הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר מחקר

פוטוסינתזה משופרת ויעילות שימוש במים בקנה סוכר טרנסגני המבטא Arabidopsis DREB1A תחת עקת בצורת

735 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/67861

⸱

3 באוקטובר 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Agricultural Biotechnology Division, National Institute for Biotechnology and Genetic Engineering College, Pakistan Institute of Engineering and Applied Sciences (NIBGE-C, PIEAS), 2National Agricultural Research Center (NARC), 3Faculty of Agriculture and Veterinary Sciences, Superior University, 4Department of Laboratory & Blood Bank, Dr. Sulaiman Al Habib Medical Group, Qassim 51431, Saudi Arabia, 5Department of Horticulture, Faculty of Agriculture, University of the Punjab, 6Department of Biology, College of Science, Princess Nourah bint Abdulrahman University, P.O. Box 84428, Riyadh 11671, Saudi Arabia, 7Institute of Molecular Biology and Biotechnology (IMBB), The University of Lahore, 8School of Life Sciences, Nantong University

במאמר זה

סיכום

מחקר זה מעריך עמידות לבצורת בתיווך Arabidopsis DREB1A בקנה סוכר טרנסגני. תחת לחץ, נצפו פוטוסינתזה משופרת, יעילות שימוש במים והצטברות ביומסה. DR-21 הציג את ביטוי ה-DREB1A הגבוה ביותר, ושיפר את עמידות הבצורת. הממצאים מספקים תובנות לגבי מנגנונים מולקולריים ומציעים אסטרטגיה פוטנציאלית לפיתוח זני קנה סוכר עמידים לאקלים באזורים מוגבלים במים.

תקציר

עקת בצורת מטילה מגבלה קריטית על תפוקת קנה הסוכר, ובכך מחייבת פיתוח זנים עמידים בפני עקה לחקלאות בת קיימא. המחקר הנוכחי נועד לשפר את הסבילות לבצורת בקנה סוכר על ידי החדרת הגן Arabidopsis DREB1A תחת שליטת מקדם rd29A המעורר לחץ. קווי קנה סוכר טרנסגניים נוצרו באמצעות טרנספורמציה בתיווך הפצצת חלקיקים ולאחר מכן הוערכו באמצעות הערכות מולקולריות, פיזיולוגיות ואגרונומיות בתנאים מבוקרים ובצורת.

ניתוח מולקולרי אישר אינטגרציה טרנסגנית יציבה, כאשר קווים טרנסגניים מציגים עלייה של עד פי 10 בביטוי DREB1A ביחס לצמחים מסוג בר. הערכות פיזיולוגיות הראו כי תחת עקת בצורת ב-60% קיבולת שדה (FC), קווים טרנסגניים שמרו על שיעורי פוטוסינתזה (PN) שהיוגבוהים ב-224-270%, מוליכות הפיוניות (g s) עלתה ב-84-167%, ותכולת המים היחסית (RWC) השתפרה ב-25-31% בהשוואה לבקרות לא טרנסגניות. יתר על כן, העלים של קנה סוכר טרנסגני הראו ויסות אוסמוטי משופר ויעילות שימוש במים. הערכות אגרונומיות חשפו עוד שיפורים משמעותיים בצמיחת הצמח ובפרודוקטיביות. תחת עקת בצורת (60% FC), קווים טרנסגניים הראו גובה קנה גדול יותר ב-76-109%, עם קוטר קנה גדול ב-71-86%. הביומסה של הנבטים גדלה ב-39-87%, וביומסה של שורשים השתפרה ב-65-103%.

בנוסף, אחוז הבריקס, המעיד על הצטברות סוכרוז, עלה ב-36-55% בצמחים הטרנסגניים ב-60% FC. ממצאים אלה מבססים מתאם חזק בין ביטוי DREB1A , חוסן פיזיולוגי משופר וביצועים אגרונומיים משופרים בתנאי בצורת. היכולת של קנה סוכר טרנסגני המבטא DREB1A לקיים פעילות פוטוסינתטית גבוהה יותר, יעילות שימוש מעולה במים והצטברות מוגברת של ביומסה מדגישה את הפוטנציאל שלו כאסטרטגיה גנטית לפיתוח זני קנה סוכר עמידים לבצורת. מחקר זה מציע תובנות חדשות לגבי המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס עמידות לבצורת ומספק גישה מבטיחה להבטחת גידול קני סוכר בר קיימא באזורים דלי מים.

מבוא

קנה סוכר (Saccharum officinarum L.) הוא יבול המזומנים השני בגודלו בפקיסטן, המעובד בעיקר בשל תכולת הסוכרוז הגבוהה שלו. עם זאת, ייצור אופטימלי מושג רק לעתים רחוקות בגלל מחסור תקופתי במים 1,2. הוא בן למשפחת העשביים Poaceae ומקובץ בקבוצת PACCAD של תת-משפחת Panicoideae3. חברים בקבוצה זו מכונים לעתים קרובות עשבים בעונה החמה ומציגים מערכת פוטוסינתטית C4 4. המצב העיקרי של קיבוע CO2 בקנה סוכר הוא פוטוסינתזה C4 עם מינימום פוטו-נשימה5. עשבים C4, כגון קנה סוכר, יכולים לתקן יותרCO2 מאשר עשבים C3, לייצר רמות סוכרוז גבוהות יותר ולהפגין יעילות שימוש טובה יותר בחנקן (NUE) ויעילות שימוש במים (WUE)6,7,8. עם זאת, דרישות הלחות בקרקע לקנה סוכר גבוהות למדי 9,10,11.

בשל האקלים המשתנה וזמינות המים המוגבלת, ייצור זני קנה סוכר עמידים ללחץ מים הוא קריטי 12,13,14. סבילות הצמח ללחץ מים היא תכונה רב-גנית המושפעת מעוצמת הלחץ, הזמן ומשך הלחץ. בשל מיקומה הגיאוגרפי של פקיסטן (30.3753° N, 69.3451° E), שיטות גידול קונבנציונליות אינן אפשריות בגלל פריחה נמוכה וכדאיות אבקה15. לכן, שיפור זני באמצעות גידול מסורתי תלוי בשונות גנטית ובבחירה הבאה של תכונות אגרונומיות רצויות16. בהקשר זה, שינוי גנים הקשורים ללחץ באמצעות הנדסה גנטית היא אחת הגישות האלטרנטיביות המבטיחות ביותר לשיפור עמידות ללחץ צמחי 17,18,19.

תגובות עקה אביוטיות בצמחים מווסתות על ידי משפחות גורמי שעתוק מרובים (TF) ואלמנטים הפועלים על ציס, כולל WRKY, MYB, bHLH, ERF ו-NAC. TFs אלה מווסתים רשתות בהתאמה אוסמוטית, ניקוי מיני חמצן תגובתיים (ROS), ויסות פיוניות ומסלולי איתות מתח 20,21,22,23,24,25,26. לדוגמה, WRKY TFs מווסתים את איתות המתח באמצעות מסלולים תלויי ABA, בעוד שחלבוני MYB מווסתים את הביוסינתזה של הפלבנואידים ואת תפקוד הפיוניות תחת לחץ בצורת27. באופן דומה, גורמי bHLH ו-ERF מקיימים אינטראקציה עם איתות אתילן, ובכך משפרים את עמידות הבצורת28. בהתחשב במורכבות של תגובות לחץ, התמקדות ברגולטורים מרכזיים כגון DREB1A היא אסטרטגיה מבטיחה לשיפור הסבילות לבצורת.

במחקר זה, חקרנו את תפקידו של ArabidopsisDREB1A בקנה סוכר טרנסגני, תוך התמקדות בהשפעתו על פוטוסינתזה, יחסי מים ותכונות יבול בתנאי עקת מים. תפקידם של חלבונים קושרי DRE (DREB) בוויסות סובלנות לעקת מים דווח בעבר 27,29,30. לדוגמה, Kasuga et al. הבחינו כי DREB מווסת באופן חיובי את ביטוי רצף ה-DRE ב-Arabidopsis thaliana31. יתר על כן, חוקרים רבים הציעו כי קנה סוכר טרנסגני המבטא יתר על המידה DREB1A מציג ביטוי מכונן של גנים המעוררים לחץ ורמות סוכר גבוהות יותר מאשר קנה סוכר מסוג בר 17,28,32,33.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

דור של rd29A: וקטור ביטוי DREB1A (איור 1)
מסגרת הקריאה הפתוחה DREB1A באורך מלא (ORF, 651 bp) הוגברה מ-Arabidopsis thaliana L. cDNA באמצעות פריימרים ספציפיים לגנים המשלבים אתרי הגבלה של BamHI ו-EcoRI: קדימה 5/-GGCGGATCCATGAACTTTTCTGCT-3/ והפוך 5/-GGCGAATTCTTAATAACTCCATAACGA-3/. באופן דומה, מקדם ה-rd29A (499 bp) הוגבר מה-DNA הגנומי של Arabidopsis באמצעות פריימרים המכילים אתרי KpnI ו-BamH I: קדימה 5/-GCG GGTACCCCTATTAGAACGATTAGAG-3/ והפוך 5/-GGCGGATCCGGTGGTTCCTCTCTTTGATCC-3/. תגובות PCR בוצעו בנפח של 25 מיקרוליטר המכיל 2.5 מיקרוליטר של מאגר PCR 10x, 1.5 מ"מ MgCl2, 0.2 מ"מ מכל dNTP, 0.4 מיקרומטר מכל פריימר, 1 U של Taq DNA פולימראז ו-1 מיקרוליטר של תבנית DNA (כ-100 ננוגרם ל-DNA גנומי או 50 ננוגרם ל-cDNA), עם מים נטולי נוקלאז שנוספו לנפח הסופי. תנאי ההגברה של שברי המקדם DREB1A ו-rd29A היו כדלקמן: דנטורציה ראשונית ב-95 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות; 35 מחזורי דנטורציה ב-95 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, חישול ב-58 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, והארכה ב-72 מעלות צלזיוס למשך דקה; ואחריה הארכה סופית ב-72 מעלות צלזיוס למשך 7 דקות. מוצרים מוגברים נפתרו על ג'ל אגרוז 0.7% וטוהרו בג'ל באמצעות ערכת מיצוי ג'ל על פי פרוטוקול היצרן.

מוצרי ה-PCR המוגברים של מקדם DREB1A ו-rd29A שובטו לתוך וקטור השיבוט, pTZ57R/T, באמצעות שיבוט TA, והמוצרים עברו ריצוף סנגר לאישור. רצף DREB1A (מס' הצטרפות. AM992886) הוגש ל-GenBank (מקדם rd29A הוכנס לאתרי KpnI ו-BamHI, ורצף הקידוד DREB1A הוכנס במורד הזרם לאתרי BamHI ו-EcoRI, ובכך החליף את מקדם ה-2x35S המקורי ומיקם את DREB1A בשליטת rd29A. הקסטה הסופית (rd29A::DREB1A::CamV) נכרתה באמצעות KpnIו-EcoRV ושובטה לאזור T-DNA של הווקטור הבינארי pGA482 כדי ליצור את המבנה המשמש לטרנספורמציה של הצמח (איור 1). לאחר ריצוף סנגר הראשוני לאימות המוצרים המשובטים, לא בוצע אימות ריצוף נוסף.

ניתוח רצף גנים
באמצעות הכלי הביואינפורמטי המוזכר, בוצע ניתוח פילוגנטי של רצפי החלבונים של AtDREB1A ו-DREB1 מ-13 מיני דיקוט ומונוקוט שונים והושווה בשיטת הצטרפות השכנים. רצפי חומצות האמינו נאספו מפיטוזום (http://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html) ובנק הג'נבנק (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/). ניתוח יישור רצפים מרובים בוצע באמצעות התוכנית המקוונת Clustal Omega. לאחר שהרצפים החיוניים נרכשו מ-Phytozome ו-GenBank, אין צורך באחזור רצף נוסף.

הכנת אקספלנטים ואקדח אינדוקציה יבלות20,34
זן קנה הסוכר גדל בשדה הניסויי ב-NIBGE, פייסלאבאד. לאחר 6 חודשים, החלק העליון של המקל הבריא נכרת כדי להחזיר את האזור האפיקלי, שנחתך לניצן הסופי. בתנאים סטריליים, גלילי העלים קולפו למקטעים גליליים של ~5 מ"מ ופני השטח עוקרו עם 70% אתנול. מהאזור שמעל המריסטם האפיקלי, הוכנו כ-10-15 דיסקים אפיקליים (~3 מ"מ גודל) לכל קנה. הדיסקים תורבתו על מדיום אינדוקציה של יבלות (CIM) כפי שתואר קודם לכן 1,20,34. לאחר 4-6 שבועות, הקאלי העוברי שנוצר עבר תת-תרבית על CIM טרי להמשך התפשטות. הערה: השימוש ב-70% אתנול לחיטוי פני השטח נמצא מספיק, ולא נדרשו שלבי עיקור נוספים.

טרנספורמציה גנטית של rd29A: DREB1A בקנה סוכר באמצעות אקדח גנים20,34
היבלת העוברית המתפשטת סודרה במרכז צלחת הפטרי המכילה CIM. לאחר 3 ימים, הקאלי הופצצו בווקטור בינארי מצופה זהב, pGA482, המכיל rd29A: DREB1A, באמצעות אקדח ביוליסטי PDS-1000/He כמתואר בפירוט34. לאחר ההפצצה, חלקים קטנים של קאלי תורבו ב-CIM במשך 3 ימים והונחו בחושך ב-26 ±-2 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הקאלי תורבת על מדיום בחירת יבלות (CSM) המכיל 60 מ"ג/ליטר גנטיצין, תת-תרבית על CSM כל 10 ימים, והונחו בחושך בטמפרטורה של 26 ± 2 מעלות צלזיוס.

לאחר 30 יום, קאלי בריא תורבת על מדיום בחירת רגנרציה (RSM) המכיל אנטיביוטיקה של 60 מ"ג/ליטר כדי לקבל יורה. הלוחות הונחו בחדר גידול למשך 4 שבועות בטמפרטורה מבוקרת (26 ± 2 מעלות צלזיוס), 16 שעות/8 שעות אור אור/חושך, עוצמת אור של 500 מיקרומול m-2 s-1 ולחות מבוקרת35. יורה הבריאות המחודשת תורבתה על מדיום ברירה (RtSM) המכיל אנטיביוטיקה של 60 מ"ג/ליטר בצנצנות זכוכית והונחה בחדר הגידול בתנאים שהוזכרו לעיל. לאחר 4-6 שבועות הועברו טרנספורמטורים משוערים לעציצי פלסטיק קטנים המכילים אדמה חולית מעוקרת והונחו בחדר הגידול בתנאים שהוזכרו לעיל. אין צורך בתת-תרבות נוספת במדיום בחירת יבלות (CSM) מעבר ל-10 ימים.

אישור מולקולרי של צמחי קנה סוכר טרנסגניים
כפי שתואר קודם לכן, DNA גנומי בודד מהעלים הצעירים של שתילי קנה סוכר טרנסגניים משוערים בשיטת מיצוי CTAB36. איכות וריכוז ה-DNA הוערכו באמצעות ספקטרופוטומטר NanoDrop ואלקטרופורזה של ג'ל אגרוז. הגברת PCR של גן הסמן הניתן לבחירה nptII (750 bp) והטרנסגן DREB1A (651 bp) בוצעה באמצעות פריימרים ספציפיים לגן המפורטים בטבלה 1. כל תגובת PCR של 25 מיקרוליטר הכילה 1x מאגר PCR, 2.5 מ"מ MgCl₂, 0.2 מ"מ dNTPs כל אחד, 0.4 מיקרומטר מכל פריימר, 1 U של Taq DNA פולימראז, ~100 ננוגרם של DNA גנומי ומים נטולי יונים לנפח. התגובות בוצעו בתרמו-סייקלר בתנאים הבאים: דנטורציה ראשונית ב-95 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות; 35 מחזורים של 94 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, 58 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, 72 מעלות צלזיוס למשך 45 שניות; ואחריה הארכה סופית ב-72 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. מוצרי PCR נפתרו על ג'ל אגרוז 1% והודגמו באור UV כדי לאשר הגברה. צמחים טרנסגניים חיוביים ל-PCR (T0) הועברו לאחר מכן לעציצי חרס גדולים והוקשחו בסביבת חממה מבוקרת עד לבגרות. עם ההתבגרות, מקטעי קנה מחמישה אירועי T₁ שאושרו באקראי על ידי PCR נשתלו והופצו במיקרו-חלקות למשך 12 חודשים כדי ליצור מספיק קבוצות שיבוט לניסוי עקת הבצורת. הערה: לאחר אישור הגנים nptII ו-DREB1A , לא בוצעו הגברות PCR נוספות.

מחקר ביטוי DREB1A
הביטוי היחסי של DREB1A בעלים לחוצים של צמחי קנה סוכר טרנסגניים ולא טרנסגניים כומת באמצעות PCR בזמן אמת (qPCR). סך ה-RNA בודד מ~100 מ"ג של רקמת עלים באמצעות מגיב המיצוי על פי פרוטוקול היצרן. איכות ה-RNA אומתה על ידי אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז וכומתה באמצעות ספקטרופוטומטר. עבור כל דגימה, 2 מיקרוגרם של RNA תומלל לאחור באמצעות ערכת סינתזת cDNA בהתאם להוראות הספק, עם פריימרים oligo(dT).

ה-cDNA שהתקבל שימש כתבנית להגברת DREB1A של 188 bp באמצעות פריימרים ספציפיים לגנים: קדימה 5'-ACAGAGGAGTTCGTCGGAGA-3' והפוך 5'-GAGTCTCCAAGCCGAGTCAG-3'. כל תגובת qPCR של 25 מיקרוליטר הכילה 12.5 מיקרוליטר של 2x SYBR Green qPCR Master Mix, 0.4 מיקרומטר מכל פריימר, 2 מיקרוליטר של cDNA מדולל (תבנית ~100 ננוגרם), ומים נטולי נוקלאז כדי להביא את הנפח ל-25 מיקרוליטר. התגובות בוצעו בשלוש עותקים על מחזורי תרמי באמצעות התוכנית הבאה: דנטורציה ראשונית ב-95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, ואחריהם 40 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, 56 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות ו-72 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, עם הארכה סופית ב-72 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.

כדי לאשר את היעילות והליניאריות של תגובות ה-qPCR, נוצרה בתחילה עקומה סטנדרטית באמצעות דילולים סדרתיים פי 10 של DNA פלסמיד המכיל את שבר ה-DREB1A המשובטים. עם זאת, עבור ניתוח ביטוי, כימות יחסי בוצע בשיטת 2−ΔΔCt 37. הגן אקטין שימש כהתייחסות אנדוגנית, ורמת הביטוי של DREB1A בכל קו טרנסגני נורמלה לזו של הביקורת מסוג הבר. כל ערכיה-Ct נאספו באמצעות הגדרות בסיס וסף אוטומטיות המומלצות על ידי תוכנת המכשיר. רק עקומות התכה עם פסגות בודדות וחדות התקבלו, מה שאישר את הספציפיות. RNA איכותי ולא מתפרק היה חיוני לכימות מדויק. דגימות RNA לא טהורות או מושפלות לא נכללו כדי להימנע מפגיעה באמינות של סינתזת cDNA וניתוח ביטוי גנים במורד הזרם.

מחקר על שינויים בתיווך DREB1A בקנה סוכר: ניסוי עקת מים20,34
לאחר שנה נזרעו שלושה שכפולים של חמישה מקטעי קנים (שני צמתים/מקטעים) של צמחים טרנסגניים ולא טרנסגניים (מסוג בר) בעומק של 5 ס"מ בעציצי חרס המכילים 18 ק"ג אדמה (ECe 1.34; SAR 2.72; pH 7.8). שלושה משטרי עקת מים: 100, 80 ו-60% FC יושמו (טבלה 2). פעילות פוטוסינתטית של קנה סוכר (PN, E ו-gs) ויחסי מים של צמחים (Ψw, Ψs ו-RWC) נחקרו לאחר 12 חודשים. אל תשנה את משטרי המים שנקבעו, מכיוון שזה ישפיע על עקביות הטיפולים.

קביעת פעילות פוטוסינתטית
לאחר 180 יום של עקת מים, פרמטרים של חילופי גזים - קצב פוטוסינתטי (PN), קצב דיות (E) ומוליכות פיוניות (gs) - נמדדו הן בצמחי קנה סוכר טרנסגניים והן בצמחי בר באמצעות מערכת פוטוסינתזה ידנית ניידת. המדידות נלקחו בין השעות 09:00 ל-11:00 בבוקר באמצעות העלה השלישי המורחב במלואו מהחלק העליון של כל צמח. העלה שנבחר הוכנס בעדינות לתא העלים השקוף המובנה (3 ס"מ2 clamp שטח), מה שמבטיח מגע מלא ללא קמטים או חסימה. תנאי הסביבה תועדו בזמן אמת על ידי המערכת, בעוד שעוצמת האור נשמרה על כ-1,000 מיקרומול m-2 s-1 באור שמש טבעי. המכשיר הותר לשיווי משקל למשך 30-60 שניות עד שהתקבלו קריאות מצב יציב להטמעת CO2 וחילופי אדי מים. החיישנים הפנימיים של המכשיר רשמו אוטומטית את טמפרטורת העלה, הלחות היחסית וריכוז ה-CO2 הסביבתי. עבור כל גנוטיפ וטיפול, המדידות שוכפלו על לפחות שלושה צמחים בלתי תלויים ביולוגית, והנתונים אוחסנו באופן פנימי ומאוחר יותר יוצאו לניתוח. הקפדה על שמירה על תנאים סביבתיים עקביים על פני שכפולים כדי להבטיח את אמינות הנתונים.

קביעת פוטנציאל מי עלים ופוטנציאל אוסמוטי
פוטנציאל המים (Ψw) של העלה השלישי המורחב במלואו מראש הצמחים נקבע באמצעות תא לחץ מסוג Scholander. לאחר מכן העלים הוקפאו בטמפרטורה של -20 מעלותצלזיוס בצינורות של 1.5 מ"ל, ומיץ התאים שהתקבל מהעלים הקפואים שימש לניתוח פוטנציאל אוסמוטי (Ψs) באמצעות האוסמומטר.

קביעת תכולת המים היחסית של העלים
תכולת המים של עלי הצמח הטרנסגניים והפראיים נבדקה בפירוט. המשקולות הטריות של העלים נמדדו, והעלים הוטבלו במים מזוקקים למשך הלילה. לאחר מכן, נרשם משקלם העכור של העלים, ואילו המשקל היבש נקבע על ידי דגירה של העלים ב-70 מעלות צלזיוס למשך 72 שעות. עלה RWC חושב באמצעות הנוסחה הבאה:

figure-protocol-1
הערה: כדי לנתח במדויק את הפוטנציאל האוסמוטי באמצעות אוסמומטר, יש להקפיא עלים בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס לאחר קביעת פוטנציאל המים.

תכונות תשואה
תכונות תפוקת קני הסוכר נמדדו בשלב הקציר, כגון גובה קנה סוכר (ס"מ), קוטר, מספר קני טחינה, בריקס (%), וביומסה של נבטים ושורשים.

ניתוחים סטטיסטיים
ניסויי שדה (מבוקרים באמצעות גדר) בוצעו באמצעות פריסת עיצוב בלוק שלם אקראי עם שלושה שכפולים לכל טיפול (חמישה צמחים לכל שכפול; n = 15). בוצע ניתוח דו-כיווני של שונות כדי לנתח את השינויים בתכונות אגרונומיות ופיזיולוגיות שונות ברמת מובהקות של P ≤ 0.05.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

אפיון מולקולרי של קווים טרנסגניים של קנה סוכר
קלטת הביטוי rd29A: DREB1A נבנתה ושובטה בווקטור הבינארי pGA482 הניתן לביטוי צמחי (איור 1), אשר לאחר מכן הוסב לגנום קנה הסוכר באמצעות טכניקת הטרנספורמציה המתווכת ביוליסטית ופיתח בהצלחה שתילי קנה סוכר טרנסגניים כמתואר (איור 2). נוכחותם של טרנסגנים בקווי קנה סוכר אושרה על ידי הגברת שברי 750 bp ו-651 bp ספציפיים לסמן nptII ולגנים DREB1A , בהתאמה. השברים האלה נעדרו בצמחי קנה ס...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

פיתוח עמידות ללחץ מים בצמחים הוא חיוני עקב ההתרחבות המתמשכת של אזורים מועדים לבצורת ברחבי העולם. כגישה ביוטכנולוגית אפשרית, חקרנו את תפקידו של DREB1A בסבילות לעקת מים בקווי קנה סוכר טרנסגניים. מחקרים קודמים דיווחו על תפקידו של גורם השעתוק DREB1A בהשראת ביטוי של גנים מרובים המעניקים סובלנות ללחץ אביוטי 28,38,39,40,41.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגודי אינטרסים להצהיר עליהם.

תודות

חוקרים תומכים בפרויקט הנסיכה נורה בינת עבד אלרחמן (PNURSP2025R39), אוניברסיטת הנסיכה נורה בינת עבד אלרחמן, ריאד, ערב הסעודית.

זמינות נתונים:
כל הנתונים מסופקים במאמר זה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
וקטור שיבוט, pTZ57R/TFermentas, Vilnius, ליטא
מנתח חילופי גז אינפרא אדוםביו-רד, קליפורניה, ארה"ב
אוסמומטרביו-רד, קליפורניה, ארה"ב
מכונת PCRביו-רד, קליפורניה, ארה"ב
PDS-1000/He אקדח ביולוגיThermoFisher Sceintific Inc, ארה"ב
PCR בזמן אמתThermoFisher Sceintific Inc, ארה"ב
ערכת סינתזה cDNA של RevertAidCI-340, CID Bio-Science, Inc., ארה"ב
תא לחץ מסוג Scholanderמכשירי סקיי, לנדרינדוד וולס, ברמינגהאם, בריטניה
מגיב טריזולWescor-5500, לוגן, יוטה, ארה"ב

מקורות

  1. Ali, S., et al. Climate change and its impact on the yield of major food crops: evidence from Pakistan. Foods. 6 (6), 39(2017).
  2. Farooq, N., Gheewala, S. H. Water use and deprivation potential for sugarcane cultivation in Pakistan. Journal of Sustainable Energy & Environment. 10, 33-93 (2019).
  3. Grass Phylogeny Working Group. Phylogeny and subfamilial classification of the grasses (Poaceae). Ann Mo Bot Gard. 88 (3), 373-457 (2001).
  4. Gibson, D. Grasses and grassland ecology. , Oxford University Press. New York. (2009).
  5. CarmoSilva, A. E., Powers, S. J., Keys, A. J., Arrabaça, M. C., Parry, M. A. Photorespiration in C grasses remains slow under drought conditions. Plant Cell Environ. 31 (7), 925-940 (2008).
  6. Pinto, H., Powell, J. R., Sharwood, R. E., Tissue, D. T., Ghannoum, O. Variations in nitrogen use efficiency reflect the biochemical subtype while variations in water use efficiency reflect the evolutionary lineage of C4 grasses at interglacial CO2. Plant Cell Environ. 39 (3), 514-526 (2016).
  7. Jobe, T. O., Zenzen, I., Rahimzadeh Karvansara, P., Kopriva, S. Integration of sulfate assimilation with carbon and nitrogen metabolism in transition from C3 to C4 photosynthesis. J Exp Bot. 70 (16), 4211-4221 (2019).
  8. Ye, Z. P., et al. Quantifying light response of leafscale wateruse efficiency and its interrelationships with photosynthesis and stomatal conductance in C3 and C4 species. Front Plant Sci. 11, 374(2020).
  9. Dingre, S., Gorantiwar, S. Determination of the water requirement and crop coefficient values of sugarcane by field waterbalance method in a semiarid region. Agric Water Manag. 232, 106042(2020).
  10. Hess, T. M., et al. A sweet deal? Sugarcane, water and agricultural transformation in subSaharan Africa. Global Environmental Change. 39, 181-194 (2016).
  11. Tammisola, J. Towards much more efficient biofuel crops-can sugarcane pave the way. GM Crops. 1 (4), 181-198 (2010).
  12. Pissolato, M. D., et al. Enhanced nitric oxide synthesis through nitrate supply improves drought tolerance of sugarcane plants. Front Plant Sci. 11, 970(2020).
  13. Diniz, C. A., et al. RB0442drought tolerant sugarcane cultivar. Crop Breed Appl Biotechnol. 19 (4), 466-470 (2019).
  14. Deng, Q., Dou, Z., Chen, J., Wang, K., Shen, W. Drought tolerance evaluation of intergeneric hybrids of BC3F1 lines of Saccharum officinarum × Erianthus arundinaceus. Euphytica. 215 (12), 1-13 (2019).
  15. Shahid, M., Khan, F., Saeed, A., Fareed, I. Variability of red rotresistant somaclones of sugarcane genotype S97US297 assessed by RAPD and SSR. Genet Mol Res. 10 (3), 1831-1849 (2011).
  16. Khan, M. A., et al. Evaluation of new sugarcane genotypes developed through fuzz: correlation of cane yield and yield components. Pakistan J Applied Sci. 3 (4), 270-273 (2003).
  17. De Paiva Rolla, A. A., et al. Phenotyping soybean plants transformed with RD29A:AtDREB1A for drought tolerance in the greenhouse and field. Transgenic Res. 23 (1), 75-87 (2014).
  18. Bihmidine, S., et al. Activity of the Arabidopsis RD29A and RD29B promoter elements in soybean under water stress. Planta. 237 (1), 55-64 (2013).
  19. Chaves, M., Davies, B. Drought effects and water use efficiency: improving crop production in dry environments. Funct Plant Biol. 37 (2), iii-vi (2010).
  20. Raza, G., et al. Overexpression of an H+PPase gene from Arabidopsis in sugarcane improves drought tolerance, plant growth and photosynthetic responses. Turkish J Biol. 40 (1), 109-119 (2016).
  21. Augustine, S. M., et al. Overexpression of EaDREB2 and pyramiding of EaDREB2 with the pea DNA helicase gene (PDH45) enhance drought and salinity tolerance in sugarcane (Saccharum spp. hybrid). Plant Cell Rep. 34 (2), 247-263 (2015).
  22. Reis, R. R., et al. Induced overexpression of AtDREB2ACA improves drought tolerance in sugarcane. Plant Sci. 221 - 222, 59-68 (2014).
  23. Molinari, H. B. C., et al. Evaluation of the stressinducible production of proline in transgenic sugarcane (Saccharum spp.): osmotic adjustment, chlorophyll fluorescence and oxidative stress. Physiologia Plantarum. 130 (2), 218-229 (2007).
  24. Zhang, S. Z., et al. Expression of the Grifola frondosa trehalose synthase gene and improvement of droughttolerance in sugarcane (Saccharum officinarum L.). J Integr Plant Biol. 48 (4), 453-459 (2006).
  25. Iwasaki, T. The dehydrationinducible RD17 (COR47) gene and its promoter region in Arabidopsis thaliana (accession no. AB004872). Plant Physiol. 115, 1287(1997).
  26. YamaguchiShinozaki, K., Shinozaki, K. A novel cisacting element in an Arabidopsis gene is involved in responsiveness to drought, lowtemperature or highsalt stress. Plant Cell. 6 (2), 251-264 (1994).
  27. Li, X., et al. Heterologous expression of the Arabidopsis DREB1A/CBF3 gene enhances drought and freezing tolerance in transgenic Lolium perenne plants. Plant Biotechnol Rep. 5, 61-69 (2011).
  28. Saint Pierre, C., Crossa, J. L., Bonnett, D., YamaguchiShinozaki, K., Reynolds, M. P. Phenotyping transgenic wheat for drought resistance. J Exp Botany. 63 (5), 1799-1808 (2012).
  29. Qin, F., et al. Regulation and functional analysis of ZmDREB2A in response to drought and heat stresses in Zea mays L. Plant J. 50 (1), 54-69 (2007).
  30. Shinozaki, K., YamaguchiShinozaki, K. Molecular responses to drought and cold stress. Curr Opin Biotechnol. 7 (2), 161-167 (1996).
  31. Kasuga, M., Liu, Q., Miura, S., YamaguchiShinozaki, K., Shinozaki, K. Improving plant drought, salt and freezing tolerance by gene transfer of a single stressinducible transcription factor. Nat Biotechnol. 17 (3), 287-291 (1999).
  32. Morran, S., et al. Improvement of stress tolerance of wheat and barley by modulation of expression of DREB/CBF factors. Plant Biotechnol J. 9 (2), 230-249 (2011).
  33. Liu, Q., et al. Two transcription factors, DREB1 and DREB2, with an EREBP/AP2 DNAbinding domain separate two cellular signal transduction pathways in drought and lowtemperatureresponsive gene expression, respectively, in Arabidopsis. Plant Cell. 10 (8), 1391-1406 (1998).
  34. Raza, G. Engineering drought tolerance in sugarcane (Saccharum officinarum L.). , QuaidiAzam University. Islamabad, Pakistan. (2013).
  35. Basso, M. F., et al. Improved genetic transformation of sugarcane (Saccharum spp.) embryogenic callus mediated by Agrobacterium tumefaciens. Curr Protoc Plant Biol. 2 (3), 221-239 (2017).
  36. Richards, E., Reichardt, M., Rogers, S. Preparation of genomic DNA from plant tissue. Curr Protoc Mol Biol. 27 (1), 2.3.1-2.3.7 (1994).
  37. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using realtime quantitative PCR and the 2^-ΔΔCT method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  38. Blum, A. Drought resistance, wateruse efficiency and yield potential-are they compatible, dissonant or mutually exclusive. Australian J Agricultural Res. 56 (11), 1159-1168 (2005).
  39. Pinto, R. S., et al. Heat and drought adaptive QTL in a wheat population designed to minimize confounding agronomic effects. Theor Appl Genet. 121 (6), 1001-1021 (2010).
  40. Li, T., et al. a DREBbinding transcription factor from Daucus carota, enhances drought tolerance in transgenic Arabidopsis thaliana and modulates lignin levels by regulating ligninbiosynthesisrelated genes. Environ Exp Bot. 169, 103896(2020).
  41. Nie, J., et al. The AP2/ERF transcription factor CmERF053 of Chrysanthemum positively regulates shoot branching, lateral root and drought tolerance. Plant Cell Rep. 37, 1049-1060 (2018).
  42. Kasuga, M., Miura, S., Shinozaki, K., YamaguchiShinozaki, K. A combination of the Arabidopsis DREB1A gene and stressinducible RD29A promoter improved drought and lowtemperature stress tolerance in tobacco by gene transfer. Plant Cell Physiol. 45 (3), 346-350 (2004).
  43. Datta, K., et al. Overexpression of Arabidopsis and rice stressgeneinducible transcription factors confers drought and salinity tolerance to rice. Plant Biotechnol J. 10 (5), 579-586 (2012).
  44. Ravikumar, G., et al. Stressinducible expression of AtDREB1A transcription factor greatly improves drought stress tolerance in transgenic indica rice. Transgenic Res. 23 (3), 421-439 (2014).
  45. BhatnagarMathur, P., et al. Stressinducible expression of AtDREB1A in transgenic peanut (Arachis hypogaea L.) increases transpiration efficiency under waterlimiting conditions. Plant Cell Rep. 26, 2071-2082 (2007).
  46. Qin, F., et al. Cloning and functional analysis of a novel DREB1/CBF transcription factor involved in coldresponsive gene expression in Zea mays L. Plant Cell Physiol. 45 (8), 1042-1052 (2004).
  47. Pellegrineschi, A., et al. Stressinduced expression in wheat of the Arabidopsis thaliana DREB1A gene delays water stress symptoms under greenhouse conditions. Genome. 47 (3), 493-500 (2004).
  48. Li, X. P., et al. Soybean DREbinding transcription factors that are responsive to abiotic stresses. Theor Appl Genetics. 110, 1355-1362 (2005).
  49. Gao, S. Q., et al. A cotton (Gossypium hirsutum) DREbinding transcription factor gene, GhDREB, confers enhanced tolerance to drought, high salt and freezing stresses in transgenic wheat. Plant Cell Rep. 28, 301-311 (2009).
  50. Dubouzet, J. G., et al. OsDREB genes in rice (Oryza sativa L.) encode transcription activators that function in drought, highsalt and coldresponsive gene expression. Plant J. 33 (4), 751-763 (2003).
  51. Morgan, J. M. Osmoregulation and water stress in higher plants. Annu Rev Plant Physiol. 35, 299-319 (1984).
  52. Gupta, A. S., Berkowitz, G. A. Osmotic adjustment, symplast volume and nonstomatal water stress inhibition of photosynthesis in wheat. Plant Physiol. 85 (4), 1040-1047 (1987).
  53. Gunasekera, D., Berkowitz, G. A. Evaluation of contrasting cellularlevel acclimation responses to leaf water deficits in three wheat genotypes. Plant Sci. 86 (1), 1-12 (1992).
  54. Brini, F., Hanin, M., Mezghani, I., Berkowitz, G. A., Masmoudi, K. Overexpression of wheat Na⁺/H⁺ antiporter TNHX1 and H⁺pyrophosphatase TVP1 improve salt and droughtstress tolerance in Arabidopsis thaliana plants. J Exp Bot. 58 (2), 301-308 (2007).
  55. Vadez, V., Rao, S., Sharma, K., BhatnagarMathur, P., Devi, M. J. DREB1A allows for more water uptake in groundnut by a large modification in the root/shoot ratio under water deficit. Journal of SAT Agricultural Research. 5 (1), 1-5 (2007).
  56. Vadez, V., Rao, J. S., BhatnagarMathur, P., Sharma, K. DREB1A promotes root development in deep soil layers and increases water extraction under water stress in groundnut. Plant Biol. 15 (1), 45-52 (2013).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

DREB1A
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.