מאמר שיטה

בידוד ותרבות של אדיפוציטים עכבריים ראשוניים מעכברים רזים והשמנים

4K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/67846

⸱

24 בינואר 2025

 ,  , 
1Department of Biochemistry, University of Utah School of Medicine

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

הגודל והשבריריות של אדיפוציטים בוגרים הגבילו את הטכניקות והכלים הזמינים למחקר ולבידוד שלהם. כאן, מתואר פרוטוקול לבידוד של אדיפוציטים עכברים בוגרים, שניתן להתאים בקלות למחסני שומן שונים ולדיאטות עכברים.

תקציר

רקמת השומן מורכבת בעיקר מאדיפוציטים בוגרים ועמוסים בשומנים בנפח. לתאים הפוסט-מיטוטיים הללו יש תפקיד חיוני באגירת אנרגיה וניוד, בוויסות חום ובהפרשת גורמים אנדוקריניים. התרחבות רקמת השומן הלבנה עקב חוסר איזון קלורי מביאה הן להגדלה של אדיפוציטים קיימים והן ליצירת אדיפוציטים נוספים מתאי אב אדיפוציטים. שינויים מונעי השמנת יתר ברקמת השומן הלבנה, כולל אלה המשפיעים על אדיפוציטים, קשורים למחלות נלוות רבות, כגון סוכרת מסוג 2 ו-13 סוגי סרטן. מחסום משמעותי לחקר האופן שבו אדיפוציטים תורמים למחלות הוא חוסר היכולת לבודד בקלות ולתרבית אדיפוציטים בוגרים. מאמר זה מתאר פרוטוקול לבידוד אדיפוציטים רזים והשמנים של עכברים ממאגרי השומן התת-עורי והקרביים של עכברי C57BL/6 זכרים ונקבות. הפרוטוקול מפרט כיצד ניתן לתרבית אדיפוציטים ראשוניים מבודדים במערכת צבירת אדיפוציטים ממברנה למשך עד שבועיים, מה שמקל על הניתוח התפקודי שלהם בניסויי תרבית משותפת, מבחני ליפוליזה, או באמצעות איסוף מדיה מותנית המכילה גורמים המופרשים על ידי אדיפוציטים. בנוסף, הפרוטוקול מתאר שיטות לתרבית אקספלנטים של רקמת שומן בכיפות מטריצת קרום הבסיס והדמיית אדיפוציטים מבודדים ראשוניים. חשוב לציין, ניתן לשלב גישה זו עם פרוטוקולים קיימים לבידוד תאי אב אדיפוציטים השוכנים ברקמת השומן באמצעות מיון תאים מופעל פלואורסצנטי (FACS). יחד, פרוטוקולים אלה מספקים לחוקרים כלים לחקור פונקציונלית אדיפוציטים, תאי אב אדיפוציטים ורקמת שומן שלמה מעכברים רזים והשמנים, זכרים ונקבות.

מבוא

צפוי כי השכיחות של השמנת יתר בקרב מבוגרים בארצות הברית תגיע ל-50% עד שנת 20301, מה שמחייב להבין טוב יותר את ההשפעות התאיות והפיזיולוגיות של השמנת יתר. השמנת יתר מאופיינת בחוסר איזון קלורי וכתוצאה מכך התרחבות רקמת השומן הלבנה עקב אחסון מוגבר של אנרגיה כשומן. התרחבות רקמת השומן יכולה להתרחש הן באמצעות יצירת אדיפוציטים חדשים (היפרפלזיה) והן באמצעות עלייה בגודל האדיפוציטים הקיימים (היפרטרופיה). למרות ששני התהליכים מביאים להתרחבות רקמת השומן, התרחבות היפרטרופית עולה בקנה אחד עם בריאות מטבולית מופחתת ושכיחות גבוהה יותר של הפרעות מטבוליות 2,3. הבנה טובה יותר של המורכבות של רקמת השומן תספק תובנה לגבי המנגנונים המולקולריים המווסתים הפרעות מטבוליות ומחלות נלוות אחרות הקשורות להשמנה, כולל סוכרת מסוג 2 וסרטן.

רקמת השומן זכתה זה מכבר להערכה על תפקידה באחסון אנרגיה וויסות חום. עם זאת, לאחרונה, רקמת השומן התגלתה כרקמת איתות מטבולית חשובה, האחראית על הפרשת מטבוליטים, שומנים ופפטידים 4,5. מולקולות אלה שמקורן ברקמת השומן, הנקראות אדיפוקין, מאותתות באופן מקומי ומערכתי ויכולות לווסת הומאוסטזיס אנרגטי, תפקוד חיסוני, דינמיקה של כלי דם ועוד 5,6,7. אדיפוציטים בוגרים מהווים כ-50% מהתאים ברקמת השומן ומייצגים את הרוב הגדול של נפח רקמת השומן8. חשוב לציין, מחקרים מצאו כי אדיפוציטים מורכבים מתת-אוכלוסיות רבות 9,10. ככזה, תאי אב אדיפוציטים מייצרים אוכלוסיות נפרדות של אדיפוציטים בוגרים על סמך גורמים כמו מין ומצבור רקמות שומן. ניתן לווסת עוד יותר את האדיפוציטים הבוגרים הללו על ידי שינויים בתזונה והשמנת יתר, וליצור תת-אוכלוסיות של אדיפוציטים הנבדלים זה מזה מבחינת שעתוק ומבטאים חתימות פרקריניות שונות 9,11,12,13,14,15,16 . למרות מורכבותם וחשיבותם הפיזיולוגית, היכולת לבודד ולתרבית אדיפוציטים בוגרים נותרה מחסום מובהק לחקר תאים אלה.

השיטות הזמינות כיום המשמשות לבידוד אדיפוציטים בוגרים משתמשות בהתמיינות מתאי אב אדיפוציטים (APCs), מיון תאים מופעלים פלואורסצנטיים וטכניקות מבוססות צנטריפוגה, אם כי לכל אלה יש חסרונות משלהם. התמיינות במבחנה או ex vivo של APCs לאדיפוציטים בוגרים נמצאת בשימוש נרחב לפיתוח אדיפוציטים בוגרים. עם זאת, תאים מובחנים מלאכותיים אלה הם רב-לוקולריים, המכילים טיפות שומן קטנות רבות, ולא את הפנוטיפ החד-לוקולרי של אדיפוציטים בוגרים in vivo, המכילים טיפת שומן אחת גדולה17. יתר על כן, מחקרים מצאו כי תאים מובחנים במבחנה נבדלים מבחינת שעתוק מאדיפוציטים בוגרים מבודדים הנמצאים ב-vivo17. חשוב לציין, התמיינות במבחנה אינה מסוגלת ללכוד את ההבדל בין אדיפוציטים רזים להשמנת יתר. מיון תאים המופעל פלואורסצנטי (FACS) משמש בדרך כלל לבידוד אוכלוסיות תאים ספציפיות מרקמה; עם זאת, אדיפוציטים בוגרים יכולים להתפוצץ בקלות בתנאי FACS בשל גודלם הגדול והממברנות השבריריות שלהם, מה שהופך אותה לשיטה לא יעילה לבידוד אדיפוציטים בוגרים. פרוטוקולים קיימים אחרים מביאים להצטברות של כמויות גדולות של שומנים חופשיים, שעלולים להיות רעילים לאדיפוציטים בוגרים בתרבית לאורך זמן.

כאן, אנו מתארים פרוטוקול לבידוד של אדיפוציטים בוגרים של עכברים מרקמת שומן לבנה. פרוטוקול זה הותאם מהפרוטוקול לתרביות אגרגט אדיפוציטים בוגרות שנקבעו במקור על ידי Harms et al.17; עם זאת, הגישה המבוססת על צנטריפוגה המתוארת כאן משתמשת בציוד מעבדה נפוץ ומסוגלת לבודד ביעילות אדיפוציטים מכמויות קטנות (~0.5 גרם) של רקמת שומן. זוהי מערכת הניתנת להתאמה בקלות, וכלולים בה שינויים לבידוד אדיפוציטים עכבריים בוגרים מעכברים זכרים ונקבות, מחסני שומן קרביים ותת עוריים ותנאי תזונה שונים.

פרוטוקול

כל הניסויים בבעלי חיים שתוארו אושרו על ידי הוועדה לשימוש וטיפול בבעלי חיים של אוניברסיטת יוטה. פרוטוקול זה עבר אופטימיזציה לבידוד של אדיפוציטים בוגרים מעכברים זכרים ונקבות C57BL/6 בגילאי 8-16 שבועות, עם משקל גוף שנע בין 20-45 גרם. פרטים על הריאגנטים והציוד המשמשים במחקר זה מסופקים בטבלת החומרים.

1. הכנת פתרון

  1. הכן מאגר קולגנאז. הוסף 100 מ"ג אבקת קולגנאז, 1 מ"ל של 1 M HEPES buffer, 500 מיקרוליטר של 100x P188, 50 מיקרוליטר של 1 M CaCl2, 0.05 גרם BSA ו-48.45 מ"ל של Medium 199. יש לסנן את התמיסה בצורה סטרילית ולאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
  2. הכינו מדיה לתרבית תאים. שלב 500 מ"ל DMEM, 50 מ"ל FBS, 5 מ"ל פניצילין-סטרפטומיצין ו-5 מ"ל תוסף L-גלוטמין.

2. אוסף מחסני רקמות שומן לבנות מעכברים

  1. הכינו צלחת בגודל 1X10 ס"מ עם 200 מיקרוליטר HBSS לכל מחסן שונה ומצבו לפי הצורך והניחו אותה על קרח.
  2. יש להוציא את בעלי החיים מבית החי ולהמית את העכברים בהתאם להנחיות הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים של המוסד. כאן, בעלי חיים הומתו על ידי פריקת צוואר הרחם בהרדמה עמוקה.
  3. שקלו ורשמו את המשקל של כל עכבר במידת הצורך.
  4. עקר את העכבר על ידי ריסוס אתנול 70% לציפוי החלק החיצוני.
  5. קצור את רפידות השומן המתאימות מהעכבר18,19.
    הערה: הקפד להסיר את בלוטות הלימפה מהמחסן התת עורי לפני הכנסת הרקמה לתוך הצלחת.
  6. שקלו כל שומן ורשמו את המשקל.
  7. מניחים את כרית השומן בצלחת המוכנה בגודל 10 ס"מ על קרח.

3. הכנת רקמת שומן לבנה

הערה: שלב זה הוא אופציונלי.

  1. לפחות 12 שעות לפני תחילת הדיסקציה, יש להפשיר את מטריצת קרום המרתף (מטריגל) ב-4 מעלות צלזיוס על קרח ולצנן קופסה אחת של קצות פיפטה סטריליים של 200 מיקרוליטר ב-4 מעלות צלזיוס.
  2. באמצעות קצות פיפטה מקוררים, פיפטה 80 מיקרוליטר של מטריצת ממברנת הבסיס למרכז כל באר של צלחת תרבית של 24 בארות כדי ליצור כיפה (איור 1A). הנח את הצלחת בחממה (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2) למשך 30 דקות כדי למצק חלקית את המטריצה.
  3. הכן רקמה: בעזרת מספריים לדיסקציה סטרילית, שקלו 0.1 גרם רקמה מכל דגימה והניחו אותה ב-PBS על קרח.
  4. בעזרת מלקחיים סטריליים, הטמיעו רקמה שקולה מראש בכיפת המטריצה המוצקה חלקית. הוסף 30 מיקרוליטר של מטריצת קרום הבסיס על גבי הרקמה המוטבעת. החזר את הצלחת לחממה למשך 30 דקות כדי לקבע את הרקמה במטריצת קרום המרתף.
    הערה: הטמעת רקמה במטריצת קרום הבסיס היא חיונית כדי להבטיח שהרקמה תישאר בתרבית ולא צפה. זה שומר על בריאות ואיכות הרקמה (איור 1B).
  5. הוסף 1 מ"ל של מצע גידול (DMEM עם 10% FBS) לכל באר וחזור לחממה.

4. טיפול בקולגנאז

  1. חשב את כמות תמיסת הקולגנאז הדרושה. ראה טבלה 1.
  2. הכן תמיסת קולגנאז עם DNase. הוסף 0.00017 גרם DNase לכל 1 מ"ל תמיסת קולגנאז. מערבולת לערבב.
  3. בעזרת סכין גילוח, טחנו את רקמת השומן המבודדת עד שהרקמה נראית הומוגנית (איור 2A). העבירו רקמה טחונה לצינור חרוטי סטרילי של 50 מ"ל.
    הערה: אין לטחון יתר על המידה. הטחינה הושלמה כאשר הרקמה נראית הומוגנית ודמוית משחה. רקמה שאינה טחונה נראית שמנמנה והטרוגנית, ורקמה טחונה יתר תגרום לשחרור של שומנים חופשיים (איור 2B).
  4. הוסף תמיסת קולגנאז ו- DNase מוכנה לרקמת השומן הטחונה באמצעות נפחים המחושבים בשלב 4.1. מערבולת במהירות מקסימלית למשך 7-10 שניות לשילוב יסודי. מניחים 50 מ"ל צינורות חרוטיים אופקית בשייקר המכוון ל-220 סל"ד, 37 מעלות צלזיוס.
  5. דגרו על טלטול למשך 10 דקות, ואז מערבולת למשך 5 שניות ובדקו את הדגימות. דגימות מעוכלות במלואן ייראו הומוגניות ללא גושים או חתיכות רקמה גלויות. אם הדגימות אינן מתעכלות במלואן, המשיכו לעכל בשייקר, ובדקו כל 2 דקות (איור 2C).
    הערה: אין לעכל יתר על המידה. זמן מוגזם בתמיסת קולגנאז עלול לגרום לפירוק אדיפוציטים ולשחרור שומנים.
  6. השתמש בפיפטה סרולוגית כדי להעביר את הרקמה המעוכלת דרך מסננת לחרוט חדש של 50 מ"ל. הוסף נפח FBS השווה לנפח הרקמה + תמיסת הקולגנאז דרך המסננת לחרוט כדי לנטרל קולגנאז.
    הערה: כמות קטנה של רקמה תישאר במסננת לאחר הסינון.

5. שטיפת הרקמה

הערה: השלם את כל השלבים הבאים במכסה מנוע סטרילי לתרבית רקמות.

  1. הכן צינור 1 x 15 מ"ל עם 10 מ"ל של אמצעי תרבית חמים לכל מצב.
  2. סובב את הצינורות משלב 4.6 ב-300 x גרם למשך 3 דקות בטמפרטורה המצוינת בטבלה 1.
    הערה: יש לשנות את הטמפרטורה לצנטריפוגה על סמך מין העכברים שמהם בודדה רקמת השומן; טמפרטורות אלה מסופקות בטבלה 1.
  3. ודא שלאחר הסיבוב, הרקמה נפרדת לארבע שכבות (איור 3A).
    הערה: השכבה העליונה ביותר היא השומנים החופשיים, השכבה השנייה היא שכבת השומן הבוגרת, השכבה השלישית היא הקולגנאז וה-FBS, והשכבה הרביעית היא שבר כלי הדם הסטרומלי (SVF) שכדורים לתחתית20,21.
  4. השליכו בזהירות את השכבה העליונה של השומנים החופשיים בעזרת פיפטה של 200 מיקרוליטר.
  5. לאחר הסרת השכבה העליונה, השתמשו בפיפטה p1000 כשהחלק התחתון מנותק כדי להעביר את האדיפוציטים הבוגרים לצינור המוכן של 15 מ"ל עם 10 מ"ל של מצע גידול (איור 3B).
    1. אופציונלי: כדי לבודד את תאי האב הראשוניים של השומן (APCs), סובב את הצינורות שוב ב-300 x גרם למשך 10 דקות. לאחר מכן המשך לבידוד תאי האב של השומן על ידי Liu et al.22, Cho et al.23, או דומה.
  6. הפוך את הצינורות של 15 מ"ל עם האדיפוציטים הבוגרים בעדינות 3-5 פעמים עד שהשכבה הלבנה מתפזרת בכל המדיה.
  7. הניחו לצינורות לנוח זקופים במשך 10 דקות בטמפרטורה המצוינת בטבלה 1 כדי לאפשר הפרדה של שכבות השומן והמדיה.
  8. לאחר מנוחה של 10 דקות, סובב את הצינורות ב -100 x גרם למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר כדי לקדם עוד יותר את הפרדת השכבות. לאחר הסיבוב, הדגימות יופרדו שוב לארבע שכבות, כפי שמוצג באיור 3A.
  9. הסר והשליך את השכבה העליונה של השומנים החופשיים בעזרת פיפטה.
  10. בעזרת מחט 21 גרם המחוברת למזרק של 5 מ"ל, החלק את המחט במורד קצה הצינור עד שתחתית המחט נקייה משכבת השומן הבוגרת (איור 3C). ודא שהחלק העליון של המחט ותחתית המזרק אינם מפריעים לשכבת השומן הבוגרת.
  11. משוך לאט את המזרק כדי להסיר את אמצעי התרבות וכל פסולת סלולרית.
    הערה: בעת הסרת המדיה, ודא שקצה המחט נקי משכבת השומן הבוגרת.
  12. הוסף בעדינות 10 מ"ל של מצע תרבית לכל צינור.
  13. חזור על שלבים 5.6-5.11. אל תוסיף עוד מדיה תרבותית.
  14. בעזרת קצות פיפטה טעינת ג'ל, החלק את קצה הפיפטה במורד קצה הצינור כדי להסיר את המדיה שנותרה מתחת לשכבת השומן הבוגרת.

6. אריזה

  1. תאי צנטריפוגה ב-100 x גרם למשך דקה אחת בטמפרטורה המצוינת בטבלה 1. הסר שומנים חופשיים (שכבת שמן שקופה על גבי התאים) באמצעות פיפטה. הסר את אמצעי התרבית מתחת לאדיפוציטים באמצעות קצה טעינת ג'ל. הקפידו למזער את ההפרעה של שכבת השומן (איור 4).
  2. חזור על שלב 6.1 עד להסרת כל אמצעי התרבית והשומנים החופשיים (בדרך כלל 3-5 פעמים). חבילת התאים צריכה להיות בצבע לבן ללא ליפידים חופשיים נראים מעל התאים או מדיה מתחת לתאים (איור 4).

7. ציפוי ובדיקות פונקציונליות

  1. ציפוי האדיפוציטים הבוגרים לתרבית תאים
    1. הסר את תוספות תרבית התאים מצלחת 24 בארות שטופלה בתרבית רקמות והנח אותן כשצד הממברנה כלפי מעלה על פני מכסה המנוע.
    2. מלאו בארות לסירוגין של הצלחת במצע תרבית חם של 1 מ"ל.
    3. בעזרת קצה פיפטה p200 חתוך, הנח 30 מיקרוליטר של אדיפוציטים בוגרים ארוזים משלב 6.2 על החלק העליון של תוספת טרנסוול (איור 5A,B).
    4. הרם בזהירות והפוך את תוספת הטרנסוול והנח אותה לבאר מלאה מראש בצלחת 24 הבארות (איור 5A). הנח בזהירות את הצלחת לתוך החממה המכוונת ל-37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2.
      הערה: אדיפוציטים ארוזים כהלכה צריכים ליצור שכבה אטומה ללא טיפות שומן חופשיות שקופות במבט מלמעלה (איור 5C).
    5. החלף את המדיה על השומנים הבוגרים כל 2-7 ימים עד 14 יום.
      1. כדי להסיר את המדיה מהבארות, החזק את ה-transwell במקומו והשתמש בפיפטה p200 כדי להסיר בזהירות את המדיה דרך הפתחים הקטנים בצד של תוספת ה-transwell (איור 5D).
      2. לאחר הסרת המדיה, תוך כדי החזקת הטרנסוול במקומו, הוסף לאט מאוד 1 מ"ל של מדיה לדופן הצדדית של הבאר.
        הערה: הקפד להוסיף ולהסיר מדיה לאט מאוד. אדיפוציטים יכולים בקלות להיעקר מהממברנה אם המדיה מוחלפת במהירות.
  2. בדיקת ליפוליזה
    1. רקמת שומן צלחת מוציאה כמתואר בשלב 3.4 או אדיפוציטים בוגרים כמתואר בשלב 7.1.
      הערה: יש לתרבית תאים או רקמות במדיה נטולת פנול אדום למשך 24 שעות לפחות לפני ביצוע בדיקת ליפוליזה.
    2. הכנת פתרון: הכינו תמיסה של 5% BSA ב-DMEM (ללא פנול אדום) על ידי המסת 5 גרם BSA ב-100 מ"ל DMEM. יש להפוך בעדינות לאיחוד עד להמסה מלאה של BSA.
      1. הכנת פתרונות עבודה לאמצעי בקרה וגירוי. עבור מדיית בקרה, שלב מדיית BSA DMEM של 5% עם הרכב. למדיית גירוי, שלב 5% מדיית BSA DMEM עם 5 מיקרומטר של CL-316,243. יש לחמם את אמצעי הבקרה והגירוי ל-37 מעלות צלזיוס לפני השימוש.
    3. הסר מדיה מבארות ושטוף עם DPBS חם של 1 מ"ל. מלאו בארות ב-500 מיקרוליטר לכל באר של אמצעי בקרה או גירוי. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2.
    4. לאחר 1 שעות, 2 שעות, 4 שעות ו-24 שעות לאחר התחלת בדיקת הליפוליזה, אסוף 100 מיקרוליטר של מדיה מכל באר לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה והחלף אותו ב-100 מיקרוליטר של אמצעי הבקרה או הגירוי המתאים.
      הערה: ניתן לאחסן דגימות בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס בשלב זה.
    5. הפעל את הבדיקה הקולורימטרית של גליצרול באמצעות ערכת גליצרול חינמית זמינה מסחרית (ראה טבלת חומרים) או דומה.
      1. הכן ריאגנטים לפי ההוראות בערכה.
      2. מפשירים דגימות ומערבבים בעדינות על ידי פיפטינג.
      3. הכן עקומה סטנדרטית עם דילול טורי של שבע נקודות, פי 2 באמצעות התמיסה הסטנדרטית של הגליצרול.
      4. העבירו 25 מיקרוליטר של דגימה או תקן לכל באר של צלחת 96 בארות עם תחתית שקופה.
      5. הוסף 100 מיקרוליטר של מגיב בדיקת גליצרול חופשי לכל באר המכילה דגימה או תמיסה סטנדרטית.
      6. דגרו במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר, ואז קראו את הספיגה ב-540 ננומטר (איור 6A-D).
  3. דימות
    1. הכן את שקופיות ההדמיה. כדי להכין שקופיות, הסר את שכבת נייר הגיבוי מכל מרווח הדמיה והנח אותה על השקופית. ניתן למקם שני מרווחי הדמיה זה לצד זה בכל שקופית.
    2. בעזרת קצה פיפטה חתוך של 200 מיקרוליטר, העבירו 30 מיקרוליטר של אדיפוציטים ארוזים משלב 6.2 לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה.
    3. הכן את תערובת הצביעה. הכן 200 מיקרוליטר לכל דגימה של תמיסת צביעת קרום פלזמה ב-5 מיקרוגרם/מ"ל והוכסט ב-4.5 מיקרוגרם/מ"ל ב-PBS. יש להוסיף תערובת כתמים לדגימות ולנער בעדינות.
    4. דגימות כתמים למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. הגן על הדגימות מפני אור.
    5. לאחר השלמת הצביעה יש לשטוף את הדגימות. הוסף 500 מיקרוליטר PBS לכל דגימה ונער בעדינות לאיחוד. מניחים לעמוד 5 דקות. סובב ב-100 x גרם למשך דקה אחת, ולאחר מכן הסר מדיה מתחת לתאים בעזרת קצה פיפטה לטעינת ג'ל.
    6. הכן את השקופיות. הסר את סרט הפלסטיק השקוף מהצד העליון של מרווחי ההדמיה כדי לחשוף את השכבה הדביקה.
    7. הוסף 500 מיקרוליטר PBS לצינור של אדיפוציטים מוכתמים וערבב בעדינות.
    8. במהירות, כדי לא לאפשר זמן לאדיפוציטים הבוגרים לעלות אל פני השטח, השתמש בקצה פיפטה p200 חתוך כדי למקם 35 מיקרוליטר מהאדיפוציטים בתוך המרווח בשקופית ההדמיה.
    9. הנח תלוש כיסוי על המרווח.
    10. המשך מיד להדמיה (איור 6C). עיכוב בהדמיה עלול לגרום לדימום של סמן הממברנה.

תוצאות

כפי שמוצג באיור 2, טחינה נכונה (איור 2B) ועיכול (איור 2C) חשובים לבידוד של אדיפוציטים בוגרים שלמים. תת-טחינה ותת-עיכול עלולים לגרום לתפוקה נמוכה של אדיפוציטים בוגרים עקב הפרדה לא מספקת מרקמת החיבור. מבחינה ויזואלית, ניתן לראות זאת עם רקמה חוטית שנותרה לאחר הטחינה וגושים גלויים בתמיסת קולגנאז. בנוסף, טחינת יתר ועיכול יתר גורמים גם לתפוקה נמוכה עקב התפוצצות השומנים הבוגרים. מבחינה ויזואלית, התוצאה היא אובדן השכבה הלבנה האטומה והצטברות של שכבת שומנים גדולה, שקופה וחופשית. רמות לא מתאימות של טחינה או עיכול יגרמו לבידוד לקוי של אדיפוציטים.

הכנה ועיכול נכונים של רקמת השומן יביאו להפרדת הרקמה לארבע שכבות נפרדות, כפי שניתן לראות באיור 3. התפרצות מסוימת של השומנים וכתוצאה מכך שחרור שומנים חופשיים היא בלתי נמנעת; עם זאת, טחינה ועיכול נאותים יבטיחו קרע מינימלי בשומן. שכבת השומנים החופשית הנותרת והמדיה יוסרו במהלך אריזת השומנים החופשיים (איור 4). אריזה נכונה של האדיפוציטים חיונית לבידוד יעיל של אדיפוציטים בוגרים. כל השומנים או המדיה החופשיים שנותרו יגרמו לבידוד לקוי וישפיעו לרעה על מבחנים תפקודיים במורד הזרם, כגון ציפוי, ליפוליזה והדמיית תאים.

פרוטוקול זה מייצר הכנה נקייה של אדיפוציטים בוגרים. ניתן לבצע הדמיית תאים ובדיקות ליפוליזה כדי להעריך את תפקוד התאים ולהוכיח כי האדיפוציטים הבוגרים שומרים על תפקודם לאחר הבידוד ולאחר תרבית עד שבועיים. בדיקת הליפוליזה מצביעה על כך שהשומנים הבוגרים שומרים על היכולת להגיב לאיתות תאי באמצעות שחרור גליצרול חופשי עם גירוי הקולטן האדרנרגי β-3 (איור 6A,B). יכולת זו נשמרת גם לאחר שבועיים בתרבית והיא דומה מאוד לפעילות הליפוליזה של צמחי רקמת שומן שגודלו במשך 24 שעות (איור 6C,D). אדיפוציטים באיכות ירודה יראו ליפוליזה מוחלשת. הדמיית התאים של אדיפוציטים מבודדים מראה אדיפוציטים בוגרים חד-עיניים עגולים ושלמים המכילים טיפת שומן אחת גדולה. בידוד אדיפוציטים באיכות ירודה יציג בעיקר טיפות שמן גדולות חוץ-תאיות המעידות על אדיפוציטים מתפרצים.

figure-results-1
איור 1: הטמעה של צמחי רקמת שומן. (A) תמונה של כיפת מטריצת קרום הבסיס שהתמצקה חלקית לפני הטמעת הרקמה. (ב) תמונות מייצגות של הטמעת רקמות לא נכונה ותקינה. הטבעה לא נכונה נראית כאשר הרקמה נראית צפה חלקית או מלאה מעל הכיפה. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: סכימה של טחינה ועיכול תקינים של רקמת השומן. (A) ייצוג סכמטי של שלבי טחינת רקמות ועיכול 4.2-4.6. (B) תמונות מייצגות של רקמה תחתונה, אופטימלית וטחונה יתר על המידה. ברקמה מתחת לטחון יש נתחים גדולים השומרים על צורתם המקורית. רקמה טחונה יתר גורמת לעלייה ניכרת בשומנים החופשיים המקיפים את הרקמה, שנראים צלולים ושומניים. (C) תמונות מייצגות של רקמות תת-קרקעיות, אופטימליות ומעוכלות יתר על המידה. רקמה לא מעוכלת מכילה גושי רקמה שלמה שנותרו בתמיסה. רקמה מעוכלת יתר מציגה שכבת שומנים חופשית גדולה הנפרדת במהירות מהתמיסה. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: הפרדת שכבות של רקמת שומן מעוכלת. (A) תמונה סכמטית ומייצגת של השכבות הקיימות לאחר שלב 5.3. (B) שימוש בקצה פיפטה חתוך כדי להסיר את שכבת השומן הבוגרת מהצינור החרוטי של 50 מ"ל. (ג) טכניקה ומיקום נכונים של המחט והמזרק כדי להסיר את מצע התרבית מתחת לשכבת השומן הבוגרת. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4
איור 4: אריזה רציפה של אדיפוציטים בוגרים. תמונות עוקבות של אריזת השומנים הבוגרים. שכבות של ליפידים חופשיים, אדיפוציטים ומדיה מסומנות. לאחר כל סיבוב, מסירים שומנים ומדיה חופשיים. זה חוזר על עצמו עד שלא נפרדים מדיה או שומנים חופשיים מהאדיפוציטים לאחר סיבוב. התמונה הסופית מייצגת אדיפוציטים בוגרים ארוזים היטב. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-5
איור 5: ציפוי ותרבות של אדיפוציטים בוגרים. (A) סכמטי של הציפוי של אדיפוציטים בוגרים. בעזרת קצה פיפטה p200 חתוך, אדיפוציטים ארוזים מונחים על הממברנה של תוספת תרבית תאים. לאחר מכן התוספת הופכת לבארות מלאות מראש של אמצעי תרבית. (B) תמונה מייצגת של ציפוי אדיפוציטים בוגרים המתארים קצה פיפטה חתוך המפקיד אדיפוציטים על הכנסת טרנסוול. (C) סכמות ותמונות מייצגות של אדיפוציטים ארוזים כהלכה וארוזים בצורה גרועה מצופים בטרנסוולים, כפי שניתן לראות מעל הבארות. אדיפוציטים ארוזים כהלכה נראים לבנים ואטומים, בעוד שאדיפוציטים ארוזים בצורה גרועה גורמים להיווצרות טיפות שומנים שקופות. (D) סכמטי של הטכניקה המשמשת לשינוי מדיית התרבית. קצה פיפטה p200 משמש להסרה זהירה של המדיה דרך הפתחים בדופן הצדדית של תוספת הטרנסוול. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-6
איור 6: הדמיה של אדיפוציטים בוגרים ובדיקת ליפוליזה. (א,ב) שחרור גליצרול מתיפוציטים בוגרים תת-עוריים (A) וקרביים (B). אדיפוציטים בודדו מעכברים זכרים בני 16 שבועות C57BL/6 שניזונו מתזונת צ'או רגילה. 30 מיקרוליטר של אדיפוציטים צופו כמתואר בשלב 7.1 ותרבו במשך 1 או 10 ימים. אדיפוציטים טופלו ב-5 מיקרומטר של CL-316,243 למשך שעה, שעתיים ו-4 שעות, וסופרנטנטים נאספו ונותחו לגליצרול חופשי. (ג,ד) שחרור גליצרול מצמחי רקמת שומן תת עורית (C) וקרביים (D). רקמת השומן בודדה מעכברים נקבות C57BL/6 בנות 18 שבועות שהוזנו בדיאטת צ'או רגילה. 0.1 גרם של רקמת שומן צופו כמתואר בשלבים 3.1-3.4 ותרבו במשך 24 שעות. אדיפוציטים טופלו ב-5 מיקרומטר של CL-316,243 למשך שעה, שעתיים ו-4 שעות, וסופרנטנטים נאספו ונותחו לגליצרול חופשי. N = 3 שכפולים טכניים עבור A-D. כל הנתונים הם ממוצע ± סטיית תקן. (E) תמונות מייצגות של אדיפוציטים בוגרים תת-עוריים וקרביים מבודדים. אדיפוציטים בודדו מעכברים זכרים בני 16 שבועות C57BL/6J שהוזנו בדיאטת צ'או רגילה. אדיפוציטים נצבעו בכתם קרום פלזמה (אדום) וכתם גרעיני הוכסט (כחול). פסי קנה מידה: 50 מיקרומטר; הגדלה: פי 60. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

מיןדיאטהדיפוקושי טחינהקולגנאז: יחס רקמותזמן עיכול מומלץ (דקות)טמפרטורת סחיטה.שטפו את הטמפרטורה.
נקבהצ'או רגילתת עוריקשה2:112RT37 מעלות צלזיוס
קרבייםבינוני1:18RT37 מעלות צלזיוס
דיאטה עתירת שומןתת עוריקל1:18RT37 מעלות צלזיוס
קרבייםקל1:18RT37 מעלות צלזיוס
זכרצ'או רגילתת עוריקשה2:1144 מעלות צלזיוסRT
קרבייםבינוני1:1104 מעלות צלזיוסRT
דיאטה עתירת שומןתת עוריקל1:1104 מעלות צלזיוסRT
קרבייםקל1:1104 מעלות צלזיוסRT

טבלה 1: מין, מחסן ושינויים ספציפיים לתזונה. קושי הטחינה של כל רקמה, המתואר כ"קל", "בינוני" או "קשה" ביחס למחסנים אחרים. שימו לב שזמן הטחינה בפועל ישתנה בהתאם לחוקר ולרקמה. קולגנאז: יחס הרקמות הרשום כנפח (מ"ל) של תמיסת קולגנאז + DNase שהוכנה בשלב 4.1 למשקל הרקמה (גרם). זמן העיכול הוא הערכה משוערת, אך זמן העיכול בפועל ישתנה בהתאם לטחינה ולרקמה. חוקרים צריכים להעריך את העיכול כמתואר בפרוטוקול. טמפרטורת הסיבוב וטמפרטורת הכביסה שונות בין עכברים זכרים ונקבות. RT מציין את טמפרטורת החדר.

דיון

אדיפוציטים ראשוניים ידועים לשמצה כקשים לבידוד ולתרבית מכיוון שהם נקרעים בקלות, וגודלם הגדול מונע שימוש בכלים נפוצים לבידוד תאים ראשוניים כגון ציטומטריית זרימה. הפרוטוקול המתואר כאן מניב אדיפוציטים בוגרים נקיים ופונקציונליים, שניתן להשתמש בהם עבור מגוון יישומים במורד הזרם. חשוב לציין, פרוטוקול זה מאפשר הפרדה של השומנים הבוגרים מפסולת תאית אחרת ושכבת השומנים החופשית, מה שמאפשר בדיקות הדמיה, תרבות וליפוליזה יעילות. ניתן לשלב את הפרוטוקול בקלות עם פרוטוקולים שפורסמו22,23 לבידוד של מקטע כלי הדם הסטרומלי ו-APCs. פרוטוקול זה מפרט גם הליך להכנה ותרבות של צמחי רקמה שלמה מרקמת שומן, שיכולים לשמש ליישומים במורד הזרם כגון בדיקות ליפוליזה ואיסוף גורמים מופרשים מרקמת שומן שלמה.

היבטים קריטיים כוללים טחינה נכונה, עיכול והסרה של שכבת השומנים החופשית. כדי להבטיח טחינה נכונה, חשוב לעקוב מקרוב אחר המראה החזותי של הרקמה לאורך כל התהליך. הזמן והמאמץ הדרושים להשגת טחינה אופטימלית של הרקמה ישתנו בהתאם למצבור רקמת השומן, התערבויות תזונתיות (כגון תזונה עתירת שומן) והחוקר. ניתן לשלב כלים אחרים לטחינה, כגון מספריים, במידת הצורך, אך זה לא נחקר כאן. יש לציין כי יש להימנע מטחינת יתר מכיוון שהיא תקרע את השומנים, מה שלא רק מקטין את התשואה המיידית אלא גם מקטין את התשואה הכוללת ואת איכות השומנים בשל ההשפעה המזיקה שיש לשכבת השומנים החופשית על שאר השומנים. עיכול תקין, בדומה לטחון תקין, יהיה תלוי במאגר רקמות השומן, התערבויות תזונתיות, גיל העכברים וכו'. הוספת DNase לקולגנאז מסייעת במניעת הצטברות של אדיפוציטים במהלך העיכול, שעלולה לנבוע מפסולת תאית. זמן העיכול של רקמות הוא, אם כן, משתנה מאוד. ההערכות המסופקות לזמני העיכול משמשות כמדריך, אותו ניתן למצוא בטבלה 1. עם זאת, הדרך הטובה ביותר להבטיח שהרקמות מתעכלות כראוי היא לבדוק ויזואלית את הרקמה לאורך כל התהליך וכמתואר בפרוטוקול. טמפרטורות הצנטריפוגה והשטיפה השונות המפורטות בטבלה 1, המוצעות על סמך מין, חיוניות להפרדה נכונה של האדיפוציטים הבוגרים הן משכבת השומנים החופשית והן מהפסולת התאית האחרת ו-SVF; שימוש בטמפרטורות חלופיות עלול לגרום לאובדן האדיפוציטים הבוגרים עקב צבירה והתפוצצות אדיפוציטים.

להסרת שכבת השומנים החופשית בכל שלב יש חשיבות קריטית, וכישלון לעשות זאת יציג סיבוכים במורד הזרם לציפוי, הדמיה ובדיקת הליפוליזה. יתר על כן, הנוכחות המתמשכת של שכבת השומנים החופשית לאורך כל ההליך תגרום למוות נוסף של אדיפוציטים עקב רעילות ליפובית, מה שישפיע באופן דרמטי על התפוקה והאיכות הכוללת. בעוד שבדרך כלל רצוי למקסם את היעילות של בידוד השומנים הבוגרים, הסרת שכבת השומנים החופשית, אפילו על חשבון חלק מהאדיפוציטים הבוגרים, תביא לעלייה כוללת בתפוקת השומנים הבוגרים בסוף הפרוטוקול.

מגבלות ההליך כוללות את מספר הדגימות. בשל הקפדנות והזמן הנצרך על ידי הסרת המדיה ושכבת השומנים החופשית, ההליך מוגבל בדרך כלל לשש דגימות בכל פעם. עיבוד משמעותי יותר דגימות יגרום לחשיפת אדיפוציטים ראשוניים לשומנים חופשיים למשך זמן רב מדי ויפחית את התשואה הכוללת. עם זאת, כוח אדם נוסף עשוי לאפשר עלייה במספר הדגימות. הזמן מהטחינה ועד לבדיקה פונקציונלית הוא קריטי מכיוון שעיכובים מוגזמים בהסרת המדיה ושכבת השומנים החופשית גורמים להתפוצצות אדיפוציטים בוגרים נוספים. הפרוטוקול מוגבל עוד יותר ביכולת להפריד תת-אוכלוסיות של אדיפוציטים בוגרים.

השיטות הנוכחיות לחקר אדיפוציטים בוגרים מסתמכות בעיקר על בידוד של APCs והתמיינות ex vivo של תאים אלה. שיטות נוספות, כולל מודל איבר על שבב ותרביות משותפות של בארות טרנס, החלו להתפתח18,24. עם זאת, הוכח כי אדיפוציטים מובחנים אלה נבדלים מבחינת שעתוק ומורפולוגית מהאדיפוציטים הבוגרים ברקמת השומן17. מבחינה מורפולוגית, אדיפוציטים מובחנים ex vivo הם רב-לולריים, בעוד שאדיפוציטים מבודדים in vivo הם חד-עיקריים. פרוטוקול זה שונה ומותאם מדוחות קודמים17,25 כדי לבודד ולתרבית בהצלחה אדיפוציטים בוגרים מ-0.5 גרם רקמת שומן בהשוואה לפרוטוקולים אחרים הדורשים לפחות 5 גרם של רקמת שומן25. לבסוף, מחקר זה נועד להמחיש חזותית את ההשלמה המוצלחת של שלבים מרכזיים בפרוטוקול במקום זמנים קונקרטיים, טמפרטורות צנטריפוגה וכמויות קולגנאז, אם כי ההנחיות כלולות בטבלה 1. יש להתאים פרמטרים אלה בהתאם לגורמים כמו מצבור רקמות השומן, המין והשמנה של בעל החיים, כל אלה יכולים להשפיע על יעילות העיכול וההפרדה הנקייה של אדיפוציטים בוגרים בפרוטוקול זה.

בסך הכל, ההליך אורך 3-4 שעות, תלוי במספר העכברים שנאספו ובמספר דגימות רקמת השומן הבודדות. צפוי כי היכולת לתרבית ולהעריך את התפקיד התפקודי של אדיפוציטים בוגרים תאפשר יישומים רבים במורד הזרם לחקר הביולוגיה של השומן עצמו (למשל, חילוף חומרים, ניצול חומרים מזינים ומעקב) והאינטראקציה של אדיפוציטים עם סוגי תאים אחרים, כגון APCs, תאים סרטניים ותאים של מערכת החיסון.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

המחברים מבקשים להודות על תמיכת המענקים מ-5 For The Fight and Huntsman Cancer Institute (KIH), קרן V לחקר הסרטן (KIH) ו-DK133455 (KIH). סכמות של הפרוטוקול שנוצרו עם Biorender. נוסף על כך, המחברים רוצים להודות לסטפני ג'יאגנוקאבו ולליבת הדימות התאית באוניברסיטת יוטה על העזרה בהדמיה, ולמארק לי על המשוב על כתב היד.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
תמיסת 100x פולוקסמר 188סיגמאP5556-100 מ"ל
15 מ"ל חרוטיCellstar 188261
21 גרם מחטBD305165
5 מ"ל מזרקBD309646
50 מ"ל Cellstar חרוטי227261
6.5 מ"מ Transwell עם 0.4 ומיקרו; m נקבוביות פוליקרבונט קרום הכנסתקרום3413
בקר סרום אלבומין (BSA)Sigma-AldrichA7906-100G
CaCl2SigmaC1016-500gm
CellMask כתמי קרום פלזמהThermo Fisher ScientificC10045
CL 316243 מלח דיסודיוםTocris1499
אבקת קולגנאזSigmaC6885
DMEMGibco11995-040
DMEM ללא pheonolאדום GibcoA14430-01
DNase ISigma-Aldrich10104159001
סרום בקר עוברי (FBS)GibcoA56708-01
Fisherbrand Tissue Path Superfrost Plus Gold SlidesFisher Scientific
ג'ל טעינת פיפט טיפפישר מדעי02-707-181
תוסף GlutaMAXGibco35050061
ערכת בדיקת גליצרולAbcamAB133130
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS)Gibco14025-092
HEPES BufferSigma83264-100ml-F
Heraeus צנטריפוגה Megafuge 16RThermo Scientific 
Hoechst 33342 פתרוןתרמו פישר מדעי62249
דגירה מיני שייקרVWR12620-942
בינוני 199סיגמא-אולדריץ'M4530
משקפי כיסוי מיקרוסקופVWR16004-302
PBSGibco10010023
פניצילין-סטרפטומיציןGibco15140-122
מרווחי הדמיה SecureSealGrace Biolabs654006
Seive (מסננת קוקטייל רשת עדינה של SteeL)OXO3112000https://www.oxo.com/steel-fine-mesh-cocktail-strainer-660.html
151884875004271

מקורות

  1. Ward, Z. J., et al. Projected U.S. state-level prevalence of adult obesity and severe obesity. N Engl J Med. 381 (25), 2440-2450 (2019).
  2. Vishvanath, L., Gupta, R. K. Contribution of adipogenesis to healthy adipose tissue expansion in obesity. J Clin Invest. 129 (10), 4022-4031 (2019).
  3. Longo, M., et al. Adipose tissue dysfunction as determinant of obesity-associated metabolic complications. Int J Mol Sci. 20 (9), 2358(2019).
  4. Funcke, J. B., Scherer, P. E. Beyond adiponectin and leptin: Adipose tissue-derived mediators of inter-organ communication. J Lipid Res. 60 (10), 1648-1684 (2019).
  5. Johnston, E. K., Abbott, R. D. Adipose tissue paracrine-, autocrine-, and matrix-dependent signaling during the development and progression of obesity. Cells. 12 (3), 407(2023).
  6. Koenen, M., Hill, M. A., Cohen, P., Sowers, J. R. Obesity, adipose tissue and vascular dysfunction. Circ Res. 128 (7), 951-968 (2021).
  7. Liu, P., et al. Transcriptomic and lipidomic profiling of subcutaneous and visceral adipose tissues in 15 vertebrates. Sci Data. 10 (1), 453(2023).
  8. Wu, Y., Li, X., Li, Q., Cheng, C., Zheng, L. Adipose tissue-to-breast cancer crosstalk: Comprehensive insights. Biochim Biophys Acta Rev Cancer. 1877 (5), 188800(2022).
  9. Emont, M. P., et al. A single-cell atlas of human and mouse white adipose tissue. Nature. 603 (7903), 926-933 (2022).
  10. Nahmgoong, H., et al. Distinct properties of adipose stem cell subpopulations determine fat depot-specific characteristics. Cell Metab. 34 (3), 458-472.e6 (2022).
  11. Hildreth, A. D., et al. Single-cell sequencing of human white adipose tissue identifies new cell states in health and obesity. Nat Immunol. 22 (5), 639-653 (2021).
  12. Maniyadath, B., Zhang, Q., Gupta, R. K., Mandrup, S. Adipose tissue at single-cell resolution. Cell Metab. 35 (3), 386-413 (2023).
  13. Gao, Y., et al. Adipocytes promote breast tumorigenesis through taz-dependent secretion of resistin. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (52), 33295-33304 (2020).
  14. Cornide-Petronio, M. E., Jimenez-Castro, M. B., Gracia-Sancho, J., Peralta, C. New insights into the liver-visceral adipose axis during hepatic resection and liver transplantation. Cells. 8 (9), 1100(2019).
  15. Verma, S., et al. Zinc-alpha-2-glycoprotein secreted by triple-negative breast cancer promotes peritumoral fibrosis. Cancer Res Commun. 4 (7), 1655-1666 (2024).
  16. Min, S. Y., et al. Diverse repertoire of human adipocyte subtypes develops from transcriptionally distinct mesenchymal progenitor cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (36), 17970-17979 (2019).
  17. Harms, M. J., et al. Mature human white adipocytes cultured under membranes maintain identity, function, and can transdifferentiate into brown-like adipocytes. Cell Rep. 27 (1), 213-225.e5 (2019).
  18. Chaurasiya, V., et al. Human visceral adipose tissue microvascular endothelial cell isolation and establishment of co-culture with white adipocytes to analyze cell-cell communication. Exp Cell Res. 433 (2), 113819(2023).
  19. Galmozzi, A., Kok, B. P., Saez, E. Isolation and differentiation of primary white and brown pre-adipocytes from newborn mice. J Vis Exp. 167, e62005(2021).
  20. Farrar, J. S., Martin, R. K. Isolation of the stromal vascular fraction from adipose tissue and subsequent differentiation into white or beige adipocytes. Methods Mol Biol. 2455, 103-115 (2022).
  21. You, X., Gao, J., Yao, Y. Advanced methods to mechanically isolate stromal vascular fraction: A concise review. Regen Ther. 27, 120-125 (2024).
  22. Liu, Q., et al. Progenitor cell isolation from mouse epididymal adipose tissue and sequencing library construction. STAR Protoc. 4 (4), 102703(2023).
  23. Cho, D. S., Doles, J. D. Preparation of adipose progenitor cells from mouse epididymal adipose tissues. J Vis Exp. 162, e61694(2020).
  24. Lauschke, V. M., Hagberg, C. E. Next-generation human adipose tissue culture methods. Curr Opin Genet Dev. 80, 102057(2023).
  25. Alexandersson, I., Harms, M. J., Boucher, J. Isolation and culture of human mature adipocytes using membrane mature adipocyte aggregate cultures (MAAC). J Vis Exp. 156, e60485(2020).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Transwell

מאמרים קשורים