פרוטוקול זה מתאר שיטה לגרימת חסימת שופכן חד צדדית (UUO) בעכברים כדי לחקור את התקדמות פיברוזיס ברקמות בנפרופתיה חסימתית. הוא כולל הליכים כירורגיים, טיפול לאחר ניתוח ושיטות להערכת פיברוזיס.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
מודל חסימת שופכה חד צדדית לחקירת פיברוזיס אינטרסטיציאלי בכליות
במאמר זה
סיכום
תקציר
פיברוזיס בכליות היא התוצאה הפתולוגית הסופית של מחלת כליות כרונית מתקדמת (CKD). מודל חסימת השופכן החד-צדדית (UUO) נמצא בשימוש נרחב כדי להבהיר את המנגנונים המולקולריים והתאיים העומדים בבסיס פיברוזיס אינטרסטיציאלי בכליות ולזיהוי מטרות טיפוליות פוטנציאליות. מודל זה נקבע בעכברים באמצעות קשירה כירורגית של שופכן חד צדדי, הליך פשוט יחסית וקל לביצוע. עם זאת, ידוע כי מודל העכבר UUO מציג שונות וחוסר עקביות משמעותיים, המושפעים מגורמים כמו מאמץ עכברים, גיל, מין, סוג הרדמה, משך הניתוח, טמפרטורת הגוף במהלך ההליך, כישורי הניתוח של המפעיל, תנאי האכלה ומצב הבריאות הכללי של העכברים. וריאציות בטכניקות הניתוח, מיקום התפרים ומשך החסימה תורמים לשונות בתוצאות. בנוסף, דגימה לא עקבית של כליות חסומות מגדילה עוד יותר את השונות בהערכת פיברוזיס בכליות. מחקר זה מתאר את תהליך פיתוח מודל העכבר UUO והערכת פיברוזיס אינטרסטיציאלי, דן באתגרים הטכניים התורמים לחוסר החיזוי של המודל, ומציע פתרונות פוטנציאליים. תובנות אלה נועדו לבסס גישה סטנדרטית וישימה יותר לחקירת פיברוזיס בכליות.
מבוא
מחלת כליות כרונית (CKD) משפיעה על למעלה מ-10% מאוכלוסיית העולם, ושכיחותה עולה1. מצבים שונים בדרכי השתן, כולל חריגות אנטומיות מולדות, נפרוליתיאזיס, היפרפלזיה של הערמונית וגידולי שלפוחית השתן, עלולים להוביל לחסימת שופכה². כתוצאה מכך, מודל העכבר של חסימת שופכן חד צדדית (UUO) הוא כלי מפתח לזיהוי מנגנונים חדשים של פיברוזיס אינטרסטיציאלי בכליות, הבנת התקדמות המחלה והערכת אסטרטגיות טיפול פוטנציאליות. נעשה בו שימוש נרחב כדי לחקור את מקורם של מיופיברובלסטים, תת-אשכולות פיברובלסטים (מיו), חילוף חומרים של תאים צינוריים ועצירת מחזור התא, מעבר אפיתל-מזנכימלי חלקי ותהליכים קשורים אחרים 3,4,5,6,7,8.
בנוסף לפיברוזיס אינטרסטיציאלי בכליות הנגרמת על ידי UUO, מודלים נפוצים אחרים של מכרסמים של פיברוזיס אינטרסטיציאלי בכליות כוללים מודלים המושרים על ידי רעלן, כגון אלה המשתמשים בחומצה אריסטולוכית, חומצה פולית ואדנין, כמו גם מודלים המושרים בניתוח כמו כריתת כליה 5/6 ופגיעה באיסכמיה-רפרפוזיה (IRI). מודל ה-UUO מציע מספר יתרונות על פני מודלים אלטרנטיביים של פיברוזיס בכליות. לדוגמה, פיברוזיס בכליות הנגרמת על ידי רעלן דורשת תקופת דוגמנות ארוכה יחסית (כחודש-חודשיים), ותופעות הלוואי הרעילות שלה על איברים אחרים עלולות לסבך את חקירת מנגנוני הפיברוזיס 9,10,11. מודלים המושרים בניתוח, כגון כריתת כליה 5/6, עלולים להוביל לדימום משמעותי בכליות ולזיהום, ולהגדיל את הסיכון לתמותה לאחר הניתוח. בנוסף, היקף הפיברוזיס האינטרסטיציאלי המושרה נמצא בקורלציה ישירה עם נפח רקמת הכליה שנכרתה, מה שמקשה על שחזור עקבי של אותה דרגה של פיברוזיס בכל עכבר12.
מודל ה-IRI הכלייתי הוא שיטה עיקרית להשראת פגיעה כלייתית חריפה ל-CKD ויש לו רלוונטיות קלינית משמעותית. ניתן לווסת את חומרת הפיברוזיס על ידי התאמת הזמן האיסכמי וטמפרטורת הגוף; עם זאת, בהשוואה למודל ה-UUO, הוא מורכב יותר מבחינה כירורגית, והשראת פיברוזיס אינטרסטיציאלי דורשת משך זמן ארוך יותר13. בהשוואה למודלים אלה, למודל ה-UUO מספר יתרונות, כולל משך דוגמנות קצר, שונות מינימלית, חזרתיות והליך כירורגי פשוט יחסית. מודל העכברים UUO, שאינו מערב רעלים, נוצר על ידי קשירת שופכן אחד, מה שמוביל לנפרופתיה חסימתית תוך שבועיים. התוצאה היא הידרונפרוזיס, התרחבות צינורית ופיברוזיס אינטרסטיציאלי, הדומה מאוד לתהליך הפתולוגי שנצפה בבני אדם14. ניתן לשלוט בחומרת הפיברוזיס - קלה, בינונית או חמורה - על ידי התאמת משך הניסוי.
למרות שמודל העכבר UUO פשוט יותר לביצוע מאשר מודלים אחרים המושרים על ידי עלבון לחקירת CKD, מספר גורמים יכולים להשפיע באופן משמעותי על יציבותו. גורמים אלה כוללים מאמץ עכברים, גיל, מין, סוג ההרדמה, משך הניתוח, טמפרטורת הגוף במהלך הניתוח, כישורי הניתוח של המפעיל ותנאי האכלה ומצב בריאותי של העכברים15,16.
מזעור מתח וזיהום כירורגי תוך ביצוע ההליך בצורה יציבה ומאורגנת בהרדמה חיוני ליצירת מודל עכבר UUO הניתן לשחזור. בנוסף, מחקר על המנגנונים והיעדים הטיפוליים הפוטנציאליים של CKD יכול להיפגע על ידי מפעילים חסרי ניסיון, מה שמוביל לאובדן עכברים מוגבר ולהטרוגניות גדולה יותר של המודל. כדי להתמודד עם אתגרים אלה, מתוארים היבטים טכניים מרכזיים של התהליך הכירורגי - לפני, במהלך ואחרי ההליך, תוך הדגשת נושאים קריטיים הדורשים תשומת לב. יתר על כן, מתודולוגיית ההערכה של מודל העכבר UUO מפורטת כדי לספק לחוקרים גישה עקבית ואמינה.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל ההליכים בבעלי חיים מבוצעים בהתאם להנחיות הסוכנות ומאושרים על ידי ועדת האתיקה המוסדית לבעלי חיים של האוניברסיטה הרפואית נאנג'ינג. כדי למנוע הבדלי מין וזן ולהבטיח השוואה של התוצאות, משתמשים רק בעכברי CD1 זכרים בגילאי 8-10 שבועות ובמשקל 22-25 גרם. פרטי הריאגנטים והציוד המשמשים במחקר זה מפורטים בטבלת החומרים.
1. הכנת בעלי חיים ומכשירים
- חיטוי כל המכשירים הכירורגיים לפני הניתוח.
- שקלו והרדימו את העכברים (בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי המוסד). חבר כראוי את מכשיר ההרדמה בשאיפה והנח את העכברים בתא האינדוקציה עם 2% איזופלורן מעורבב עם חמצן ב-1-2 ליטר לדקה. לאחר מכן, הנח את אף העכבר לתוך חרוט האף עם אספקה קבועה של הרדמה. אשר את רמת ההרגעה המתאימה על ידי הערכת חוסר התגובה לצביטה בבוהן.
הערה: בדוק באופן קבוע את קצב הנשימה והעריך את רמת ההרדמה באמצעות רפלקס הדוושה של העכברים. התאם את האיזופלורן לפי הצורך. - הנח את העכבר על כרית חום אלקטרונית במצב שכיבה כשהראש והצוואר מורחבים כדי לשמור על דרכי הנשימה פתוחות. אבטח את הכפות בעזרת סרט דבק נמוך.
- השתמש במדחום כדי לנטר את טמפרטורת הסביבה ולשמור עליה על 37-38 מעלות צלזיוס. הכנס בדיקה רקטלית ושמור על טמפרטורת הליבה של גוף העכברים סביב 36.5-37 מעלות צלזיוס במהלך ההליך.
- מרחו משחה עיניים על העיניים כדי למנוע פגיעה בסרוזיס בקרנית.
- יש לגלח את השיער על אזור הניתוח עם קרם להסרת שיער ולחטא אותו בתמיסת בטדין שלוש פעמים.
2. הליך כירורגי
הערה: לאחר שטמפרטורת הגוף מתייצבת בנקודה שנקבעה ורפלקס צביטת הבוהן נעדר, התחל את ההליכים הכירורגיים הבאים.
- השתמש בלהב כירורגי כדי לבצע חתך כירורגי אנכי של כ-1-1.5 סנטימטרים משלפוחית השתן לקצה השמאלי התחתון של הצלעות כדי לחשוף את חלל הבטן.
- העבירו את המעי לצד ימין של חלל הבטן באמצעות צמר גפן רטוב במי מלח סטריליים רגילים כדי לחשוף את הכליה השמאלית, הממוקמת מתחת לחלק האחורי של הטחול וצמודה לעמוד השדרה.
- השתמש במלקחיים מעוקלים של קשתית כדי לנקות את השומן ורקמת החיבור המקיפה את השופכן השמאלי. לאחר בידוד עדין, קשרו את השופכן השמאלי קרוב לקוטב התחתון של הכליה באמצעות תפר קלוע משי 3/0. בצע קשירה שנייה של השופכן השמאלי בין הקשירה הראשונה לשלפוחית השתן.
הערה: כדי למזער את השונות בין העכברים, ודא שתנוחת הקשירה נשארת עקבית בכל הנבדקים. השתמש במלקחיים השמאליים כדי למקם את התפר בקצות המלקחיים הימניים והחלק את התפר לאחור מתחת לשופכן17. הימנע מהכללת עודפי שומן ורקמת חיבור בקשירה, מכיוון שהדבר עלול להוביל לחסימת כליות לא מלאה. השג זאת על ידי ליטוף עדין של השופכן עם צמר גפן יבש. - מקם בזהירות את המעיים לחלל הצפק. תפרו את שכבות השריר והעור בנפרד באמצעות תפר קלוע משי 3/0.
הערה: תפירת שכבות העור והשרירים יחד עלולה לגרום לקרע בפצעי תפרים ולנזק לקרביים בבטן. - בעת ניתוח על מספר עכברים, נקו את מכשירי הניתוח במים זורמים ואתנול 75% לפני שתמשיכו לעכבר הבא.
3. טיפול וניטור לאחר ניתוח
- יש להזריק 0.5 מ"ל של מי מלח חמים רגילים תוך צפקית כדי למנוע התייבשות.
- החזירו את העכברים לכלוב נקי עד שהם חוזרים להכרה מלאה.
- יש לתת בופרנורפין (50 מיקרוגרם/ק"ג) בהזרקה תת עורית למשך 3 ימים. עקוב אחר העכברים מדי יום לאיתור סימנים של חוסר טיפוח, ירידה באכילה ויציבה לא תקינה.
4. הערכות לאחר ניתוח
- היסטולוגיה
- המתת חסד של העכברים עם מנת יתר של איזופלורן (בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי המוסד). קצור את הכליות החסומות והנגדיות שאינן חסומות18 לאחר המתת חסד.
- השתמש באזור החתך הגדול ביותר של חתך הכליה לבדיקה היסטולוגית.
- תקן רקמות כליה ב-4% פרפורמלדהיד וחתוך את הדגימות שהתקבלו למקטעים של 4 מיקרומטר.
- צביעת קטעי כליות עם חומצה-שיף תקופתית (PAS), צביעת טריכרום של מאסון (MTS) או צביעה אדומה של סיריוס לאיתור פגיעה צינורית כלייתית ופיברוזיס בכליות.
- בחר עשרה שדות אקראיים של חלקי הכליה תחת מיקרוסקופ אור בהגדלה של 200×.
- חשב את החלק היחסי של האזור הכחול החיובי לקולגן באמצעות תוכנת ImageJ.
- כתם מערבי
- חלץ כ-20 מ"ג של רקמת כליה מאותו קוטב של כליות UUO באמצעות מאגר18 של בדיקת רדיו-אימונומון-משקעים (RIPA).
- כמת את ריכוז החלבון באמצעות בדיקת חומצה ביצינצ'ונינית19.
- טען כמויות שוות של דגימות חלבון על ג'ל ביס-טריס 4%-10% לאלקטרופורזה והעבר אותן לממברנות פוליווינילידן דיפלואוריד (PVDF).
- חסמו את ממברנות ה-PVDF עם 5% חלב ב-Tris-Buffered Saline Tween (TBST) ודגרו עליהן עם נוגדנים ראשוניים למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס.
- שטפו את ממברנות ה-PVDF עם TBST ודגרו אותן עם נוגדנים משניים בטמפרטורת החדר למשך שעה.
- זיהוי רמות חלבון בשיטת כימילומינסנציה משופרת (ECL) וניתוח שלהן באמצעות תוכנת ImageJ, עם גליצרלדהיד 3-פוספט דהידרוגנאז (GAPDH) כבקרת ההעמסה.
- תפקוד כלייתי
- להרדים את העכברים עם איזופלורן בשאיפה (ראה שלב 1.2).
- אסוף דגימות דם רטרו-אורביטלית לאחר ההרדמה.
- דגימות דם צנטריפוגות ב-3,000 x גרם למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
- מדוד קריאטינין בסרום וחנקן אוריאה בדם (BUN) באמצעות מנתח כימי יבש אוטומטי לניטור תפקוד הכליות.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
היסטולוגיה
צביעה תקופתית של חומצה-שיף (PAS) חשפה התרחבות צינורית, אובדן גבולות מברשת, היווצרות יציקה ונפיחות אפיתל צינורית. הטריכרום של מאסון והצביעה האדומה של סיריוס הראו פיברוזיס אינטרסטיציאלי לאחר UUO, בניגוד לצינורות הקומפקטיים הרגילים עם לומן שניתן להבחין בהם שנצפו בקבוצת הדמה. דרגת הפיברוזיס הבין-רקמתי הכלייתי, שמסומנת על ידי אזורים כחולים בצביעה הטריכרומית של מאסון ואזורים אדומים בצביעה האדומה של סיריוס, עלתה באופן תלוי זמן (איור 1A).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
ניתן נוהל מקיף לביסוס מודל UUO, גישה בשימוש נרחב לחקירת פיברוזיס אינטרסטיציאלי בכליות. בנוסף, הזיהוי וההערכה של המודל, כולל הערכות של תפקוד הכליות ושינויים היסטולוגיים, מודגמים. נדונים המשתנים התורמים להטרוגניות של המודל ולגורמים הטכניים הניתנים לשינוי.
הרגישות ל-UUO משתנה באופן משמעותי בהתאם לגיל, מין וזן עכברים. בהשוואה לעכברי C57BL/6, עכברי BALB/c פחות רגישים או אפילו עמידים ל-UUO20. במחקרים שכללו עכברי C57BL/6 זכרים ונקבות, עכברים ז...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים שאין ניגוד עניינים.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי מענקי הקרן הלאומית למדע של סין (82370686/2024YFA1107704), מענק פרופסור שמונה במיוחד על ידי ג'יאנגסו, פרויקט החדשנות המדעית והטכנולוגית של נאנג'ינג, תוכנית טיפוח הכישרונות ברמה גבוהה של בית החולים במחוז ג'יאנגסו (שלב I) (CZ0121002010037), קרן מדעי הטבע של מחוז ג'יאנגסו (BK20240055), וצוות החדשנות הרפואית של ג'יאנגסו ל-JR; בית החולים של מחוז ג'יאנגסו (בית החולים המסונף הראשון לאוניברסיטה הרפואית של נאנג'ינג) פרויקט שיפור היכולת הקלינית (JSPH-MA-2023-4), פיתוח תוכנית אקדמית עדיפות של מוסדות להשכלה גבוהה בג'יאנגסו (סין) והקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (81970639/82151320) להוד מלכותו.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 1 מ"ל מזרק | Mingankang | / | |
| 4/0 תפר כירורגי | Jinhuan Medical | F401 | |
| 75% אתנול | לירקון | 6303060031 | |
| הרדמה משאבת אוויר | RWD מדעי החיים | R510-29 | |
| תאי אינדוקציה הרדמה | RWD מדעי החיים | V102-V | |
| קוצץ שיער בעלי חיים | Jinke | / | |
| תמיסת בטדין | לירקון 6303030036 | ||
| בופרנורפין (משכך כאבים) | RWD מדעי החיים | / | |
| מלקחיים מעוקלים קשתית | ג'ינקה | / | |
| כרית חום אלקטרונית | Reptizoo | AHM23 | |
| מלקחיים ישרים עדינים | Jinke | / | |
| מיכל מסנן גז | RWD מדעי החיים | R510-31-6 | |
| רפידות גזה | זוכה רפואי | 601-026576 | |
| מספריים איריס | Jinke | / | |
| Isoflurane (הרדמה) | RWD Life Science | R510-22-10 | |
| מכונת הרדמה לבעלי חיים מרובת פלטים | RWD Life Science | R550IE | |
| מחזיק מחט | jinke | / | |
| משחת עיניים | Dechra NDC | 17033-211-38 | |
| זוכה | צמר גפן סטרילי | 601-015213 | |
| שימן | מי מלח סטרילי | H20066533 |
מקורות
- Bello, A. K., et al. An update on the global disparities in kidney disease burden and care across world countries and regions. Lancet Glob Health. 12 (3), e382-e395 (2024).
- Klahr, S. Obstructive nephropathy. Intern Med. 39 (5), 355-361 (2000).
- Lovisa, S., et al. Epithelial-to-mesenchymal transition induces cell cycle arrest and parenchymal damage in renal fibrosis. Nat Med. 21 (9), 998-1009 (2015).
- Grande, M. T., et al. Snail1-induced partial epithelial-to-mesenchymal transition drives renal fibrosis in mice and can be targeted to reverse established disease. Nat Med. 21 (9), 989-997 (2015).
- Kang, H. M., et al. Defective fatty acid oxidation in renal tubular epithelial cells has a key role in kidney fibrosis development. Nat Med. 21 (1), 37-46 (2015).
- Lebleu, V. S., et al. Origin and function of myofibroblasts in kidney fibrosis. Nat Med. 19 (8), 1047-1053 (2013).
- Yang, L., Besschetnova, T. Y., Brooks, C. R., Shah, J. V., Bonventre, J. V. Epithelial cell cycle arrest in g2/m mediates kidney fibrosis after injury. Nat Med. 16 (5), 535-543 (2010).
- Kuppe, C., et al. Decoding myofibroblast origins in human kidney fibrosis. Nature. 589 (7841), 281-286 (2021).
- Ren, J., et al. The transcription factor twist1 in the distal nephron but not in macrophages propagates aristolochic acid nephropathy. Kidney Int. 97 (1), 119-129 (2020).
- Perales-Quintana, M. M., et al. Metabolomic and biochemical characterization of a new model of the transition of acute kidney injury to chronic kidney disease induced by folic acid. PeerJ. 7, e7113(2019).
- Kim, K., et al. Skeletal myopathy in CKD: A comparison of adenine-induced nephropathy and 5/6 nephrectomy models in mice. Am J Physiol Renal Physiol. 321 (1), F106-F119 (2021).
- Tan, R. Z., et al. An optimized 5/6 nephrectomy mouse model based on unilateral kidney ligation and its application in renal fibrosis research. Ren Fail. 41 (1), 555-566 (2019).
- Fu, Y., Xiang, Y., Wei, Q., Ilatovskaya, D., Dong, Z. Rodent models of aki and AKI-CKD transition: An update in 2024. Am J Physiol Renal Physiol. 326 (4), F563-F583 (2024).
- Kramann, R., Menzel, S. Mouse models of kidney fibrosis. Methods Mol Biol. 2299, 323-338 (2021).
- Chevalier, R. L., Forbes, M. S., Thornhill, B. A. Ureteral obstruction as a model of renal interstitial fibrosis and obstructive nephropathy. Kidney Int. 75 (11), 1145-1152 (2009).
- Nørregaard, R., Mutsaers, H. aM., Frøkiær, J., Kwon, T. H. Obstructive nephropathy and molecular pathophysiology of renal interstitial fibrosis. Physiol Rev. 103 (4), 2827-2872 (2023).
- Thornhill, B. A., Chevalier, R. L. Variable partial unilateral ureteral obstruction and its release in the neonatal and adult mouse. Methods Mol Biol. 886, 381-392 (2012).
- Ren, J., et al. Twist1 in infiltrating macrophages attenuates kidney fibrosis via matrix metallopeptidase 13-mediated matrix degradation. J Am Soc Nephrol. 30 (9), 1674-1685 (2019).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).
- Puri, T. S., et al. Chronic kidney disease induced in mice by reversible unilateral ureteral obstruction is dependent on genetic background. Am J Physiol Renal Physiol. 298 (4), F1024-F1032 (2010).
- Falke, L. L., et al. Age-dependent shifts in renal response to injury relate to altered BMP6/CTGF expression and signaling. Am J Physiol Renal Physiol. 311 (5), F926-F934 (2016).
- Song, L., Shi, S., Jiang, W., Liu, X., He, Y. Protective role of propofol on the kidney during early unilateral ureteral obstruction through inhibition of epithelial-mesenchymal transition. Am J Transl Res. 8 (2), 460-472 (2016).
- Saad, K. M., et al. Reno-protective effect of protocatechuic acid is independent of sex-related differences in murine model of UUO-induced kidney injury. Pharmacol Rep. 76 (1), 98-111 (2024).
- Goorani, S., Khan, A. H., Mishra, A., El-Meanawy, A., Imig, J. D. Kidney injury by unilateral ureteral obstruction in mice lacks sex differences. Kidney Blood Press Res. 49 (1), 69-80 (2024).
- La Russa, D., Barberio, L., Marrone, A., Perri, A., Pellegrino, D. Caloric restriction mitigates kidney fibrosis in an aged and obese rat model. Antioxidants (Basel). 12 (9), 1778(2023).
- Wei, Q., Dong, Z. Mouse model of ischemic acute kidney injury: Technical notes and tricks. Am J Physiol Renal Physiol. 303 (11), F1487-F1494 (2012).
- Hammad, F. T. The long-term renal effects of short periods of unilateral ureteral obstruction. Int J Physiol Pathophysiol Pharmacol. 14 (2), 60-72 (2022).
- Chevalier, R. L., Thornhill, B. A., Wolstenholme, J. T., Kim, A. Unilateral ureteral obstruction in early development alters renal growth: Dependence on the duration of obstruction. J Urol. 161 (1), 309-313 (1999).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
תגיות
