מאמר שיטה

בידוד ואפיון של נויטרופילים בצפיפות נמוכה ונורמלית מדם מלא

DOI:

10.3791/67805

⸱

7 בפברואר 2025

 ,  , 
1TB Immunology Group, Department of Clinical Medicine, Trinity Translational Medicine Institute, St James's Hospital, Trinity College Dublin, The University of Dublin

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מספקים גישה אמינה לבידוד נויטרופילים בצפיפות נמוכה ונורמלית מדם מלא באמצעות בידוד מגנטי (ברירה שלילית) ומדיום שיפוע צפיפות לא רציף. הוא מבטיח בידוד ללא נגיעה של תאים בעלי טוהר גבוה (≥93%), מה שמקל על ניתוח מדויק במורד הזרם של תת-אוכלוסיות נויטרופילים, חיוני להבנת תפקידיהם בבריאות ובמחלות.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקרים חדשים מראים כי אוכלוסיית הנויטרופילים המסתובבת בבני אדם מורכבת מתת-סוגים מגוונים ואין לחקור אותה כאוכלוסייה אחת, כפי שנעשה בעבר. בפרט, הוכח כי לנויטרופילים בצפיפות נמוכה ובצפיפות נורמלית (LDNs, NDNs) יש פרופילים מובחנים מבחינה תפקודית ומטבולית, גורם שיש לקחת בחשבון בעת פרסום מחקר נויטרופילים. כאן, אנו מציגים שיטה שונה לבידוד והפרדה ללא נגיעה של LDNs ו-NDNs מדם מלא.

מדיום שיפוע הצפיפות (1.135 גרם/מ"ל) משולב ב-9:10 עם 10x PBS. שיפועי צפיפות ספציפית של 55%, 70% ו-81% נעשים לאחר מכן על ידי שילוב של מדיום שיפוע צפיפות של 100% עם תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS). נויטרופילים שבודדו מ-12 מ"ל של דם מלא היקפי שהתקבלו מתורמים בהסכמה באמצעות ערכת בידוד מגנטי מבוססת ברירה שלילית מושעים מחדש בחלק של 55%. נפח של 3 מ"ל של שברים של 81% ו-70% מרובד לתוך צינור של 15 מ"ל, ואחריו חלק של 55% המכיל את סך הנויטרופילים. לאחר מכן שיפועי הצפיפות עוברים צנטריפוגה ב-720 x גרם למשך 30 דקות. שני פסים נפרדים מתקבלים בממשק 55%/70% (LDN) ובממשק 70%/81% (NDN). התאים מוזרמים בזהירות לצינורות נפרדים ונשטפים באמצעות PBS. טוהר השברים המבודדים נקבע באמצעות ציטומטריית זרימה. גם LDNs וגם NDNs הוגדרו כ-CD14lo CD15+ SSChi על ידי ציטומטריית זרימה. טוהר הבידוד חושב ב-≥93% מהתאים ברי הקיימא עבור שני הסוגים.

שיטה זו מספקת גישה אמינה ויעילה להפרדת LDN ו-NDNs מדם היקפי, ומבטיחה טוהר וכדאיות גבוהים של התאים המבודדים. שיפור הדיוק של בידוד נויטרופילים מאפשר ניתוחים מדויקים יותר במורד הזרם של תת-אוכלוסיות נויטרופילים מובהקות אלה. אלה קריטיים לקידום הבנתנו את ההטרוגניות של נויטרופילים והשלכותיה בהקשרים פיזיולוגיים ופתולוגיים שונים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

נויטרופילים הם תאים חיסוניים גרגירים והלויקוציטים הנפוצים ביותר בדם היקפי, ומהווים כ-50%-70% מהלויקוציטים בממוצע. הם מתפתחים במח העצם ממבשרי גרנולוציטים-מונוציטים (GMPs), אשר בתורם מתפתחים מתאי אב המטופויאטיים (HPCs) בנוכחות גורם מגרה מושבת גרנולוציטים (G-CSF). בהומאוסטזיס, יש להם תוחלת חיים של ~24 שעות, אך מחקרים הראו שניתן להאריך את תוחלת החיים שלהם בתנאים פיזיולוגיים ספציפיים ובמיקרו-סביבות הקשורות אליהם כגון הפעלה חיסונית כרונית1, דלקת1 ואפילו שהות רקמות במצב יציב2. נויטרופילים נחשבים זה מכבר לקו ההגנה הראשון נגד פתוגנים ומעוררים את ההשפעות האנטי-מיקרוביאליות שלהם באמצעות 3 פונקציות אפקטור עיקריות - דה-גרנולציה, פגוציטוזיס והפעלה ושחרור של מלכודת נויטרופילים חוץ-תאית (NET) (NETosis).

רוב המחקרים על תפקוד הנויטרופילים והביולוגיה בוחנים את התוצאות עבור אוכלוסיית הנויטרופילים הכוללת. עם זאת, ממחקרים במסגרות סרטן התוחמים תת-סוגים של N1 (אנטי-גידול) / N2 (פרו-גידול) לסיווג הנויטרופילים על סמך בגרות, מחלה ומצב פיזיולוגי, ואפילו צפיפות תאית (נויטרופילים בצפיפות נמוכה וצפיפות נורמלית), התברר יותר ויותר שאוכלוסיית הנויטרופילים האנושית מהווה תת-סוגים מגוונים פנוטיפיים. בין אם ניתן לייחס את קיומם של תת-סוגים אלה של נויטרופילים להיותם סוגי תאים נפרדים לחלוטין או בשל האופי המורכב של הפלסטיות, קיים גוף הולך וגדל של ספרות על נויטרופילים לא טיפוסיים ומציג הזדמנות משכנעת לחקור נויטרופילים בצפיפות נמוכה הנפרדים מניטרופילים בצפיפות נורמלית3.

תוארו לראשונה בחולי זאבת כתת-קבוצה4 של נויטרופילים פרו-דלקתיים, LDNs זוהו מאז במחלות כרוניות, בהריון, ואפילו במחזור דם בריא, ביכולות פרו-דלקתיות כמו גם ביכולות דיכוי 5,6,7,8. LDNs נמצאים במקביל לתאים חד-גרעיניים בדם היקפי (PBMCs) כאשר דם מלא עובר צנטריפוגה על פני מדיה שיפוע צפיפות. הצפיפות הסגולית שלהם תואמת לכ-1.077 גרם/מ"ל, בהשוואה ל-NDNs ב-1.083 גרם/מ"ל9. בעוד שעדיין יש ויכוח ניכר בנושא, קיימת השערה כי LDNs דומים לפנוטיפ גרנולוציטים לא בשל יותר (בדומה לפרומילוציטים ומיאלוציטים, עם צפיפות מתחת ל-1.080 גרם/מ"ל)9,10. אחרים עדיין משערים כי ישנם פנוטיפים בוגרים ולא בשלים של LDN בהתאם לנוכחות או היעדר מחלה 11,12,13. עם זאת, LDNs זוהו גם אצל אנשים בריאים; עם זאת, הכללתם בחלק מהמחקרים מוגבלת בשל הקושי לבודד אותם במספרים מספיקים5.

מחקר זה נועד לבודד את שתי האוכלוסיות הללו בכמויות שיאפשרו לנו לבצע ניסויים מטבוליים במורד הזרם באתרם (מינימום 0.5 × 106 תאים/מ"ל). בכך, פרוטוקולקיים 5 עבר אופטימיזציה עם סמנים פנוטיפיים מדווחים בדרך כלל13,14 המספקים את התוצאה הטובה ביותר לבידוד ואפיון LDNs ו-NDNs מדם מלא (איור 1A).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דגימות דם נאספו בהסכמה מדעת של משתתפים בריאים. המחקר קיבל אישור מוועדת האתיקה של המחקר הן של בית החולים סנט ג'יימס והן של בית החולים האוניברסיטאי טלאגט.

1. הכנת מדיום שיפוע צפיפות, שברים של פתרונות עבודה איזוטוניים ומאגר הפרדת תאים

  1. הכנת פתרונות עבודה איזוטוניים ממדיום שיפוע צפיפות
    1. הכנת תמיסת עבודה איזוטונית 100% (~1.123 גרם/מ"ל)
      1. כדי להכין את תמיסת העבודה האיזוטונית של 100%, שלב 27 מ"ל של מדיום שיפוע צפיפות עם 3 מ"ל של 10x PBS. התוצאה היא תמיסה איזוטונית המתאימה לדילולים נוספים.
    2. הכנת תמיסת עבודה איזוטונית 81% (~1.0996 גרם/מ"ל)
      1. הכן את תמיסת העבודה האיזוטונית של 81% על ידי ערבוב של 8.1 מ"ל של תמיסת העבודה האיזוטונית 100% (שהוכנה בשלב 1.1.1) עם 1.9 מ"ל של 1x PBS. מערבבים היטב כדי להבטיח הומוגניות.
    3. הכנת תמיסת עבודה איזוטונית 70% (~1.0861 גרם/מ"ל)
      1. להכנת תמיסת העבודה האיזוטונית של 70%, שלב 7 מ"ל של תמיסת העבודה האיזוטונית 100% עם 3 מ"ל של 1x PBS. ודא שהתמיסה מעורבבת היטב.
    4. הכנת תמיסת עבודה איזוטונית 55% (1.0676 גרם/מ"ל)
      1. צור את תמיסת העבודה האיזוטונית של 55% על ידי ערבוב של 5.5 מ"ל של תמיסת העבודה האיזוטונית 100% עם 4.5 מ"ל של 1x PBS. מערבבים היטב.
  2. שכבות של שברי מעבר צבע
    1. שכבות שבר מעבר צבע
      1. בעזרת צינור חרוטי של 15 מ"ל, שכבה בזהירות של 3 מ"ל מתמיסת העבודה האיזוטונית של 81% בתחתית. לאחר מכן, שכבה איטית ועדינה של 3 מ"ל מתמיסת העבודה האיזוטונית של 70% מעל, הימנעות מערבוב השכבות. שיפוע זה ישמש להפרדת תאים.
  3. הכנת מאגר הפרדת תאים
    1. הכנת 500 מ"ל של מאגר הפרדת תאים
      1. כדי להכין את מאגר הפרדת התאים, שלב 2% סרום בקר עוברי (FBS) וחומצה אתילנדיאמינטטראצטית של 1 מ"מ (EDTA) עם 1x PBS לנפח כולל של 500 מ"ל. השתמש במאגר זה כדי לשטוף ולהשעות תאים במהלך תהליך הבידוד.
        הערה: ודא שהשכבות מופרדות היטב וללא הפרעה. בפרוטוקול זה, פתרונות העבודה האיזוטוניים מכונים "100%", "81%", "70%" ו-"55%" בהתבסס על שיטת ההכנה, בהתאם למחקרים קודמים5. עם זאת, חשוב להבהיר כי תוויות אלו אינן מייצגות את הריכוזים הסופיים בפועל של פתרונות העבודה. לדוגמה, מדיום שיפוע הצפיפות "100%" מוכן על ידי ערבוב של 27 מ"ל של מדיום שיפוע בצפיפות טהורה עם 3 מ"ל של 10x PBS, וכתוצאה מכך ריכוז סופי של 90% תמיסת עבודה איזוטונית. הדילולים הבאים (למשל, "81%", "70%" ו-"55%") משקפים באופן דומה את יחסי ההכנה ולא את ריכוזי האחוזים האמיתיים. מינוח זה נשמר כדי לשמור על עקביות עם הטרמינולוגיה ששימשה בספרות מוקדמת יותר בנושא.

2. בידוד נויטרופילים מדם מלא באמצעות ברירה שלילית

  1. הכנת חרוזים מגנטיים
    1. מערבול את החרוזים המגנטיים ביסודיות במשך 30 שניות כדי להבטיח שהם מושעים במלואם לפני השימוש.
  2. הכנת דם
    1. עבור כל תורם, יש להקצות 4 מ"ל של דם מלא לשלושה צינורות נפרדים עם תחתית עגולה של 14 מ"ל.
  3. תוספת קוקטייל בידוד נויטרופילים וחרוזים מגנטיים
    1. הוסף 50 מיקרוליטר קוקטייל בידוד נויטרופילים ו -50 מיקרוליטר חרוזים מגנטיים לכל מ"ל דם לכל צינור. עבור 4 מ"ל דם, הוסף 200 מיקרוליטר מכל מגיב.
    2. השעו את התערובת היטב על ידי פיפטינג בעדינות ודגירה בטמפרטורת החדר (RT) למשך 5 דקות כדי לאפשר לריאגנטים להיקשר לתאים לא רצויים.
  4. כביסה והפרדה מגנטית - סיבוב ראשון
    1. מלאו כל צינור ל-12 מ"ל באמצעות מאגר הפרדת תאים וערבבו היטב.
    2. הנח את הצינורות ללא מכסים על מגנט ותן להם לדגור ב-RT למשך 10 דקות כדי לאפשר לחרוזים המגנטיים הקשורים לתאים לא רצויים להימשך לדופן הצינור.
  5. אוסף תאים לא מאוגדים
    1. העבירו בזהירות את תרחיף התאים השקוף המכיל נויטרופילים מכל צינור לתוך צינור חדש ונקי באמצעות פיפטת העברה. הסר את הצינור המקורי מהמגנט.
  6. יישום חוזר ודגירה של חרוזים מגנטיים - סיבוב שני
    1. מערבולת את החרוזים המגנטיים שוב למשך 30 שניות. הוסף את אותו נפח של חרוזים מגנטיים לתרחיף התא החדש שהועבר כמו בשלב 2.3. השעו ביסודיות ודגרו ב-RT למשך 5 דקות נוספות.
  7. הפרדה ואיסוף מגנטי סופי
    1. הנח את הצינורות בחזרה על המגנט ללא מכסים ודגר ב-RT למשך 10 דקות נוספות.
    2. העבירו בזהירות את מתלה התאים השקופים לצינור חדש. תרחיף סופי זה מייצג את אוכלוסיית הנויטרופילים המבודדת.

3. הפרדה של נויטרופילים בצפיפות נמוכה (LDNs) ונויטרופילים בצפיפות נורמלית (NDNs) מכלל אוכלוסיית הנויטרופילים

  1. איגום והכנת תרחיפי תאים
    1. עבור כל תורם, אסוף את תרחיפי הנויטרופילים המבודדים לצינורות של 50 מ"ל. מלאו כל צינור לנפח כולל של 50 מ"ל באמצעות מאגר הפרדת התאים.
  2. צנטריפוגה
    1. צנטריפוגה את הצינורות ב-400 x g למשך 5 דקות ב-RT כשהבלמים פועלים.
  3. השעיה וספירת תאים
    1. השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את כדור הנויטרופילים ב-1 מ"ל של מאגר הפרדת תאים. בצע ספירת תאים כדי לקבוע את המספר הכולל של נויטרופילים.
  4. הכנת מדיום שיפוע צפיפות
    1. צנטריפוגה את הצינורות שוב ב-400 x g למשך 5 דקות ב-RT עם הבלם. השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את כדור הנויטרופילים ב-3 מ"ל של מדיום שיפוע הצפיפות של 55%. לרזולוציה אופטימלית, השתמש ב-3 מ"ל של מדיום שיפוע צפיפות של 55% לכל 5-6 ×-106 נויטרופילים בסך הכל.
    2. במידת הצורך, חלקו את התאים התלויים על פני מספר צינורות שיפוע צפיפות שהוכנו מראש, וודא ש-3 מ"ל של תרחיף התא יהיו בשכבות בכל צינור.
  5. שכבות על צינורות שיפוע צפיפות
    1. שכב לאט את תרחיף התאים של 3 מ"ל המכיל את מדיום שיפוע הצפיפות של 55% על צינורות שיפוע הצפיפות שהוכנו מראש (מוכנים כמתואר בסעיף 1). הקפידו על שכבות זהירות כדי למנוע הפרעה לשיפוע.
  6. צנטריפוגה של שיפוע צפיפות
    1. צנטריפוגה את הצינורות ב-720 x גרם למשך 30 דקות ללא שימוש בבלם. לאחר הצנטריפוגה, יש לטפל בצינורות בזהירות כדי למנוע הפרעה לשכבות.
  7. בידוד שברי נויטרופילים
    1. לאחר הצנטריפוגה, התבוננו בנויטרופילים נפרדים לשתי שכבות נפרדות:
      נויטרופילים בצפיפות נמוכה (LDNs) ימוקמו בממשק של 55%/70%, ויצרו פס עליון בערך בסימן של 3 מ"ל, ונויטרופילים בצפיפות נורמלית (NDNs) יהיו בממשק של 70%/81%, ויופיעו כרצועה תחתונה סביב סימן 6 מ"ל.
    2. בעזרת פיפטת העברה, בודדו בזהירות כל שכבה והעבירו אותם לצינורות נפרדים של 15 מ"ל.
  8. שטיפת שברים מבודדים
    1. כדי לשטוף כל מדיום שיפוע בצפיפות שיורית, הוסף 1x PBS לכל צינור של 15 מ"ל עד לסימון 15 מ"ל.
    2. צנטריפוגה ב-400 × גרם למשך 5 דקות ב-RT עם הבלם. אם התאים אינם יוצרים גלולה יציבה ובמקום זאת נשארים תלויים, חזור על שלב כביסה זה, המציין נוכחות של מדיום שיפוע צפיפות שנותר.
  9. ספירת תאים ויישומים במורד הזרם
    1. ספרו את התאים בכל שבר והמשיכו ביישומים במורד הזרם כגון ניסויים מטבוליים, צביעת זרימה ציטומטרית, מיצוי RNA או ליזיס חלבון לפי הצורך.
      הערה: לאחר ציפוי התאים החוצה, מומלץ לסובב את הצלחת ב-210 × גרם למשך דקה אחת (כיבוי הבלם).

4. פנוטיפ של LDN ו-NDN מבודדים

  1. בודד ~0.5-1 × 106 LDNs ו-NDNs. צור תערובת נוגדנים מרוכזת פי 2 באמצעות CD14, CD86, CD15, CD16, CD10, בלוק Fc וכתם כדאיות.
  2. צבעו את אוכלוסיות ה-LDN וה-NDN המבודדות בנפח שווה ערך של תערובת הנוגדנים כך שהדילול הסופי של הנוגדנים המכתימים את התאים הוא 1:100 (CD14, CD86, CD15, CD16, CD10, בלוק Fc) ו-1:50 (כתם כדאיות), בהתאמה.
  3. דגרו על התאים למשך 10 דקות בחושך ב-RT.
    הערה: ודא שהתאים מעורבבים היטב עם תערובת הנוגדנים ובלוק ה-Fc.
  4. שוטפים את התאים פעם אחת עם PBS, ואז צנטריפוגה בחום של 400 × גרם למשך 5 דקות. השליכו את הסופרנטנט.
  5. תקן את התאים ב-1% פרפורמלדהיד (PFA) למשך 15 דקות ב-RT בחושך.
  6. שוטפים שוב את התאים עם PBS, צנטריפוגה בחום של 400 × גרם למשך 5 דקות, וזורקים את הסופרנטנט.
  7. השעו מחדש את התאים ב -200 מיקרוליטר של PBS או לפי הצורך לשימוש ורכשו את התאים על ציטומטר זרימה בהקדם האפשרי.
    הערה: ניתן לאחסן את התאים המוכתמים והקבועים לטווח קצר בטמפרטורה של 4 ◦C בחושך כדי למנוע הלבנת פוטו של הפלואורופורים. עם זאת, באופן אידיאלי, הליך הפנוטיפ צריך להתבצע מיד לאחר הצביעה והקיבוע כדי להבטיח כדאיות תאים אופטימלית ותוצאות מדויקות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ניתן לראות את השכבות המוצלחות, של הנויטרופילים הכוללים על תווך שיפוע הצפיפות, באיור 1B. יש להשיג שתי רצועות נפרדות. אם מתרחש ערבוב של השיפועים, או אם מספר הנויטרופילים הכולל בשכבות לכל שפופרת גבוה (גדול מ-5-6 ×-106), הרצועות ייראו מפוזרות (איור 1C), והסיכון לערבוב שני תת-הסוגים של הנויטרופילים גדל באופן משמעותי. כדי להימנע מהאחרון, אנו ממליצים להניח שכבות של עד 5-6 ×10-6 נויטרופילים בסך הכל לכל שפופרת עם שיפוע צפיפות. למרות דיווחים על LDNs ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מציגים שיטה אופטימלית לפיצול אוכלוסיית הנויטרופילים הכוללת לנויטרופילים בצפיפות נמוכה ובצפיפות נורמלית, יחד עם אפיון פנוטיפי של כל סוג תא באמצעות ציטומטריית זרימה המותאמת משיטות קודמות5.

פרוטוקול זה מבוסס על בידוד של LDNs ו-NDNs מדם מלא. שלב מכריע הוא שסך הנויטרופילים מבודדים באמצעות שיטות ברירה שליליות. שיטות ברירה חיובית כוללות שימוש בנוגדנים הנקשרים לסמני פני השטח, מה שעלול להפעיל את הנויטרופילים ולעורר דה-גרנולציה

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין גילוי נאות.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו מומנה על ידי מועצת מחקר הבריאות EIA-2024-002 וקרן בית החולים המלכותית של דבלין. אנו רוצים להודות לד"ר לוריין תונג ולד"ר קווין בראון על סיועם באיסוף דגימות מתורמים בריאים עבור כתב היד הזה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
14 מ"ל פוליפרופילן צינור תחתון עגול (17 x 100 מ"מ)קורנינג מדע352059
APC אנטי אנושי CD14 (63D3)BioLegend367118
Brilliant Violet 421 אנטי אנושי CD10 (25 בדיקות)BioLegend312217
Dulbecco's Phosphate-Buffer-BufferedSagmaD8537-1L
EasyEights EasySep מגנטStemCell Technologies#18103
EasySep Buffer (מאגר הפרדת תאים)StemCell Technologies#20144
EasySep Direct Human NeutrophilIsolation Kit StemCell Technologies#19666
FcR Blocking Reagent, HumanMiltenyi Biotec130-059-901
FITC Anti-Human CD16 (3G8)BioLegend302005
OneComp eBeads פיצוי חרוזיםeBioscience Inc.01-1111-42
PE/Cy7 אנטי-אנושי CD86 (BU63)BioLegend374209
PE/Dazzle 594 אנטי-אנושי CD15 (SSEA-1)BioLegend323037
טבליות מלח עם פוספט Gibco18912-014
ערכת כדאיות ניתנת לתיקון זומבי NIRBioLegend423105

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tracchi, I., et al. Increased neutrophil lifespan in patients with congestive heart failure. Eur J Heart Fail. 11 (4), 378-385 (2009).
  2. Ballesteros, I., et al. Co-option of neutrophil fates by tissue environments. Cell. 183 (5), 1282-1297.e18 (2020).
  3. Mckenna, E., et al. Neutrophils: Need for standardized nomenclature. Front Immunol. 12, 602963(2021).
  4. Hacbarth, E., Kajdacsy-Balla, A. Low density neutrophils in patients with systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, and acute rheumatic fever. Arthritis Rheumatol. 29 (11), 1334-1342 (1986).
  5. Hardisty, G. R., et al. High purity isolation of low density neutrophils casts doubt on their exceptionality in health and disease. Front Immunol. 12, 625922(2021).
  6. Scapini, P., Marini, O., Tecchio, C., Cassatella, M. A. Human neutrophils in the saga of cellular heterogeneity: Insights and open questions. Immunol Rev. 273 (1), 48-60 (2016).
  7. Ssemaganda, A., et al. Characterization of neutrophil subsets in healthy human pregnancies. PLoS One. 9 (2), e85696(2014).
  8. Tay, S. H., Celhar, T., Fairhurst, A. M. Low-density neutrophils in systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheumatol. 72 (10), 1587-1595 (2020).
  9. Hassani, M., et al. On the origin of low-density neutrophils. J Leukoc Biol. 107 (5), 809-818 (2020).
  10. Cowland, J. B., Borregaard, N. Isolation of neutrophil precursors from bone marrow for biochemical and transcriptional analysis. J Immunol Methods. 232 (1-2), 191-200 (1999).
  11. Blanco-Camarillo, C., Aleman, O. R., Rosales, C. Low-density neutrophils in healthy individuals display a mature primed phenotype. Front Immunol. 12, 672520(2021).
  12. Park, J., et al. Low-density granulocytes display immature cells with enhanced NET formation in people living with HIV. Sci Rep. 13 (1), 13282(2023).
  13. Denny, M. F., et al. A distinct subset of proinflammatory neutrophils isolated from patients with systemic lupus erythematosus induces vascular damage and synthesizes type I IFNs. J Immunol. 184 (6), 3284-3297 (2010).
  14. Ui Mhaonaigh, A., et al. Low density granulocytes in anca vasculitis are heterogenous and hypo-responsive to anti-myeloperoxidase antibodies. Front Immunol. 10, 2603(2019).
  15. Mosca, T., Forte, W. C. Comparative efficiency and impact on the activity of blood neutrophils isolated by Percoll, Ficoll and spontaneous sedimentation methods. Immunol Invest. 45 (1), 29-37 (2016).
  16. Ren, Y., et al. Increased apoptotic neutrophils and macrophages and impaired macrophage phagocytic clearance of apoptotic neutrophils in systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheum. 48 (10), 2888-2897 (2003).
  17. Connelly, A. N., et al. Optimization of methods for the accurate characterization of whole blood neutrophils. Sci Rep. 12 (1), 3667(2022).
  18. Carmona-Rivera, C., Kaplan, M. J. Low-density granulocytes in systemic autoimmunity and autoinflammation. Immunol Rev. 314 (1), 313-325 (2023).
  19. Yennemadi, A. S., Keane, J., Leisching, G. Mitochondrial bioenergetic changes in systemic lupus erythematosus immune cell subsets: Contributions to pathogenesis and clinical applications. Lupus. 32 (5), 603-611 (2023).
  20. Futoh, Y., et al. Peripheral low-density granulocytes after colorectal cancer surgery in predicting recurrence. BJS Open. 7 (1), zrac154(2023).
  21. Dwivedi, A., et al. Emergence of dysfunctional neutrophils with a defect in arginase-1 release in severe COVID-19. JCI Insight. 9 (17), e171659(2024).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים