פרוטוקול זה מתאר הליך סינון תרופות בזחלי זברה 3-7 ימים לאחר ההפריה ואחריו הערכה מורפולוגית.
מאמר שיטה
בדיקת מולקולות קטנות ובדיקת רעילות בזחלי דגי זברה בשלב מוקדם
נפתח בלשונית חדשה
במאמר זה
סיכום
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
תקציר
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
דגי הזברה הפכו לאורגניזם מודל בולט למחקר תרגומי אנושי, בדיקות רעילות של מולקולות קטנות ומזהמים סביבתיים, גילוי תרופות טיפוליות ויישומי מחקר ביו-רפואיים אחרים. הפרוטוקול המוצג נועד לספק מדריך ברור לבדיקת תרופות ובדיקת רעילות בזחלי דגי זברה בשלב מוקדם (בגילאי 3-7 ימים לאחר ההפריה, dpf). פורסמו מספר מתודולוגיות המתארות בדיקת רעילות בזחלי דגי זברה, אם כי חסרות פרוטוקול סטנדרטי עבור משכי החשיפה, קצב השינויים במדיה וניקוד המורפולוגיה, בין היתר. קבענו בניסוי את גילאי הזחלים האידיאליים לביצוע הניסויים, את גודל הלוחות המתאים ביותר לגילאים אלה, את קצב שינויי המדיה המספקים תוצאות אמינות תוך הגבלת בזבוז תרכובת הבדיקה, ומערכת ניקוד מורפולוגית הניתנת לכימות בקלות באופן סטטיסטי. כתב היד מתאר בפירוט פרוטוקול לבדיקת רעילות בזחלי דגי זברה בגילאי 3 עד 7 dpf, במטרה למקד את הפער בבדיקות רעילות לתרופות ולעשות את הצעד הראשון לקראת שיטה סטנדרטית הדומה לבדיקת רעילות חריפה של עוברי דגים.
מבוא
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
דגי זברה (Danio rerio) התגלו לאחרונה כאורגניזם מודל רב עוצמה של חולייתנים, והפכו פופולריים יותר ויותר במחקרים לקידום המחקר הביו-רפואי1. לכ-70% מהגנים המקודדים חלבונים אנושיים יש לפחות אורתולוג אחד של דגי זברה, כאשר ~82% מהגנים הגורמים למחלות בבני אדם מכילים לפחות גן אורתולוגי אחד בדגי זברה2. השימור הגנטי, יחד עם תבניות ומורפולוגיה בסיסיות דומות של איברים, הופכים את דגי הזברה למודל מעניין לחקר מחלות בבני אדם, ומאפשרים השוואה בין מינים ברמה המולקולרית 1,2,3, שהיא חיונית לפיתוח תרופות.
דגי הזברה מתפתחים במהירות כאשר ניצן הזנב נוצר ב-10 שעות לאחר ההפריה (HPF) והסומיט הראשון מופיע ב-16 כיפות. העוברים יוצאים מהכוריון ב~2-3 ימים לאחר ההפריה (dpf). עד 4 dpf, מערכת העיכול שלהם מפותחת במלואה ועל ידי 5 dpf, שלפוחית השחייה שלהם מתנפחת, מה שמאפשר להם לשחות בחופשיות ולצוד מזון. למרות היכולת להאכיל עד 5 dpf, זחלים שאינם מוזנים יכולים לשרוד אך ורק על חומרים מזינים שמקורם בחלמון עד לפחות 7 dpf, תוך עקיפת הצורך בהזנה חיצונית שעלולה לגרום לזיהום ולהפריע לבדיקת תרופות, טוקסיקולוגיה ובדיקות התנהגותיות4. על ידי 7 dpf, הזחלים גם לפתח תוכנית גוף מלאה עם כמה מערכות איברים בסיסיים, כולל הלב וכלי הדם, שריר, ועצם 5,6. עוברי דגי זברה מופרים גם הם exvivo, מתפתחים חיצונית, והם שקופים אופטית בשלבי החיים המוקדמים, מה שהופך אותם לנגישים ביותר לעריכת גנים וסינון של מולקולות קטנות3. בנוסף, גודלם הקטן ושיעור הפריון הגבוה שלהם מאפשרים הכללת יותר משכפלים, מה שמגדיל את הכוח הסטטיסטי, כמו גם לשימוש בצלחות מרובות בארות, מה שחוסך בכמויות התרופות ומגדיל את התפוקה.
סינון של מולקולות קטנות חדשות במודל של בעלי חיים חשוב כדי לקבוע את יכולתן של התרופות לייצר השפעות מועילות או שליליות, ובכך לזהות אילו תרכובות הן בנות קיימא לבדיקות נוספות ואחרות שעשויות לדרוש שינוי כדי לשנות את פעילותן. כחלק מתהליך סינון התרופות, יש לזהות את הריכוז הקטלני 50 (LC50) של תרכובת המטרה. זה מספק ריכוז עבודה שגורם למוות ב -50% מחיות הניסוי כחלק מבדיקת הרעלים הראשונית.
קיים פרוטוקול סטנדרטי לבדיקת רעילות בעוברים של דגי זברה עד 96 שעות לאחר ההפריה (hpf), כלומר בדיקת רעילות חריפה של עוברי דגים (FET) (TG236)7. במבחן FET, ביצים מופרות חדשות נחשפות לחמישה ריכוזים של כימיקל למשך עד 96 שעות ונצפו סימנים של קטלניות, כלומר (i) קרישת ביציות, (ii) חוסר היווצרות סומיט, (iii) חוסר ניתוק ניצני זנב משק החלמון, ו (iv) חוסר דופק. הבדיקה מאפשרת לקבוע רעילות חריפה ואת LC50. יתר על כן, הוא גם מייעץ לגבי גודל תאי הבדיקה שישמשו לסינון (צלחות 24 בארות), פיזור ביצים בתא הבדיקה ותנאי דיור, בין היתר, הבטחת תוצאות תקפות וניתנות לשחזור7.
בעוד בדיקת FET מתאימה לבדיקת רעילות בשלב העוברי, היא אינה חורגת מעבר ל -4 dpf. עבור פנוטיפים שמתחילים להתפתח בסביבות נקודת זמן זו (למשל, מינרליזציה של נוטוכורד6), בדיקת תרופות חייבת להתקדם מעבר ל -4 dpf כדי לאפשר הערכה מורפולוגית של רקמה כזו. יתר על כן, אנו ממליצים כי החשיפה לתרופות מתחילה לפחות יום לפני התפתחות הפנוטיפ של עניין. למיטב ידיעתנו, לא קיים פרוטוקול סטנדרטי הדומה ל-FET לבדיקת תרופות בזחלי דגי זברה בשלב מוקדם, במיוחד בדגי זברה בגילאי 3 עד 7 dpf. בעוד שפורסמו מספר מחקרים המתארים בדיקות סמים בזחלי דגי זברה מעבר ל-4 dpf, קיים חוסר עקביות במתודולוגיה בה נעשה שימוש, כולל גודל תאי הבדיקה, מספר השכפולים הביולוגיים והטכניים, קצב השינויים במדיה, משכי החשיפה והפגמים המורפולוגיים המוערכים 8,9,10,11,12,13 . מסיבה זו, פיתחנו פרוטוקול מאומת לבדיקת רעילות סטנדרטית ואחריה תצפית חזותית של שינויים מורפולוגיים בזחלי דגי זברה ב 3-7 dpf. לאחר מכן ניתן להשתמש בפרוטוקול המוצע לבדיקות פנוטיפ אחרות במורד הזרם, כגון ניתוח התנהגותי, פרופיל ביטוי גנים והיסטומומורפומטריה.
פרוטוקול
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
דגי הזברה טופלו בהתאם להנחיית האיחוד האירופי 2010/63/EU. כל הניסויים אושרו על ידי ועדת האתיקה של המחקר הפקולטי (FREC) ותת-הוועדה הסקטוריאלית המשותפת למחקר בבעלי חיים (JFARSS) של אוניברסיטת מלטה. תרשים זרימה של הפרוטוקול המוצע ניתן למצוא באיור 1.
1. ייצור, איסוף ותחזוקה של ביצים
- הציבו את הדגים במכלי רבייה יום לפני, לפחות שעה לאחר ההאכלה האחרונה, עם מחיצות במקום המפרידות בין הזכרים לנקבות. לקבלת תוצאות טובות יותר בייצור ביצים, השתמשו ביחס גבוה יותר בין נקבות לזכרים. מקמו את הדגים בחדר המצויד במחזור אור/חושך של 14 שעות: 10 שעות ובטמפרטורת סביבה של 27-28 מעלות צלזיוס.
הערה: מיכל רבייה של 1 ליטר יכול להכיל שלושה דגים בוגרים, ואילו מיכל רבייה של 1.7 ליטר יכול להכיל חמישה דגים בוגרים. - למחרת בבוקר, לאחר הופעת האור, החליפו את המים במיכלי הרבייה והסירו את החוצצים. במקרה שמיכל הרבייה אינו משופע בקלות, הניחו אותו במצב משופע כדי להבטיח מים רדודים זמינים לקידום ההזדווגות. במקרה של ייצור ביצים איטי ופעילות הזדווגות, יש להחליף את המים במיכלי הרבייה כל 45 דקות. השאירו את הדג להזדווג עד 3 שעות או לפי הצורך.
- לאחר השלמת ההזדווגות, סחטו בעדינות את כל הנקבות שלא ייצרו ביצים כדי למנוע קשירת ביצים לטווח ארוך. החזירו את הדגים למכלים שלהם.
- אספו את כל הביצים במיכלי הרבייה באמצעות מסננת רשת, שטפו במי עובר (E3) והניחו בצלחת פטרי עם E3. להכנת E3, יש לערבב 16.67 מ"ל של 60x E3 (300 mM NaCl; 10 mM KCl; 20 mM CaCl 2.2H 2O; 20 mM MgSO 4.7H2O) עם 1 מ"ל של 0.01% מתילן כחול ו-982 מ"ל של מים נטולי יונים. יש להסיר ביצים לא מופרות או פסולת. ודאו שמנות הפטרי אינן צפופות, עם 50 ביצים לצלחת פטרי בגודל 100 מ"מ על 15 מ"מ ו-120 ביצים לצלחת פטרי בגודל 150 מ"מ על 15 מ"מ.
- שמור את הביצים באינקובטור מוגדר ל 28.5 מעלות צלזיוס ומצויד במחזור יום / לילה של 14 שעות: 10 שעות. ב 1 dpf, לרענן את E3 ולהסיר ביצים שאינן קיימא כדי להגביל את הצמיחה פטרייתית.
2. הכנת צלחת הבדיקה
- ב 3 dpf, להעביר עובר אחד בריא למראה, בקע לכל באר בצלחת 96 באר באמצעות מיקרופיפטה 1,000 μL להגדיר נפח 100 μL.
הערה: אין להשתמש בעוברים שלא בקעו, מכיוון שהדבר עלול לגרום לספיגת תרכובות משתנות. שימוש בעוברים שנראים בריאים גם מגביל את ההטיה במהלך הבדיקה. גודל קצה פיפטה מאפשר איסוף קל של עובר דג הזברה מבלי לגרום נזק פיזי. בנוסף, מיקרופיפטה מאפשרת שליטה טובה יותר בנפח המוזרם לבאר לעומת פיפטת העברה. - בצלחת בת 12 בארות, הכינו את הריכוז(ים) הרצויים לכל כימיקל בדיקה בבארות נפרדות (כאן, בוסוטיניב בטווח ריכוזים שבין 100 מיקרומטר ל-6.25 מיקרומטר). בכל באר, להוסיף את הנפח הדרוש של כימיקל הבדיקה באמצעות micropipettes ולעשות עד 2.4 מ"ל באמצעות E3.
הערה: יש לבצע חיפוש ספרות כדי לקבוע את הריכוזים המתאימים לשימוש עבור כימיקלים רלוונטיים לבדיקה. אם אין מידע זמין, ניתן לבדוק מספר ריכוזים עד לקביעת טווח ריכוז מתאים. יש להשתמש במינימום של חמישה ריכוזים, כאשר הריכוז הגבוה ביותר גורם לתמותה של 100% והריכוז הנמוך ביותר גורם ללא השפעה נצפית7. - הכינו בקרת רכב בהתאם לממס המשמש להמסת כימיקל בדיקת המלאי.
הערה: תרכובות בדיקה רבות אינן מסיסות במים ומסיבה זו, יש להמיס אותן בממסים ספציפיים ("כלי רכב") כגון אתנול או דימתיל סולפוקסיד (DMSO) כדי ליצור תמיסה מימית. עדיף ש-DMSO לא יעלה על ריכוז של 1% כאשר משתמשים בו כבקרת רכב, שהוא הריכוז שנמצא בטוח בדגי זברה14. - הסר כל פתרון E3 נוכח צלחת 96 באר באמצעות micropipette 200 μL ולהחליף אותו עם 100 μL של המדיום המתאים נבדק. הקפידו לבדוק סה"כ 24 זחלים בכל ריכוז. השתמש מיקרופיפטה יחידה או 8 ערוצים 200 μL כדי להעביר את כימיקלים הבדיקה לבארות צלחת הבדיקה המתאימות. כלול בקרות (למשל, E3, רכב כימי, בקרות חיוביות וכו ').
הערה: הגדרת הצלחת מכילה עד ארבעה כימיקלים שונים לבדיקה או ארבעה ריכוזים שונים של אותו כימיקל. דוגמה ללוחיות הבדיקה שהוקמו לצורך חקירה של חמישה ריכוזים של אותו כימיקל (למשל, בוסוטיניב) בליווי בקרות מוצגת באיור 1. - ב-24 שעות לאחר החשיפה, יש לבצע ניקוד מורפולוגי (כמתואר בסעיף 3) ושינוי חצי בינוני, תוך הסרת 50 מיקרוליטר מדיום והחלפתו בתווך טרי. הסר ורשום את כל הזחלים המתים בתהליך. שמור את הזחלים באינקובטור מוגדר ל 28.5 °C (75 °F) ומצויד במחזור יום / לילה של 14 שעות: 10 שעות. חזור על התהליך עד 7 dpf.
3. הערכה מורפולוגית
- באמצעות מיקרוסקופ אור סטריאופוני, התבוננו בזחלי הבדיקה הבודדים בהגדלה מתאימה.
הערה: דוגמאות לפגמים מורפולוגיים שניתן להעריך מובאות בטבלה 1. - יש להעריך את המורפולוגיה על ידי שני קלעים בלתי תלויים, כאשר השלישי ייוועץ במקרה של חילוקי דעות בין שני הניקודים.
- ניקוד המורפולוגיה באמצעות שיטה בינארית (כלומר, נוכח/נעדר), כאשר 'נעדר' מציין מורפולוגיה נורמלית (ניקוד כ- '0') ו'נוכח' מציין נוכחות של חריגה מורפולוגית (ניקוד כ- '1'). איור 2 מראה דוגמאות של דגי זברה ב-5 dpf לאחר יומיים של חשיפה לתרופות, כולל דג זברה שלא נפגע (איור 2A), דג זברה עם בצקת קלה של קרום הלב (איור 2B), בצקת חמורה של קרום הלב עם דימום חלמון והרחבת חלמון (איור 2C), התפתחות מאוחרת עם פיגמנטציה מופחתת, שלפוחית שחייה ואורך כולל (איור 2D), חלמון נפוח וסנפיר קאודלי מעוקם (איור 2E), היעדר סנפיר קאודלי (איור 2F), נוטוכורד מעוקל (איור 2G), חיתוך (איור 2H) ומוות עם נמק (איור 2I). ציון כל הפנוטיפים החריגים כ- '1' ודגי הזברה שלא נפגעו כ- '0'.
4. קביעת LC50
- לאחר הערכת מורפולוגיה, יש לשרטט את אחוז התמותה המצטבר ב-7 dpf כנגד ריכוז. דוגמה לכך מוצגת באיור 3. השתמש בעקומת הריכוז כדי להעריך את הריכוז שגורם לתמותה של 50%.
- לאחר הערכת ריכוז LC50 , חזור על הניסוי שתואר לעיל על ידי חשיפת 24 זחלים משוכפלים בצלחת של 96 בארות לריכוז LC50 מוערך יחיד זה.
5. שכפולים טכניים
- חזור על התהליך כולו באמצעות חמשת הריכוזים שנבחרו של אותו כימיקל לפחות פעמיים נוספות בשתי הזדמנויות נפרדות כדי להבטיח שהתוצאות ניתנות לשחזור.
תוצאות
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
ניתן להסתכל על החריגות בנפרד או במצטבר על ציר הזמן של הניסוי עד 7 dpf. ניתן להשתמש בציון המורפולוגיה המרבי לכל חריגה כדי לחשב חריגות מורפולוגיות כאחוז ממספר הזחלים המשמשים. לדוגמה, אם ביום 7 ציוני המורפולוגיה של בצקת קרום הלב הם 19 ו-20 עבור ציונים 1 ו-2, בהתאמה, מתוך ציון אפשרי של 24, כלומר 19 או 20 זחלים מתוך 24 מציגים בצקת קרום הלב, ניתן לחשב את ציון האחוזים כך:
טבלה משלימה S1 מציגה את תוצאות הניקוד המורפולוגיה (של שני הניקודים) ב-4 dpf לאחר בדיקת רעילות לתרכובת Bosutinib, מעכב טירוזין קינאז המיועד לטיפול בלוקמיה מיאלואידית כרונית15. אותו ניקוד מורפולוגי חוזר על עצמו עבור דגים חשופים בגילאי 5 dpf עד 7 dpf. התרכובת נבדקה בטווח ריכוזים שבין 100 מיקרומטר ל-6.25 מיקרומטר. שלושה שכפולים טכניים נערכו בנקודות זמן שונות, ושיעור התמותה המצטבר הממוצע של 7 dpf שימש לקביעת LC50, הריכוז שבו 50% מהזחלים שורדים. ניתן לקבוע את LC50 בכל נקודת זמן חשיפה. עם זאת, אנו ממליצים לחשב זאת ב- 7 dpf.
התמותה הממוצעת המצטברת של 7 dpf שימשה ליצירת עקומת LC50 , שניתן לראות באיור 3. עבור Bosutinib, ריכוז LC50 הוערך להיות 37.95 מיקרומטר.
הערה: ריכוז LC50 משוער זה חל אך ורק על מערכת מודל זו ולאחר מכן ניתן להשתמש בו לבדיקות פנוטיפ נוספות במורד הזרם.
איור 1: סכמטי של בדיקת התרופה המוצעת בזחלים ב-3-7 dpf. לוחות הבדיקה של 96 בארות ערוכים לחקירה של חמישה ריכוזים הנעים בין 100 מיקרומטר ל -6.25 מיקרומטר עבור התרכובת בוסוטיניב. קיצור: dpf = ימים לאחר ההפריה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: פגמים מורפולוגיים מייצגים שנצפו בזחלי דגי זברה בריכוז כימי של 5 dpf שנחשפו לריכוזים כימיים שונים (יומיים לאחר החשיפה). (A) דגי זברה (לא מושפעים), (B) זחלי זברה המראים בצקת קרום הלב קלה, (C) דגי זברה עם בצקת חמורה של קרום הלב ודימום חלמון, (D) דגי זברה עם עיכוב התפתחותי, פיגמנטציה מופחתת, שלפוחית שחייה קטנה, (E) דגי זברה עם חלמון נפוח וסנפיר קאודלי מעוקם, (F) דגי זברה עם היעדר סנפיר קאודלי, (G) דגי זברה עם נוטוכורד מעוקל, (H) דגי זברה עם זנב קטוע, ו-(I) דגי זברה מתים עם נמק. פגמים מצוינים עם ראשי חץ אדומים. פסי קנה מידה = 1 מ"מ. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: עקומת LC50 המראה ריכוז כנגד % תמותה. חמשת הריכוזים שנבדקו היו 100 μM, 50 μM, 25 μM, 12.5 μM ו-6.25 μM, כאשר אחוז התמותה היה 100%, 100%, 29.2%, 12.5% ו-12.5%, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
| פגמים מורפולוגיים | תיאור |
| בצקת קרום הלב | הצטברות נוזלים סביב הלב עם לב מתוח ותקלה במחזור הדם |
| פעימות לב (לדקה) | מספר מופחת של פעימות לדקה |
| חלמון | נוכחות או היעדר בצקת חלמון או דימום שיכול להתרחש בו זמנית עם מומים לבביים |
| סיומת חלמון | חלמון נפוח, דק או נעדר |
| נוטוכורד מעוקל | נוכחות של נוטוכורד מעוקם או גלי, ו / או זנב מעוקל |
| שלפוחית שחייה | נוכחות, היעדר או התפתחות חלקית של שלפוחית השחייה |
| פיגמנטציה | פחות או ללא מלנוציטים בהשוואה לדגים לא מטופלים באותו גיל |
| נקרוזה | נוכחות (קלה או חמורה) או היעדר נמק בכל חלק של הגוף |
| עיכוב בפיתוח | התפתחות מאוחרת או מעוכבת בהשוואה לבקרות מסוג בר באותו גיל. |
| תגובה למגע | תגובה מאוחרת או ללא תגובה בעקבות בהלה (למשל, שימוש בקצה פיפטה) |
| חיתוך | היעדר גוף דג זברה אחורי (כלומר היווצרות הזנב) |
| סנפירים | נוכחות או היעדר סנפיר קאודלי שעשוי להיות מלווה בהארכת חלמון דק |
| ציר גוף מופחת | דגים שנראים רגילים אך כאשר נמדדים הם קצרים יותר באורכם |
טבלה 1: רשימת פגמים מורפולוגיים חזותיים שניתן להבחין בהם בעקבות מחקרי חשיפה לתרופות.
טבלה משלימה S1: תוצאות מורפולוגיות מייצגות עבור Bosutinib ב 4 dpf (1 יום לאחר החשיפה). אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
דיון
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
דגי זברה הפכו למודל חשוב לבדיקת תרופות. כאשר ניסינו לקבוע מתודולוגיה לביצוע בדיקות רעילות, מצאנו מספר שיטות מנוגדות ממעבדות שונות 8,9,10,11,12,13. השיטות המתוארות משתמשות בזחלים בגילאים שונים, בצירי זמן ניסיוניים משתנים, בקצב שונה של שינויים בינוניים ובמערכות ניקוד מורפולוגיות שונות. באמצעות ניסוי וטעייה, הקמנו את המתודולוגיה המתוארת, אשר סיפקה תוצאות אמינות וניתנות לשחזור.
בחירת גודל צלחת
בתחילה, ניסויים בוצעו בצלחת של 24 בארות כדי להבטיח שלזחלים יהיה מספיק מקום לנוע ולגדול. הצלחות סודרו עם 10 זחלים לכל באר, שתי בארות לכל ריכוז, ו 1 מ"ל של פתרון סמים לכל באר. סידור זה לא סיפק תוצאות ניתנות לשחזור, מה שהוביל למסקנה שהזחלים לא ספגו כמויות שוות של סמים מהבאר. לאחר מכן בוצעו ניסויים באמצעות צלחת של 96 בארות ו-48 בארות עם זחל אחד לכל באר, מה שהראו כי הזחלים בלוחות של 96 בארות לא הראו בעיות בצמיחה. לפיכך, הניסויים נמשכו בצלחת של 96 בארות תוך ניצול פחות מקום ונפחי תרופות.
שינוי יומי בינוני
מכיוון שדגי זברה סופגים את התרופה מהתווך, וידאנו שיש צורך במידה מסוימת של שינוי בינוני כדי לשמור על ריכוז עקבי של התרופה בתווך. יתר על כן, שינוי בינוני מסיר חומר פסולת פוטנציאלי שהצטבר בבאר, מה שיכול לספק סביבה רעילה ולהוביל לתוצאות מוטות. ניסוי נערך עם Bosutinib, שבו הוצבו שלוש צלחות עבור אותה תרופה, אחת ללא שינוי מדיום יומי, אחת עם שינוי יומי חצי בינוני, ואחד עם שינוי מדיום יומי מלא. בעוד הצלחת ללא שינוי בינוני הציגה שיעורי תמותה מוגדלים, הלוחות עם שינויים בינוניים חצי ומלא הביאו לאותה תוצאה על ידי 7 dpf. לפיכך, נבחר שינוי יומי חצי בינוני. בחירה זו מבטיחה פחות צריכה של חומר הבדיקה היקר והמוגבל, אשר עשוי להידרש לניסויים נוספים במורד הזרם.
משך החשיפה
גיל השימוש בזחלי הבדיקה ומשך החשיפה לתרופות שנבחרו בפרוטוקול זה הונעו על ידי הפנוטיפ שמעניין אותנו הוא מינרליזציה של העצם. מאחר שהיווצרות העצם מתחילה ב~4 dpf, בחרנו להתחיל עם דגי זברה ב-3 dpf כדי לקבוע אם כימיקלים לבדיקה השפיעו על תחילת התפתחות העצם. לאחר מכן, סיימנו את מחקרי החשיפה לתרופות ב -7 dpf מכיוון שנצפתה רמה גבוהה של תמותה מ -8 dpf ואילך לאור חוסר הזנה שעלול להטות את התוצאות. עם זאת, מסגרות הזמן עשויות להיות מותאמות בהתאם לאופי המחקר ופנוטיפ העניין.
מגבלות
למתודולוגיה זו יש כמה מגבלות. העברת 3 דגי זברה dpf לצלחות בדיקה מרובות בארות גוזלת זמן. הוצאת המדיום מהבארות מבלי להרים את הזחלים מייגעת באותה מידה. יש להסיר את המדיום מכל באר באיטיות באמצעות פיפטה חד-ערוצית, ולהבטיח שהזחלים לא ייפגעו בתהליך. יתר על כן, בעוד ששינוי יומי חצי בינוני מחדש את מתחם הבדיקה ומבטיח פינוי פסולת מהבאר, הוא אינו מבטיח שניתן יהיה לשמור על ריכוז תרופה יציב בבאר לאורך 5 ימי החשיפה. בעוד שניתוח כרומטוגרפיה נוזלית בעל ביצועים גבוהים יכול לתת תובנה נוספת לגבי כמות התרופה הנספגת בפועל על ידי כל זחל, הבדיקה כבר לא תיחשב כשיטת סינון בעלת תפוקה גבוהה.
לסיכום, מתודולוגיה זו שואפת למקד את הפער בבדיקות רעילות באמצעות דגי זברה מעבר ל -4 dpf, תוך נקיטת צעדים לקראת פרוטוקול סטנדרטי החל על קווי דגי זברה מסוג בר, מוטנטיים וטרנסגניים, וזה שווה ל- FET בשלב העוברי. זה פותח אפיקים לבדיקות פנוטיפ אחרות במורד הזרם שאולי לא יהיו אפשריות בשלבים מוקדמים יותר.
גילויים
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.
תודות
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
המחברים נתמכים על ידי פרויקטים ZeEBRA (R&I-2019-018), קרן תוכנית לפיתוח טכנולוגיה (TDP), STRONG (R&I-2024-007L), קרן TDPLite, NASDAC (SINO-MALTA-2022-08), מענק שיתוף פעולה מדעי וטכנולוגי, ו- DEMON (R&I-2018-007A), מענק Go2Market, כולם ממומנים על ידי XjenzaMalta עבור ובשם הקרן למדע וטכנולוגיה. איור 1 נוצר באמצעות BioRender.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל | Starlab | E1415-1510 | |
| 10 ומיקרו; מיקרופיפטה L (P10) | גילסון | F144802 | |
| 10/20 ומיקרו; קצות פיפטה L | Starlab | S1110-3810 | |
| 1000 ומיקרו; מיקרופיפטה L (P1000) | גילסון | F123602 | |
| 1000 ומיקרו; קצות פיפטה L | Starlab | S1111-6001 | |
| צלחת 12 בארות | Starlab | CC7672-7512 | סטרילי, עטוף יחיד, לא מטופל, עם מכסה |
| 20 ומיקרו; מיקרופיפטה L (P20) | גילסון | F123600 | |
| 200 ומיקרו; מיקרופיפטה L (P200) | גילסון | F123601 | |
| 200 ומיקרו; L פיפטה רב ערוצית | גילסון | F81024 | |
| 200 ומיקרו; קצות פיפטה | L Starlab | S1113-1006 | |
| צלחת 96 בארות | Starlab | CC7672-7596 | סטרילי, עטוף יחיד, תחתית שטוחה, לא מטופל, עם מכסה |
| מיכלי גידול עם תחתית משופעת ברשת פנימית, מחיצות מיכל ומכסים | Tecniplast | ZB17BTISLOP, ZB17BTE, ZB17BTL, ZB17BTD | מיכל פנימי משופע |
| מסננת רשת | / | / | |
| כפפות ניטריל | Mercator | / | / |
| Petri-dish | Starlab | CC7672-3394/CC7672-3359 | 100 x 20 מ"מ או 60 x 15 מ"מ |
| Leica M205 FCA מיקרוסקופ סטריאו פלואורסצנטי | Leica | 10450826 | |
| אינקובטור מקורר פלטייר כולל 2 מדפים עם מודול אור לבן קר | Memmert | IPP110ecoplus, T8 | מצויד במחזור |
| דימתיל סולפוקסיד | ביוכימיה כימופארמה | 504341000 | להכנת תמיסה של 1% ב-E3 |
| סידן כלוריד דיהידרט | ביוכימיה כימופארמה | 303080500 | להכנת E3 |
| מגנזיום גופרתי הפטהידרט | ביוכימיה כימופארמה | 313060500 | להכנת E3 |
| אשלגן כלורי | ביוכימיה כימופארמה | 316030500 | להכנת E3 |
| SCREEN-WELL ספריית Wnt Pathway (Bosutinib) | Enzo | BML-2838-0500 | |
| נתרן כלורי | פישר סיינטיפיק | S/3161/53 | להכנת E3 |
מקורות
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
- Teame, T., et al. The use of zebrafish (Danio rerio) as biomedical models. Anim Front. 9 (3), 68-77 (2019).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Patton, E. E., Zon, L. I., Langenau, D. M. Zebrafish disease models in drug discovery: From preclinical modelling to clinical trials. Nat Rev Drug Discov. 20 (8), 611-628 (2021).
- Clift, D., Richendrfer, H., Thorn, R. J., Colwill, R. M., Creton, R. High-throughput analysis of behavior in zebrafish larvae: Effects of feeding. Zebrafish. 11 (5), 455-461 (2014).
- Keenan, S. R., Currie, P. D. The developmental phases of zebrafish myogenesis. J Dev Biol. 7 (2), 12(2019).
- Tonelli, F., et al. Zebrafish: A resourceful vertebrate model to investigate skeletal disorders. Front Endocrinol (Lausanne). 11, 489(2020).
- OECD. Test no. 236: Fish embryo acute toxicity (FET). , (2013).
- Chen, J. R., Lai, Y. H., Tsai, J. J., Hsiao, C. D. Live fluorescent staining platform for drug-screening and mechanism-analysis in zebrafish for bone mineralization. Molecules. 22 (12), 2068(2017).
- He, H., Wang, C., Tang, Q., Yang, F., Xu, Y. Possible mechanisms of prednisolone-induced osteoporosis in zebrafish larva. Biomed Pharmacother. 101, 981-987 (2018).
- Huang, H. X., et al. Application of bone transgenic zebrafish in anti-osteoporosis chemical screening. Animal Model Exp Med. 1 (1), 53-61 (2018).
- Haney, M. G., Moore, L. H., Blackburn, J. S. Drug screening of primary patient derived tumor xenografts in zebrafish. J Vis Exp. (158), e60996(2020).
- Nishimura, Y., et al. Using zebrafish in systems toxicology for developmental toxicity testing. Congenit Anom (Kyoto). 56 (1), 18-27 (2016).
- Hayot, G., et al. Evaluating toxicity of chemicals using a zebrafish vibration startle response screening system. J Vis Exp. (203), e66153(2024).
- Hoyberghs, J., et al. DMSO concentrations up to 1% are safe to be used in the zebrafish embryo developmental toxicity assay. Front Toxicol. 3, 804033(2021).
- Lipton, J. H., Brümmendorf, T. H., Sweet, K., Apperley, J. F., Cortes, J. E. Practical considerations in the management of patients treated with bosutinib for chronic myeloid leukemia. Ann Hematol. 103 (9), 3429-3442 (2024).
הדפסות חוזרות והרשאות
בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה
בקש הרשאה