכל השלבים. שתי דגירות של 6 שעות גרמו לשחרור טבעי של אקסוזומים מחלקי רקמת הגידול.

4. אולטרה-צנטריפוגה

  1. סנן את ה-supernatant דרך מסנן מיקרו-נקבובי של 0.45 מיקרומטר.
  2. צנטריפוגה של הסופרנטנט ב-12,000 × גרם למשך 30 דקות ב-4 מעלות צלזיוס כדי להסיר את השלפוחיות הגדולות.
  3. העבירו את הסופרנטנט לצינור חדש ולצנטריפוגה ב-120,000 × גרם למשך 90 דקות ב-4 מעלות צלזיוס כדי לאסוף אקסוזומים.
  4. שטפו את משקעי האקסוזום עם PBS (0.01 מ') וצנטריפוגה שוב ב-140,000 × גרם למשך 60 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
  5. השעו את האקסוזומים המשקעים ב-PBS (0.01 מ') לשימוש מיידי או לאחסון ב-80 מעלות צלזיוס.
    הערה: היו עדינים בכל השלבים. בצע כל שלב עם הכוח הצנטריפוגלי הקטן ביותר האפשרי והזמן הצנטריפוגלי הקצר ביותר.

5. הצגת תוצאות זיהוי אקסוזומים

  1. לזהות את המורפולוגיה של אקסוזומים מרקמת הגידול באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים הולכה (TEM)30.
  2. קבע את הגודל והריכוז של אקסוזומים מרקמת הגידול באמצעות ניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים (NTA)30.
  3. זהה את סמני החלבון האקסוזומי CD9 ו-CD63 באמצעות כתם מערבי (WB)30.
    הערה: הנחיות אחרונות למחקר אקסוזומים, כולל שימוש ב-CD63, CD9, כקריטריונים לסמני אקסוזום31.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

TEM גילה שלאקסוזומים שמקורם ברקמת הגידול בשיטה זו היו מבנים דמויי אופייניים (איור 1A), ולא היה הבדל משמעותי בין צורת האקסוזומים שמופקים בשיטה זו לבין עיכול אנזימים (איור 1B). תוצאות ה-NTA חשפו כי קוטר האקסוזום הממוצע היה 172.8 ננומטר, שהיה בטווח של 30-200 ננומטר ותואם את גודל האקסוזומים; ריכוז החלקיקים היה 5.9 ×-106/מ"ל (איור 1C); הקוטר הממוצע של אקסוזומים שהופקו על ידי עיכול אנזימים היה 175.5 ננומטר. ריכוז החלקיקים היה 1...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

בשיטה זו, אקסוזומים שמקורם ברקמת הגידול חולצו מרקמות סרטן הקיבה החוץ רחמיות של עכברים עירומים, ושלבי המפתח היו שחרור, הפרשה, הפרדה וטיהור של האקסוזומים. שיטות שונות להפרדת אקסוזומים תוכננו ואומתו על פי התכונות הפיזיקליות וההרכב של אקסוזומים 2,21,28,29, כל אחת עם יתרונות וחסרונות, אך המטרה היא למזער את ההשפעה של הליכי מיצוי אקסוזומים שונים על תכונות האקסוזום

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגודי אינטרסים להצהיר עליהם.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי תוכנית התמיכה במדע וטכנולוגיה של מחוז סצ'ואן (2024NSFSC0592, 2023YFS0064).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
α-MEMHyCloneSH30265.01B
נוגדן Anti-CD63Biossbsm-43117M
נוגדן Anti-CD9Biossbs-2489R
צינור צנטריפוגהThermo339650
שייקר טמפרטורה קבועהThermoMAXQ4450
פיפטה סטרילית חד פעמית-10 מ"לJET
EDTABiosharpBS107
פיפטה חשמליתThermo9501
צנטריפוגה אופקית בטמפרטורה מבוקרתThermoSorvall ST1R בתוספת
מנתח מעקב אחר ננו-חלקיקיםMalvinNanoSight Pro
מספריים עינייםJinzhongY3D010
PBSHyCloneSH30256.01B
חומצה פוספוטונגסטית   Sigma455970-10G
מספריים כירורגייםJinzhongJ21010
נוגדן משניBiossBs-0295Gעיזים נגד ארנב IgG H& מיקרוסקופ אלקטרונים שידור L/FITC
NikonPlan Apo WF
צינור אולטרה-צנטריפוגליבקמן355618
GSP01001

מקורות

  1. Yáñez-Mó, M., et al. Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions. J Extracell Vesicles. 4, 27066(2015).
  2. Zhou, B., et al. Application of exosomes as liquid biopsy in clinical diagnosis. Signal Transduct Target Ther. 5, 144(2020).
  3. Rani, S., O'Brien, K., Kelleher, F., Corcoran, C., Germano, S., Radomski, M., et al. Isolation of exosomes for subsequent mRNA, MicroRNA, and protein profiling. Methods Mol Biol. 784, 181-195 (2011).
  4. Zhou, L., et al. The biology, function and clinical implications of exosomes in lung cancer. Cancer Lett. 407, 84-92 (2017).
  5. D'Agostino, E., et al. Exosomal microRNAs: Comprehensive methods from exosome isolation to miRNA extraction and purity Analysis. MicroRNA Profiling. 2595, 75-92 (2022).
  6. Whiteside, T. Tumor-derived exosomes and their role in cancer progression. Adv Clin Chem. 74, 103-141 (2016).
  7. Ludwig, N., Whiteside, T., Reichert, T. Challenges in exosome isolation and analysis in health and disease. Int J Mol Sci. 20 (19), 4684(2019).
  8. Johnstone, R., Adam, M., Hammond, J., Orr, L., Turbide, C. Vesicle formation during reticulocyte maturation. Association of plasma membrane activities with released vesicles (exosomes). J Biol Chem. 262, 9412-9420 (1987).
  9. Li, B., Cao, Y., Sun, M., Feng, H. Expression, regulation, and of exosome-derived miRNAs in cancer progression and therapy. FASEB J. 35 (10), e21916(2021).
  10. Caby, M., Lankar, D., Vincendeau-Scherrer, C., Raposo, G., Bonnerot, C. Exosomal-like vesicles are present in human blood plasma. Int Immunol. 17, 879-887 (2015).
  11. Pisitkun, T., Shen, R. F., Knepper, M. A. Identification and proteomic profiling of exosomes in human urine. Proc Natl Acad Sci USA. 101 (36), 13368-13373 (2004).
  12. Street, J., et al. Identification and proteomic profiling of exosomes in human cerebrospinal fluid. J Transl Med. 10, 5(2012).
  13. Palanisamy, V., et al. Nanostructural and transcriptomic analyses of human saliva derived exosomes. PLoS ONE. 5, e8577(2010).
  14. Runz, S., et al. Malignant ascites-derived exosomes of ovarian carcinoma patients contain CD24 and EpCAM. Gynecol Oncol. 107, 563-571 (2007).
  15. Keller, S., et al. CD24 is a marker of exosomes secreted into urine and amniotic fluid. Kidney Int. 72, 1095-1102 (2007).
  16. Admyre, C., et al. Exosomes with immune modulatory features are present in human breast milk. J Immunol. 179, 1969-1978 (2007).
  17. Simpson, R., Lim, J., Moritz, R., Mathivanan, S. Exosomes: proteomic insights and diagnostic potential. Expert Rev Proteomics. 6 (3), 267-283 (2009).
  18. Sung, B. H., Parent, C. A. Extracellular vesicles: Critical players during cell migration. Dev Cell. 56, 1861-1874 (2021).
  19. Xie, Q., et al. Exosome-mediated immunosuppression in tumor microenvironments. Cells. 11 (12), 1946(1946).
  20. Zhang, L., Yu, D. Exosomes in cancer development, metastasis, and immunity. Biochim Biophys Acta Rev Cancer. 1871 (2), 455-468 (2019).
  21. Jiang, Z., Wang, H., Mou, Y., Li, L., Jin, W. Functions and clinical applications of exosomes in pancreatic cancer. Mol Biol Rep. 49 (11), 11037-11048 (2022).
  22. Pegtel, D. M., Gould, S. J. Exosomes. Annu Rev Biochem. 88 (1), 487-514 (2019).
  23. Al-Nedawi, K., et al. Intercellular transfer of the oncogenic receptor EGFR VIII by microvesicles derived from tumour cells. Nat Cell Biol. 10, 619-624 (2008).
  24. Nazarenko, I., et al. Cell surface tetraspanin Tspan8 contributes to molecular pathways of exosome-induced endothelial cell activation. Cancer Res. 70, 1668-1678 (2010).
  25. Skog, J., et al. Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers. Nat Cell Biol. 10, 1470-1476 (2008).
  26. Macias, M., et al. Liquid biopsy: from basic research to clinical practice. Adv Clin Chem. 83, 73-119 (2018).
  27. Brennan, K., et al. A comparison of methods for the isolation and separation of extracellular vesicles from protein and lipid particles in human serum. Sci Rep. 10, 1039(2020).
  28. Hu, J., et al. Application exosomes as nanocarriers in cancer therapy. J Mater Chem B. 11 (44), 10595-10612 (2023).
  29. Wang, C., et al. A light-activated magnetic bead strategy utilized in spatio-temporal controllable exosomes isolation. Front Bioeng Biotechnol. 10, 1006374(2022).
  30. Crescitelli, R., et al. Subpopulations of extracellular vesicles from human metastatic melanoma tissue identified by quantitative proteomics after optimized isolation. J Extracell Vesicles. 9 (1), 1722433(2020).
  31. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. J Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  32. Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. 3 (Unit 3.22), (2006).
  33. Gardiner, C., et al. Techniques used for the isolation and characterization of extracellular vesicles: results of a worldwide survey. J Extracell Vesicles. 5, 32945(2016).
  34. Li, W., et al. Comparison of the yield and purity of plasma exosomes extracted by ultracentrifugation, precipitation, and membrane-based approaches. Open Chem. 20, 182-191 (2022).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

אקסוזומים של גידוליםבידוד אקסוזומיםהפקת אקסוזומיםמיקרו-סביבה של גידולאולטרה-צנטריפוגציהעיכול אנזימטיתקשורת בין-תאיתאפיון אקסוזומיםמצע נטול סרום

מאמר זה פורסם

הסרטון יגיע בקרוב

צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.