מאמר שיטה

זיהוי הידוק קשתית הרשתית האנדופלזמית הקשורה למיטוכונדריה באמצעות חיישני FRET מושרים

DOI:

10.3791/67914

⸱

7 באוגוסט 2026

 ,  , 
1Genetics and Aging Research Unit, MassGeneral Institute for Neurodegenerative Disease, Henry and Allison McCance Center for Brain Health, Department of Neurology, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School,

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מתארים שיטה למדידת ערכי FRET של חיישני FRET מושרים המיוקדים את ה-ER (מתויג CFP) או מיטוכונדריה (מתויגת YFP) במבחנה , כדי להעריך את ההידוק של ממברנות ER הקשורות למיטוכונדריה (MAMs), המשפיעות על יצירת Aβ, ושיטה זו יכולה לשמש לסקר ראשוני של סוכנים סינתטיים או טבעיים המווסתים MAM כתרפיאציות פוטנציאליות ל-AD.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקרים רבים הראו כי מספר, האורך ורוחב הרווח (עובי) של מגעי ER-מיטוכונדריה, או ממברנות הקשורות למיטוכונדריה (MAMs), משפיעים על תפקידם הביולוגי. העבודה הקודמת שלנו הראתה כי ייצוב של MAMs הדוקים, המאופיין ברוחב פער של כ-7 ננומטר, מוביל לעלייה ברמות β העמילואידים (Aβ), בעוד שנוכחות MAMs רופפים, עם רוחב פער של כ-40 ננומטר, מפחיתה את ייצור ה-Aβ במודל תלת-ממדי (תלת-ממדי) של מחלת האלצהיימר (AD). כדי לחקור את השפעות ה-MAMs ברוחבי פערים שונים, פותחו ביוסנסורים ממוקדי ER ומיטוכונדריה FRET (Förster Resonance Energy Transfer) - ER-CFP (חלבון פלואורסצנטי ציאן) ומיטו-YFP (חלבון פלואורסצנטי צהוב) בהתאמה - לכימות MAMs הדוקים (רוחב פער <10 ננומטר) לעומת MAMs רופפים או לא-MAMs. FRET מתרחש כאשר הפלואורופור של התורם (CFP) ופלואורופור המקבל (YFP) נמצאים במרחק של 10 ננומטר זה מזה, מה שהופך מערכת זו למתאימה להערכת קרבה ל-MAM. פרוטוקול זה מפרט את השימוש ב-FRET ביחס ספקטרלי למדידת היקף היווצרות MAM הדוקה.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מגעי רשתית אנדופלזמיים הקשורים למיטוכונדריה (MERCs), המבודדים ביוכימית כממברנות ER הקשורות למיטוכונדריה (MAMs), מעורבים במספר הפרעות ניווניות נוירודגנרטיביות, כולל מחלת אלצהיימר (AD)1. השערת "MA" שהוצעה לאחרונה מציעה כי MAMs ממלאים תפקיד מרכזי ביצירת β עמילואידים (Aβ), ובכך יוזמים את המפל הפתוגני של AD. מפל זה כולל היווצרות של קשרים נוירופיבריליים (NFTs), דיסאומוסטזיס סידן ודלקת עצבית2. MAMs מורכבים ממיקרודומיינים עשירים בכולסטרול, דמויי רפסודת שומנים ברשתית האנדופלזמית ובממברנת המיטוכונדריה החיצונית (OMM), המקושרים על ידי חלבוני קישור ספציפיים התורמים למגוון המבני והתפקודי שלהם. ייצוב מגעי ER-מיטוכונדריה משפיע על תהליכים תאיים שונים, כולל איתות סידן ER ואפופטוזיס 4,5. ההערכה היא ש-5%-20% מהמיטוכונדריה יוצרות מגעים פיזיים עם חדר המיון כדי ליצורMAMs 6. מספר מחקרים הראו כי המספר, האורך ורוחב המרווח (עובי) בין ה-ER למיטוכונדריה באתרי MAM הם גורמים חשובים לתפקידם הפונקציונלי. מיקרוסקופ אלקטרון קריו-וניתוחים in vivo של כבד העכבר הראו כי מצב המטבוליזם של צירי הכבד מווסת הן את העובי (הנע בין 14 ל-20 ננומטר) והן את האורך (הנע בין 145 ל-270 ננומטר) שלMAMs 7.

MAMs גם הופכים למטרות טיפוליות פוטנציאליות להפרעות שונות, כולל סרטן והפרעות מטבוליות. עובי או רוחב הפער של MAM מווסתים את הישרדות התאים. מייצבי ה-MAM המרכיבים, MAM 1X ו-MAM 9X, שתוכננו לייצוב ברוחב רווח צמוד (6 ננומטר ± 1 ננומטר) ו-MAMs רופפים (רוחב פער של 24 ננומטר ± 3 ננומטר), בהתאמה, הראו כי ייצוב של MAMs הדוקים הגדיל באופן דרמטי את יצירת ה-Aβ במודל חדש לתרבות עצבית תלת-ממדית של AD. לעומת זאת, ייצוב ה-MAMs הרופפים לא השפיע8. לכן, המרת ייצוב של MAMs הדוקים ל-MAMs רופפים עשויה להיות מועילה לפתולוגיה אמילואידית נמוכה יותר. המורכבות המבנית והפונקציונלית והיעדר ניתוח כמותי מדויק של מידת ייצוב ה-MAM הופכים את המיקוד ב-MAMs לגילוי תרופות לאתגר. הדמיה חדשה של תאים חיים וניתוח מבוסס קימוגרפיה של מהירות האקסונים של המיטוכונדריה הקשורה ל-ER הראתה כי מהירות האקסונים של המיטוכונדריה יכולה לשמש כמדד למדידת ייצוב MAM כמותית, משום שמגע הדוק יותר עם ה-ER מפחית משמעותית את מהירות האקסונים המיטוכונדרית בהשוואה למיטוכונדריה חופשית 8,9. באמצעות מייצב מושרה של MAMs בתאי Neuro 2A (N2AAPP)המביעים hAPP 8, מצאנו כי הידוק רוחבי פערי MAM מגדיל את יצירת Aβ באופן תלוי במינון8. מייצבי MAM המושרים הם פלסמידים ביטוי המקודדים את החיישנים הביולוגיים המתויגים ב-CFP (חלבון פלואורסצנציה ציאן) עם אפיטופה, ו-YFP (חלבון פלואורסצנציה צהוב) עם תיוג אפיטופים, המאוחדים לדומיינים של FK506 ראפמיצין (FRB) או 12kDa לחלבון FK506 (FKBP). החיישנים הביולוגיים סומנו כ-ER-CFP ו-Mito-YFP, בהתאמה. ה-CFP הוא פלואורופור תורם שמעביר אנרגיה לפלואורופור המקבל YFP כאשר הם מופרדים ב->10 ננומטר. תאים (N2A APP) המבטאים את החיישנים הביולוגיים המושרים הגדילו את ייצור ה-Aβ בטיפול בראפמיצין8, מה שמרמז כי הגדלת ה-MAMs ההדוקה הגדילה את ייצור Aβ. שיטות אלו יהיו מועילות לסינון מודולטורים מולקולריים קטנים של MAMs והריכוז האפקטיבי הנדרש כדי להגיע לייצוב רמה אופטימלית של MAMs הדוקים שימירו MAMs פתוגניים ("Aβ עולה") ל-MAMs טיפוליים ("מוריד Aβ") מבלי לערער לחלוטין את מגעי ER והמיטוכונדריה, דבר חשוב להישרדות התאים.

מודל ניסיוני
מחקר זה השתמש בתאי Neuro2A(N2A) המבטאים באופן קונסטורטיבי את APP751 (N2A APP). תאים אלו משחררים רמות ניתנות לזיהוי של Aβ לתוך המדיה המותנית (CM) בהשוואה לתאי N2A נאיביים. תאיAPP של N2A נשמרו ב-DMEM עם תוספת של 10% FBS, 100 U/mL פניצילין, 100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין, ו-2 מ"מ L-גלוטמט עם תוספת של 200 מיקרוגרם/מ"ל G418, כפי שתואר קודם10.

פלסמיד הבעה
פלסמיד ביטוי נוצר על ידי מיזוג רצף המיקוד המיטוכונדריאלי המסומן YFP (חלבון פלואורסצנטי צהוב) של רצף העוגן היונקי A-kinase 1 [AKAP1(34-63)] ורצף מטרה ER מתויג CFP (חלבון פלואורסצנטי ציאן) של פוספטידילינוזיטול-3-פוספטאז Sac1 [Sac1(521-587)] עם רצף Tav2A חותך עצמי המקודד את רצף הפפטיד EGRGSLLTCGDVEENPGP, המסומן כ-pYFP-AKAP1-Tav2A-Sac1-CFP8. פלסמיד הביטוי הממוזג Tav2A מוקף גם ברצפי נוקלאוטידים המקודדים את תחום הקשירה של FK506 רפמיצין (FRB) [EMWHEGLEEASRLYFGERNVKGMFEVLEPL HAMMERGPQTLKETSFNQAYGRDLMEAQEWCRKYMKSGNV (K 2095P)DLTQAWDLYYHVFRRISKQ] או דומיין החלבון הקשור FK506 (FKBP) ב-12 kDa (MGVEKQVIRPNGPKPAPGQTVTVHCTGFGKD GDLSQKFWSTKDEGQKPFSFQIGKGAVIKGWDEGVIGMQ IGEVARLRCSSDYAYGFPAWGIQPNSVLDFEIEVLSVQ). הפלסמיד ההיתוך FRB-YFP-AKAP1(34-63)-Tav2A-Sac1(521-587)-CFP-FKBP, המסומן כאן כ-MAM-Tav2A, נוצר כדי לקבל רמות ביטוי אקווימולריות של FRB-YFP-AKAP1(34-63) ו-Sac1(521-587)-CFP-FKBP לניתוח FRET הקצבי. ה-Sac1(521-587)-CFP-FKBP, המסומן כ-ER-CFP, הוא הפלואורופור של התורם, בעוד שמיטו-YFP-FRB, המסומן כ-Mito-YFP, הוא הפלואורופור המקבל שמייצר FRET כאשר הוא מופרד ב~10 ננומטר8. לכן, הביוחיישנים מבוססי FRET מזהים MAMs צפופים (6-10 ננומטר, רוחב פערים). ה-FRB וה-FKBP הוצגו כדי לעודד הידוק רוחבי פערי MAM עם הוספת רפמיצין באופן התלוי במינון, שניתן לכמת על ידי מדידת אות ה-FRET המוגבר8.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הריאגנטים והציוד ששימשו במחקר זה מופיעים בטבלת החומרים.

1. טרנספקציה

  1. טרנספקט של תאיN2A APP עם פלסמיד ביטוי MAM-Tav2A (14-18 שעות).
    1. לפני ההתחלה, לוח 1 × 106 תאיN2A APP בכל באר של לוחות 6 בארות המכיל כיסויי זכוכית ושומרים על התאים במדיום הצמיחה במשך 12-16 שעות.
    2. טרנספקט 1-3 מיקרוגרם פלסמיד MAM-Tav2A (קובץ משלים 1) באמצעות תגובת טרנספקציה של ליפופקטמין בהתאם לפרוטוקול היצרן.
    3. לאחר 12-16 שעות של טרנספקציה, בצע טיפול תרופתי.
      הערה: תמיד יש להעביר תאים עם פלסמיד ביטוי המקודד רק את התורם (ER-CFP) או את המקבל (Mito-YFP) שישמשו כרקע ל-FRET.

2. טיפול בסמים

  1. לטפל בתאיה-APP הביטוי MAM-Tav2A ב-Rapamycin (Rapa) או Rapalog (Log) (3-6 שעות).
    1. לפני הטיפול, יש להכין תמיסות מלאיות (10 מ"מ) של ראפה ולוג.
    2. החלף מדיה עם מדיה טרייה המכילה 0 ננומטר, 100 ננומטר, או 250 ננומטר ראפה או לוג.
    3. לאחר 3 שעות טיפול, מוסיפים 3.3% פרפורמלדהיד (PFA) כדי לקבע את התאים.
    4. הכינו את השקופיות למיקרוסקופ קונפוקלי פלואורסצנצי על ידי הנחת טיפה אחת של תגובת אנטי-פייד.
    5. התקן את הכיסוי מעל הטיפה ולחץ בעדינות עם המלקחיים.
      הערה: כיסויי הזכוכית שבירים ודורשים זהירות. כחלופה לכיסויי זכוכית, השתמשו בלוחות תחתית מזכוכית. החיסרון העיקרי בשימוש בלוחות עם תחתית זכוכית הוא שלא ניתן להשתמש במגיב האנטיפייד, מה שמקשה על הדמיה עקב הלבנת הפלואורופורים. אל תשתמשו בתגובת אנטי-פייד המכילה DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) כי הפלואורסצנציה הכחולה שלו תפריע ל-FRET בין CFP ל-YFP.

3. מיקרוסקופיה קונפוקלית להעברת אנרגיית תהודה פלואורסצנטית (FRET)

  1. הניחו את השקופיות תחת מיקרוסקופ הפוך וכווננו את מוקד המיקרוסקופ עד שהתאים יהפכו לגלויים.
  2. עוררו את הפלואורופור באמצעות לייזר 440 ננומטר וצילמו תמונות באמצעות פליטה של 468-503 ננומטר עבור התורם CFP (FKBP-CFP-ER) או 525-565 ננומטר עבור המקבל YFP (FRB-YFP-MITO).
  3. כוון את עוצמת האות באמצעות המסנן הפלואורסצנטי המובנה עד שאות הרקע מתפוגג (אמור להיות כמעט שחור לחלוטין).
    הערה: מיקרוסקופ קונפוקלי שימש ללכידת תמונות פלואורסצנטיות באמצעות תוכנת NIS Element AR. הגדלה של 60x שימשה ברזולוציה של 512 פיקסלים.
  4. שמור את התמונות כקבצי .nds.
  5. בצע ניתוח FRET ביחס ספקטרלי.

4. ניתוח FRET בקצב (6 - 12 שעות)

הערה: פליטת פלואורסצנציה מהתורם ER-CFP (468-503 ננומטר) ומהמקבל Mito-YFP (525-565 ננומטר) זוהתה באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי. תוכנת ImageJ שימשה לכימות את עוצמת הפלואורסצנציה הממוצעת של הפיקסלים לאחר חיסור ברקע. היחס בין עוצמת הפליטה של YFP ל-CFP חושב ושימש כקריאה לניתוח FRET ספקטרלי.

  1. תמונה פתוחה J (פיג'י).
  2. או לגרור את קובץ ה-.nds לתמונה J, או ללחוץ על קובץ -> Open ולבחור בתמונה.
  3. במסך הבא, בחר בתיבת Split Channels .
  4. לחץ על לוח C = 0 .
  5. לחץ על ניתוח -> מדידה.
    הערה: רשמו את הערך הממוצע לחישוב מאוחר יותר.
  6. לחץ על תהליך -> מתמטיקה -> חיסור.
  7. הנה הערך הממוצע.
  8. חזור על שלב 4 עבור לוח C = 1.
  9. לחצו על כלי הבחירה ביד חופשית .
  10. הקיף תא מעניין, ואז לחץ על Ctrl+T כדי להקליט אותו ל-ROI.
  11. לחצו על Show All בתחתית התשואה כדי להראות מה כבר בחרת.
  12. בחר את כל התאים שנבחרו ולחץ על מדידה, הקלטת ערכים אלה ב-Excel.
  13. לחצו על לוח C = 1 ולחצו על Show All.
  14. בחר את כל התאים ולחץ שוב על מדידה, ורשום את הערכים בעמודה נפרדת באקסל.
  15. ב-Excel, צור פונקציה שמניחה את ערכי אות התורם מעל המקבל (C0/C1). זהו יחס ה-FRET.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ניתוח FRET בקצב תאי N2AAPP מועשר ב-FACS המבטאים MAM-Tav2A הראה עלייה תלויה במינון ברמות Aβ40 לאחר טיפול בראפמיצין8. רפאמיצין פועל על ידי עיכוב מסלול איתות ה-rapamycin (mTOR) של היונקים היוצים, מה שמפחית את ביטוי TREM2 (קולטני טריגר המובע על תאי מיאלואיד 2) במיקרוגליה, מה שמוביל להפחתת ניקוי פלאק Aβ במודלים של עכברים 5XFAD של מחלת אלצהיימר11. AP21967 האנלוגי של ראפמיצין, הידוע בדרך כלל כראפלוג (Log), מציג זיקה נמוכה ל-mTOR ולכן אינו רעיל יחסית לתאים. עם זאת, הוא שומר על היכולת לקשור את תחום ה-FRB באותה זיקה כמו רפמיצין, בשל מוטציה מפצה היווצרת חלל (K2095P) שהוכנסה לתחום FRB12.

טיפול ב-Rapa ו-Log הגדיל את יחס ה-FRET (איור 1). הטיפול הראה השפעה מועטה או כלל לא על רמות APP או חלבוני MAM אחרים, כגון IP3R3 או VDAC1. לכן, הגברת MAMs הצמודה (<10 ננומטר) הגדילה את ייצור Aβ במבחנה8. ראוי לציין כי בדיקות ה-FRET שבוצעו בתאי N2A נאיביים גם הן הניבו תוצאות דומות.

figure-results-1
איור 1: הידוק רוחבי פערי MAM הגדיל את ייצור Aβ במבחנה. (א) סכמטי של מייצב ה-MAM המושרה CFP-FRB-ER-Tav2A-Mito-FKBP-YFP (MAM-Tav2A) שעובר פיצול עצמי, ומייצר רמות אקווימולריות של התורם (CFP-FRB-ER או ER-CFP) והמקבל (Mito-FKBP-YFP או Mito-YFP), ומקדם FRET/FLIM כאשר מחוברים ל-MAMs הצמודים האנדוגניים או על ידי הגברת היווצרות ה-MAM ההדוק על ידי יצירת אינטראקציה בין FRB ל-FKBP עם רפאמיצין (Rapa) או האנלוגיה שלו Rapalog (Log). (B) IB של תאים המבטאים MAM-Tav2A (Tav2A) המראה ביטוי אקווימולר של CFP-ER (קופסה כחולה) ומיטו-YFP (קופסה צהובה) לאחר הפיצול העצמי של Tav2A. (C) תמונות קונפוקליות של תאים שטופלו ב-DMSO (Veh) או Rapa (250 ננומטר) הביטוי יתר על MAM-Tav2A. (D,E). ניתוח FRET רציונטרי של תאים שטופלו ללא (Veh) או ב-100 ננומטר ראפמיצין (Rapa) (D) או רפאלוג (Log) (E). ערכי FRET מוצגים כיחסים של עוצמות בין ערוץ 2 (465-500 ננומטר) לערוץ 1 (525-555 ננומטר). לכל ניתוח FRET, 40-50 תאים נבחרו באקראי כדי לייצר ROIs על בסיס תא אחר תא. אנובה חד-כיוונית. עמוד < 0.0001. (ו) תמונת כתם מערבי מייצגת של תאי MAM-Tav2Aהמבטאים N2A APP לאחר טיפול של 24 שעות בריבסטיגמין (Riv: 0 או 50 מיקרומון). MAM-Tav2A יצר רמות אקווימולריות של התורם (CFP-ER) והמקבל (Mito-YFP). (ז) כימות יחס ה-FRET בין התורם למקבל של רכב מטופל (0 מיקרומטר) או מטופל בריבר (50 מיקרומון). (H) Aβ ELISA (Wako) של המדיה המותאמת (CM) של תאים שטופלו ברכב (0 μM) או טופל ב-Riv (50 מיקרומול) הראה ירידה משמעותית ברמות Aβ40 (pM) לאחר טיפול Riv של 50 מיקרון. n = 6, עמוד < 0.001. (I) ערכי FRET (יחס) ו-Aβ (pM) נסמנים. האיור שונה מזלמר ואח'8. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

קובץ משלים 1: קובץ רצף פלסמיד MAM-Tav2A. רצף ה-DNA של הפלסמיד הביטוי המקודד את רצף Sac1 המיקוד ב-ER (521FLALPIIMVVAFSMCIICLLMA GDTWTETLAYVLFWGVASIGTFFIILYNGKDFVDAPRLVQ KEKID587) קשור לרצף FKBP ו-CFP ולרצף AKAP1 המכוון למיטוכונדריה (34SSHDEQQVEAGAVQLRADPAIKEPLPVEDV63) הקשור לרצף FRB ו-YFP הקשור לרצף Tav2A החותך את עצמו (EGRGSLLTCGD VEENPGP). אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המודולציה של MAMs היא תחום מחקר מתפתח עם השלכות פוטנציאליות להפרעות שונות, כולל סרטן, הפרעות מטבוליותומחלות ניווניות עצבית. רבים מהסוכנים הפרמקולוגיים, כולל האנטגוניסט לדינין LDC-3/Dynarrestin, התרופה נגד סוכרת מטורמין וסוכן אנטי-סרטן סולפוראפן, משבשים את MAMs ונמצאים כיום בניסויים פרה-קליניים וקליניים לסרטן ולהפרעות מטבוליות. סוכנים פרמקולוגיים אלו מווסתים את מגעי ה-ER-מיטוכונדריה או רוחבי מגע MAM על ידי ויסות האינטראקציות בין חלבונים הקשרים ל-MAM כגון PTPIP51, VAPB, VDAC1, PACS2, MFN2, VDAC1 ו-IP3R3 14,15,16,17,18,19,20. האנטגוניסט של קולטני סיגמא-1 (S1R) (NE-100) הוריד את ה-MAMs והפחית באופן דרמטי את רמות Aβ האקסונליים במודל נוירוני תלת-ממדי שלAD 21. דוח עדכני הראה כי אובדן S1R הגביר את ה-MAMs הרופפים והפחית את ה-MAMs הצמודים, והציע ש-S1R הוא מטרה טיפולית לוויסות הידוק MAM 8,9.

הדמיית FRET חיה (העברת אנרגיית תהודה פלואורסצנטית) של נוירונים שמקורם בעכברים טרנסגניים של מחלת אלצהיימר (AD) חשפה הפרעה משמעותית ב-MAMs צפופים (<10 ננומטר), ללא שינוי נראה ב-MAMs רופפים (~20 ננומטר), בהשוואה לאלו בביקורת מסוג פראי1. מייצבי MAM מבוססי FRET/FLIM השראה הכוללים דומיינים של רפמיצין (Rapa)/רפאלוג (Log) ודימריזציה של FRB ו-FKBP, המתבטאים בתאיN2A APP, הראו כי טיפול ב-Rapa/Log הגביר את ההידוק ב-MAM והגביר את ייצור Aβ40 באופן תלוי במינון 8,9. זה סיפק את ההוכחה הראשונה לכך שהצרת רוחב פער MAM מקדמת עיבוד אמילואידוגני. התרופה האנטי-אמנסטית שאושרה על ידי ה-FDA, ריבסטיגמין, שנמצאת כעת בבדיקה פרה-קלינית עבור AD קל עד בינוני22,23, הפחיתה משמעותית את רמות Aβ40 (p < 0.001) מבלי לשנות את הביטוי של VDAC1 או BACE1, או להשפיע על תדירות הקולוקליזציה בין CFP-ER ל-Mito-YFP 8,9. נראה כי ריבסטיגמין משפיע על ייצוב MAM על ידי ויסות רמות חלבון העוגן ל-MAM, מיטופוזין-2 (MFN2)24. ממצא זה תואם מחקרים אחרים שדיווחו כי ריבסטיגמין מפחית את רמות Aβ בנוירונים מתורבתים ובמודלים של עכברי AD (3xTg)25,26. מכיוון שרוחב פער ה-MAM מווסת תהליכים תאיים שונים החיוניים להישרדות תא27, מודולציה ממוקדת של יציבות MAM עשויה להציע אסטרטגיה טיפולית יעילה יותר נגד הצטברות Aβ מאשר חוסר יציבות מוחלט של ה-MAMs, מה שעלול להוביל לתופעות לוואי לא מכוונות.

מגבלה עיקרית של השיטה היא שטכניקת ה-FRET ברציומטריה מתבססת על הביטוי האקווימולרי של התורם והקבלן. ביטוי משותף של הפלסמידים המקודדים את התורם, או את המקבל, יניב תוצאות לא עקביות. שימוש ב-Tav2A חותך את עצמו המחבר בין התורם לחיישני המקבל מבטיח ביטוי אקווימולר של החיישנים הביולוגיים. עם זאת, רמות הביטוי של הביוסנסורים נבדקו באמצעות ניתוח Western blot לפני ניתוח FRET.

ראפאמיצין (Rapa) עשוי שלא להיות אידיאלי להערכת השפעות הידוק MAM על ייצור Aβ, שכן הוא מעכב את מסלול האיתות של רפמיצין (mTOR), מה שמוביל לירידה ברגולציה של TREM2 (קולטן טריגר המובע בתאי מיאלואיד 2) במיקרוגליה ובכך מפחית את ניקוי פלאק Aβ במודלים של עכברים של מחלת אלצהיימר (AD) (5XFAD)11. כחלופה, ניתן להשתמש באנלוגיה של ראפמיצין AP21967, המכונה בדרך כלל רפאלוג (Log). לוג מציג זיקה נמוכה ל-mTOR, מה שהופך אותו לבלתי רעיל יחסית לתאים. עם זאת, הוא שומר על היכולת לקשור את דומיין ה-FRB בזיקה דומה לראפמיצין, בשל הכנסת מוטציה מפצה ליצירת חלל (K2095P) בתחום FRB12.

השיטה המתוארת בעלת משמעות גבוהה. למרות ראיות ממספר מחקרים פרה-קליניים שהראו השפעות טיפוליות מבטיחות של מודולטורים סינתטיים או טבעיים של מולקולות קטנות של MAMs בסרטן ובהפרעות מטבוליות, טרם נערכו ניסויים קליניים. אחת הסיבות העיקריות לכך היא היעדר שיטה אמינה שיכולה למדוד כמותית את יציבות ה-MAM, תנאי מוקדם לפיתוח טיפולים יעילים. כימות הקשר בין מבנה-פונקציה של MAM דורש תצפית מלאה על התא, דבר שלא ניתן להשיג עבור נוירונים בוגרים באמצעות TEM המסורתי או מיקרוסקופים ברזולוציה גבוהה אחרים, אך ניתן לרכוש אותו בהגדלהנמוכה של 28. לכן, טכניקות מסורתיות כמו TEM, קריו-TEM או מיקרוסקופיות אלקטרונים סורקות (SEM) עשויות לזהות מבנים תאיים ברמת ננומטר, אך יש להן מגבלות במדידת מידת ייצוב MUM, משום שהאופי הדינמי מאוד של מיטוכונדריה29 ו-ER30,31 הופך את מבני MAM לחולפים 32,33,34. כדי לחקור את הקשר בין הפונקציה המבנית של ה-MAM, הוצע למדוד את מהירות האקסונים של מיטוכונדריה המחוברת ל-ER באמצעות MAMs הדוקים או רופפים באמצעות הדמיה של תאים חיים וניתוח קימוגרפיה 8,9. דבר זה תואם לדיווחים שהראו ירידה בהעברת מיטוכונדריה אקסונלית בנוירונים קורטיקליים ממוחות AD35 ותאי סייבריד AD ממוינים36. למרות הדיוק הכמותי הגבוה, טכניקת ההדמיה של תאים חיים עשויה שלא להיות שימושית לסקר תרופות בתפוקה גבוהה. לעומת זאת, ניתוח FRET/FLIM יכול לשמש כשיטה כמותית מהירה יותר מהמיקרוסקופיה הקיימת של תאים חיים או ברזולוציה גבוהה בעתיד, כדי לזהות טיפולים קטנים ל-AD.

פרוטוקול ה-FRET המתואר כאן הוכח כיעיל במיוחד בהקשר של קישור מלאכותי בין ה-ER למיטוכונדריה. פשטותו מאפשרת הערכה יעילה של יציבות המגע בין ER-מיטוכונדריה ולחקור את ההשפעות הנובעות על פתולוגיה עמילואידית, שהיא המטרה העיקרית של גישה זו. אנו שואפים לנצל שיטה זו לסינון ספרייה של מולקולות קטנות פוטנציאליות למודולציה של MAM בתוך פלטפורמת סקר תרופות ל-AD תלת-ממדית(3D) שפותחה לאחרונה 37. התוצאות יהיו שימושיות מאוד בבחירת מודולטורים פוטנציאליים נגד Aβ מולקולות קטנותMAM 13 במבחנה , שניתן להרחיב אותם למחקרים בחיים או קליניים בעתיד.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים בכנות לד"ר רודולף אי. טנצי, פרופסור בבית החולים הכללי של מסצ'וסטס (MGH), על הערותיו המעמיקות על כתב היד. אנו מודים לד"ר מסאטו מאסאקו, מרצה בכיר ב-MGH, על שיתוף מומחיותו בבדיקות FLIM. אנו מודים לד"ר גיורגי היינוצקי, פרופסור, אוניברסיטת תומאס ג'פרסון, פילדלפיה, על כך שסיפק לנו בנדיבות פלסמידי ביטוי המקודדים ER-CFP או Mito-YFP. מחקר זה נתמך על ידי קרן ריפוי אלצהיימר ל-RB.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
BSAFisher Scientific501781532
מיקרוסקופ קונפוקלי Olympus FV3000RS (טוקיו, יפן)N/A
DMEM עם תוסף GlutaMAXGibco/Thermo Fisher Scientific10564011
EDTA  Life Technologies41116134
Falcon 6 Well Plates VWR International41122107
GAPDH נוגדן פוליקלונליThermo Fisher ScientificPA1-988
ג'לטין VWR International9000-70-8
Geneticin (G418 סולפט)Gibco/Thermo Fisher Scientific10131035
נוגדן מונוקלונלי GFPInvitrogenMA5-15256
Graphpad Prism N/APrism 9, version 9.5.0N/A
הפריןSigma-Aldrich H0200000
תוכנת ImageJ ImageJ 1.53aN/A
מיקרוסקופ קונפוקלי מהופך Nikon (C2 Eclipse Ti2)N/A
Lipofectamine2000Invitrogen11668027
MS Excel  Microsoft Excel, version 2302N/A
NaCl  Fisher Scientific7647145
ג'ל NuPAGE 4–12% Bis-Tris  InvitrogenNP0321BOX
פניצילין/סטרפטומיצין/אמפוטריצין B Lonza 17-745E
PhotoshopAdobe Photoshop CC 20.0.10 N/A
Tris-HCL, pH 7.6  Boston BioProducts42000000
Triton X-100  Sigma-AldrichT8787
טריפסין-EDTAGibco/Thermo Fisher Scientific25200056
Tween 20Fisher Scientific501657287

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Martino Adami, P. V., et al. Perturbed mitochondria-ER contacts in live neurons that model the amyloid pathology of Alzheimer's disease. J Cell Sci. 132 (20), 229906(2019).
  2. Area-Gomez, E., Schon, E. A. On the pathogenesis of Alzheimer's disease: The MAM hypothesis. FASEB J. 31 (3), 864-867 (2017).
  3. Fujimoto, M., Hayashi, T. New insights into the role of mitochondria-associated endoplasmic reticulum membrane. Int Rev Cell Mol Biol. 292, 73-117 (2011).
  4. Prudent, J., et al. MAPL SUMOylation of Drp1 stabilizes an ER/mitochondrial platform required for cell death. Mol Cell. 59 (6), 941-955 (2015).
  5. Carpio, M. A., et al. controls apoptosis by Ca2+ through ER-mitochondrial contact sites. Cell Rep. 34 (10), 108827(2021).
  6. Degechisa, S. T., Dabi, Y. T., Gizaw, S. T. The mitochondrial associated endoplasmic reticulum membranes: A platform for the pathogenesis of inflammation-mediated metabolic diseases. Immun Inflamm Dis. 10 (7), e647-e658 (2022).
  7. Csordás, G., Weaver, D., Hajnóczky, G. Endoplasmic reticulum-mitochondrial contactology: Structure and signaling functions. Trends Cell Biol. 28 (7), 523-540 (2018).
  8. Zellmer, J. C., et al. Stabilization of mitochondria-associated endoplasmic reticulum membranes regulates Aβ generation in a three-dimensional neural model of Alzheimer's disease. Alzheimers Dement. 21 (2), e14417(2024).
  9. Zellmer, J. C., Lomoio, S., Tanzi, R. E., Bhattacharyya, R. Quantitative analysis of mitochondria-associated endoplasmic reticulum membrane (MAM) stabilization in a neural model of Alzheimer's disease (AD). J Vis Exp. (215), e66129(2025).
  10. Bhattacharyya, R., et al. The neuronal-specific isoform of BIN1 regulates beta-secretase cleavage of APP and Abeta generation in a RIN3-dependent manner. Sci Rep. 12 (1), 3486-3500 (2022).
  11. Shi, Q., et al. Microglial mTOR activation upregulates Trem2 and enhances β-amyloid plaque clearance in the 5XFAD Alzheimer's disease model. J Neurosci. 42 (27), 5294-5313 (2022).
  12. Wilmington, S. R., Matouschek, A. An inducible system for rapid degradation of specific cellular proteins using proteasome adaptors. PLoS One. 11 (4), e0152679(2016).
  13. Magalhaes Rebelo, A. P., et al. Chemical modulation of mitochondria-endoplasmic reticulum contact sites. Cells. 9 (7), 1637-1655 (2020).
  14. De Vos, K. J., et al. VAPB interacts with the mitochondrial protein PTPIP51 to regulate calcium homeostasis. Hum Mol Genet. 21 (6), 1299-1311 (2012).
  15. Yang, M., et al. Mitochondria-associated ER membranes: The origin site of autophagy. Front Cell Dev Biol. 8, 595(2020).
  16. Filadi, R., et al. Mitofusin 2 ablation increases endoplasmic reticulum-mitochondria coupling. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (17), E2174-E2181 (2015).
  17. Filadi, R., et al. On the role of Mitofusin 2 in endoplasmic reticulum-mitochondria tethering. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (12), E2266-E2267 (2017).
  18. Xie, Q., et al. ABT737 reverses cisplatin resistance by regulating ER-mitochondria Ca2+ transduction in human ovarian cancer cells. Int J Oncol. 49 (6), 2507-2519 (2016).
  19. Tsunoda, T., et al. Inositol 1,4,5-trisphosphate receptor type 1 modulates the acquisition of cisplatin resistance in bladder cancer cell lines. Oncogene. 24 (8), 1396-1402 (2005).
  20. Tubbs, E., et al. Sulforaphane improves disrupted ER-mitochondria interactions and suppresses exaggerated hepatic glucose production. Mol Cell Endocrinol. 461, 205-214 (2018).
  21. Bhattacharyya, R., et al. Axonal generation of amyloid-beta from palmitoylated APP in mitochondria-associated endoplasmic reticulum membranes. Cell Rep. 35 (7), 109134(2021).
  22. Alhazmi, H. A., Albratty, M. An update on the novel and approved drugs for Alzheimer disease. Saudi Pharm J. 30 (12), 1755-1764 (2022).
  23. Rountree, S. D., et al. Effectiveness of antidementia drugs in delaying Alzheimer's disease progression. Alzheimers Dement. 9 (3), 338-345 (2013).
  24. Hadwen, J., et al. Transcriptomic RNAseq drug screen in cerebrocortical cultures: Toward novel neurogenetic disease therapies. Hum Mol Genet. 27 (18), 3206-3217 (2018).
  25. Ray, B., et al. Rivastigmine modifies the α-secretase pathway and potentially early Alzheimer's disease. Transl Psychiatry. 10 (1), 47(2020).
  26. Bailey, J. A., Ray, B., Greig, N. H., Lahiri, D. K. Rivastigmine lowers Aβ and increases sAPPα levels, which parallel elevated synaptic markers and metabolic activity in degenerating primary rat neurons. PLoS One. 6 (7), e21954(2011).
  27. Ziegler, D. V., Martin, N., Bernard, D. Cellular senescence links mitochondria-ER contacts and aging. Commun Biol. 4 (1), 1323(2021).
  28. Neikirk, K., et al. Call to action to properly utilize electron microscopy to measure organelles to monitor disease. Eur J Cell Biol. 102 (4), 151365(2023).
  29. Liu, X., et al. Mitochondrial 'kiss-and-run': Interplay between mitochondrial motility and fusion-fission dynamics. EMBO J. 28 (20), 3074-3089 (2009).
  30. Szymanski, J., et al. Interaction of mitochondria with the endoplasmic reticulum and plasma membrane in calcium homeostasis, lipid trafficking and mitochondrial structure. Int J Mol Sci. 18 (7), ijms18071576(2017).
  31. Tikhomirova, M. S., et al. A role for endoplasmic reticulum dynamics in the cellular distribution of microtubules. Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (15), e2104309119(2022).
  32. Stacchiotti, A., et al. Perspective: Mitochondria-ER contacts in metabolic cellular stress assessed by microscopy. Cells. 8 (1), 8010005(2018).
  33. Cieri, D., et al. SPLICS: A split green fluorescent protein-based contact site sensor for narrow and wide heterotypic organelle juxtaposition. Cell Death Differ. 25 (6), 1131-1145 (2018).
  34. Giacomello, M., Pellegrini, L. The coming of age of the mitochondria-ER contact: A matter of thickness. Cell Death Differ. 23 (9), 1417-1427 (2016).
  35. Dai, J., et al. Impaired axonal transport of cortical neurons in Alzheimer's disease is associated with neuropathological changes. Brain Res. 948 (1), 138-144 (2002).
  36. Trimmer, P. A., Borland, M. K. Differentiated Alzheimer's disease transmitochondrial cybrid cell lines exhibit reduced organelle movement. Antioxid Redox Signal. 7 (9-10), 1101-1109 (2005).
  37. Quinti, L., et al. Neurotherapeutics in the Era of Translational. Smith, R. A., Kaspar, B. K., Svendsen, C. N. , Academic Press. 311-331 (2021).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

234234JoVE
הסרטון יגיע בקרוב

מאמרים קשורים