מאמר שיטה

פלטפורמת הדמיה אופטית מולטי-מודאלית לחקר חילוף החומרים התאי

DOI:

10.3791/67906

⸱

6 ביוני 2025

 ,  ,  , 
1Shu Chien-Gene Lay Department of Bioengineering, University of California San Diego, 2Aiiso Yufeng Li Family Department of Chemical and Nano Engineering, University of California San Diego, 3Department of Electrical and Computer Engineering, University of California San Diego, 4Institute of Engineering in Medicine, University of California San Diego, 5Synthetic Biology Institute, University of California San Diego

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תוך שימוש בפלטפורמה רב-מודאלית המשלבת שיטות הדמיה אופטיות ללא תוויות, פיתחנו פרוטוקול להדמיה וכימות של דינמיקה תאית וחילוף חומרים. באמצעות הדמיה באמצעות פלואורסצנציה רב-פוטונית, דור הרמוני שני ומיקרוסקופ פיזור רמאן מגורה, אנו יכולים ליצור סקירה הוליסטית של הסביבה התאית והמולקולרית.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טכנולוגיות הדמיה אופטית הן קריטיות במחקרים ביו-רפואיים בשל יכולתן להשיג מידע מורפולוגי ופונקציונלי מדגימות ביולוגיות ברזולוציה מרחבית גבוהה. תהליכים אופטיים אלה מנצלים אינטראקציות שונות של מולקולות אור, כגון פיזור, ספיגה, פליטה ויצירה הרמונית, בין פוטונים למולקולות בתוך תאים, רקמות או איברים. בעוד שהדמיה ביו-רפואית קונבנציונלית התמקדה היסטורית ביישום שיטה אחת, מחקרים עדכניים הראו כי טכניקות מגוונות אלה מספקות תובנות משלימות, והתפוקות המשולבות שלהן מציעות הבנה מקיפה יותר של שינויים מולקולריים בתהליכי הזדקנות והתפתחות מחלות ויסודות בביולוגיה של התא.

בעשורים האחרונים התקדמו שיטות הדמיה אופטיות ללא תוויות, המאפשרות חקירה מפורטת של סביבות תאיות ותת-תאיות. לדוגמה, פלואורסצנציה רב-פוטונית (MPF) לא רק מאפשרת הדמיית חלבון ממוקדת אלא גם מכמתת פעילות מטבולית באמצעות קו-אנזימים אוטו-פלואורסצנטיים, ומשיגה עומק חדירה גבוה ורזולוציה מרחבית. הדור ההרמוני השני (SHG) משמש להדמיית מבנים כמו קולגן במטריצה החוץ-תאית, בעוד שפיזור רמאן מגורה (SRS) ממפה קשרים כימיים והרכב מולקולרי באתרם ברזולוציה תת-תאית.

פיתחנו פלטפורמת הדמיה רב-מודאלית המשלבת שיטות MPF, SHG ו-SRS. השילוב של שיטות אלה בפלטפורמה אחת מאפשר רכישת מידע רב פנים מאותו לוקליזציה בתוך תאים, רקמות, איברים או אפילו גופים, מה שמקל על חקירה מפורטת יותר של היחסים המורכבים בין חילוף החומרים התאי, מבנה המטריצה החוץ-תאית, וההרכב המולקולרי. מערכת רב-מודאלית זו מציעה רזולוציה תת-תאית, חדירת רקמות עמוקות, הדמיית תאים חיים/רקמות באתר , כמו גם זיהוי ללא תוויות ורישום משותף מיידי ללא צורך בהתאמות מיקום, החלפת מכשיר או יישור לאחר הניתוח. כאן, אנו מציגים פרוטוקול להדמיה ללא תווית עם פלטפורמה רב-מודאלית זו ומדגימים את יישומו באפיון חילוף החומרים התאי, והטרוגניות מולקולרית בתאים וברקמות לחקר הזדקנות ומחלות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הדמיה ביו-רפואית אופטית הייתה מרכזית בקידום ההבנה שלנו לגבי המבנה והתפקוד הביולוגיים. התמונות נוצרות על ידי אפנון אור עירור וזיהוי אותות מאינטראקציות אור-רקמה. המיקרוסקופ המורכב הראשון, שפותח על ידי הנס וזכריה יאנסן בסביבות 1590, השתמש בשתי עדשות קמורות בצינור, וסיפקו הגדלה של עד 30x1. מיקרוסקופים אופטיים מודרניים, לאחר מאות שנים של התקדמות, יכולים כעת להשיג רזולוציות עדינות כמו 1-3 ננומטר 2,3. בנוסף להצעת רזולוציה גבוהה, מערכות הדמיה מתקדמות מספקות כעת חדירה עמוקה יותר לרקמות, יעילות רבה יותר ונזק מינימלי לדגימה, מה שהופך אותן למתאימות במיוחד להדמיית תאים ורקמות חיים. הדמיה ללא תוויות היא יתרון במיוחד מכיוון שהיא לוכדת מידע מבלי לשבש תהליכים תוך-תאיים או לפגוע בשלמות הדגימה.

מיקרוסקופיה פלואורסצנטית רב-פוטונית (MPF), במיוחד מיקרוסקופיה פלואורסצנטית דו-פוטונית, שימשה באופן נרחב להדמיה ללא תוויות. בניגוד למיקרוסקופיה פלואורסצנטית קונבנציונלית, המסתמכת על ספיגה ופליטה ליניארית של פוטון בודד, עירור MPF כרוך בספיגה בו זמנית של פוטונים מרובים, שהאנרגיה המשולבת שלהם מעוררת מולקולת פלואורופור בודדת 4,5. פוטונים אלה, בדרך כלל בספקטרום האינפרא אדום, מחזיקים במחצית או פחות מהאנרגיה הנדרשת לעירור פוטון בודד. אורכי הגל הארוכים יותר והעירור המקומי בנקודת המוקד בתהליך לא ליניארי זה מביאים לפיזור נמוך יותר, חדירה עמוקה יותר לרקמות ופוטוטוקסיות מופחתת.

ניתן ללכוד מידע מטבולי תאי על ידי מיקרוסקופ MPF ללא תווית באמצעות זיהוי אותות אוטופלואורסצנטיים ממצעים מטבוליים אנדוגניים, כגון ניקוטינמיד אדנין דינוקלאוטיד מופחת (NADH) ופלווין אדנין דינוקלאוטיד (FAD). קו-אנזימים אלה מציגים ספקטרום עירור ופליטה מובהק, ויחס עוצמת הקרינה שלהם, המכונה יחס חמצון חיזור (NADH/FAD), משקף את מצב החמצון של התא. מאז שבריטון צ'אנס הציגה לראשונה את הרעיון של יחס חמצון חיזור בשנת 1979, הוצעו יחסים נוספים, כולל NAD(P)H/FAD, NAD(P)H/(FAD + NAD(P)H), ו-FAD/(FAD + NAD(P)H), 6,7,8,9. כימות יחסי חמצון חיזור אופטיים אלה באמצעות הדמיית MPF מספק תובנה חשובה לגבי הדינמיקה המטבולית. לדוגמה, הדמיית MPF יכולה להבחין בין תאים סרטניים לתאים רגילים על סמך חילוף החומרים המשתנה שלהם, מה שמדגים את הפוטנציאל שלו לאבחון סרטן 10,11,12. עם זאת, לזיהוי אוטופלואורסצנטי מבוסס MPF יש מגבלות. פלואורופורים פנימיים אחרים, כגון קרטין, עשויים לתרום לעוצמת הקרינה, מה שמוביל לדיבור צולב ספקטרלי ולפרשנות אותות לא מדויקת13. בנוסף, יחס החיזור משקף רק את השינויים הכוללים בהפחתת חמצון תאים ואינו מבחין בין NADH ממקורות שונים (למשל, ציטופלזמי או מיטוכונדריאלי) או בין NADH ל-NAD(P)H, מכיוון ששניהם מציגים שיאים ספקטרליים דומים ב-450 ננומטר, וכתוצאה מכך אותות עוצמה מעורבבים14.

הדור ההרמוני השני (SHG), תהליך אופטי לא ליניארי שהודגם לראשונה בתחום הביו-רפואי בשנות ה-80, נמצא בשימוש נרחב להדמיה ללא תוויות של מבנים תאיים15,16. בדומה ל-MPF, SHG כרוך בספיגה בו-זמנית של שני פוטונים בעלי אותה אנרגיה מלייזר פועם מהיר במיוחד. פוטונים אלה משולבים מחדש כדי לפלוט פוטון חדש בתדירות כפולה מהאור הפוגע, וכתוצאה מכך מתגלה האות ההרמוני השני. אינטראקציה אופטית לא ליניארית זו מתרחשת אך ורק בחומרים לא צנטרו-סימטריים המציגים רגישות מסדר שני שאינה אפס לגרום לקיטוב ליצירת האות ההרמוני השני17,18. זה הופך את SHG ליעיל במיוחד להדמיית החלבונים החוטים והמבנים הסיביים, כגון קולגן, מיוזין וטובולין, מבלי לדרוש צבעי פלואורסצנטיים אקסוגניים 15,17,19,20. החריגות בשפע, בנוקשות, ביישור ובמבנה של פיברוזיס וקולגן נפוצות במצבים רבים כגון דלקת וסרטן, מה שהופך את SHG לכלי מבטיח לזיהוי יעיל ולא פולשני למצבי מחלה מסוימים 21,22,23. היישום הנרחב של הדמיית SHG במחקר אונקולוגי, כולל מחקרים על סרטן השד, השחלות והעור, הדגיש את תפקידו המכריע הן במחקר בסיסי והן ביישומים קליניים פוטנציאליים 24,25,26,27.

מולקולות שונות מציגות רמות אנרגיית רטט שונות, הגורמות לדרגות שונות של פיזור לא אלסטי כאשר הן נרגשות על ידי אור מקרי - תופעה שאופיינה לראשונה על ידי C. V. Raman בשנת 192828. מאז נעשה שימוש נרחב באפקט ראמאן במיקרוסקופיה אופטית לאיתור קומפוזיציות מולקולריות ורקמות ללא תיוג אקסוגני. גם פיזור רמאן מגורה (SRS) וגם פיזור רמאן קוהרנטי נגד סטוקס (CARS) מעוררים תנודות מולקולריות באופן קוהרנטי וממנפים את האינטראקציה הלא ליניארית של האור כדי לייצר אות חזק יותר בהשוואה לספקטרוסקופיה ספונטנית קונבנציונלית. תופעת ה-SRS דווחה לראשונה ב-196229. בשנת 2008, מנגנון זה שולב בהדמיה תלת מימדית רב-ממדית, המאפשרת זיהוי סלקטיבי של כימיקלים על סמך שינויי עוצמה בקרני המשאבה וסטוקס עקב מעברי רטט מולקולריים30. שיטה זו ממזערת הפרעות רקע שאינן תהודה, ויוצרת אות עוצמה נקי העולה על זה של CARS. הדמיית SRS מצטיינת במתן הדמיה מרובה והיפרספקטרלית, המאפשרת זיהוי בו זמנית של קשרים כימיים מרובים ומאפשרת הדמיה ברזולוציה גבוהה של הרכב מולקולרי בדגימות בעלות עומק חדירה ניכר. למרות שמדובר בטכניקה חדשה יחסית, הדמיית SRS הוכחה כיעילה הן באבחון קליני והן במחקר מטבולי, in vivo ו-in vitro 30,31,32,33,34,35,36. לדוגמה, SRS יכול להבדיל בין רקמות שחדרו לגידול במוח לבין קליפת המוח והחומר הלבן על ידי כימות יחס השומנים לחלבון, מה שמאפשר תיחום של שולי הגידול בצורה נטולת תווית ולא פולשנית37,38. בנוסף, ניתן להעריך כמותית שינויים מטבוליים, הנחשבים לעתים קרובות לסימני היכר של מחלות הקשורות להזדקנות ולסרטן, באמצעות SRS שהושג על ידי זיהוי קשרי פחמן-דאוטריום בדגימות שטופלו במים כבדים (D2O), המאפשר מדידה כמותית של סינתזת חלבונים, ליפוגנזה ותהליכים מטבוליים מקרומולקולריים אחרים 31,33,34,35,36. היכולת לעקוב אחר מטבוליטים ברזולוציה גבוהה בזמן ובמרחב מציבה את SRS ככלי מבטיח לחקירת ואבחון מחלות, עם פוטנציאל ליישומים קליניים רחבים יותר.

הדמיה רב-מודאלית התגלתה כגישה רבת עוצמה במחקר ביו-רפואי, המשלבת שתי שיטות הדמיה או יותר כדי להשיג הבנה מקיפה יותר של מערכות ביולוגיות מורכבות באותה דגימה. בשנת 2018 הוצגה טכניקת מיקרוסקופיה אוטופלואורסצנטית-מולטי-הרמונית (SLAM) ללא תוויות, המשלבת פלואורסצנציה דו-פוטונית (2PF), פלואורסצנציה תלת-פוטונית (3PF), SHG ודור הרמוני שלישי (THG)39. גישה זו מאפשרת הדמיה בו זמנית של אינטראקציות תאיות, תהליכים דינמיים ורכיבים בודדים בתוך מיקרו-סביבת הגידול. מיקרוסקופ SLAM מציע הפרעה מינימלית ודרישות כוח לייזר מופחתות לדגימה, מה שמאפשר פרופיל רקמות עמוק ומספק שיטה בטוחה יותר לניטור תוך חיוני40. שיטה רב-מודאלית נוספת, המשלבת ספקטרוסקופיה פלואורסצנטית פנימית, ספקטרוסקופיה של החזר מפוזר וספקטרוסקופיה של ראמאן, פותחה לגילוי סרטן באתרו במהלך פרוצדורות כירורגיות41. בנוסף, מערכת אנדוסקופיה לא ליניארית רב-מודאלית שתוכננה לאחרונה, המשלבת CARS, SHG ופלואורסצנציה דו-פוטונית (TPF), הדגימה את היכולת לצלם דגימות ביולוגיות ברזולוציה מרחבית תת-מיקרונית ותת-תאית42. מיקרוסקופיה משולבת של 2PF ו-SRS שימשה באופן דומה להדמיה ברזולוציה גבוהה של רקמות, תאים ואברונים 42,43,44,45. טכניקות הדמיה מולטי-מודאליות מתפתחות אלה רותמות את החוזקות של שיטות בודדות, מה שמוביל לשיפור הרזולוציה, עומק החדירה ויעילות רכישת התמונה, ובכך מראות פוטנציאל ניכר ליישומים קליניים וכירורגיים.

גישה רב-מודאלית זו מועדפת יותר ויותר על פני הדמיה חד-מודאלית מכיוון שהיא מספקת מגוון רחב יותר של מדידות תוך הפחתת המגבלות הקשורות לטכניקות בודדות. כפי שנדון קודם לכן, MPF מודד פלואורסצנטיות אנדוגנית כדי לשקף שינויים מטבוליים, SHG יכול לדמות מבנים לא צנטרו-סימטריים כגון קולגן בדגימות ביולוגיות, ו-SRS מזהה בעיקר חלבונים ושומנים בשל הצפיפות הגבוהה של קשרים כימיים המייצרים אותות ראמאן ייחודיים על סמך מצבי הרטט שלהם. בהתחשב בתכונותיהם הקוהרנטיות והעיקרון המשותף של תכונות אופטיות לא ליניאריות, ניתן לשלב שיטות הדמיה אלה במערך מיקרוסקופ יחיד תוך שימוש בלייזרים פולסים קצרים במיוחד, המאפשרים רכישה של סמנים ביולוגיים שונים באזורים מקומיים כדי לספק תצוגה מלאה יותר של תהליכים ביולוגיים44,45. מאמר זה מתאר פרוטוקול ליישום פלטפורמת הדמיה רב-מודאלית המשלבת MPF, SHG ו-SRS ליישומי מחקר ביו-רפואי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. ניסויי הדמיה מולטי-מודאליים ללא תוויות

הערה: פרוטוקול זה מתמקד בהליך ההגדרה והרכישה של הדמיה רב-מודאלית ללא תוויות.

  1. הגדרת המיקרוסקופ הרב-מודאלי (איור 1A) וכיול המערכת
    1. מחממים את הלייזר ומחכים כ-15-20 דקות.
    2. הפעל את יחידות הבקרה והמסכים ברצף הבא: תיבת בקרה | בקר לוח מגע | מתאם AC לשלט לייזר ראשי מתאם AC לשלט לייזר משנה.
    3. הפעל את גלאי הפוטו-דיודה Si ואת מגבר הנעילה.
    4. הגדר את קרני הלייזר של המשאבה ואת קרן סטוקס. הגדר את מערכת הלייזר עם קרן משאבה הניתנת לכוונון מ-780 ננומטר ל-990 ננומטר, רוחב דופק של 5 - 6 ps וקצב חזרה של 80 מגה-הרץ. לקרן הלייזר של סטוקס אורך גל קבוע של 1,031 ננומטר עם דופק של 6 ps וקצב חזרה של 80 מגה-הרץ . ודא שגם קורות המשאבה וגם קורות סטוקס הן בהספק נמוך (לפחות 20 mW) כדי להיות גלויות על לוחית היישור.
    5. הנח לוחית יישור אחת בנתיב האופטי (מיד אחרי תיבת הלייזר) כדי לבדוק את החפיפה המרחבית של המשאבות וקרני סטוקס וכוונן את המראה עד ששתי הנקודות חופפות במרכז לוחית היישור.
      הערה: למרות שהמשאבות וקרני סטוקס חופפות באופן גס, כוונון עדין של החפיפה המרחבית של שתי קרני לייזר יכול להשיג את אות ה-SRS האופטימלי.
    6. לאחר חפיפה מרחבית, כוונון עדין עם ה-PSD (גלאי רגיש למיקום) על ידי לחיצה ראשונה על תוכנת הבקרה OPO . השתמש במקש המשושה כדי לכוונן בזהירות את המראה האופטית 1 (OM1) וצפה בתצוגת ה-PSD לשינוי מיקום ה-XY כדי לכוון לסטייה המינימלית מהמרכז. לאחר מכן, כדי לבצע התאמות מדויקות יותר, השתמש במקש המשושה במראה האופטית 2 (OM2) עד שמחוון המיקום יהיה ממורכז בתצוגת ה-PSD.
      הערה: OM1 ו-OM2 הן שתי מראות בראש OPO כדי להתאים את יישור הלייזר.
    7. לבסוף, מרכז את המעבה על ידי סיבוב שני הברגים המרכזיים את המעבה כדי להזיז את תמונת דיאפרגמת הקשתית למרכז שדה הראייה.
      הערה: דיאפרגמת קשתית השדה יכולה להגביל את קוטר אלומת האור הנכנסת למטרה ובכך להוציא אור זר, ולשפר את ניגודיות התמונה.
  2. שלבי קליטת הדמיה רב-מודאלית ללא תוויות
    1. מרחו שמן על מעבה השמן בעל הצמצם המספרי הגבוה (1.4 NA) והרכיבו את שקופית המיקרוסקופ על המעבה המשומן. לבסוף, הנח טיפת מים גדולה על שקופית המיקרוסקופ עבור מטרת המים פי 25. ודא שהמיקרוסקופ מותקן היטב ובלתי ניתן להזזה ולאחר מכן כוונן את z stage כדי לכוונן את המיקוד עד שניתן יהיה לראות את תמונת השדה הבהיר של הדגימה הביולוגית מתחת למטרת המים פי 25.
    2. התחל את תהליך ההדמיה ברצף הנכון: MPF, SHG ו-SRS כדי למנוע פוטוהלבנה, מה שישפיע על איכות התמונה והניתוח המדויק של MPF. כדי לעבור בין MPF ל-SHG במהירות, עבור מקרן המשאבה לקורת סטוקס הקבועה.
      הערה: כוונון לייזר המשאבה מ-800 ננומטר (NADH ו-FAD autofluorescence) ל-791.3 ננומטר (CH3 Raman Shift) יכול להימשך 1-2 דקות.
    3. בחר את רזולוציית התמונה (512 x 512 פיקסלים) ואת זמן ההשתהות המתאים לכל אופן. השתמש ב-8 מיקרון/פיקסל עבור MPF ו-SHG עם מסגרת ממוצעת מעל 3. השתמש ב-40 מיקרו-שניות/פיקסל עם מסגרת ממוצעת 2 לשיטת SRS.
      הערה: המסגרת הממוצעת פירושה מספר התמונות שיש לחשב בממוצע לפני השמירה.
    4. כדי לרכוש אוטופלואורסצנטיות עם MPF, כבה את קרן הלייזר של סטוקס וכוון את לייזר המשאבה ל-800 ננומטר לקבלת NADH ופלבין מרגשים. התקן את קוביית המסנן FVOPT בנתיב האור עם 460 ± 10 ננומטר ו-515 ± 10 ננומטר עבור ה-NADH והפלבין, בהתאמה. ההספק על המדגם הוא אפוא כ-15 מגוואט.
    5. רכשו את אות סיבי הקולגן באמצעות SHG. כבה את קרן הלייזר של המשאבה, השתמש רק בקרן לייזר של סטוקס, והגדר את ההספק ל-500 מגוואט. רכוש רק את הערוץ הקשור למסנן 515 ננומטר.
    6. השג את ההתפלגות המרחבית של חלבונים ושומנים באמצעות SRS. השאר את שתי קרני הלייזר דולקות והתאם את תדר קרן הלייזר כך שיתאים למצב הרטט הספציפי עבור כל מולקולה.
      הערה: בדרך כלל, 791.3 ננומטר משמש ל-CH3, 797 ננומטר משמש ל-CH2, 787 ננומטר לשומנים בלתי רוויים, ו-794.6 ננומטר לשומנים רוויים. ההספק על הדגימה הוא אפוא כ-40 מגוואט.
    7. כדי לרכוש את מערכי הנתונים של התמונה ההיפרספקטרלית של SRS, פתח את תוכנת הבקרה OPO כדי לבחור טאטא, הגדר את טווח אורכי הגל מ-780 ננומטר ל-806.5 ננומטר ובחר מספר מחסנית של לפחות 60. לאחר מכן, לכוד את ערימת התמונות ההיפר-ספקטרלית.
      הערה: מערך הנתונים המתקבל מכיל 60 תמונות, שכל אחת מהן מייצגת את ההתפלגות המרחבית בשינוי ראמאן ספציפי (מ-2,700 ס"מ-1 ל-3,150 ס"מ-1). זמן הרכישה ההיפרספקטרלית תלוי בשדה הראייה (FOV) של התמונה ובזמן הסריקה, אך יהיה בערך בין 5 דקות ל-8 דקות עבור תמונה של 512 x 512. עבור תמונות גדולות יותר, יש להקפיד למזער את משך הזמן מתחת ללייזר כדי למנוע נזק לאור, שעלול להתרחש לאחר שעתיים (תלוי בעובי הדגימה ובגודל ה-FOV).
    8. שמור את כל התמונות באותם אזורי עניין (ROI) באותה תיקייה. פורמט התמונה הוא קובץ Olympus .oir.

2. ניתוח תמונות

  1. השתמש בתוכנת עיבוד תמונה כדי לפתוח את כל התמונות הגולמיות השמורות כדי להקצות את הצבע ולהוסיף את סרגל קנה המידה לתצוגת התמונה. השתמש בו גם כדי ליצור את המסכה הבינארית של תמונות NADH וחומצות שומן רוויות (SFAs, 2,880 ס"מ-1) ליחס חמצון חיזור אופטי וניתוח אי רוויה של שומנים.
    הערה: ודא שעוצמת המסכה כוללת רק 0 ו-1.
  2. השתמש בסקריפט הפיתון הביתי כדי לבצע כל ניתוח במורד הזרם (הקוד זמין בכתובת https://github.com/lingyanshi2020/HSI_Analysis).
    הערה: סקריפט זה נועד לעבד אזורי עניין מרובים (ROI) הן מדגימות בקרה והן מדגימות סרטן. הפונקציה העיקרית של הסקריפט דורשת שתי כניסות בלבד: נתיבי הקבצים עבור תיקיות הבקרה ותמונות הסרטן.
    1. חזור על התיקיות, והתאם תמונות עם אותו שם בסיס (למשל, "roi_1_flavin.tif", "roi_1_nadh.tif", "roi1_mask.tif").
    2. עבור כל קבוצה של תמונות תואמות, תנו לסקריפט לבצע ניתוח רציומטרי וליצור תמונות רציומטריות חדשות על סמך החישובים האלה.
      יחס החמצון האופטי מחושב כ- flavin / (NADH + flavin).
      אי רוויה של שומנים מחושבת כ: USFAs / (SFAs + USFAs) כאשר USFAs מייצגים חומצות שומן בלתי רוויות.
    3. כל ערכי היחס מהתמונות מאוחסנים לאחר מכן ב-pandas DataFrame למניפולציה קלה. בצע ANOVA חד כיווני והשתמש ב-matplotlib עם styple "ggplot" או seaborn כדי לבצע את ה-barplot או boxplot לכימות.
    4. השתמש בתמונות 2,930 ס"מ-1 (CH3) ו-2,850 ס"מ-1 (CH2) כדי ליצור תמונה מופחתת (CH3 - CH2). לאחר מכן, מזג את תמונת CH2 CH3 - CH2 במרחב צבעים RGB עם LUT מותאם אישית המחקה צביעה של H&E כדי ליצור את תמונת ההיסטולוגיה הדיגיטלית46.
  3. לאחר רכישת תמונות SRS היפר-ספקטרליות, השתמש בסקריפט הפיתון הביתי כדי לבצע את אשכולות k-means כדי לפלח את התמונות על סמך קווי דמיון ספקטרליים (הקוד זמין ב-https://github.com/lingyanshi2020/HSI_Analysis).
    1. טען את אוספי התמונות .tiff בחבילת tifffile. עצב מחדש את ערימת התמונות ההיפר-ספקטרלית של SRS (x, y, ספקטרה) למערך דו-ממדי (פיקסלים, ספקטרום).
    2. השתמש בחבילת scikit-learn כדי לפרוס אלגוריתם k-means למערך דו-ממדי זה, עם מספר האשכולות המוגדר
    3. עצב מחדש את תוויות האשכול המתקבלות בחזרה למידות התמונה המקוריות, וצור מפת פילוח.
    4. הקצה צבעים ייחודיים לכל אשכול, וצור תמונה בצבע כוזב המייצגת הרכבים ביוכימיים שונים בתוך הרקמה.
    5. השתמש ב-matplotlib כדי לשרטט את הספקטרום של כל אשכול עם ערך ממוצע (קו מלא) וסטיית תקן (אזור צל)
    6. עקוב אחר הפרוטוקול של פרוטוקול התאמת ההפניה העונשית SRS (PRM-SRS) באמצעות MATLAB כדי ליצור את זיהוי תת-סוג השומנים המרחבי ללא תווית עם מערכי נתונים של תמונה היפרספקטרלית SRS47.
    7. ארגן את התמונות ושמור אותן בפורמט .tif של 300 dpi.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

התמונות באיור 2 מייצגות את התוצאות המתקבלות ממעקב אחר הפרוטוקול לרכישת אוטופלואורסצנציה של FAD ו-NADH כמו גם ארבעת ערוצי ה-SRS עבור חלבון, סך השומנים, השומנים הבלתי רוויים והשומנים הרוויים. כאן אנו מייצרים גם תמונה פסאודו-היסטולוגית כמתואר בפרוטוקול באמצעות מיזוג צבעים RGB. רכישת ערוצי MPF ו-SRS מספקת את קבצי התמונה שישמשו מאוחר יותר בניתוח רציומטרי. דוגמה לניתוח זה ניתן לראות באיור 3 על רקמת ריאה אנושית. לאחר רכישת תמונה בפרוטוקול, מתודולוגיית ניתוח התמונות שלנ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מערכת רב-מודאלית זו היא פלטפורמת הדמיה רבת עוצמה ללכידת הדמיה הוליסטית של הסביבה המולקולרית של דגימות על פני מגוון רחב של מקורות ביולוגיים ומצבים פתולוגיים. היתרון במינוף שיטות שונות ללא תוויות טמון ביכולת לרכוש מידע משלים ולמקד אנליטים ספציפיים שאחרת עשויים להיות קשים או בלתי אפשריים בטכניקת הדמיה אחת ללא תוויות. באופן ספציפי, שלוש טכניקות ההדמיה הלא ליניאריות (SRS, MPF, SHG) המוזכרות במאמר זה מאפשרות לכמת את הרכב המקרומולקולות, דינמיקת אנרגיה באמצעות יחס חמצון חיזור אופטי ומידע מבני, כ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי אינטרסים להצהיר עליהם.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לד"ר גלוריה פריהובר ולחברי צוות HuBMAP שלה על אספקת פרוסות רקמת ריאה אנושית. אנו מודים לד"ר קון ז'אנג על אספקת רקמות מוח אנושיות. אנו גם מודים לד"ר Gen-Sheng Feng על שסיפק דגימות כבד של עכברים. אנו מודים לתמיכה מ-NIHU54DK134301, NIH R01GM149976, NIH U01AI167892, NIH R01HL170107, NIH 5R01NS111039, NIH R21NS125395, NIH U54CA132378, קרנות סטארט-אפ של UCSD, פרס עמית מחקר סלואן ופרס CZI DAF2023-328667.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
קוביית מסנן 460 ננומטראולימפוסOCT-ET 460/50M32
מסנן פס פסKR אלקטרוניקהKR27248 מגה-הרץ
BNC 50 אוהם טרמינטורמיני מעגליםSTRM-50
ספק כוח DCTopWard6302D
הר דיכרואיThorlabsKM100CL
FIJI ImageJImageJ
מעבה שמן NA גבוהאולימפוס6-U130
מסנן מעבר קצר OD גבוהThorlabs950 ננומטר
מיקרוסקופ סריקת לייזר הפוךמגבר נעילה אולימפוסFV1200MPE
ציריך אינסטרומנטס
מערכת לייזר אמרלדפיזיקה יישומית & אלקטרוניקה בע"מ  אלומת משאבה פועמת מסונכרנת (ניתנת לכוונון 720– 990&דק; אורך גל ננומטר, 5– 6&דק; רוחב דופק PS, ו-80  קצב חזרות MHz) וסטוקס (אורך גל ב-1032  ננומטר, 6  רוחב דופק PS, ו-80  קצב חזרות MHz)
SI גלאי פוטודיודה
Olympus
VF-300 Compresstome מדויק
בקר לוח מגע ביתי

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wollman, A. J. M., Nudd, R., Hedlund, E. G., Leake, M. C. From Animaculum to single molecules: 300 years of the light microscope. Open Biol. 5 (4), 150019(2015).
  2. Vicidomini, G., Bianchini, P., Diaspro, A. STED super-resolved microscopy. Nat Methods. 15 (3), 173-182 (2018).
  3. Weber, M., et al. MINSTED fluorescence localization and nanoscopy. Nat Photonics. 15 (5), 361-366 (2021).
  4. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. , (1990).
  5. Hell, S. W., et al. Three-photon excitation in fluorescence microscopy. J Biomed Optics. 1 (1), 71-74 (1996).
  6. Alhallak, K., Rebello, L. G., Muldoon, T. J., Quinn, K. P., Rajaram, N. Optical redox ratio identifies metastatic potential-dependent changes in breast cancer cell metabolism. Biomed Opt Express. 7 (11), 4364-4374 (2016).
  7. Pena, A. -M., et al. Multiphoton FLIM imaging of NADH and FAD to analyze cellular metabolic activity of reconstructed human skin in response to UVA light. Multiphoton Microscopy in the Biomedical Sciences XIX. 10882, 23-33 (2019).
  8. Hu, L., Wang, N., Cardona, E., Walsh, A. J. Fluorescence intensity and lifetime redox ratios detect metabolic perturbations in T cells. Biomed Opt Express. 11 (10), 5674-5688 (2020).
  9. Chance, B., Schoener, B., Oshino, R., Itshak, F., Nakase, Y. Oxidation-reduction ratio studies of mitochondria in freeze-trapped samples. NADH and flavoprotein fluorescence signals. J Biol Chem. 254 (11), 4764-4771 (1979).
  10. Ostrander, J. H., et al. Optical redox ratio differentiates breast cancer cell lines based on estrogen receptor status. Cancer Res. 70 (11), (2010).
  11. Skala, M. C., et al. In vivo multiphoton microscopy of NADH and FAD redox states, fluorescence lifetimes, and cellular morphology in precancerous epithelia. Proc Natl Acad Sci USA. 104 (49), 19494-19499 (2007).
  12. Varone, A., et al. Endogenous two-photon fluorescence imaging elucidates metabolic changes related to enhanced glycolysis and glutamine consumption in precancerous epithelial tissues. Cancer Res. 74 (11), 3067-3075 (2014).
  13. Malak, M., James, J., Grantham, J., Ericson, M. B. Contribution of autofluorescence from intracellular proteins in multiphoton fluorescence lifetime imaging. Sci Rep. 12, 16584(2022).
  14. Blacker, T. S., Duchen, M. R. Investigating mitochondrial redox state using NADH and NADPH autofluorescence. Free Radic Biol Med. 100, 53-65 (2016).
  15. Roth, S., Freund, I. Second harmonic generation in collagen. J Chem Phys. 70 (4), 1637-1643 (1979).
  16. Freund, I., Deutsch, M. Second-harmonic microscopy of biological tissue. Opt Lett. 11 (2), 94(1986).
  17. Boyd, R. W., Gaeta, A. L., Giese, E. Nonlinear optics. Springer Handbook of Atomic, Molecular, and Optical Physics. Drake, G. W. F. , Springer. 1097-1110 (2023).
  18. Aghigh, A., et al. Second harmonic generation microscopy: a powerful tool for bio-imaging. Biophys Rev. 15 (1), 43-70 (2023).
  19. Mohler, W., Millard, A. C., Campagnola, P. J. Second harmonic generation imaging of endogenous structural proteins. Methods. 29 (1), 97-109 (2003).
  20. Cox, G. Biological applications of second harmonic imaging. Biophys Rev. 3 (3), 131(2011).
  21. Brown, E., et al. Dynamic imaging of collagen and its modulation in tumors in vivo using second-harmonic generation. Nat Med. 9 (6), 796-800 (2003).
  22. Keikhosravi, A., Bredfeldt, J. S., Sagar, A. K., Eliceiri, K. W. Chapter 28 - Second-harmonic generation imaging of cancer. Methods Cell Bio. 123, 531-546 (2014).
  23. Hui Mingalone, C. K., et al. Bioluminescence and second harmonic generation imaging reveal dynamic changes in the inflammatory and collagen landscape in early osteoarthritis. Lab Invest. 98 (5), 656-669 (2018).
  24. Tsafas, V., et al. Polarization-dependent second-harmonic generation for collagen-based differentiation of breast cancer samples. J Biophotonics. 13 (10), e202000180(2020).
  25. Nadiarnykh, O., LaComb, R. B., Brewer, M. A., Campagnola, P. J. Alterations of the extracellular matrix in ovarian cancer studied by Second Harmonic Generation imaging microscopy. BMC Cancer. 10, 94(2010).
  26. Xiong, S. Y., Yang, J. G., Zhuang, J. Nonlinear spectral imaging of human normal skin, basal cell carcinoma and squamous cell carcinoma based on two-photon excited fluorescence and second-harmonic generation. Laser Phys. 21 (10), 1844-1849 (2011).
  27. Tilbury, K., Campagnola, P. J. Applications of second-harmonic generation imaging microscopy in ovarian and breast cancer. Perspect Medicin Chem. 7, 21-32 (2015).
  28. Raman, C. V., Krishnan, K. S. A New type of secondary radiation. Nature. 121 (3048), 501-502 (1928).
  29. Eckhardt, G., et al. Stimulated Raman scattering from organic liquids. Phys Rev Lett. 9 (11), 455-457 (1962).
  30. Freudiger, C. W., et al. Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy. Science. 322 (5909), 1857-1861 (2008).
  31. Li, Y., et al. Microglial lipid droplet accumulation in tauopathy brain is regulated by neuronal AMPK. Cell Metab. 36 (6), 1351-1370.e8 (2024).
  32. Lu, F. -K., et al. Label-free neurosurgical pathology with stimulated Raman imaging. Cancer Res. 76 (12), 3451-3462 (2016).
  33. Shi, L., et al. Optical imaging of metabolic dynamics in animals. Nat Commun. 9 (1), 2995(2018).
  34. Zhang, L., et al. Spectral tracing of deuterium for imaging glucose metabolism. Nat Biomed Eng. 3 (5), 402-413 (2019).
  35. Li, Y., et al. Bioorthogonal stimulated Raman scattering imaging uncovers lipid metabolic dynamics in Drosophila brain during aging. GEN Biotechnol. 2 (3), 247-261 (2023).
  36. Li, X., et al. Quantitative imaging of lipid synthesis and lipolysis dynamics in Caenorhabditis elegans by stimulated Raman scattering microscopy. Anal Chem. 91 (3), 2279-2287 (2019).
  37. Ji, M., et al. Detection of human brain tumor infiltration with quantitative stimulated Raman scattering microscopy. Sci Transl Med. 7 (309), 309ra163(2015).
  38. Ji, M., et al. Rapid, label-free detection of brain tumors with stimulated Raman scattering microscopy. Sci Transl Med. 5 (201ra119), 201ra119(2013).
  39. You, S., et al. Intravital imaging by simultaneous label-free autofluorescence-multiharmonic microscopy. Nat Commun. 9, 2125(2018).
  40. You, S., et al. Label-free deep profiling of the tumor microenvironment. Cancer Res. 81 (9), 2534-2544 (2021).
  41. Jermyn, M., et al. Highly accurate detection of cancer in situ with intraoperative, label-free, multimodal optical spectroscopy. Cancer Res. 77 (14), 3942-3950 (2017).
  42. Pshenay-Severin, E., et al. Multimodal nonlinear endomicroscopic imaging probe using a double-core double-clad fiber and focus-combining micro-optical concept. Light Sci Appl. 10 (1), 207(2021).
  43. Wu, W., Li, X., Qu, J. Y., He, S. In vivo imaging of biological tissues with combined two-photon fluorescence and stimulated Raman scattering microscopy. J Vis Exp. (178), e63411(2021).
  44. Li, X., Jiang, M., Lam, J. W. Y., Tang, B. Z., Qu, J. Y. Mitochondrial imaging with combined fluorescence and stimulated Raman scattering microscopy using a probe of the aggregation-induced emission characteristic. J Am Chem Soc. 139 (47), 17022-17030 (2017).
  45. Li, Z., et al. Multimodal imaging of metabolic activities for distinguishing subtypes of breast cancer. Biomed Opt Express. 14 (11), 5764-5780 (2023).
  46. Fung, A. A., et al. Label-free optical biopsy reveals biomolecular and morphological features of diabetic kidney tissue in 2D and 3D. , (2024).
  47. Zhang, W., et al. Multi-molecular hyperspectral PRM-SRS microscopy. Nat Commun. 15 (1), 1599(2024).
  48. Xu, F. X., et al. Discrimination of lipid composition and cellular localization in human liver tissues by stimulated Raman scattering microscopy. J Biomed Opt. 29 (1), 016008(2024).
  49. Zoumi, A., Yeh, A., Tromberg, B. J. Imaging cells and extracellular matrix in vivo by using second-harmonic generation and two-photon excited fluorescence. Proc Natl Acad Sci USA. 99 (17), 11014-11019 (2002).
  50. Liaudanskaya, V., et al. Mitochondria dysregulation contributes to secondary neurodegeneration progression post-contusion injury in human 3D in vitro triculture brain tissue model. Cell Death Dis. 14 (8), 1-15 (2023).
  51. Walsh, A. J., et al. Optical metabolic imaging identifies glycolytic levels, sub-types and early treatment response in breast cancer. Cancer Res. 73 (20), 6164-6174 (2013).
  52. Conklin, M. W., et al. Aligned collagen is a prognostic signature for survival in human breast carcinoma. Am J Pathol. 178 (3), 1221-1232 (2011).
  53. Sun, W., et al. Nonlinear optical microscopy: use of second harmonic generation and two-photon microscopy for automated quantitative liver fibrosis studies. J Biomed Optics. 13 (6), 064010(2008).
  54. Nejim, Z., Navarro, L., Morin, C., Badel, P. Quantitative analysis of second harmonic generated images of collagen fibers: a review. Res Biomed Eng. 39 (1), 273-295 (2023).
  55. Burke, K., Brown, E. The use of second harmonic generation to image the extracellular matrix during tumor progression. Intravital. 3 (3), e984509(2015).
  56. Balasubramanian, P., Prabhakaran, M. P., Sireesha, M., Ramakrishna, S. Collagen in human tissues: Structure, function, and biomedical implications from a tissue engineering perspective. Polymer Composites - Polyolefin Fractionation - Polymeric Peptidomimetics - Collagens. Abe, A., Kausch, H. H., Möller, M., Pasch, H. 251, 173-206 (2012).
  57. Dadsena, S., et al. Lipid unsaturation promotes BAX and BAK pore activity during apoptosis. Nat Commun. 15, 4700(2024).
  58. Barelli, H., Antonny, B. Lipid unsaturation and organelle dynamics. Curr Opin Cell Biol. 41, 25-32 (2016).
  59. Harayama, T., Antonny, B. Beyond fluidity: The role of lipid unsaturation in membrane function. Cold Spring Harb Perspect Biol. 15 (7), a041409(2023).
  60. Yoon, H., Shaw, J. L., Haigis, M. C., Greka, A. Lipid metabolism in sickness and in health: Emerging regulators of lipotoxicity. Mol Cell. 81 (18), 3708-3730 (2021).
  61. Villazon, J., Shi, L. Utilizing K-means clustering on hyperspectral DO-SRS images of the mouse hippocampus. CLEO 2024, Technical Digest Series. , Optica Publishing Group. (2024).
  62. Fu, D., et al. Quantitative chemical imaging with multiplex stimulated Raman scattering microscopy. J Am Chem Soc. 134 (8), 3623-3626 (2012).
  63. Periasamy, A., Diaspro, A. Special section guest editorial: Multiphoton microscopy. J Biomed Optics. 8 (3), 327(2003).
  64. Lakowicz, J. R., Szmacinski, H., Nowaczyk, K., Johnson, M. L. Fluorescence lifetime imaging of free and protein-bound NADH. Proc Natl Acad Sci USA. 89 (4), 1271-1275 (1992).
  65. Blacker, T. S., et al. Separating NADH and NADPH fluorescence in live cells and tissues using FLIM. Nat Commun. 5, 3936(2014).
  66. Xiong, H., et al. Background-free imaging of chemical bonds by a simple and robust frequency-modulated stimulated Raman scattering microscopy. Opt Express. 28 (10), 15663-15677 (2020).
  67. Georgakoudi, I., Quinn, K. P. Label-free optical metabolic imaging in cells and tissues. Annu Rev Biomed Eng. 25, 413-443 (2023).
  68. Alam, S. R., Wallrabe, H., Christopher, K. G., Siller, K. H., Periasamy, A. Characterization of mitochondrial dysfunction due to laser damage by 2-photon FLIM microscopy. Sci Rep. 12 (1), 11938(2022).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים