פרופיל של מוצין O-גליקנים פרמתילציה באמצעות ספקטרומטריית מסה של זמן טיסה בלייזר בעזרת מטריצה

סיכום

כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט לשחרור O-גליקנים ממוצין, והתפלה, פרמתילציה וניתוח לאחר מכן באמצעות ספקטרומטריית מסה MALDI-TOF.

תקציר

ספקטרומטריית מסה של זמן טיסה בלייזר בעזרת מטריצה (MALDI-TOF MS) היא כלי רב עוצמה לפרופיל של מוצין גליקנים המציע רגישות ותפוקה גבוהות. כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט לניתוח גליקנים מקושרים ל-O ממוצינים באמצעות MALDI-TOF MS, הכולל שחרור גליקן, התפלה, פרמתילציה ואיסוף וניתוח נתונים. מחקר זה מראה כי התפלה המבוססת על כרומטוגרפיה של חילופי יונים מובילה להתאוששות משופרת של גליקנים גדולים יותר ולאיכות טובה יותר של הספקטרום המיוצר בהשוואה למיצוי שלב מוצק באמצעות פחמן גרפיטי נקבובי (PGC). בנוסף, עבודה זו מצביעה על כך שזמן תגובת פרמתילציה ארוך יותר מזה המשמש כיום עשוי להיות נחוץ לשינוי יעיל של מבנים סיאליליים. אנו גם מדגימים את החשיבות והצורך של נתוני פיצול וידע מוקדם על המסלולים הביו-סינתטיים של O-glycan לזיהוי מדויק של הרכב ומבנה הגליקן ודנים ביתרונות ובמגבלות הגלומים ש-MALDI-TOF מציג בניתוח של מוצין O-גליקנים.

מבוא

מוצינים הם גליקופרוטאינים גדולים המרכיבים את רוב המרכיבים המבניים בריר. הם מיוצרים על ידי תאי אפיתל מיוחדים הנקראים תאי גביע ועוברים O-glycosylation נרחב לפני שהם מופרשים על פני הרירית. הגליקוזילציה של מוצינים מתרחשת במנגנון גולגי, שם משפחה של גליקוזילטרנספראזות מיוחדות, polypeptide-N-acetylgalactosamine transferases (ppGalNAc-T) יוזמת את התהליך על ידי הצמדת שאריות GalNAc לסרין (Ser) או לתראונין (Thr)¹. לאחר מכן, ארסנל של גליקוזילטרנספראזות מרחיב את מבני הגליקן על ידי הוספת גלקטוז (Gal), N-אצטיל גלוקוזאמין (GlcNAc), GalNAc, חומצה N-אצטילנויראמית (Neu5Ac) ושאריות פוקוז (Fuc), בעוד שאנזימים אחרים משני פחמימות יכולים לבצע תגובות כגון סולפטציה של הגליקנים¹. הגליקנים המעטרים את עמוד השדרה של חלבון המוצין נמצאים בעיקר באשכולות באזורי חלבון עשירים בשאריות Ser ו-Thr, שכן קבוצות ההידרוקסיל בשרשרת הצד של שאריות אלה משמשות כאתרי O-glycosylation. גליקוזילציה צפופה זו מעניקה למוצינים מראה של "מברשת בקבוק" ואחראית על תכונותיהם הפיזיקליות, כגון היכולת לשמור על כמויות גדולות של מים, יכולת יצירת הג'ל שלהם וצמיגות גבוהה ^2,3. בשל תכונות אלה, מוצינים מספקים שימון, מגנים על האפיתל מפני התייבשות ופציעה פיזית, ויוצרים מחסום פיזי בין האפיתל למיקרו-סביבה שלו ^4,5. מוצין גליקנים יכולים לשמש גם כאתרי קישור ומקור פחמן לחיידקים קומנסליים או פתוגניים ^6,7,8. הארגון וההרכב של הריר חיוניים בהגנה על האפיתל על ידי שמירה על חיידקים בקרבת מקום אך הרחק מפני השטח של האפיתל. מוצין גליקנים משתתפים גם בתקשורת תא-תא ובהידבקות⁹.

מוצין גליקנים ממלאים תפקיד מרכזי בשמירה על הומאוסטזיס רירית, ופרופילי גליקוזילציה חריגים של מוצין קשורים לתפקוד לקוי של המחסום, שינוי בהרכב המיקרוביוטה, גרורות גידול מוגברות, מחלות מעי דלקתיות (IBD) ומחלות אחרות 10,11,12. לכן, חקר הגליקוזילציה של מוצין חשוב להבנת תפקידם של ריר ומוצינים בבריאות האדם ויכול להוביל לגישות חדשות לניהול או טיפול במחלות.

טכניקות מבוססות ספקטרומטריית מסה הן בין האפשרויות הפופולריות ביותר לחקר מוצין גליקנים. MALDI-TOF MS היא טכניקת יינון רכה המאפשרת ניתוח של ביומולקולות גדולות ולא נדיפות כגון גליקנים וגליקופרוטאינים¹³. גישה זו מציעה רגישות גבוהה וטווח מסה רחב, המאפשר זיהוי וזיהוי של תערובות גליקן בשפע נמוך ומגוונות. בנוסף, דפוסי הפיצול המתקבלים מניסויי ספקטרומטריית מסה טנדם (MS/MS) יכולים לספק מידע מבני רב ערך על הרכב הגליקן ורצף¹³.

בדרך כלל, הניתוח של גליקנים המקושרים ל-O ממוצינים על ידי MALDI-TOF MS כרוך בזרימת עבודה רב-שלבית, שבה ה-O-גליקנים משתחררים תחילה כימית מעמוד השדרה של החלבון בשיטות כמו חיסול β רדוקטיבי, ולאחר מכן מתמלחים כדי להסיר את המלחים מהשחרור הכימי ונגזרים כדי לשפר את היינון והזיהוי. לאחר מכן, הגליקנים המטוהרים והנגזרים מתגבשים יחד עם מטריצת MALDI מתאימה על לוחית מטרה של MALDI ונרכשים ספקטרום מסה המספקים מידע על המסות של יוני הגליקן השלמים. לאחר מכן, הגליקנים מפוצלים בניסויי MS/MS כדי להניב מידע על מבנה הגליקנים¹⁴. כאן אנו מספקים פרוטוקול מפורט לשחרור, התפלה ופרמתילט של גליקנים וניתוח שלהם על ידי MALDI-TOF MS.

פרוטוקול

הערה: ראה איור 1 לייצוג סכמטי של זרימת העבודה.

איור 1: ייצוג סכמטי של זרימת העבודה הניסיונית. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

1. שחרור גליקן

1. הכנת מאגר β-חיסול
   הערה: יש להכין אותו טרי לפני כל שימוש.
   1. שקלו כדור נתרן הידרוקסיד (NaOH) והמיסו אותו בכמות מתאימה של H₂O בצינור של 50 מ"ל כדי לקבל תמיסה של 0.1 מ'.
   2. בשפופרת של 5 מ"ל, ממיסים 189 מ"ג נתרן בורוהידריד (NaBH₄) ב-5 מ"ל מהתמיסה האלקליין שהוכנה לעיל בשלב 1.1.1.
      זהירות: NaOH הוא קורוזיבי ו-NaBH₄ הוא מאכל, רעיל, דליק ומהווה סכנה בריאותית. יש לטפל בשני הכימיקלים מתחת לארון אדים באמצעות ציוד מגן אישי מתאים. אין להמיס NaBH₄ ישירות ב-H₂O, מכיוון שהוא מתפרק ומשחרר מימן שניתן להצית את עצמו.
2. הגדרת תגובת β-חיסול
   1. בבקבוקון זכוכית של 4 מ"ל, ממיסים עד 100 מיקרוגרם של מוצינים מטוהרים ב-250 מיקרוליטר של H₂O.
      הערה: חלק מהמוצינים עשויים שלא להתמוסס במלואם ובמקום זאת ליצור תרחיף של חלקיקים קטנים מאוד.
   2. הוסף 250 מיקרוליטר ממאגר חיסול β וסגור את הבקבוקון היטב עם מכסה מרופד PTFE. דגרו את התגובה בטמפרטורה של 45 ^מעלותצלזיוס למשך 16 שעות.
3. עצירת התגובה
   1. בבקבוק זכוכית של 100 מ"ל, הוסף 5 מ"ל של חומצה אצטית קרחונית ל-95 מ"ל של ריכוז H₂O (5% (v/v).
      הערה: ניתן לאחסן בטמפרטורת החדר ולעשות בו שימוש חוזר.  זהירות: חומצה אצטית היא דליקה וקורוזיבית ויש להשתמש בה בארון אדים עם ציוד המגן האישי הדרוש.
   2. על קרח, הוסף 1 מ"ל מתמיסת החומצה האצטית 5% לכל תגובה (שלב 1.2.3) בצורה טיפתית. בשלב זה, חפש תסיסה משחרור מימן מעודף NaBH₄. אם התסיסה לא פסקה לאחר תוספת של 1 מ"ל של 5% חומצה אצטית, חזור על שלב זה.
      הערה: אם אין תסיסה עם תוספת של 5% חומצה אצטית, אז תגובת חיסול β עשויה להיות לא שלמה או לא מוצלחת.
4. התפלת הדגימות
   1. בבקבוק זכוכית של 100 מ"ל, הכינו תרחיף צפוף של שרף חילופי קטיונים, בצורת H⁺ , 200-400 רשת בחומצה אצטית של 5% (v/v).
   2. חבר פיפטה מזכוכית עם כמות קטנה של צמר זכוכית. הוסף 1.5 מ"ל ממתלה השרף על פיפטת הזכוכית מלמעלה ותן לה להתייצב ולהתנקז. זה יהפוך את עמוד ההתפלה.
   3. שוטפים את השרף עם 2 מ"ל של 5% חומצה אצטית. השלך את הזרימה.
   4. הוסף את דגימת המוצין לעמודת ההתפלה. אוספים את הזרימה בצינור של 5 מ"ל.
   5. שטפו את בקבוקוני הדגימה עם 1 מ"ל של חומצה אצטית 5% וטענו אותם לעמוד ההתפלה. אוספים את הזרימה באותו צינור.
   6. שוטפים את העמוד פי 2 עם 1 מ"ל של 5% חומצה אצטית. אוספים את הזרימה באותו צינור.
   7. השתמש במאייד צנטריפוגלי כדי להסיר את החומצה האצטית ולרכז את הדגימות (5 מבר, 30 ^{מעלות צלזיוס}, 2 שעות).
   8. הקפיאו את הדגימות בחום של -80 ^{מעלות צלזיוס}וייבשו אותן למשך הלילה על מייבש הקפאה.
      הערה: לחלופין, האידוי הצנטריפוגלי יכול להמשיך להתייבש, אך הוא יקשה על המסת הדגימות מחדש.
   9. בבקבוק זכוכית של 100 מ"ל, הוסף 5 מ"ל חומצה אצטית ל-95 מ"ל מתנול (ריכוז 5% (v/v).
      זהירות: מתנול דליק ורעיל. יש להשתמש בו בארון אדים עם ציוד המגן האישי הדרוש.
   10. ממיסים את הדגימות ב-0.5 מ"ל של חומצה אצטית מתנולית ומייבשים את הדגימות תחת זרם חנקן. חזור על שלב זה 3-5x. אחסן את הדגימות המיובשות בטמפרטורה של 4 ^{מעלות צלזיוס}.
5. פרמתילציה של הגליקנים
   1. בבקבוקון זכוכית של 8 מ"ל, מערבבים היטב תמיסת NaOH של 50% (0.2 מ"ל) עם 0.4 מ"ל מתנול ומערבולת. ייווצר משקע לבן שיתמוסס שוב במהירות.
   2. בעזרת מזרק זכוכית מוסיפים היטב 4 מ"ל של דימתיל סולפוקסיד נטול מים (DMSO) ומערבולת.
   3. צנטריפוגה התמיסה למשך 2 דקות ב -2,000 × גרם. זה ייצור ג'ל בתחתית הצינור, שלב נוזלי באמצע ומלחים שהצטברו בחלקו העליון.
   4. מזלפים בזהירות את הסופרנטנט והמלחים, מבלי להפריע לג'ל.
   5. חזור על שלבים 1.5.2-1.5.4 פי 5 עד שלא נוצרים יותר מלחים. אם המלחים נדבקים לדפנות הצינור, סובבו בעדינות את הצינור כדי להביא את המלחים בתרחיף, מבלי להפריע לג'ל בתחתית, או הסירו אותם באמצעות פיפטת פסטר מזכוכית.
   6. לאחר שלא נוצרים מלחים נוספים, השעו מחדש את הג'ל ב -4 מ"ל של DMSO נטול מים. מתלה זה הוא בסיס הפרמתילציה.
      הערה: כמות זו של בסיס פרמתילציה מספיקה ל~25 דגימות. ניתן להתאים את הכמויות בהתאם.
   7. לדגימות המיובשות יש להוסיף 100 מיקרוליטר של DMSO נטול מים ו -150 מיקרוליטר של בסיס הפרמתילציה. בעזרת פיפטה מזכוכית מוסיפים 80 מיקרוליטר יודומתאן במהירות האפשרית, כדי למנוע ספיגת לחות מהסביבה.
      זהירות: יודומתאן רעיל ומהווה סכנה בריאותית וסביבתית. יש להשתמש בו בארון אדים עם ציוד המגן האישי הדרוש.
   8. דגרו את תגובות הפרמתילציה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר עם ניעור נמרץ.
   9. הוסף 0.5 מ"ל של H₂O כדי לסיים את התגובה. הדגימות יהפכו מעוננות.
      הערה: אם הדגימות לא הופכות עכורות, ייתכן שתגובת הפרמתילציה לא הייתה שלמה.
   10. שטפו את הדגימות בחנקן עד שהן מתבהרות.
   11. טען את הדגימות על צלחת מיצוי הידרופילית-ליפופילית-מאוזנת (HLB) עם 96 בארות (60 מ"ג) או מחסניות HLB. הפעל לחץ חיובי כדי לדחוף את הדגימות דרך השלב המוצק בקצב זרימה של ~1 מ"ל/דקה. אם אתה משתמש במחסניות HLB, השתמש בפטמת גומי או בסעפת ואקום כדי להפעיל לחץ על הדגימות. השלך את הזרימה.
   12. שטפו בארות עם 2 x 1 מ"ל של H₂O. הפעל לחץ חיובי והשליך את הזרימה.
   13. הסר את הגליקנים מצלחת HLB באמצעות 1 מ"ל מתנול. הפעל לחץ רק עד שמתנול מתחיל לצאת מהצלחת. לאחר מכן, זרימת הכבידה מספיקה בכדי לתת את קצב הזרימה הנדרש. אסוף את הזרימה.
   14. חזור על שלב הפליטה פעם נוספת.
   15. יבש את הדגימות באמצעות מאייד צנטריפוגלי
   16. בבקבוקון זכוכית של 4 מ"ל, הכינו מאגר TA50 על ידי ערבוב של 1 מ"ל אצטוניטריל, 998 מיקרוליטר של H₂O ו-2 מיקרוליטר של חומצה טריפלואורואצטית.
       זהירות: אצטוניטריל דליק וחומצה טריפלואורואצטית קורוזיבית. יש להשתמש בשניהם בארון אדים, תוך שימוש בציוד מגן אישי מתאים.
   17. בצינור מיקרו-צנטריפוגה, הכינו את תמיסת המטריצה על ידי המסת 10 מ"ג של סופר-DHB [תערובת 9:1 (w/w) של חומצה בנזואית 2,5-דיהידרוקסי וחומצה 2-הידרוקסי-5-מתוקסי בנזואית] ב-1 מ"ל של TA50.
   18. ממיסים את הדגימות המיובשות ב -10 מיקרוליטר של TA50.
   19. מערבבים 1 מיקרוליטר מהדגימה עם 1 מיקרוליטר מתמיסת המטריצה, מאתרים אותה על לוחית מטרה MALDI מפלדה ונותנים לה להתייבש.

2. ניתוח MALDI TOF של הדגימות

1. הגדרה לרכישת נתוני הורה-יון
   1. ירה 1,000 יריות מהלייזר בעוצמה של 50%.
      הערה: אלה יכולים להשתנות בהתאם להגדרות המכשיר הגלובליות וניתן לכוונן אותם לפי הצורך.
   2. תחת הכרטיסייה מנשא לייזר , הגדר את הגדרת ההליכה האקראית להשלמת הדגימה.
   3. תחת הכרטיסייה זיהוי , הגדר את טווח המסה ל 500 - 3,000; הגדל טווח זה אם נצפות פסגות חזקות בגובה 2,500-3,000 מ"ש. הגדר את רווח הגלאי ל-20x.
      הערה: הרווח יכול להשתנות בהתאם להגדרות הגלובליות של המכשיר וניתן לכוונן אותו לפי הצורך.
   4. תחת הכרטיסייה ספקטרומטר, הגדר את הקוטביות לחיובית ואת דיכוי המטריצה להטיה, 300 Da.
   5. לחץ על התחל | לאחר סיום רכישת הנתונים, שמור בשם כדי לשמור את הנתונים בספרייה מתאימה.
2. פתיחת ספקטרום האב לרכישת ספקטרום פיצול
   1. לאחר לחיצה ימנית על הספקטרום, בחר מצא רשימת מסה.
   2. מהרשימה שנוצרה, בחר את היונים הרלוונטיים לפיצול ולחץ על הוסף לרשימת MS/MS לאחר לחיצה ימנית על הפסגות שנבחרו.
   3. לחץ שוב באמצעות לחצן העכבר הימני על הרשימה ההמונית ובחר רשימת MS/MS.
   4. לחץ על שלח ל-flexControl.
   5. ב-flexControl, טען את שיטת LIFT ונווט אל הכרטיסייה LIFT.
   6. בחר כל פסגה שנטענה בזה אחר זה ורכוש גם יוני אב וגם יונים על ידי מעבר בין מצב Parent ו-Fragments. התאם את עוצמת הלייזר ומספר הצילומים לפי הצורך. לחץ על שמור כדי לשמור את הנתונים לאחר הפיצול של כל יון הורה.
   7. ייצא את הספקטרום בתבנית '.ascII'.
      הערה: ניתן לייבא אותו מאוחר יותר ל-Glycoworkbench להמשך ניתוח.
3. ניתוח נתונים באמצעות glycoworkbench
   1. ב-Glycoworkbench, טען את קובץ ה-.ascII המיוצא של ספקטרום המסה ובצע תיקון בסיסי וסינון רעשים באמצעות הכפתורים הרלוונטיים בתחתית החלון, לפני חישוב מרכזי השיא. בחלון המוקפץ, בחר את תחום המסה המתאים, יחס אות/רעש מינימלי ועוצמת שיא מינימום MS.
   2. לאחר חישוב שיא הצנטרואידים, השתמש בכלי Glyco-Peakfinder כדי למצוא קומפוזיציות מבנה התואמות את רשימת השיא. בחר perMe כנגזרת, redEnd בתור הקצה המפחית ואת המספר המינימלי והמקסימלי של שאריות צפויות.
      1. עבור מוצין, בחר Hexose, N-Acetyl-Hexosamine, Deoxy-Hexose וחומצה N-אצטיל-נויראמינית. עבור גליקנים סולפטיים, השתמש באפשרות השאריות האחרת עם מסה של 87.9. עבור נתוני MALDI-TOF, הגדר יונים Max # Na ומטענים Max # מוגדרים ל-1 ואת הדיוק ל-0.5 Da.
         הערה: ייתכן שיהיה צורך להגדיל עוד יותר את הדיוק, בהתאם לכיול ספקטרומטר המסה.
   3. בחר את כל ההערות הנכונות על ידי לחיצה ממושכת על מקש הבקרה ולחיצה על כל ביאור; לאחר מכן לחץ לחיצה ימנית על ההערה ולחץ על הוסף לרשימת השיא המבוארת.
   4. כדי ליצור דוח המשווה ספקטרום מרובה עם ביאורים, בכרטיסיה כלים , תחת דיווח, בחר צור דוח המשווה פרופילים שונים. הדפס את הדוח כקובץ PDF כדי לשמור אותו.
   5. לאחר זיהוי פסגות הגליקן, חשב את השפע היחסי של כל מבנה בודד כאחוז מהשטח הכולל מתחת לעקומה של כל פסגות הגליקן.
   6. לניתוח ספקטרום הפיצול, טען את הספקטרום על Glycoworkbench וצור את רשימת השיא כמו בשלב 2.3.1.
   7. צייר מבני גליקן משוערים התואמים את קומפוזיציות הגליקן המוערות. צור שברים עבור כל מבנה מצויר על ידי בחירה באפשרות החישוב הרלוונטית תחת הכלי Fragments . לאחר מכן, בחר את כל הקטעים, לחץ עליהם באמצעות לחצן העכבר הימני ולחץ על העתק קטעים לקנבס.
   8. כדי לתמוך עוד יותר בניתוח הפיצול, בחר שיא עניין על ידי לחיצה עליו במציג הספקטרום. לאחר מכן, על ידי לחיצה ימנית ובחירה מצא את כל המבנים התואמים לפסגות, חקור את ה-m/z של השיא שנבחר מול מסדי נתונים מקוונים עבור מבני גליקן משוערים.
   9. בחר מבנים משוערים מעניינים והעתק אותם לחלון הקנבס של התוכנה לאחר לחיצה ימנית ובחירת האפשרות המתאימה.
   10. כדי לחשב את המקטעים האפשריים שניתן ליצור מכל מבנה גליקן, בחר את המבנה המעניין בבד הציור ולאחר מכן, תחת הכרטיסייה כלים, בחר מקטעים וחשב מקטעים עבור המבנה הנוכחי.
   11. אם חושבו מקטעים עבור יותר ממבנה גליקן אחד, הצג את טבלת ההשוואה בכרטיסיית הסיכום, תחת תצוגת הטבלה Fragments.
   12. בחר את המקטעים התואמים לרשימת השיא עבור כל מבנה גליקן פוטנציאלי ובחר העתק מקטעים לבד הציור מהתפריט הנפתח בלחיצה ימנית.
   13. בכרטיסייה כלים , תחת פרופיל, בחר ביאורים פסגות עם כל המבנים ולאחר מכן לחץ על כלים | דיווח | צור דוח של הביאורים. הדפס את הדוח כקובץ PDF כדי לשמור אותו.

תוצאות

בתוצאות הבאות השתמשו במוצין קיבה חזירי (PGM) כדי למטב את שלבי ההתפלה והפרמתילציה. כדי להשוות בין שתי גישות התפלה נפוצות, לאחר שחרור הגליקנים, הדגימות הומלחו על ידי חילופי קטיון (כמתואר בפרוטוקול לעיל) ואידוי משותף של בוראט עם מתנול או על ידי מיצוי פאזה מוצקה עם מחסניות פחמן גרפיטי נקבובי (PGC). זה דורש מיזוג מוקדם של המחסנית עם 80% אצטוניטריל ו-100% H₂O, שלב שטיפה עם 0.1% (v/v) חומצה טריפלואורואצטית (TFA), ופליטה של הגליקנים עם 2 מ"ל של 25% אצטוניטריל ב-0.1% TFA, 2 מ"ל של 50% אצטוניטריל ב-0.1% TFA, ו-2 מ"ל של 80% אצטוניטריל ב-0.1% TFA.

הספקטרום שהתקבל לאחר פרמתילציה נותח בטווח m/z 500 עד m/z 2,500. בסך הכל זוהו 33 מבני גליקן בדגימה שהותפלו על ידי חילופי יונים והסרת בוראט ואילו 32 מבנים זוהו בדגימה שהותפלה על ידי מיצוי PGC (איור 2A). מבנה גליקן אחד לא זוהה בדגימת ה-PGC המומלחת (מסומן בכוכבית באיור 2A). ניתוח השוואתי זה הראה כי התאוששות של גליקנים גדולים יותר לא הייתה יעילה לאחר מיצוי PGC, בהשוואה לחילופי יונים. עדות לכך היא גם השפע היחסי של גליקנים גדולים יותר, המהווה 21% מסך הגליקנים לאחר מיצוי PGC, לעומת 31% לחילופי יונים. יתר על כן, התפלה על ידי חילופי יונים והסרת בוראט הובילה לספקטרום עם יחסי אות לרעש מוגברים בהשוואה לאלו שנוצרו לאחר התפלה על ידי מיצוי פאזה מוצקה עם PGC (איור 2B).

כדי לייעל את זמן תגובת הפרמתילציה, ציטוטים של אותה תגובת פרמתילציה רוו על ידי הוספת H₂O בנקודות זמן שונות, (כלומר, 5 דקות, 30 דקות או 90 דקות). התוצאות הראו כי ניתן לזהות 33 פסגות גליקן בטווח של m/z 500 עד m/z 2,500, בדגימות שעברו פרמתילציה למשך 30 או 90 דקות, כאשר הספקטרום שהתקבל היה דומה. לעומת זאת, ניתן היה לזהות רק 31 פסגות גליקן כאשר פרמתילציה בוצעה במשך 5 דקות (איור 3). מעניין ששני המבנים שלא זוהו בזמן תגובה קצר יותר זה (מסומן בכוכבית באיור 3) הם שני המבנים הסיאליליים, מה שמרמז על כך ששינוי של חומצות סיאליות אינו יעיל תוך 5 דקות, בתנאים שנבדקו.

נעשה שימוש בפיצול עבור כל שיא גליקן PGM כדי לאשר את הרכב הגליקן ולקבוע את מבנה הגליקן. שתי דוגמאות מוצגות כאן (איור 4). באיור 4A, מוצג ספקטרום הפיצול של שיא ב-983 m/z. הרכב הגליקן מוקצה כ-HexNAc₂Hex₂. ישנם שני מבנים פוטנציאליים להרכב גליקן זה, או Gal-(Gal-GlcNAc-Gal-)-GalNAc (גליקן 1) או Gal-GlcNAc-Gal-GalNAc (גליקן 2). פיצול של תרכובת זו יצר ספקטרום מסה עם פסגות שניתן להקצות לשברים שונים של הגליקן. השיא ב-m/z 529 והשיא ב-m/z 708 אופייניים למבנים 1 ו-2, בהתאמה, ואנו יכולים להסיק שגם גליקנים 1 וגם 2 קיימים בתערובת הגליקן PGM.

באיור 4B, מוצג ספקטרום הפיצול של שיא ב-m/z 2,026. Glycoworkbench חישב שני קומפוזיציות גליקן פוטנציאליות לשיא זה, Hex₃HexNAc₁Neu5Ac₃ ו-Hex₃HexNAc₄dHex₂. להרכב הסיאלילי יש דיוק נמוך יותר (~160 עמודים לדקה ו-178 עמודים לדקה, בהתאמה), מה שמצביע על כך שהראשון חייב להיות הבחירה הנכונה. עם זאת, פרופיל הפיצול מצביע על נוכחות של Fuc, לא Neu5Ac; לכן, ההרכב השני הוא הנכון. כאן, מוצגים ארבעה מבני גליקן משוערים, והספקטרום הוער עם השברים המחושבים מכל מבנה גליקן משוער. בספקטרום המבואר, אנו יכולים לראות כי קיימות פסגות האופייניות רק לגליקנים 4 ו-6, בעוד שלא זוהו שיאים האופייניים לגליקנים 3 ו-5. על סמך נתונים אלה, אנו יכולים להסיק כי גליקנים 4 ו -6 קיימים.

איור 2: השוואה של פסגות הגליקן לפי התפלה ומיצוי פאזה מוצקה. (A) השוואה של פרופיל הגליקן PGM לאחר התפלה על ידי כרומטוגרפיה של חילופי קטיונים והסרת בוראט או על ידי מיצוי פאזה מוצקה PGC. (B) השוואה בין שתי גישות ההתפלה ביחס האות לרעש המתקבל עבור כל שיא גליקן שזוהה. הכוכבית מציינת את הגליקן שזוהה רק בדגימות שהותפלו על ידי חילופי קטיונים והסרת בוראט. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: השוואה של פרופיל הגליקן PGM לאחר פרמתילציה במשך 5, 30 או 90 דקות. הכוכביות מציינות את הגליקנים הסיאליליים שזוהו רק לאחר 30 או 90 דקות של פרמתילציה. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: דוגמאות לספקטרום פיצול מגליקנים של PGM. (A) פיצול של שיא הגליקן ב-m/z 983. (B) פיצול של שיא הגליקן ב-m/z 2026. הקופסאות מצביעות על מבני גליקן פוטנציאליים. המספרים על השברים מצביעים על מבנה הגליקן שממנו הם יכולים להיגזר. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

דיון

כדי לחקור גליקנים, החוקרים משתמשים במגוון מתודולוגיות, החל משימוש בלקטינים לזיהוי אפיטופים ספציפיים ועד לכרומטוגרפיה נוזלית מתוחכמת יותר-ספקטרומטריית מסה טנדם (LC-MS) ותהודה מגנטית גרעינית (NMR) כדי לקבל אפיון מפורט של מבני גליקן. היתרונות העיקריים של MALDI-TOF MS על פני גישות אלטרנטיביות הם הרגישות ואופי התפוקה הגבוה של השיטה¹³. עם זאת, מכיוון שאין יכולת להפריד בין תרכובות איזובריות, מבני גליקן שונים עם אותו ערך m/z מייצרים תערובת של שברים תחת MS/MS שקשה לפירוק¹³. אם נדרשת קביעת המבנה המדויק של מוצין גליקנים, LC-MS צריכה להיות שיטת הבחירה.

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לניתוח מוצין גליקנים על ידי MALDI-TOF MS הכולל את כל השלבים הקריטיים בתהליך, החל משחרור גליקן, התפלה ופרמתילציה, ועד לרכישת נתונים וניתוחם. חשוב להכיר בכך שכל אחד מהשלבים הללו יכול להתבצע בגישות שונות, ולכולם יש יתרונות ומגבלות נלווים.

בפרוטוקול זה, השתמשנו בסילוק β רדוקטיבי כדי לשחרר את הגליקנים. התגובה מתרחשת בתנאים בסיסיים. אם דגימות המוצין כבר נמצאות בהשעיה ולא טוהרו בעבר, יש לבדוק את ה- pH באמצעות נייר מחוון pH; אם הוא חומצי, יש להגדיל אותו ל-pH של ~8-9. מגבלה של גישה זו היא שהתנאים הבסיסיים הנדרשים לשחרור הגליקנים מובילים גם להידרוליזה ולכן, לאובדן קבוצות O-אצטיל הנמצאות לעתים קרובות על חומצות סיאליות, בתגובה המכונה ספוניפיקציה.

בעוד שתוארו שיטות אחרות בספרות לשחרור גליקנים 15,16,17,18, שחלקן יכולות לשמר את קבוצות ה-O-אצטיל הלאביליות, חיסול β רדוקטיבי נותר תקן הזהב בתחום. גישה זו דורשת ריכוז גבוה של מלחים. לאחר מכן יש להסיר מלחים ומזהמים אחרים לדיכוי יונים לפני ניתוח MALDI-TOF¹⁹, מכיוון שהם יכולים להשפיע על יעילות היינון והכימות של גליקנים. כאן, כרומטוגרפיה של חילופי קטיונים, ואחריה הסרת בוראט על ידי אידוי מתנול הוכחה כגישה היעילה ביותר להתפלת הגליקנים המשוחררים ממוצין. במקרה זה, הגליקנים אינם מקיימים אינטראקציה עם השרף ובמקום זאת זורמים דרכו, בעוד יוני נתרן נלכדים על השרף. עם זאת, הכנת עמודות חילופי היונים היא מייגעת והופכת גישה זו ללא יעילה עבור ניסויים בקנה מידה גדול עם דגימות רבות. במקרים כאלה, ניתן להעדיף התפלת PGC, מכיוון ששרף זה זמין גם בפורמט צלחת של 96 בארות. עם זאת, כפי שהוצג לעיל, התפלה על ידי מיצוי PGC עלולה להוביל לפליטה לא יעילה, במיוחד של גליקנים גדולים יותר, ויש לקחת זאת בחשבון בעת פירוש התוצאות.

למרות שניתן לנתח גליקנים מקומיים גם על ידי MALDI-TOF, בדרך כלל משתמשים בפרמתילציה, מכיוון שתגובה זו מגבירה משמעותית את רגישות הזיהוי, מכיוון שלגליקנים מקומיים יש יעילות יינון נמוכה²⁰. יתר על כן, פרמתילציה הופכת את הגליקנים הטעונים שלילית, כגון גליקנים סולפטיים או סיאליליים, לקלים יותר לזיהוי במצב חיובי ושומרת על אפיטופים של גליקן, כגון חומצות סיאליות או פוקוז²⁰. לרוב, מותר לפרמתילציה לפעול במשך 5-10 דקות^14,21, כאשר דיווחים מסוימים מאפשרים לתגובה להימשך עד 40 דקות²². כאן, הראינו כי בתנאים שנבדקו, גליקנים סיאליליים לא זוהו ביעילות לאחר 5 דקות של פרמתילציה, ונדרשה דגירה ארוכה יותר.

בנוסף לזמן התגובה, גורם נוסף שיכול להשפיע על יעילות הפרמתילציה הוא תכולת המים בתגובה. נוכחות מים עלולה להוביל לתת-מתילציה או מתילציה חלקית של הגליקנים, כאשר לא כל קבוצות ההידרוקסיל הומרו לקבוצות מתיל²³. ניתן לקבוע זאת בקלות כאילו התרחשה תת-מתילציה, ניתן לראות קבוצות של פסגות הנבדלות ב-14 Da (הפרש המסה בין קבוצות הידרוקסיל ומתיל) בספקטרום המסה. ניתן לטפל בבעיה זו על ידי חזרה על תגובת הפרמתילציה וניתוח מחדש של הנתונים.

גורם מגביל בניתוח גליקן הוא פירוש הספקטרום. למרות ההתקדמות האחרונה, תהליך זה עדיין ידני ברובו ודורש ידע והבנה טובים של המסלולים הביו-סינתטיים של הגליקן כדי להוסיף הערות מדויקות לספקטרום. כלים כמו Glycoworkbench²⁴ יכולים לסייע על ידי מתן הערות אפשריות, מבני גליקן והרכבים, אך בשל ההטרוגניות המובנית של תערובות גליקן, החוקרים עדיין צריכים לקבל את ההחלטה איזו בחירה היא הנכונה. בדוגמה שהוצגה לעיל באמצעות PGM, Glycoworkbench הציע שני קומפוזיציות גליקן פוטנציאליות לשיא ב-mz 2,025.7620, ועל סמך פרופיל הפיצול, הגענו למסקנה שהמבנה הפוקוסילטי. עם זאת, אם ספקטרום פיצול לא היה זמין (מה שקורה לעתים קרובות עבור גליקנים בשפע נמוך), החוקרים יכולים לבסס את ההערה על הידיעה שגליקנים עם הרכב של Hex3HexNAc1Neu5Ac3 נמצאים על גנגליוזידים, ולא על מוצין, ולכן אין לשקול אפשרות זו בהקשר של PGM. לפיכך, יש להצליב מבנים או הרכבים של גליקן שזוהו לפרסומים קודמים ולהסכים עם העקרונות של ביוסינתזה של O-גליקן. בסך הכל, פרוטוקול זה משמש כמשאב יקר ערך, במיוחד עבור חוקרים חדשים בתחום הגליקוביולוגיה ובעלי עניין בחקר אינטראקציות המתרחשות בממשק הרירי.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
פיפטות פסטור זכוכית 150 מ"מ	פישר סיינטיפיק	15202699	מוצרי צריכה הפניה בטקסט (אם רלוונטי): פיפטת זכוכית
צינורות 5 מ"ל	אפנדורף	30122305	מוצרי צריכה
לוח חילוץ HLB עם 96 בארות	פישר סיינטיפיק	16553290	מוצרי צריכה
חומצה אצטית	סיגמא-אלדריץ'	A6283	מגיב
אצטוניטריל	פישר סיינטיפיק	15624520	מגיב
DMSO אנהידרוס	סיגמא-אלדריץ'	5.89569	מגיב
מתנול אנהידר	סיגמא-אלדריץ'	5.89596	מגיב
ספקטרומטר מסה אוטופלקס	ברוקר		ציוד
שרף DOWEX 50w x8, בצורת H+, רשת 200-400	סיגמא-אלדריץ'	44519	Reagent התייחסות בטקסט (אם רלוונטי): שרף חילוף קטיון
מחמם בלוק יבש	גרנט	QBD2	ציוד
אידוי/מרוכז למחממי בלוק	קול-פאלמר	WZ-36610-99	ציוד
flexAnalysis	ברוקר		תוכנה, קניינית
flexControl	ברוקר		תוכנה, קניינית
ז'נבק EZ-2	ביופרמה	EZ-2	ציוד הפניה בטקסט (אם רלוונטי): אידוי צנטריפוגלי
בקבוקי זכוכית עם פקקי PTFE תואמים (4 מ"ל)	וויטון	DWKW224582-144EA	מוצרי צריכה
בקבוקי זכוכית עם פקקי PTFE תואמים (8 מ"ל)	פישר סיינטיפיק	11587413	מוצרי צריכה
צמר זכוכית	סופלקו	1.04086	מוצרי צריכה
שולחן עבודה גליקו-בלש	נה		תוכנה; להורדה מ-https://glycoworkbench.software.informer.com/
מחסניות HLB SPE	סופלקו	57493-U	מתכלה, כחלופה ללוח החילוץ HLB עם 96 בארות
יודומתאן	סיגמא-אלדריץ'	289566	מגיב
לוחית מטרה של MALDI	ברוקר		ציוד
מייבש הקפאה ModulyoD	תרמו פישר	מודוליוD-230	ציוד הפניה בטקסט (אם רלוונטי): מייבש הקפאה
NaBH4	סיגמא-אלדריץ'	452882	מגיב
כדורי NaOH	סיגמא-אלדריץ'	567530	מגיב
פתרון NaOH 50%	סיגמא-אלדריץ'	415413	מגיב
מעבד לחץ חיובי-96	ווטרס	186006961	ציוד
סופר DHB	סיגמא-אלדריץ'	50862	מגיב
חומצה טריפלואורואצטית	סיגמא-אלדריץ'	T6508	מגיב