הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

פרוטוקול חזק וניתן לשחזור ליצירת אורגנואיד מצינורות עצביים מתאי גזע עובריים בעכבר יחיד

465 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/67883

⸱

19 בדצמבר 2025

 , 
1Vienna BioCenter, Institute of Molecular Biotechnology of the Austrian Academy of Sciences (IMBA), 2Vienna BioCenter PhD Program, Doctoral School of the University of Vienna and Medical University of Vienna

במאמר זה

סיכום

אורגנואידים תלת-ממדיים של צינור עצבי (NTOs) שמקורם בתאי גזע עובריים של עכבר הם כלים חשובים לחקר מערכת העצבים המרכזית בהתפתחות המוקדמת. כאן מוצגת הדגמה שלב אחר שלב של פרוטוקול אופטימלי לגידול NTO במבחנה, המספק תנאי תרבית יציבים ואסטרטגיות פתרון תקלות ליצירת NTO אמינה וניתנת לשחזור.

תקציר

התפתחות היונקים היא תהליך מורכב מאוד, המאופיין בצורך באיתות מדויק תלוי ריכוז ובזמן ליצירת דפוסים נכונים ומורפוגנזה. למרות התקדמות טכנולוגית משמעותית וידע שנאספ, היבטים רבים של התפתחות היונקים נותרו חמקמקים. כאשר בוחנים את כל האורגניזם, קשה להפריד את השפעות המסלולים הבודדים או את המנגנון שבו גירויים חיצוניים מנחים את ההפרעה של רקמות וגורמים סביב. בהתמודדות עם מורכבות זו, מודלים תלת-ממדיים (תלת-ממדיים) במבחנה כמו אורגנואידים הפכו לכלים חשובים. אורגנואידים, שמקורם בתאי גזע עובריים (ESCs) או מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs), מציגים תכונות דמויות רקמה הדומות מאוד למקביליהם ב-in vivo מבחינת דפוסי ביטוי ותפקוד. חשוב לציין, הם מציעים נגישות למניפולציה ומחקרים ביולוגיים נרחבים במסגרת ניסוי מבוקר. למרות שמקורן בתרבויות פלוריפוטנטיות, מערכות אורגנואידיות לעיתים קרובות מציגות הטרוגניות וגיוון משמעותי, מה שמגביל את תועלתן בלימוד שאלות ביולוגיות מורכבות ומורכבות. לכן, יש צורך דחוף בפרוטוקולים מפורטים שמטרתם לאחד פרוצדורות שמובילות לנתונים איכותיים וניתנים לשחזור, להפחתת החומרים בשימוש, וחשוב מכך, לאפשר חקירה של תופעות מסובכות. בהקשר זה, מוצג כאן פרוטוקול אופטימלי לגידול אורגנואידים של צינורות עצבים (NTOs) במבחנה . על ידי יצירת תנאי תרביות יציבים והצעת אסטרטגיות פתרון תקלות מקיפות, פרוטוקול זה מאפשר יצירת NTOs אמינה וניתנת לשחזור, המשמשים כמודל מספק לחקר שאלות מדעיות רלוונטיות, כולל מנגנוני השראת עצבים, דפוסים והתפתחות מוקדמת של מערכת העצבים המרכזית.

מבוא

התפתחות יונקים, שמתחילה מתא גזע טוטיפוטנטי יחיד, היא תהליך מורכב הכולל השראה של יצירת דפוסים ומורפוגנזה 1,2. פיתוח זה דורש תוכניות תאיות מפוקחות היטב לניהול אינטראקציות דינמיות בין התאים לסביבתם. לתאי גזע יש יכולת פנימית לחוש, לשלב ולהגיב לאותות מערכתיים ומקומיים, כולל גרדיאנטים של מורפוגן3, גבולות מכניים4, התרבות תאית ועיצוב מחדש סביבתי. רמזים מרחביים-זמניים חיצוניים גם מניעים תגובות רב-תאיות, בתחילה, ברקמות הומוגניות, כדי להבטיח היווצרות מדויקת של מבנים מורכבים. תאי גזע, המזוהים ביכולת התחדשות עצמית 6,7 וביכולות התמיינות, ממלאים תפקיד מרכזי בהתפתחות עוברית ובתיקון רקמות בוגרות, כאשר הסוגים העיקריים כוללים תאי גזע עובריים (ESCs), תאי גזע בוגרים (ASCs) ותאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs).

ESCs מופקים ממסת התא הפנימית (ICM) של בלסטוציסט ובדרך כלל מתרבתים בסביבה דו-ממדית (2D) על תאי הזנה או מטריצה חוץ-תאית באמצעות מדיום תרבית ספציפי לשמירה על פלוריפוטנציה8. בשנים האחרונות, הצורך בתנאים וטכנולוגיות ריאליסטיות יותר של תרביות תאים גדל באופן דרסטי, ולכן הוקמו מודלים תלת-ממדיים (תלת-ממדיים) של תאים ורקמות לחקר תהליכים ביו-רפואיים בסיסיים9. במיוחד בביולוגיה התפתחותית, מודלים תלת-ממדיים אלה כמו אורגנואידים מציעים שיטה איתנה למידול מורפוגנזה של רקמות ואורגנוגנזה אקס ויבו9. אורגנואידים נוצרים דרך ארגון עצמי של תאי גזע מתרבים, המתפתחים באופן ספונטני למבנים תלת-ממדיים מורכבים דרך שבירת סימטריה ויצירת דפוסים. תהליך זה דומה, אם כי אינו זהה למה שנצפה ב-vivo, ומתרחש ברובו ללא הכוונה חיצונית אלא מונע על ידי דינמיקות פנימיות ואינטראקציות10. מכיוון שאורגנידים מחקים מקרוב את המבנה והתפקוד של האיברים האמיתיים, הם יכולים לספק ייצוג מדויק יותר של ביולוגיית יונקים בהשוואה לתרביות תאים דו-ממדיותמסורתיות. בנוסף, אחד היתרונות המרכזיים הוא היתרון האתי, שכן אורגנואידים מפחיתים את הצורך במודלים של בעלי חיים, ומטפלים בדאגות הקשורות לניסויים בבעלי חיים12,13. יתרה מזאת, אורגנואידים מציעים פלטפורמה לסקר תרופות בתפוקה גבוהה, המשפרת את חיזוי יעילות התרופה ורעילותן. עם זאת, קיימים גם מספר אתגרים הקשורים לשימוש באורגנואידים. למרות שהן ריאליסטיות יותר מתרביות דו-ממדיות, הן אינן משכפלות במלואן את המורכבות והאינטראקציות של איברים שלמים בתוך אורגניזםחי. בנוסף, ניתן לראות שונות משמעותית בין אורגנואידים, גם כאשר הם נגזרים מאותו סוג תאים, מה שמוביל לאי-עקביותבתוצאות הניסוי. לכן, גידול אורגנידים בצורה חזקה וניתנת לשחזור הוא חיוני ודורש מיומנויות טכניות מתקדמות, ציוד מיוחד ופרוטוקולים מפורטים.

מערכת העצבים היא רשת מורכבת האחראית לתיאום פעולות ולעיבוד מידע חושי על ידי שליחת וקבלת אותות ברחבי הגוף, ובכך שולטת ומתאמת את כל הפונקציות הנדרשות, כולל תנועה, תחושה, חשיבה ותפקודים אוטונומיים כמו דופק ועיכול. הקדמון למערכת העצבים המרכזית, המורכבת מהמוח והחוט השדרה, הוא צינור העצב. חשוב להבין כיצד מבנים עצביים נוצרים ומתפקדים בהתפתחות מוקדמת של צינורות עצבים כדי לקבל תובנות לגבי הפרעות נוירולוגיות שונות וחריגות התפתחותיות. הפרעות נוירו-התפתחותיות הן אתגר לחקר בתוך החיים, במיוחד כאשר הן נובעות מנבדקים אנושיים בשל חששות אתיים. אורגנואידים עצביים, כגון אורגנואידים מוחיים 16,17, שיפרו משמעותית את ההבנה של התפתחות ומחלות מערכת העצבים על ידי מתן מודלים גמישים ונגישים המדמים במידה רבה את רקמת המוח האנושית. מבנים תלת-ממדיים אלו, שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים (PSCs), משכפלים היבטים שונים של התפתחות המוח, כולל יצירת אזורים מובחנים במוח, גיוון תאים ורשתות עצביות מורכבות 16,18,19. על ידי מתן אפשרות לחוקרים לצפות בשלבי התפתחות בזמן אמת ולחקור מנגנוני ויסות מרכזיים, אורגנואידים אלו מציעים תובנות עמוקות על התפתחות מוח תקינה. אורגנואידים במוח מאפשרים גם מידול של מחלות נוירו-התפתחותיות19 ומחלות ניווניות נוירודגנרטיביות20, כגון מיקרוצפליה 16,21, זיהום נגיף זיקה22, הפרעות ספקטרום האוטיזם23 ואחרות, ומבהירים מנגנוני מחלה ומזהים מטרות טיפוליות פוטנציאליות. בנוסף, אורגנואידים במוח משמשים כפלטפורמות חשובות לבדיקות ופיתוח סמים, מקלים על הערכת יעילות ורעילות תרופתית בסביבה דמוית מוח אנושי ומאיצים גישות רפואיות מותאמות אישית. יתרה מזאת, הם מספקים סביבה מבוקרת לחקר אינטראקציות בין גנים לסביבה, ומעשירים את ההבנה של מחלות מורכבות הנובעות מהאינטראקציה בין גורמים גנטיים וסביבתיים. עם זאת, מאחר שאורגנידים עצביים, כמו אורגנואידים במוח, בדרך כלל נוצרים מאגרגטים של תאים, הם לעיתים מציגים הטרוגניות תאית משמעותית ושונות בתוצאות הניסוי, מה שמשפיע בתורו על פרשנות הנתונים שנוצרו, ומציב אתגר משמעותי לחוקרים17. מסיבה זו, אופטימיזציה של פרוטוקולים וקריטריונים מדויקים לבקרת איכות הם קריטיים להחלשת נתונים יקרי ערך המייצגים כראוי את מצב ה-in vivo.

מיינהארדט ועמיתיו24 עשו השפעה מכרעת כאשר דיווחו תחילה על פרוטוקול אורגנואידי עצבי שיבוטי המדמה התפתחות מוקדמת של צינורות עצבים, שנוצר מתאי גזע עובריים בודדים (ESCs) שמפחית באופן דרסטי את ההטרוגניות הבין-אורגנואידית. חידוש זה מאפשר לחוקרים לחקור תהליכים ומנגנונים התפתחותיים, כמו גם דפוסים עצביים, בסביבה מדויקת ומוגדרת ברזולוציה יוצאת דופן. עד כה, מעבדות רבות פיתחו אורגנואידים עצביים, רובם ממקור עכבר או אדם, המדמים חלקים שונים של הצינור העצבי והתפתחותו, כפי שמסוכםבפרק 25. עם זאת, בהתבסס על המידע הזמין, הפרוטוקול שהוקם על ידי מיינהארט ואחרים.24 הוא השיטה היחידה שבה NTOs נוצרים באופן אמין מתא יחיד, מתארגנים את עצמם ומתפתחים ביעילות לגורלות דורסווונטרליים בעקבות פולס גלובלי יחיד של חומצה רטינואית (RA) ללא הוספת גורמי ונטרליזציה אחרים כמו אגוניסט Sonic Hedgehog Agonist (SAG)26, או השימוש בתאי מיקרופלואיד המספקים מידע מרחבי הנובע מהיווצרות גרדיאנט. הפרוטוקול המוצג כאן הותאם ממיינהארט ואח' 24 כפי שנקבע בקרמר ואח' 26. בפרוטוקול זה, ESCs של עכבר בודד מוזרעים במטריצת תרבית תאים ונחשפים לתנאי נוירובדינציאציה מוגדרים. בתוך יומיים, תאים אלה מתרחבים ואפיתליים באופן קלוני, ויוצרים מבנה תלת-ממדי עגול-אליפסואידי עם לומן יחיד ותאים שכבתיים בבסיס האפיקי סביבו. ביום השני, פולס גלובלי של 18 שעות של מולקולת האיתות RA משפר את התמיינות עצבית, מאחורי ה-NTOs מרמות המוח האמצעי לרמות חוט השדרה האחורי/צוורי, וגורם להיווצרות לוח רצפה פונקציונלי יחיד ביום השישי, שמדפס את ה-NTO מהונטרלי לגבי.

הפרוטוקול האופטימלי מציע מספר יתרונות מרכזיים. הוא מאפשר אפיתליאליזציה חזקה בתוך שלושת הימים הראשונים ומייצר רקמות כדוריות קטנות יחסית בקוטר של כ-200 מיקרון, שכל אחת מהן מכילה לומן יחיד. האורגנואידים נוצרים בקלון מתאים בודדים ומתוחזקים במדיום תרבית ללא סרום, מוגדר כימית. בתוך שישה ימים, מושגת התמיינות עצבית הדרגתית מתרביות פלוריפוטנטיות, מה שמוביל לאורגנואידים שמציגים זהות קדמית של המוח האמצעי ביום השישי ומבנים דמויי מוח אחורי או צווארי בדפוס דורסובנטרי לאחר פולס RA גלובלי26.

מספר היבטים הותאמו ושונים מהפרוטוקולהמקורי 22,25 כדי לשפר את השחזוריות והתפוקה. אלה כוללים תנאי תרבית ESC מותאמים, מספר מופחת של תאי קלט, שיפור במדיום התמיינות, ופרוטוקול התמיינות מותאם שמונע תוספת Noggin בימים 0-2 (שכבר שימשוב-26). יתרה מזאת, צפיפות הזריעה מותאמת לשימוש בלוחות עם 96 בארות, מה שמאפשר ניתוח בתפוקה גבוהה. ביחד, השיפורים הללו הובילו לעלייה של 40% ביעילות היווצרות ותבניות NTO, מ-~40% 24 ל-~80% 26 בגרסה המעודכנת.

כאן (איור 1), מסופק תיאור מפורט של פרוטוקול אופטימלי המאפשר יצירת NTOs חזקה וניתנת לשחזור במטריצת תרבית תאים. הפרוטוקול כולל את כל שלבי הטיפול ב-NTO, מהזרעה הראשונית של ESCs לבדיקות התמיינות ועד לתחזוקה, קיבוע וניתוח מאוחרים. הוא כולל גם הנחיות לבקרת איכות באמצעות הערכה חזותית יומית של מורפולוגיית NTO, וכן אפיון קריטי של זהות אורגאנואידים באמצעות צביעת נוגדנים לאימות דפוסים נכונים והבדלות עצבית. בנוסף, מוצעות גישות מקיפות לפתרון תקלות, המאפשרות הערכה ביקורתית בכל שלב בפרוטוקול, הנדרש להבטחת שחזוריות ואמינות של פרוטוקולים ניסיוניים. הוראות מפורטות אלו מסייעות לזהות ולפתור בעיות פוטנציאליות, לצמצם טעויות ולייעל תוצאות. דבר זה חיוני לשמירה על שלמות הניסויים המדעיים ולאפשר למדענים אחרים לשחזר בהצלחה את העבודה ולהסיק מסקנות מקיפות מהנתונים שנוצרו, ובכך לקדם את התחום.

figure-introduction-1
איור 1: סקירה של הפרוטוקול. (א) העברת ESCs (ראו שלב 1.1). (ב) פירוק מטריצת תרבית תאים וזריעה של ESC בודדים לצורך התמיינות ל-NTO (ראו שלב 1.2). (ג) פירוק טיפול ב-RA וב-RA (ראו שלב 2). (ד) הסרת דלקת מפרקים שגרונית ושגרת החלפת מדיום יומית (ראו שלב 3). דמות זו נוצרה עם BioRender.com. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הערה: בדקו מדי יום תאים ו-NTO להערכת איכות לפני כל הליך נוסף (החלפת מדיום, טיפול, קיבוע וכו'). כל ההליכים הדורשים חשיפה ישירה של תאים לאוויר חייבים להתבצע בתוך ארון בטיחות ביולוגית כדי להבטיח סטריליות ולמנוע זיהום של התרבית.

1. תחזוקה, העברת וזריעה של ESCs של עכברים לצורך התמיינות NTO

  1. מעבר
    1. שמרו את ה-ESCs על קלחות תרביות תאים או בארות של צלחת עם 6 בארות מצופה מראש ב-0.15% ג'לטין למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
    2. בדיקות ESC במעבר כל 2-3 ימים, עם החלפה יומית בינוניות מהיום השני ואילך.
    3. חממו מראש את כל החומרים (מדיום, PBS, תמיסת אנזימים) בטמפרטורה מינימלית של 21 מעלות צלזיוס ומקסימום של 37 מעלות לפני השימוש.
    4. בדוק תאים תחת מיקרוסקופ ניגודיות פאזה (ראו תמונות מייצגות, איור 2). ודא שלמושבות יש גודל מתאים ומורפולוגיה מתאימה (איור 2A), תוך אישור שהן דבקות לתחתית הצלחת.
      הערה: השליכו את התרבית אם יותר מ-10% מ-ESCs העכברים מובחנים (איור 2B), והכינו תרבית חדשה שהופשרה, שכדאי לעבור לפחות פעמיים לפני זריעת ESCs לבדיקת הבדלה. חוקרים מנוסים יכולים לשפוט באמצעות הערכה חזותית (ראו גם מולאס ואח' 28) או באמצעות צביעת נוגדנים לביטוי סמן (למשל, OCT4, ראו גם Ying ואח' 29).
    5. פתח את המכסה של הצלחת/הצלחת, הטה אותה מעט ושאף בזהירות את המדיום. תשאיר את התאים מחוץ לאינקובטור לזמן קצר ככל האפשר. שמור על תאים ללא מדיום בקצרה כדי למנוע ייבוש התרבית.
    6. שטפו מושבות עם 500 מיקרוליטר של PBS מחוממים מראש (הוסיפו לתאים בבאר אחת של צלחת 6 בארות), ושאפו מיד שוב.
      הערה: שלב זה קריטי כי: i) יש להימנע מהעברת ESC medium (2iLIF) לפני בדיקת ההתמיינות (אחרת היווצרות NTO תופרע), ii) FBS או BSA במדיום תרבית יכולים לעצור את הדיסוציאציה. זה חל על ESCs שגודלו במדיום ESC שונה, המכיל FBS או BSA.
    7. הוסיפו 500 מיקרוליטר של תמיסת אנזימים מחוממת מראש והעבירו את התאים חזרה לאינקובטור.
    8. דגרו תאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות באמצעות טיימר.
    9. לאחר זמן הדגירה, מוציאים את הפלטה ובדקו את התאים תחת מיקרוסקופ פאזה-ניגודיות.
      הערה: ה-ESCs היו אמורים להתנתק מפלטת התרבית; אם לא, הקישו על הצלחת/הצלחת בחוזקה אך בזהירות (איור 2C).
    10. הוסיפו 1 מ"ל מדיום N2B27 (טבלה 1) על ידי פיפטינג ישיר על התאים.
      הערה: בעת הכנת מדיום (N2B27), נשמר גלוטמין עד 5-10 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, ורצוי בטמפרטורת החדר. יש לשטוף את ה-ESCs מהצלחת, ולהשאיר אזורים 'ריקים' בצלחת התרבות.
    11. השתמש בפיפטה P1000 והטה מעט את הצלחת כך שכל המושבות שנדבקות לצלחת התרבית יוכלו להישטף.
    12. כדי להפריד גושי תאים, הטיה קלה של הצלחת, מניחים את קצה הפיפטה (P1000) במרכז הצלחת, לחצו את הקצה כנגד תחתית הצלחת אך מעט מהציר המאונך, ושטפו את התאים. חזור על זה חמש עד עשר פעמים כדי לשבור את גושי התאים.
    13. בדוק שהתאים מפורקים כראוי לתאים בודדים תחת מיקרוסקופ ניגוד פאזה (איור 2D) וחזור על התהליך אם עדיין יש גושים.
    14. לאחר פירוק מוחלט, העבר את תליית התא לצינור צנטריפוגה קוני נקי וסטרילי בנפח 15 מ"ל, שטוף את הבאר הריקה שבה תרבתו התאים עם 1 מ"ל מדיום N2B27, והעבר לאותו צינור צנטריפוגה חרוטי עם מתלה התא.
    15. סובב תאים למשך 5 דקות ב-453 x g באולטרה-צנטריפוגה.
    16. שאפו בזהירות את הסופרנטנט.
    17. החזירו את התאים לכמות מתאימה של מדיום N2B27 (למשל, 1 מ"ל) וספירת תאים (ראו טבלה 2 למספר תאים מומלץ לבדיקת התמיינות ל-NTO).
  2. התמיינות של ESCs לאורגנידים של צינור עצבי (NTOs)
    1. מטריצת תרבית תאים של אליקיוטינג
      1. הפשיר את בקבוק מטריצת תרבית התאים בלילה על קרח בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס (לעולם לא בטמפרטורת החדר או בהפשרה ידנית). אין להשאיר את מטריצת תרבית התאים בטמפרטורה של 4°C לזמן ארוך מהנדרש; AliQuot ו-Freeze בהקדם האפשרי כדי לשמור על הפונקציונליות שלו.
      2. בארון הבטיחות הביולוגית, הניחו צינורות מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5-2 מ"ל על קרח כדי לקרר אותם מראש תוך שמירה על בקבוק מטריצת תרבית התאים על קרח טרי.
      3. ערבבו בזהירות את מטריצת תרבית התאים המופשרת כדי למנוע היווצרות בועות, שכן בועות עלולות לגרום להיפרדות מהבאר/הצלחת לאחר הג'יליפיקציה.
      4. מטריצת תרבית תאים באליקווט בנפח הרצוי (מומלץ 0.5-1 מ"ל) והקפאה ב-20°- מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף. הימנעו מהחלפת הקצה בין האליקווטות, שכן קצות בטמפרטורת החדר עלולים לגרום למטריצת תרבית התאים להתמצקות, מה שעלול לגרום לאובדן משמעותי. במקום זאת, קרר את קצות הפיפטה ל-4 מעלות צלזיוס על ידי שמירתן במקרר לפני השימוש.
    2. זריעה של תאים בודדים במטריצת תרבית תאים
      1. כמת את מספר התאים הנדרש (מטריצת תרביות תאים של 100 תאים/מיקרוליטר, ראו טבלה 2).
      2. העבר את מספר התא המתאים (תליית תא) לצינור צנטריפוגה קוני נקי בנפח 15 מ"ל וממלא אותו ב-1 מ"ל של N2B27.
      3. סובב את התאים במשך 5 דקות בעוצמה של 453 x g בצנטריפוגה.
      4. שואף את הסופרנטנט והניח את צינור הצנטריפוגה הקוני על קרח.
      5. החזירו בזהירות את כדור התא על הקרח בכמות מתאימה של מטריצת תרבית תאים מופשרת ונוזלית, תוך הימנעות מהיווצרות בועות.
      6. יש לפזר את כמות ההשעיה המתאימה של מטריצת תאים, בשכבה דקה, על צלחת תחתית זכוכית או פלסטיק האופטימלית להדמיה (ראו טבלה 2, איור 3A-C), מבלי לגעת בקירות של לוחות רב-בארות. בגלל מתח פנים גבוה, טיפת מטריצת תרבית התאים יכולה לנוע ממרכז הבאר אל הקירות אם נגעו בה בעבר, מה שגורם להתפלגות לא מספקת של תאים/NTOs.
        הערה: אם משתמשים בלוחות רב-בארים: תחילה ציירו מעגל של מטריצת תרבית תאים באמצעות קצה פיפטה P20 (פלטת 96 בארות) או P200 לפני 'ממלאים' במטריצת תרבית התאים-תלייה תא (איור 3B).
      7. הניחו את הצלחת/הצלחת הרב-בארית באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס כדי לאפשר למטריצת תרבית התאים להתגבש. הערכה של 1 דקה למטריצת תרבית תאים במיקרוליטר עבור כמויות קטנות ומקסימום של 15 דקות ל-40 מיקרוליטר או יותר.
      8. לאחר זמן הדגירה, מוציאים את הצלחת והוסיפו נפח מדיום מתאים (ראו טבלה 2). ESCs במטריצת תרבית התאים לא צריכים להתייבש במהלך הזרעה לצורך בדיקת התמיינות ל-NTO או בעת החלפת המדיום. לאחר הג'ליפיקציה, יש ליישם את המדיום בהקדם האפשרי. הג'ליפיקציה בדרך כלל מסתיימת תוך דקה אחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס לכל מטריצת תרבית תאים של 1 מיקרוליטר, ומקסימום של 15 דקות למטריצת תרבית תאים של 40-100 מיקרוליטר כאשר היא מפוזרת כשכבה דקה.
        הערה: כדי להימנע מהתייבש של ESCs במטריצת תרבית התאים, יש לטפל במקסימום 8 בארות של לוח 96 בארות עם פיפטה רב-ערוצית או צלחת/באר אחת עם תחתית זכוכית בקוטר 35 מ"מ מכל פלטת רב-בארות אחרת. תשאיר את התאים מחוץ לאינקובטור לזמן קצר ככל האפשר.
      9. בדוק את צפיפות הזריעה והתפלגות התאים במטריצת תרבית התאים תחת מיקרוסקופ הניגודיות הפאזה (איור 3C,D). צפיפות הזריעה האופטימלית מומלצת (טבלה 2 ואיור 3). עם זאת, ביישומים מסוימים, כמו ניתוח מוקדם, צפיפות זריעה גבוהה עד פי 10 עשויה להיות יתרון.
        הערה: ערבבו בזהירות את מטריצת תרבית התאים-תלייה על ידי השעיה מחדש עם קצה פיפטה P300 או P1000 לפני הזרעה לבדיקת התמיינות כדי לנטרל שונות במספר התאים בין בארות/צלחות. שלב זה אינו מומלץ לפני זריעת כל באר כדי להגן מפני אובדן מטריצת תרבית תאים, שכן זה עלול להתקשה ולהיצמד לקצה הפיפטה.

טבלה 1: רכיבים בינוניים (בסיס N2B27, 2iLIF, N2B27diff). אנא לחצו כאן להורדת הטבלה הזו.

טבלה 2: מידע על מספר התאים לכל צלחת, כמות מטריצת תרבית התאים, נפח המדיום וזמן הג'ליפיקציה. אנא לחצו כאן להורדת הטבלה הזו.

2. טיפול בדלקת מפרקים שגרונית ב-NTOs לשיפור התמיינות עצבית וליצירת פוסטריוריזציה וונטרליזציה

  1. אליקיוטינג חומצה רטינואית (RA)
    1. הביא אבקת RA מלאה לטרנס לטמפרטורת החדר (מאוחסנת ב-20°C- מעלות צלזיוס).
    2. לשחזר אבקה בנפח מתאים של DMSO כדי להגיע לריכוז סופי של 100 מ"מ.
    3. Aliquot 1 מיקרוליטר של 100 mM RA לתוך בקבוקון אחד של 1.5 מ"ל עם מדחף כל אחד.
    4. הוסיפו גז ארגון עד שהצינור 'מלא'.
      הערה: מכיוון שגז ארגון כבד יותר מחמצן, הוא ישקע לתחתית הצינור כדי לכסות ולשמור על RA מהאוויר. אפשר להרגיש זאת בידיים כשהוא דולף כשהצינור מלא.
    5. סגור חזק את הבקבוקון. RA רגיש מאוד לאור ולאוויר.
    6. אחסן את האליקוות בחושך בטמפרטורה של מינוס 80°C עד לשימוש נוסף. לחלופין, ניתן לאחסן RA משוחזר בצינורות מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל בנוזלN2.
      הערה: ניתן לאחסן דלקת שגרונית מחודשת ומדוללת במקרר כאשר היא מכוסה בנייר אלומיניום למשך מקסימום יומיים.
  2. טיפול ב-RA של NTOs למשך 18 שעות (איור 4A)
    1. הוציאו 1 מיקרו ליטר מהאליקווט בריכוז של 100 מ"מ מ-80 מעלות צלזיוס ושמרו בחושך עד להפשרה בטמפרטורת החדר (למשל, בכף היד או במתקן צינורות בארון בטיחות ביולוגית ללא אורות דלוקים).
      הערה: אם אליקווטים של RA מאוחסנים בנוזל N2, פתח מיד את מכסה צינור המיקרוצנטריפוגה כדי למנוע פיצוץ הצינור, ואז סגור שוב והמשך לשלב 2.2.2.
    2. לאחר הפשרה, הוסף 400 מיקרוליטר של מדיום N2B27diff מחומם מראש לריכוז של 250 מיקרומולר באמצעות פיפטת P1000. ערבב היטב כדי להשיג הומוגניות.
      הערה: לחילופין, ניתן לשחזר ולדולל RA ב-DMSO טהור במקום בתווך N2B27diff, אם כי זה מעלה את ריכוז ה-DMSO בתרבית. בעת הכנת מדיום (N2B27diff), נשמר גלוטמין למקסימום 5-10 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, ורצוי בטמפרטורת החדר.
    3. הוציאו צלחות/כלים שמגדלים NTO מהאינקובטור והניחו אותם בארון בטיחות ביולוגית סטרילי.
    4. בדקו את ה-NTO הגדלים תחת מיקרוסקופ ניגוד פאזה. המורפולוגיה של ה-NTOs חיונית במתן מידע על כדאיות התרבית ויעילות הניסוי (איור 4B-D).
    5. הסר את מכסה הצלחת/הצלחת והטה מעט את הצלחת הצידה. שאיפת המדיום בזהירות, בין אם באמצעות פיפטה P200 או שאיבר, מבלי להפריע למטריצת תרבית התאים. שמור על NTO ללא מדיום בקצרה כדי למנוע ייבוש מהתרבית ו/או תערובת תרבית התאים.
    6. הוסיפו נפח מתאים של N2B27diff בתוספת תמיסת RA של 250 ננומטר (ראו טבלה 2), כסה עם המכסה, והעבר את ה-NTOs חזרה לאינקובטור.
      הערה: לפעמים, במיוחד אם ה-RA לא היה מעורבב לחלוטין, יכולים להיווצר משקעים שקשה יותר להמיס ב-N2B27diff רגיל. במקרה זה, יש להשליך את האליקווט וליצור אליקווטים טריים של RA כי למשקעים אלו יש ריכוז לא ידוע ולא מבוקר של RA.

3. הסרת דלקת דלקת מפרקים שגרונית ושגרת החלפת המדיה היומית של NTOs

  1. העבר את צלחת התרבית מהאינקובטור לארון הבטיחות הביולוגית הסטרילי.
  2. הסר את המכסה והטה מעט את הצלחת הצידה.
  3. שאיבה זהירה של N2B27diff המכיל RA, בין אם באמצעות פיפטה P200 או שאיבר, מבלי לגעת במטריצת תרבית התא.
  4. הוסיפו PBS מחומם מראש (השתמשו בנפח מספיק כדי לכסות את טיפת מטריצת תרבית התאים או כפי שמוזכר בטבלה 2), ואז הטינו את הפלטה שוב והסירו אותה בזהירות כדי לשטוף את שאריות ה-RA.
  5. הוסף נפח מתאים של N2B27diff (כפי שמוזכר בטבלה 2), על ידי פיפטינג של המדיום לאורך דופן הבאר/הצלחת כדי למנוע נזק לטיפה של מטריצת תרבית התא.
  6. החלף את המדיום מדי יום לפי שלבים 3.1-3.3, ואז הוסיף בעדינות N2B27diff מחומם מראש על ידי פיפסת המדיום על קיר הבאר/צלחת לפני החזרת ה-NTO לאינקובטור. פיפטינג ישיר ונמרץ או הוספת מדיום קר/PBS לטיפה של מטריצת תרבית התאים עלולה לגרום לשבירה ולניתוק הצלחת/הצלחת.
    הערה: כאשר מפריעים למסלולים באמצעות מולקולות קטנות או חלבונים רקומביננטיים, חשוב להחליף את המדיום מדי יום. אם יש ליישם תרופות ליותר מיום אחד, יש להכין תמיסות תרופות טריות מדי יום או לפחות כל יומיים כדי להבטיח יציבות חלבון/תרופה והמשך ריכוזים נכונים.

4. קיבוע של NTOs

הערה: NTOs קבועים כפי שתוארו על ידי קרמר ואחרים. בהתאם לנוגדן שישמש לאחר מכן, ייתכן שיהיה צורך ב-PFA ממקורות שונים (קנוי, פנימי וכו').

  1. הפשרה ב-PFA בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס במהלך הלילה.
  2. הביא את ה-PFA לטמפרטורת החדר לפני השימוש.
  3. אם משתמשים בריכוז גבוה יותר של PFA, יש לדלל PFA ל-4% במדיום N2B27diff או PBS במכסה כימלי.
  4. הוצא את ה-NTO מהאינקובטור והעבר אותם למכסה כימיקלים.
  5. פתח את המכסה והוסיף 4% PFA ביחס של 1:1 ישירות ל-NTOs כדי להגיע לריכוז סופי של 2% (למשל, 100 מיקרוליטר של 4% PFA נוסף ל-100 מיקרוליטר N2B27diff בפלטת 96 בארות).
  6. להחזיר את המכסה ולדגור NTO למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. קבע טיימר, שכן קיבוע ארוך יותר עלול לפגוע בביצועי טיפולים מסוימים בנוגדנים.
    הערה: PFA רעיל ואסור לשאוף אותו. עבדו בזהירות ובזהירות מתחת למכסה הכימי. חלק מהנוגדנים דורשים שימוש ב-PFA ספציפי או זמן קיבוע קצר/אופטימלי.
  7. אחרי 30 דקות, הסר את המכסה והטה מעט את הפלטה הצידה, ואז עקוב אחרי שלבים 3.3-3.4.
  8. הוסיפו בזהירות PBS מחוממים מראש (השתמשו בנפח מספיק כדי לכסות את טיפת מטריצת תרבית התאים או כפי שמוזכר בטבלה 2), ודגרו במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. חזור על השלב הזה 3 פעמים כדי להסיר את כל ה-PFA שנשאר.
  9. לאחר הכביסה הסופית, הוסף כמות מתאימה של PBS (ראו טבלה 2), אוטם את הפלטה באמצעות פאראפילם, ואחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף.

5. צביעת נוגדנים של NTO

  1. צביעת נוגדנים היא כלי חשוב להערכת הזהות הנכונה של ה-NTO וכן להצלחת הבדיקה/הניסוי. צביעת נוגדנים יכולה להתבצע כפי שמתואר במיינהארט ואח' 24 וקרמר ואח' 26.
    הערה: אם ה-NTO נראים פחות אופטימליים (איור 4E-G) או אינם מציגים ביטוי נכון של סמן מרחב-זמן (איור 5 עד איור 7), יש להשליך את החומר כי הוא אינו עומד בסטנדרטים של איכות.
  2. שמור על תמיסת הבלוק/פרמיאביליזציה (1x PBS עם 1% BSA ו-0.5% Triton-X) ב-4 מעלות צלזיוס והסתגל לטמפרטורת החדר לפני השימוש.
  3. לשיקום וניתוח תלת-ממדי מלא, שמרו על נוגדנים (1 ו-2) בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס לפחות לילה אחד, אך עדיף 2-3 לילה, כדי להבטיח חדירה טובה של נוגדנים.
    הערה: נוגדן Alexa Fluor anti-5612nd עשוי לספק אות רקע חזק יותר במטריצת תרבית התאים בשלושת הימים הראשונים של בדיקת התמיינות.

6. פינוי NTOs

  1. התכוננו לפינוי26
    1. השלים את תהליך צביעת הנוגדנים לפני תחילת הליך הניקוי (ודא ששניהנוגדנים הראשונים והשני מודגרים ונשטפים היטב).
    2. הוסף פרופילגלאט לתמיסת הניקוי (2 מ"ג פרופילגלאט לכל מ"ל תמיסת ניקוי) כדי למזער פוטו-הלבנה של NTOs.
      הערה: בצע את הניקוי 1-2 שעות לפני ההדמיה כדי למנוע חמצון (הנוזל הופך מצהוב בהיר/קרם לצהוב כהה או אפילו חום) או התגבשות של תמיסת הניקוי. אם מתרחשת התגבשות, יש להמיס על ידי הוספת PBS לבאר.
  2. pH תמיסה ואמצעי זהירות ערבוב
    1. שמור על ה-pH הנכון של תמיסת הניקוי כדי למנוע חמצון מהיר או מהמסה של מטריצת תרבית התא.
    2. הימנע מניעור חזק או ערבוב חזק של התמיסה כדי למנוע היווצרות בועות אוויר.

7. ניתוח של NTOs

  1. הכנת מיקרוסקופיה
    1. לאחר סיום צביעת נוגדנים וניקוי רקמות שלמות, השתמש במיקרוסקופ קונפוקלי עם מטרות של 10-40x להדמיה.
  2. הערכה ויזואלית
    1. השתמשו בהערכה חזותית וכימות ידני כדי לקבוע ביעילות האם NTOs מציגים ביטוי מתאים של סמנים עצביים וארגון דורסובונטרלי.
  3. תוכנת ניתוח תלת-ממדי
    1. לניתוח תלת-ממדי, יש להשתמש בתוכנות כמו CellProfiler28,29, Imaris (File Converter and Viewer) או כלי דומה להערכת סמנים מרחביים ופרטים מבניים.
  4. אימות זהות NTO
    1. לאשר את הזהות הנכונה של NTOs על ידי הערכת הביטוי הטמפורלי של סמנים עצביים והביטוי המרחב-זמני של סמנים מסוימים בדפוסי הגג הדורסווונטרלי. שלב זה חיוני כדי להבטיח שהבדיקה ההבדלה הצליחה לפני מחקר נוסף.
  5. היבטי אפיון: עיינו באיור 4, וכן באיור 6 ובאיור 7 כדי לאמת את ההיבטים הקריטיים הבאים של הצלחת תרבות:
    1. עיין באיור 4 ובצביעה ZO-1 המוצגת במיינהארט ואח' 24 כדי לאמת אפיתליאליזציה מוצלחת והיווצרות לומן.
    2. הבחנה עצבית מוצלחת מאופיינת בירידה בוויסות של OCT4 ובעלייה ב-SOX1, ואחריה ביטוי β3TUBULIN (מפורטב-24). עיין באיור 6 ובאיור 7 לאימות התמיינות עצבית מוצלחת.
    3. דפוס גב וונטרלי מאושר על ידי נוכחות לוח רצפה גחוני FOXA2+/SHH+ וביטוי PAX3+ בקוטב הגבי הנגדי (דפוס ונטרלי מפורטב-26). עיין באיור 6 ובאיור 7 כדי לאמת דפוס דורסובונטרלי מוצלח.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

עכבר R1 ESC שימשו לכל הדוגמאות המייצגות באיורים המוצגים בכתב יד זה. עכברים נוספים שהוזכרו יכולים להראות הבדלים קלים בתזמון האפיתליאליזציה, התמיינות עצבית או יעילות הדפוס כאשר הם מזרעים ל-NTOs, אך התוצאות לא צריכות להיות שונות באופן מובהק מהנתונים המוצגים כאן.

רק ESCs איכותיים (איור 2A) שזרעו בצפיפות תאים מתאימה (איור 3) יוצרים NTO איכותיים (איור 4B). כאשר ESCs איכותיים (<...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

כאן מוצגות מספר התאמות אופטימיזציה ושיפורים לפרוטוקול המקורי ליצירת NTOs איכותיים כדי להקל על תקינה בין מעבדות. שינויים מרכזיים כוללים תנאי תרבית ESC שונים, הפחתת מספר תאי קלט, שיפור מדיום התמיינות, פרוטוקול התמיינות מותאם והתאמות צפיפות זריעה לניתוח תפוקה גבוהה באמצעות לוחות רב-בארים. כמה היבטים של הפרוטוקול קריטיים במיוחד להשגת תוצאות אמינות וניתנות לשחזור. ראשית, יש להשתמש במטריצת תרבית תאים נכונה עם ריכוז חלבון מתאים, שכן ריכוזים לא מתאימים עלולים לפגוע ביעילות דפוסי NTO (ראו

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין ניגוד עניינים.

תודות

אנו רוצים להודות לחברי מעבדת טנקה הנוכחיים והקודמים על תמיכתם ודיונם בפיתוח פרוטוקול זה. במיוחד, אנו מודים לא. פלזל על קריאה ביקורתית של כתב היד, תרומה וסייע בשרטוטים, ול-א. צ'אטזידקי על קריאה ביקורתית של כתב היד, עריכה ותמיכה בשרטוטים, וכן על השגת מימון ל-PUD 25 יחד עם יורגן א. קנובליך. פרסום זה מומן על ידי קרן המדע האוסטרית (FWF): "פרויקט פרסום עצמאי מספר PUD 25". בנוסף, הפרויקט קיבל מימון מהמועצה האירופית למחקר (ERC) במסגרת תוכנית המחקר והחדשנות Horizon 2020 של האיחוד האירופי (הסכם מענק ERC AdG 742046), ומקרן המדע האוסטרית (FWF) [10.55776/ F7803-B] (מודולציית תאי גזע). לצורך גישה פתוחה, המחברים החלו רישיון זכויות יוצרים ציבורי CC BY לכל גרסת כתב יד מאושר (AAM) הנובעת מההגשה הזו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
צלחת 35 מ"מ | קאברסליפ מס' 1.5 | קוטר זכוכית 14 מ"מ | ללא ציפויחברת MatTekקט# P35G-1.5-14-C
אקוטאזInvitrogenקט# 00-4555-56
אלבומין (BSA) שבר V (pH 7.0)Panreac AppliChemקטגוריה# A1391
חומצה רטינואית טרנס בלבדמרקCat# R2625
תוסף B-27 (50X), ללא סרוםגיבקוCat# 17504044
מטריצת ממברנת הבסיס (Matrigel)קורנינגCat# BDL354234ריכוז החלבון 10 מ"ג/מ"ל & nbsp;
CellCarrier-96 אולטרה מיקרופלטיםפרקיןאלמרCat# 6055302
CellProfiler 4סטרלינג ואח' 2021https://cellprofiler.org
CHIR 99021טוקריסCat# 4423
CUBIC-R+(N)מצומוטו ואחרים, 2019לא זמין
דימתילסולפוקסידסיגמא אולדריץ'Cat# D2650
DMEM/F-12, ללא גלוטמיןגיבקוCat# 21331020
דולבקו' s סליין מופתר-פוספט (DPBS, 1X)גיבקוCat# 14190144
צנטריפוגה אפנדורף 5810 RאפנדורףCat# 5811000015
אפנדורף מיקרוטיוב 3810XמרקCat# EP0030125150
צינורות צנטריפוגה חרוטיים של פלקוןקורנינגCat# 352095
ג'לטיןמרקCat# G2500
L-גלוטמין (200 מ"מ)גיבקוCat# A2916801
חממת CO2 HeracellVIOS 160i, 165 ליטרתרמופישר סיינטיפיקCat# 51033557
אימאריסאוקספורד אינסטרומנטסhttps://imaris.oxinst.com
מיקרוסקופ ניגודיות מופע LED הפוך (CKX53)אולימפוס
2-מרקפטואנול (50 מ"מ)גיבקוCat# 31350010
עכבר מונוקלונלי אנטי-OCT-3/4ביוטכנולוגיה של סנטה קרוזCat# sc-5279; RRID:AB_628051שימוש ב-1:200
עכבר מונוקלונלי אנטי-PAX3DSHBקט# PAX3-C; RRID:AB_528426שימוש ב-1:100
ארנב מונוקלונלי אנטי-SHHטכנולוגיות איתות סלולריCat#2207; RRID:AB_2188191שימוש ב-1:300
אנטי-ובטא של ארנב מונוקלונלי; 3-טובוליןטכנולוגיות איתות סלולריקטגוריה# 5568; RRID:AB_10694505שימוש ב-1:500
עכבר מונוקלונלי אנטי-ZO-1Invitrogenקטגורוג# 33-9100; RRID:AB_2533147שימוש ב-1:200
עכבר LIFקיקייןCat# Qk018-1000
תוספת N-2 (100X)גיבקוCat# 17502048
מדיום נוירובסיסיגיבקוCat# 21103049
פאראפורמלדהיד, דרגת תגובה, גבישימרקCat# P6148
PD 0325901טוקריסCat#4192
תמיסת פניצילין-סטרפטומיציןגיבקוCat# 15140130
מיקרוסקופ ניגודיות פאזה
עז פוליקלונלית אנטי-FOXA2R& DCat# AF2400; RRID:AB_2294104שימוש ב-1:400
עז פוליקלונלית אנטי-SOX1R& D SystemsCat# AF3369; RRID:AB_2239879שימוש ב-1:200
נתוני RNA-Seq הקשורים לאיור 6אישיהרה ואח', 2022GEO: GSE214368
ארון בטיחות מיקרוביולוגי פרימיום SafeFASTקבוצת דאסיט FASTERCat# F00025200000
נתרן פירובט (100 מ"מ)גיבקוCat# 11360070
מיקרוסקופ דיסק מסתובב קונפוקלי הפוך (IX3)אולימפוס
טריטון X-100סיגמא אולדריץ'Cat# 9036-19-5

מקורות

  1. Hiiragi, T., Solter, D. First cleavage plane of the mouse egg is not predetermined but defined by the topology of the two apposing pronuclei. Nature. 430 (6997), 360-364 (2004).
  2. Louvet-Vallée, S., Vinot, S., Maro, B. Mitotic spindles and cleavage planes are oriented randomly in the two-cell mouse embryo. Curr Biol. 15 (5), 464-469 (2005).
  3. Sagner, A., Briscoe, J. Morphogen interpretation: concentration, time, competence, and signaling dynamics. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 6 (4), e271(2017).
  4. Anlaş, A. A., Nelson, C. M. Tissue mechanics regulates form, function, and dysfunction. Curr Opin Cell Biol. 54, 98-105 (2018).
  5. Haupt, A., Minc, N. How cells sense their own shape: mechanisms to probe cell geometry and their implications in cellular organization and function. J Cell Sci. 131 (6), jcs214015(2018).
  6. Lajtha, L. G. Stem cell concepts. Differentiation. 14 (1-3), 23-33 (1979).
  7. Evans, M. J., Kaufman, M. H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 292 (5819), 154-156 (1981).
  8. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  9. Kretzschmar, K., Clevers, H. Organoids: modeling development and the stem cell niche in a dish. Dev Cell. 38 (6), 590-600 (2016).
  10. Zhao, Z., et al. Organoids. Nat Rev Methods Primers. 2 (1), 94(2022).
  11. Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture. Front Mol Biosci. 7, 33(2020).
  12. Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  13. Park, G., Rim, Y. A., Sohn, Y., Nam, Y., Ju, J. H. Replacing animal testing with stem cell-organoids: advantages and limitations. Stem Cell Rev Rep. 20 (6), 1375-1386 (2024).
  14. Xu, Z., et al. Merits and challenges of iPSC-derived organoids for clinical applications. Front Cell Dev Biol. 11, 1188905(2023).
  15. Phipson, B., et al. Evaluation of variability in human kidney organoids. Nat Methods. 16 (1), 79-87 (2019).
  16. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
  17. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125(2014).
  18. Lancaster, M. A., et al. Guided self-organization and cortical plate formation in human brain organoids. Nat Biotechnol. 35 (7), 659-666 (2017).
  19. Eichmüller, O. L., et al. Amplification of human interneuron progenitors promotes brain tumors and neurological defects. Science. 375 (6579), eabf5546(2022).
  20. Reumann, D., et al. In vitro modeling of the human dopaminergic system using spatially arranged ventral midbrain-striatum-cortex assembloids. Nat Methods. 20 (12), 2034-2047 (2023).
  21. Esk, C., et al. A human tissue screen identifies a regulator of ER secretion as a brain-size determinant. Science. 370 (6519), 935-941 (2020).
  22. Krenn, V., et al. Organoid modeling of Zika and herpes simplex virus 1 infections reveals virus-specific responses leading to microcephaly. Cell Stem Cell. 28 (8), 1362-1379.e7 (2021).
  23. Li, C., et al. Single-cell brain organoid screening identifies developmental defects in autism. Nature. 621 (7978), 373-380 (2023).
  24. Meinhardt, A., et al. 3D reconstitution of the patterned neural tube from embryonic stem cells. Stem Cell Rep. 3 (6), 987-999 (2014).
  25. Wu, Y., Peng, S., Finnell, R. H., Zheng, Y. Organoids as a new model system to study neural tube defects. FASEB J. 35 (4), e21545(2021).
  26. Krammer, T., et al. Mouse neural tube organoids self-organize floorplate through BMP-mediated cluster competition. Dev Cell. 59 (15), 1940-1953.e10 (2024).
  27. Ishihara, K., Ranga, A., Lutolf, M. P., Tanaka, E. M., Meinhardt, A. Reconstitution of a patterned neural tube from single mouse embryonic stem cells. Organ Regen. 1597, 43-55 (2017).
  28. Mulas, C., et al. Defined conditions for propagation and manipulation of mouse embryonic stem cells. Development. 146 (6), dev173146(2019).
  29. Ying, Q. L., et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).
  30. Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7 (10), R100(2006).
  31. Stirling, D. R., et al. CellProfiler 4: improvements in speed, utility and usability. BMC Bioinformatics. 22 (1), 433(2021).
  32. Ishihara, K., et al. Topological morphogenesis of neuroepithelial organoids. Nat Phys. 19, 177-183 (2023).
  33. Nagy, A., Rossant, J., Nagy, R., Abramow-Newerly, W., Roder, J. C. Derivation of completely cell culture-derived mice from early-passage embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (18), 8424-8428 (1993).
  34. Ying, Q. L., Smith, A. G. Defined conditions for neural commitment and differentiation. Methods Enzymol. 365, 327-341 (2003).
  35. Ying, Q. L., Stavridis, M., Griffiths, D., Li, M., Smith, A. Conversion of embryonic stem cells into neuroectodermal precursors in adherent monoculture. Nat Biotechnol. 21 (2), 183-186 (2003).
  36. Robanus-Maandag, E., et al. p107 is a suppressor of retinoblastoma development in pRb-deficient mice. Genes Dev. 12 (11), 1599-1609 (1998).
  37. Smith, A. G., Hooper, M. L. Buffalo rat liver cells produce a diffusible activity which inhibits the differentiation of murine embryonal carcinoma and embryonic stem cells. Dev Biol. 121 (1), 1-9 (1987).
  38. Kuehn, M. R., Bradley, A., Robertson, E. J., Evans, M. J. A potential animal model for Lesch-Nyhan syndrome through introduction of HPRT mutations into mice. Nature. 326 (6110), 295-298 (1987).
  39. Doetschman, T., et al. Targeted correction of a mutant HPRT gene in mouse embryonic stem cells. Nature. 330 (6148), 576-578 (1987).
  40. Hooper, M., Hardy, K., Handyside, A., Hunter, S., Monk, M. HPRT-deficient (Lesch-Nyhan) mouse embryos derived from germline colonization by cultured cells. Nature. 326 (6110), 292-295 (1987).
  41. Ranga, A., et al. Neural tube morphogenesis in synthetic 3D microenvironments. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (44), (2016).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

In Vitro
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.