Method Article

תוסף Micro-Manager בקוד פתוח להדמיה בתצוגה חיה של דיפולים פלואורסצנטיים

DOI:

10.3791/67755

⸱

March 14th, 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1College of Engineering, Eastern Institute of Technology, 2Department of Biomedical Engineering, College of Future Technology, Peking University, 3National Biomedical Imaging Center, Peking University, 4Zhejiang Provincial Engineering Research Center for Organelles Diagnostics and Therapy

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פיתחנו תוסף Micro-Manager בקוד פתוח, המאפשר תצפית בתצוגה חיה של דיפולים פלואורסצנטיים במיקרוסקופ תאורה מובנה. התוסף תומך בהתבוננות בכיוון דיפול דו-ממדי ותלת-ממדי כאחד.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מיקרוסקופ קיטוב פלואורסצנטי (FPM) יכול לדמות את המיקום והכיוון הדיפול של פלואורופורים. למרות ההישגים של מיקרוסקופ קיטוב פלואורסצנטי ברזולוציה גבוהה, ההסתמכות שלהם על לאחר הרכישה מעכבת תצפית בזמן אמת. מיקרוסקופ תאורה מובנה מקוטב (pSIM) מציע הדמיה ברזולוציה גבוהה של דיפולים פלואורסצנטיים עם מהירות הדמיה גבוהה ומתאים היטב ליישומי תאים חיים. פיתחנו יישום קוד פתוח לשחזור בזמן אמת של תמונות קיטוב והצגת הדיפולים הפלואורסצנטיים. בנוסף, הרחבנו את השיטה להשגת מיפוי אוריינטציה תלת מימדי (3DOM), והרחבנו את התועלת שלה למחקרים ביולוגיים מורכבים. יתר על כן, הצגנו מבוא יסודי להרחבת מיקרוסקופ SIM קיים על הדמיית קיטוב וסיפקנו מדריך תצורה מפורט של Micro-Manager 2.0 לשליטה במיקרוסקופ, המאפשר תצוגה מקדימה בזמן אמת של הדמיה מקוטבת. בנוסף, סיפקנו את קוד MATLAB לשחזור מלא המקיף הן את pSIM והן את 3DOM. מדריך מקיף זה נועד לסייע למתחילים לשלוט במהירות ולהתחיל בקלות בפעולות.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מיקרוסקופ קיטוב פלואורסצנטי (FPM) התגלה כטכניקה רבת עוצמה להדמיה בו זמנית הן של המיקום והן של כיוון הדיפול של פלואורופורים, ומציעה תובנות עמוקות לגבי הדמיה ביולוגית 1,2. על ידי הקלה על תצפית כיוון על כיווני הביו-מולקולות, FPM חושף את הסידור המורכב של מקרו-מולקולות כגון אקטין 3,4,5, מיקרו-צינורית5, ספטין6, חוט DNA 7-9, קומפלקס נקבוביות גרעיניות10 וחלבוני ממברנה

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הרחבת מיקרוסקופ תאורה מובנה קיים להדמיית קיטוב

  1. הכן מיקרוסקופ SIM.
    הערה: אנו מניחים שלקוראים יש בסיס מסוים בהגדרת מיקרוסקופ וכבר יש להם מיקרוסקופ אור מובנה. אם חסר לך ניסיון רלוונטי, עיין במאמר זה, המספק תיאור מפורט כיצד לבנות מיקרוסקופ SIM16. ניתן להחליף את יחידת בקרת הקיטוב של "HWP+WQP+LCVR" בצלחת גל מערבולת פיצה בעבודת pSIM5 שלנו או בצלחת חצי גל פיצה17.
  2. מדוד יחסי הכחדת קיטוב של שלושה כיווני פסים על ידי טעינת דפוסים שונים על מאפנן אור מרחבי (SLM). הנח וסובב מקטב מיד לאחר המטרה והשתמש במד כוח כדי למדוד את עוצמת הלייזר. ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ניתן לבצע את שיטת ה-pSIM במיקרוסקופי SIM המבוססים על ההפרעה באמצעות קרני לייזר מקוטבות s. הפרעות קיטוב s הן סוג ה- SIM הנפוץ ביותר ויוצרות פסי תאורה בעלי ניגודיות גבוהה. אב הטיפוס האקדמי של מערך מיקרוסקופ נכלל בעבודה המקורית של pSIM5. הוצג בקצרה באיור 1, מודולטור אור מרחבי (SLM) מייצר את הסדר ±1 של אלומות עקיפות וצלחת חצי גל פיצה שומרת על קיטוב s של שלושה כיוונים. בעוד שחלופות SIM אחרות עשויות להשתמש בסורגים כדי ליצור אלומות עקיפות או .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במחקר שלנו, פיתחנו תוסף המאפשר תצוגה מקדימה בזמן אמת של שתי טכניקות הדמיית קיטוב, pSIM ו-3DOM. ניתן לבצע את שתי הטכנולוגיות במערכת SIM קיימת עם שינוי קל. סיפקנו את השלבים המפורטים להתקנת מיקרוסקופ pSIM ו-3DOM והקמנו את Micro-Manager כדי לשלוט במיקרוסקופ ולהדגים כיצד להשיג את תוצאות הקיטוב בתצוגה חיה. תוצאות הניסוי כוללות את חוט האקטין שצולם על ידי pSIM ו-λ-DNA שצולם על ידי 3DOM. הכיוון של דיפולים הפאלואידין מקביל בערך לכיוון חוטי האקטין, בעוד שהכיוון של STOYOX Orange fluorophores מאונך ל.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי תוכנית המחקר והפיתוח הלאומית של סין (2022YFC3401100).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
חרוזי פלורסנט 100 ננומטרInvitrogenF8801
4% תמיסת פורמלדהידInvitrogenR37814
מצלמהTucsenDhyana 400BSI V3 https://www.tucsen.com/download-software/
חומרי בסיס תותבות (סוג I סוג הגדרה תרמית, נוזל)New Century DentalN/A
Dulbecco' s Modified Eagle' s בינוניGibcoC11995500BT
Eclipse TE2000 מיקרוסקופ הפוךNikonTE2000 E
סרום בקר עובריGibco10099141C
MATLAB R2019bMathWorksגרסה R2019bhttps://ww2.mathworks.cn/downloads/
MetroCon V4.0Kopinגרסה 4.0תוכנה של מודולטור
אור מרחבימיקרו-מנג'ר 2.0μ &מו; anagerגרסה 2.0הורד Micro-Manager המהדורה האחרונה
MS-2000 XYZ שלבאוטומטי מכשור מדעי יישומיMIM3https://www.asiimaging.com/support/downloads/usb-support-on-ms-2000-wk-controllers/
myDAQNational Instruments781325-01הורדות תוכנה ומנהלי התקנים - NI
OBIS 561 ננומטר LS 20 mW לייזרקוהרנטי1325777
Phalloidin-AF568InvitrogenA12380
פוספט חוצץ מלחקורנינג21-040-CV
פולי מתיל מתקרילטSolarbioM9810
ProLong DiamondInvitrogenP36980
מאפנן אור מרחביKopinSXGA-12
SYTOX כתם חומצת גרעין כתומהInvitrogenS11368
Triton X-100InvitrogenHFH10
TrypsinGibco25200056&lambda
;-DNAInvitrogenS11368

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zhanghao, K., Gao, J., Jin, D., Zhang, X., Xi, P. Super-resolution fluorescence polarization microscopy. J Innov Opt Health Sci. 11 (01), 1730002(2018).
  2. Alonso, M. A., Brasselet, S. Polarization microscopy: from ensemble structural imaging....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Fluorescence Polarization MicroscopyPolarized Structured IlluminationSuper Resolution ImagingFluorescent DipolesLive Cell ImagingMicro Manager PluginReal Time Reconstruction3D Orientation MappingPolarization ImagingMATLAB Reconstruction Code
Video Coming Soon

Related Articles