מאמר שיטה

גידול וקטיף חד-שבטי מיקרוביאלי אוטומטי ובתפוקה גבוהה באמצעות מערכת אומיקס תרבית מיקרוליטר-טיפה חד-תאית

1.8K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/67925

⸱

14 במרץ 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemical Engineering, Institute of Biochemical Engineering, Tsinghua University, 2Key Laboratory of Industrial Biocatalysis, Ministry of Education, Tsinghua University, 3Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd., 4Biobreeding Center, Wuxi Research Institute of Applied Technologies, Tsinghua University, 5Center for Synthetic and Systems Biology, Tsinghua University, 6Institute of Biomedical Health Technology and Engineering, Shenzhen Bay laboratory, 7Institute of Biopharmaceutical and Health Engineering, Shenzhen International Graduate School, Tsinghua University

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר כיצד להשתמש במערכת Omics של תרבית מיקרוליטר טיפה חד-תאית (תא MISS) כדי לבצע בידוד, טיפוח וקטיף חד-שבטי מיקרוביאלי. תא ה-MISS משיג זרימת עבודה משולבת המבוססת על טכנולוגיית מיקרופלואידית טיפות, המציעה פיזור חד-טיפתי מעולה, גידול מקביל גבוה וזיהוי ביומסה בתפוקה גבוהה.

תקציר

תרביות חיידקים טהורות חיוניות לחקר התרבות המיקרוביאלית. שיטות מסורתיות המבוססות על לוחות מוצקים, לוחות באר ומיקרו-כורים מעוכבות על ידי נהלים מסורבלים ותפוקה נמוכה, מה שמעכב את ההתקדמות המהירה של מחקר התרבות המיקרוביאלית. כדי להתמודד עם אתגרים אלה, פיתחנו בהצלחה את מערכת Omics של תרבית מיקרוליטר טיפה חד-תאית (תא MISS), פלטפורמה אוטומטית בעלת תפוקה גבוהה המשתמשת בטכנולוגיה מיקרופלואידית טיפתית לבידוד, גידול וסינון חד-שבטיים מיקרוביאליים. מערכת זו יכולה לייצר מספר רב של טיפות חד-תאיות ולטפח, לסנן ולאסוף מושבות חד-שבטיות תוך זמן קצר, מה שמקל על תהליך משולב מבידוד מיקרוביאלי ועד קטיף. בפרוטוקול זה, הדגמנו את יישומו באמצעות בידוד וטיפוח של מיקרוביוטת מעיים אנושית כדוגמה והשווינו את יעילות הבידוד המיקרוביאלי, ביצועי התרבית החד-שבטית ותפוקת הסינון בשיטת תרבית הצלחת המוצקה. זרימת העבודה הניסיונית הייתה פשוטה, וצריכת הריאגנטים הייתה נמוכה מאוד. בהשוואה לשיטות תרבית בצלחת מוצקה, תא ה-MISS יכול לטפח מגוון גדול יותר של מיני מיקרוביוטה במעיים, מה שמציע פוטנציאל וערך משמעותיים למחקר קולטורומיקה מיקרוביאלית.

מבוא

לתרבות מיקרוביאלית יש יישומים נרחבים בחקר חיידקים מועילים בתעשיית המזון, מגוון החיידקים הסביבתיים, סינון תרכובות אנטי-מיקרוביאליות חדשות והמיקרוביום האנושי ביחס למחלה 1,2,3,4. שיטות מסורתיות, המבוססות בעיקר על לוחות מוצקים, לוחות באר או מיקרו-ריאקטורים להשגת ובחירת מושבות חד-שבטיות, קלות לתפעול אך סובלות מתפוקה נמוכה בשל השלבים המרובים שלהן. מגבלה זו מעכבת יישומים כגון סינון מוטגנזה מיקרוביאלית, מחקרי תרבות מיקרוביאלית ובחירת מושבות בייצור גבוה, שכולם דורשים סינון חד-שבטי נרחב.

לאחרונה, תוכננו התקני זיהוי וחלוקה שונים של תאים בודדים כדי לשפר משמעותית את מהירות העיבוד של דגימות מיקרוביאליות, תוך הפחתת העבודה ומזעור שגיאות מטיפול ידני5. עם זאת, מכשירים אלה מתייחסים בדרך כלל רק לשלבים ספציפיים בשיטות מסורתיות, ולעתים קרובות דורשים שילוב ציוד נרחב, תופסים מקום משמעותי וכרוכים בעלויות גבוהות. לכן, היה צורך דחוף לפתח פלטפורמת תרבית וסינון מיקרוביאלית בעלות נמוכה וניתנת ליישום אוניברסלי כדי לפצות על החסרונות שהוזכרו לעיל.

בעבודתנו הקודמת, פיתחנו בהצלחה פלטפורמת סינון אוטומטית בעלת תפוקה גבוהה, הידועה בשם Single-cell Microliter-droplet Culture Omics System (תא מיס, להלן "מערכת Omics")6. פלטפורמה זו משתמשת בטכנולוגיה מיקרופלואידית טיפתית, הטומנת בחובה הבטחה להשגת אוטומציה ואינטגרציה בבידוד מיקרוביאלי, גידול וקטיף 7,8,9,10. מערכת Omics כוללת מספר מודולים מרכזיים, כולל מודול דגימה, שבב מיקרופלואידי, מערכת זיהוי ואיסוף טיפות, המאפשרת בידוד יעיל של תא בודד, גידול, סינון חד שבטי ואיסוף במחקר מיקרוביולוגיה. כבר השתמשנו במערכת Omics כדי להשיג בדיקת מוטגנזה בתפוקה גבוהה של Corynebacterium glutamicum6.

בשל האוטומציה ויכולות הסינון הגבוהות של מערכת Omics, יישומה על תרבות מיקרוביאלית צפוי להשיג במהירות כמות גדולה של נתונים מיקרוביאליים. בפרוטוקול זה, הצגנו את ההליך התפעולי המפורט של תא ה-MISS, עם בידוד וטיפוח של מיקרוביוטת המעיים האנושית כדוגמה להדגמת תהליך הבידוד המיקרוביאלי של תא בודד, גידול, זיהוי חד-שבטי וסינון. פעולת מערכת Omics היא פשוטה, והחוקרים צריכים רק לעקוב אחר כיוון התוכנה להתקנה רציפה של שבב מיקרו-נוזלי ליצירת מיקרו-צינורות וטיפות, הגדרות פרמטרים והכנת דגימות.

בממשק פעולת התוכנה, מערכת Omics מחולקת לשלוש פונקציות עיקריות - בידוד, טיפוח וסינון. החוקרים יכולים לבחור שלבים שונים בהתאם לניסוי. יתר על כן, בשלב סינון הטיפות, החוקרים יכולים לבחור בין שני מצבי זיהוי: אות פלואורסצנטי או צפיפות אופטית. התוכנה מספקת הדמיה בזמן אמת של תהליך סינון הטיפות. לבסוף, לחוקרים יש את הגמישות להגדיר פרמטרים כגון תנאי תרבית, אורך גל שזוהה ומספר בארות האיסוף על סמך דרישות הניסוי הספציפיות שלהם, והם יכולים להשהות את המכשיר בכל עת כדי לבצע פעולות אחרות. תא ה-MISS הוא פלטפורמת סינון חד-שבטית ידידותית לחיידקים, בעלת תפוקה גבוהה עם הפעלה פשוטה וצריכת ריאגנטים מינימלית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל נהלי המחקר תואמים את כל התקנות האתיות הרלוונטיות. הנהלים אושרו על ידי ועדת האתיקה של המדע והטכנולוגיה של אוניברסיטת צינגהואה. לצורך חקר המיקרוביוטה של המעי האנושי, נאספו דגימות צואה ממבוגר בריא ללא בעיות רפואיות משמעותיות, שנתן הסכמה מדעת בכתב.

1. התקנת מכשירים

  1. הנח את מכשיר מערכת Omics בסביבה נקייה או סטרילית (כגון חדר סטרילי או ספסל אנאירובי). המכשיר הוא מכשיר מדויק, וכאשר מניחים אותו במתקן, יש לקחת בחשבון את הדברים הבאים:
    1. שמור על המכשיר בלחץ וטמפרטורה רגילים.
    2. הרחק את המכשיר משדות חשמליים חזקים, שדות מגנטיים ומקורות קרינת חום.
    3. ודא ששטח מיקום המכשיר עולה על מידות של 2,500 מ"מ (D) x 1,500 מ"מ (W) x 2,000 מ"מ (H).
    4. שמור על לחות הסביבה של המכשיר מתחת ל-60%.

2. הכנות

  1. הפעל ברצף את החשמל עבור מערכת Omics, המחשב ותוכנת ההפעלה של מערכת Omics.
  2. התקנת שבב מיקרו-נוזלי של תא MISS ויצירת טיפות:
    1. פתח את הדלת של תא הייצור והטיפוח של טיפות (איור 1A) והסר אנכית את כיסוי המגן עבור השבב המיקרו-נוזלי ליצירת המיקרו-צינורות והטיפות. השתמש במזרק חד פעמי כדי להוסיף 10 מ"ל של מים מזוקקים סטריליים למכשיר האדים בתוך תא גידול הטיפות (איור 1C) והתקן מחדש את כיסוי המגן עבור השבב המיקרו-נוזלי ליצירת מיקרו-צינורות וטיפות.
    2. פתח את האריזה הסטרילית של השבב המיקרו-נוזלי ליצירת המיקרו-צינורות והטיפות והנח אותו אנכית ישירות מעל תא הטיפוח (איור 1C).
    3. בממשק התוכנה, לחץ על התקנה (איור 2A). בשלב זה, מופיע חלון מוקפץ עם ההנחיה, לאשר את החלפת השבב המיקרו-נוזלי ליצירת מיקרו-צינורות וטיפות? לחץ על כן כדי להתחיל בהתקנה.
    4. הוצא את מסיר בועות האוויר וקבע אותו הפוך על מיקום מסיר בועות האוויר בתא יצירת הטיפות והטיפוח. היזהר לא ללחוץ על צינורות הכניסה והיציאה של הטיפות של מסיר בועות האוויר (איור 1E).
    5. חבר את צינור יציאת הטיפות של מסיר בועות האוויר ל-clampשסתום שמתחתיו ותן לו לעבור דרך החור, המופנה לתא גילוי ואיסוף הטיפות (איור 1B).
    6. פתח את הדלת של תא גילוי ואיסוף טיפות, הכנס אנכית את צינור הגילוי, שכבר מחובר לצינור יציאת הטיפות, לתוך שקע הגילוי, וודא שצינור הגילוי מוכנס במלואו (איור 1D).
      הערה: בעת הכנסת צינור הזיהוי, הכנס אותו אנכית ללא כיפופים על הצינור.
    7. הדק את הבורג המאבטח את צינור הזיהוי בכיוון השעון. לאחר אישור שצינור הזיהוי מוכנס ומאובטח במלואו, סגור את דלת תא הזיהוי והאיסוף של הטיפות.
    8. מהשבב המיקרו-נוזלי ליצירת המיקרו-צינורות והטיפות, ישנם 10 צינורות סיליקון, כל אחד מסומן במספר (L01-L10). חבר כל צינור מסומן ל-clamp שסתום הממוספר המתאים (01-10) (איור 1C).
    9. חבר את המחבר המהיר מהשבב המיקרו-נוזלי ליצירת המיקרו-צינורות והטיפות ליציאה המתאימה במערכת Omics: C1 ל-O1, C2 ל-O2, C4 ל-O4 ו-CF ל-OF.
      הערה: ההתקנה של השבב המיקרו-נוזלי ליצירת מיקרו-צינורות וטיפות הושלמה. אין צורך לחבר את C3 ל-O3.
    10. לאחר השלמת התקנת השבב המיקרו-נוזלי ליצירת המיקרו-צינורות והטיפות, מופיע חלון מוקפץ המבקש פתיחת שסתום הידוק צינורות טיפות. לחץ על אישור לאחר השלמת התקנת השבב המיקרו-נוזלי ליצירת מיקרו-צינורות וטיפות. לאחר שווידאת שכל צינורות הסיליקון מהשבב המיקרו-נוזלי של המיקרו-צינורות ויצירת הטיפות מחוברים ל-clamp שסתום המתאים, לחץ על אישור.
  3. אתחול מכשיר
    1. לפני ביצוע האתחול, לחץ על ממשק ההגדרה (איור 2B) כדי להגדיר פרמטרים רלוונטיים: מצב זיהוי (זיהוי מבוסס OD או מבוסס פלואורסצנטי; OD כאן), טמפרטורת הדגירה (37 מעלות צלזיוס) והזמן (30 יום = 720 שעות), מהירות המערבל (20 סל"ד), אורך הגל של זיהוי OD (600 ננומטר), ואורך גל העירור והפליטה של זיהוי הקרינה.
      הערה: הפרמטרים המשמשים לבידוד וטיפוח של מיקרוביוטת המעי האנושי בפרוטוקול זה ניתנים בסוגריים. בעת קביעת הפרמטרים, טמפרטורת הגידול צריכה להיות בין 5 מעלות צלזיוס ל-50 מעלות צלזיוס. בעת בחירת מצב הזיהוי, יש להחליף את הסיב האופטי אם הסיב במודול זיהוי הטיפות אינו זהה (ראה שלב 2.3.2). בעת קביעת התצורה של פרמטרים, ערך ייחוס שלב השמן (ספקטרל בסיסי) מזוהה אוטומטית על ידי התוכנה, ומבטל את הצורך בהתאמות ידניות.
    2. החלפת הסיב האופטי שזוהה
      1. הסר את הסיב שזוהה ממחזיק הסיבים (הברג נגד כיוון השעון) ושחרר את בורג קיבוע הסיבים במודול הטיפות (איור 1D).
      2. אם לא ייעשה שימוש בסיב האופטי, הסר אותו מהמודול, הכנס אותו למחזיק הסיבים והדק אותו. הכנס את הסיב שזוהה ליציאת הזיהוי, והדק את בורג קיבוע הסיבים במודול. החלפת הסיב האופטי הסתיימה.
    3. פנה לממשק הבית ולחץ על אתחול כדי לאפשר למערכת Omics לבצע בדיקה עצמית של רכיביה, כולל משאבת ההזרקה, הגדרות הטמפרטורה, בדיקת פריקת נוזלי פסולת, מודול סינון ומודול זיהוי טיפות.
      1. במהלך האתחול, בצע בדיקת פריקת נוזלי פסולת ממודול זיהוי הטיפות על ידי הזרקת 1 מ"ל של 75% אלכוהול לתוך יציאת נוזל הפסולת והתבוננות אם הנוזל זורם החוצה כרגיל.
      2. לבדיקת מודול הסינון, הנח צלחת של 96 בארות על מיקום הצלחת ובדוק אם תנועת הצלחת תקינה.

3. יצירת טיפות

  1. איסוף ועיבוד דגימות מיקרוביוטה במעיים אנושיים
    1. הכן סיר תא ומיכלי שרפרף, שטוף ידיים ולבש כפפות כדי לאסוף דגימות צואה טריות.
      הערה: בעת איסוף דגימות צואה, הימנע ככל האפשר מזיהום שתן. עדיף להשתין לפני כן, ולהניח את הצואה בכלי נקי ויבש.
    2. יש לאסוף באופן אספטי את הכמות המתאימה של צואה באמצע הקטע ולאטום אותה בקריוביאלים מעוקרים (כ-3-5 גרם לבקבוקון). הנח את הבקבוקונים על קרח מיד לצורך ציטוט ותיוג לאחר מכן.
      הערה: אם דגימת הצואה גדולה או שלא ניתן לאסוף אותה מיד, יש לאסוף אותה תוך שעתיים לכל היותר.
    3. בספסל האנאירובי, השתמש במקלון סטרילי או בכלי דגימת צואה כדי לאסוף דגימה באמצע הקטע.
      הערה: שכבת פני השטח של הצואה מכילה תאי רירית מעיים שנשפכו ונוטה לזיהום חיצוני; לאחר חשיפה לאוויר, חלק מהדנ"א המיקרוביאלי מתחיל להתפרק.
    4. העבירו את דגימות הצואה שנאספו לצינורות מיקרו-צנטריפוגה סטריליים של 2 מ"ל או קריוביאלים סטריליים, כאשר כל צינור מכיל 0.5-2.0 גרם צואה. הכן שתי מכסות להקפאה לכל דגימה.
    5. השעו מחדש את דגימת הצואה הטרייה בתמיסת מלח פיזיולוגית סטרילית, כאשר כל 100 מ"ג של הצואה מדוללת ב-1 מ"ל תמיסה. מערבבים היטב את הצואה עד שלא נראים חלקיקים גדולים.
    6. לאחר שקיעה טבעית במשך 10 דקות, סנן ברצף את הסופרנטנט דרך מסנני רשת סטריליים עם גדלי נקבוביות של 200 רשת (0.075 מ"מ), 400 רשת (0.038 מ"מ) ו-800 רשת (0.018 מ"מ) כדי להסיר מזון לא מעוכל וחלקיקים קטנים יותר. לבסוף, אוספים את המסנן בצינורות צנטריפוגה סטריליים.
    7. קח 10 מיקרוליטר מהתרחיף הצואתי המסונן וקבע את ריכוז החיידקים באמצעות המוציטומטר ומיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך.
      הערה: לאחר סינון דגימת הצואה דרך גדלי רשת שונים, נשארים כמה חלקיקי צואה קטנים יותר. לכן, בעת קביעת ריכוז המיקרוביאלי, חלקיקים פעילים הנצפים במיקרוסקופ נחשבים כמיקרואורגניזמים, מה שמאפשר רק חישוב משוער של ריכוז החיידקים.
    8. העבירו את תרחיף הצואה לצינור צנטריפוגה סטרילי של 1.5 מ"ל וסמנו אותו עם התאריך, ריכוז החיידקים ושם המדגם. שמור חלק לניסויים הבאים, ואחסן את השאר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס כשימוש עתידי.
      הערה: רשום מיד מידע מדגם (שם המדגם, זמן האיסוף) כדי להבטיח שהדגימות נאספות בו זמנית (בהתחשב בשינויים בקצב הזמן של חיידקי המעי של יונקים). כל איסוף ועיבוד הדגימות צריך להתבצע בסביבה אנאירובית.
  2. הכנה להשעיית הצואה הראשונית
    1. הכינו מדיום מרק לב מוח (BHI) לפי פרוטוקול היצרן ועקרו אותו על ידי חיטוי בטמפרטורה של 121 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
    2. קח את תרחיף הצואה משלב 3.1.8 ובצע דילולים סדרתיים עם מדיום BHI כדי להשיג ריכוז של ~50 תאים/מ"ל.
      הערה: כדי למלא את בקבוק הדגימה, הכינו לפחות 40 מ"ל של תרחיף צואה.
    3. ודא שמוט ערבוב מגנטי קטן נמצא בתחתית, שפכו את תרחיף הצואה המדולל לתוך בקבוק הדגימה עד למצב הוספת הדגימה. הברג את המכסה והדק אותו. לאחר מכן, הכניסו את המחבר המהיר A למחבר המהיר B כדי להשלים את תהליך טעינת הדגימה (איור 3A).
    4. הנח את בקבוק הדגימה במיקום המיועד והפרד את המחברים המהירים A ו-B מבקבוק הדגימה. חבר את המחבר המהיר A של בקבוק הדגימה ליציאת O3 במערכת Omics, ומחבר C3 בשבב המיקרו-נוזלי של מיקרו-צינורות וטיפות מתחבר למחבר המהיר B. סגור את הדלת של תא יצירת טיפות וטיפוח (איור 3B).
  3. יצירת טיפות
    1. בחר את המספר הרצוי של צינורות טיפות שייווצרו בממשק הבית של התוכנה (איור 2A).
      הערה: כל ריצה יכולה לייצר עד 10 צינורות טיפות, כאשר כל צינור מייצר כ-5,000 טיפות.
    2. נקישה לייצר בממשק הבית של התוכנה כדי להתחיל ביצירת טיפות של תא בודד.
      הערה: ודא אם פריקת משאבת נוזל הפסולת פועלת או לא. במהלך יצירת הטיפות, לכל טיפה יש נפח של 2.0 מיקרוליטר. עיין בפרק הדיון לתיאור של יצירת טיפות.
    3. המתן עד שאזעקת הביפר תציין שיצירת הטיפות הסתיימה. סגור את clamp על מחבר C3 (איור 1E) והסר את בקבוק הדגימה.

4. גידול טיפות

  1. בחר את אותו מספר צינורות טיפות כמו במהלך יצירת טיפות בממשק הבית של התוכנה, לחץ על תרבות, אשר את זמן הטיפוח והטמפרטורה והתחל בתהליך. עקוב אחר סרגל ההתקדמות בממשק הביתי המציג את התקדמות הטיפוח והזמן שנותר.
  2. המתן עד שאזעקת הביפר תציין כי גידול הטיפות הסתיים. אם יש להאריך את זמן הטיפוח, התאימו את השעה ישירות בממשק ההגדרות .

5. סינון טיפות

  1. לחץ על לחצן ה-UV במערכת Omics כדי להדליק אור אולטרה סגול (UV) (איור 1A), להקרין את תא זיהוי הטיפות והאיסוף למשך 30 דקות, ולאחר מכן לכבות את אור ה-UV.
    הערה: לפני הדלקת אור ה-UV, ודא שדלת תא זיהוי הטיפות והאיסוף סגורה.
  2. בספסל נקי במיוחד, פתחו את כל צלחות 96 הבארות המשמשות לאיסוף טיפות וערמו אותן זו על גבי זו ללא מכסים, ומספור אותן ברצף מלמטה למעלה. ודא כי צלחת הבאר העליונה מכוסה במכסה.
    הערה: כל ריצה יכולה להכיל עד עשר צלחות של 96 בארות, ומספר הלוחות תלוי במספר הכולל של הטיפות.
  3. פתח את הדלת של תא זיהוי ואיסוף הטיפות, הנח את לוחות הבאר במיקומים המיועדים (איור 1D), הוצא את המכסה מלוח הבאר העליון וסגור את דלת החדר.
  4. הפעל את נורת ה-UV במערכת Omics למשך 30 דקות כדי לבצע עיקור משני.
  5. התקנת מסיר בועות האוויר
    1. הסר את מסיר בועות האוויר ממצב המיקום שלו, הברג את המכסה והסר את הבורג בצורת פרפר מהמכסה (איור 3C).
    2. יוצקים 200 מ"ל משמן הסרת בועות האוויר לתוך מסיר בועות האוויר, הברג את הבקבוק בחוזקה עם המכסה של מסיר בועות האוויר במערכת Omics, ולאחר מכן קבע את המסיר הפוך על מיקום מסיר בועות האוויר. ההתקנה של מסיר בועות האוויר הושלמה.
      הערה: בעת קיבוע מסיר בועות האוויר במיקום, ודא שלא ידלוף שמן החוצה. אם מתרחשת דליפה כלשהי, הדק את המכסה.
  6. בחר את צינורות הטיפות למיון בממשק הביתי , לחץ על מיון, הזן את מספר לוחות הבאר שיש לאסוף ולאחר מכן התחל בתהליך. לאחר תחילת סינון הטיפות, התבונן באזור תצוגת התהליך, המציג מדידות בזמן אמת של צפיפות אופטית של טיפות (OD) או ערכי פלואורסצנטיות.
  7. נתח כ-20-30 טיפות כדי לבדוק את ערך ה-OD. לדוגמה, אם נמצא שלרוב יש ערך OD של ~0.2, המתאים לערך ה-OD של טיפות ריקות, בהתבסס על התפלגות פואסון, הגדר את סף ה-OD התחתון ל-0.5, ואת סף ה-OD העליון ל-4.0. הטיפות בטווח זה ייאספו אוטומטית ללוחות של 96 בארות (איור 4A).
    הערה: על פי חוק באר-למברט, ערך ה-OD של טיפות ריקות נקבע על ידי הרכב מדיום התרבות בתוך הטיפות. בדרך כלל, סף ה-OD הנמוך יותר מוגדר ב-0.2-0.3 יחידות גבוה יותר מערך ה-OD של טיפות ריקות כדי להבטיח הבחנה ברורה בין טיפות ריקות לטיפות המכילות מיקרואורגניזמים.
  8. המתן עד שאזעקת הביפר תציין שסינון ואיסוף הטיפות הסתיימו. פתח את הדלת של תא זיהוי ואיסוף הטיפות, הנח את מכסה לוחית הבאר על צלחת הבאר העליונה, ולאחר מכן הוצא את כל לוחות הבאר מהתא יחד כדי לבצע את הרצף והגיבוי שלאחר מכן.

6. ייצוא נתונים והצגת מפות חום

  1. נקישה ייצוא נתונים כדי לשמור את נתוני אות הטיפות שנאספו (איור 4A,B).
  2. נקישה מפת חום, בחר את קובץ הנתונים של איסוף הטיפות וצפה בערכי ה-OD של טיפות שנאספו במיקרו-פלטה המוצגת על ידי התוכנה. דמיין את ערכי ה-OD הללו כמפת חום, כאשר עוצמת הצבע תואמת את התפלגות ה-OD על פני הבארות, ומספקת ייצוג ברור ואינטואיטיבי של ערכי ה-OD החד-שבטיים שנאספו (איור 4A,C).

7. ניקוי תא ה- MISS

  1. לאחר השלמת הניסוי, בחר את צינור הטיפות הדורש ניקוי, ולחץ על נקה כדי להתחיל בניקוי המכשיר.

8. גיבוי חד שבטי מיקרוביאלי והכנת דגימת ריצוף

  1. הכנת מדגם ריצוף
    1. בספסל האנאירובי, הוסיפו 100 מיקרוליטר של מדיום BHI לכל באר של צלחת הטיפות שנאספה, ערבבו היטב על ידי פיפטינג, ואז קחו 10 מיקרוליטר מכל באר והעבירו את הכל לצינור סטרילי אחד של 15 מ"ל. מערבולת לקבלת תרחיף מיקרוביאלי מעורב.
    2. הוסף 5 מ"ל של מי מלח עם חוצץ פוספט לתרחיף המיקרוביאלי המעורב, צנטריפוגה ב-1,000 × גרם למשך 10 דקות, הסר את הסופרנטנט והנח את הגלולה המיקרוביאלית בחנקן נוזלי להקפאה מהירה. הכנת מדגם הרצף הושלמה.
    3. השתמש בשיטות ריצוף אמפליקון 16S rDNA המכוונות לתחום V3 ו-V4 של 16S rDNA. פריימרים לריצוף הספציפיים המשמשים הם כדלקמן: 341F: ACTCCTACGGGAGGCAGCA ו-806R: GGACTACHVGGGTWTCTAAT.
  2. שימור הקפאה של מדגם חד שבטי מיקרוביאלי:
    1. לאחר איסוף 10 מיקרוליטר מהדגימה מכל באר בצלחות הטיפות (משלב 8.1.1), הוסף 30 מיקרוליטר גליצרול לכל באר. מניחים את הצלחות מתחת ל-80 מעלות צלזיוס לשימור מתח מיקרוביאלי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

על פי ההערכות, מיקרוביוטת המעיים האנושית, המהווה את הקהילה המיקרוביאלית הדומיננטית, מאכלסת כ-4 × 1013 מיקרואורגניזמים במעיים, ומציגה את מספריה העצומים ואת הרכבה המורכב11. במחקר זה, מטרתנו הייתה לבודד ולתרבית את מיקרוביוטת המעיים והשתמשנו בשיטת הצלחת המוצקה כבקרה כדי להדגים את ביצועי התפוקה הגבוהים של תא ה-MISS.

ראשית, השתמשנו באותו תרחיף צואה כדי להשוות את תפוקת הבידוד של תא בודד בשתי השיטות. בתא MISS השתמשנו בריכוזים מיקרוביאליים נמוכים, שבהם ניתן לחשב את הס...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

פרוטוקול זה מתאר את פעולת תא ה-MISS לבידוד, גידול, גילוי ואיסוף חד-שבטיים מיקרוביאליים אוטומטיים ובעלי תפוקה גבוהה. בהשוואה לשיטות מסורתיות שבאמצעותן ניתן היה לבודד ולתרבית רק ~20%-30% ממיקרוביוטת המעיים 2,12, מספר השיבוטים החד-שבטיים שהתקבלו באמצעות מערכת Omics היה גבוה פי 1.97 מאלה שהתקבלו מלוחות מוצקים. השוואה זו מגלה כי לתא ה-MISS יש יתרונות בבידוד תאים בודדים, גידול חד-שבטי וסינון.

לבידוד תא בודד,...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגודי אינטרסים לחשוף.

תודות

מחקר זה נתמך על ידי פרויקטי מחקר ופיתוח באזורי מפתח במחוז גואנגדונג (2024B1111130002), פרויקטי מחקר ופיתוח של מחוז הביי (22375503D), ופרויקט הפתיחה של מעבדת ההנדסה של אנהוי לגידול מולקולרי של מיקרוביולוגיה תעשייתית (Grant ELMB-07).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
צלחת פטרי 100 מ"מMerck KGaA, דרמשטדט, גרמניהP5731-500EAלהכנת צלחת מוצקה
מיכלי שרפרף 30 מ"לBoen Healthcare Co., Ltd611101לאיסוף דגימות הצואה
37 מעלות; חממת טמפרטורה קבועה Cשנחאי Yiheng טכנולוגיה ושות', בע"מLRH-150לטפח את הצלחת המוצקה בחממה
96 בארות שקופה שטוחה פוליסטירן פוליסטירן מטופלTC קורנינג3599לזיהוי תנועת צלחת באר ואיסוף טיפות
אגרבקטון, דיקינסון ושות214010להכנת צלחת מוצקה
שמן להסרת בועות אווירLuoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.MISS cell-S-oilהשמן במסיר בועות האוויר במהלך סינון טיפות
מסיר בועות אווירLuoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.MISS cell-Sאל תכלול את שלב הגז בין טיפות לפני ביצוע זיהוי ואיסוף טיפות
ספסל אנאירוביארגון ומחלקת עסקים של ציוד חלל חנקן, Haiyu Town, Changshu CityVGB-4CM לניתוח אספטי ועיקור UV בתנאים אנאירוביים
אוטוקלאבPuhexi בריאות וציוד רפואי ושות', בע"מMLS-830Lלחיטוי מדיום BHI, צינור EP וכן הלאה.
עירוי לב מוח (BHI) מרקצ'ינגדאו היי-טק פארק תעשייתי Haibo Biotechnology Co., LtdHB8297-1רכיבי BHI medium
רשימת המרכיבים:
38.5 גרם/ליטר מרק BHI במים מזוקקים
מפזר תאיםMerck KGaA, דרמשטדט, גרמניהHS8151לחסן את התמיסה המיקרוביאלית על
צינור הצנטריפוגה המוצק, 15 מ"לבייג'ינג Xinhengyan Technology Co., בע"מHB53397להכנת פתרון מיקרוביאלי
מחשבLenovoE450התקנת תוכנה ובקרת תא MISS
CryovialThermo Fisher2.0 מ"ללשימור
צואה מים מזוקקיםבייג'ינג Mreda טכנולוגיה ושות', בע"מM306444-100 מ"להוסף למכשיר אדים כדי לשמור על הלחות בתא גידול טיפות
צינור EPתרמו פישר2.0 מ"ללאיסוף דגימות הצואה
מיקרוסקופ הפוך פלואורסצנטימדעי החיים אולימפוס (LS)CKX53בדוק וחשב את ריכוז החיידקים
גליצרולGENERAL-REAGENTG66258Aלשימור מתח
המוציטומטרAcmecAYA0810-1eaחשב את ריכוז המיקרוביאלי
KClAmbeedA442876רכיבים של תמיסת מלח חוצצת פוספט (תמיסת PBS)רשימת המרכיבים: 8 גרם/ליטר NaCl, 0.2 גרם KCl, 1.44 גרם Na2HPO4, 0.24 גרם KH2PO4 במים מזוקקים
KH2PO4MACKLIN P815661רכיבים של תמיסת מלח חוצץ פוספט (תמיסת PBS)רשימת המרכיבים: 8 גרם/ליטר NaCl, 0.2 גרם KCl, 1.44 גרם Na2HPO4, 0.24 גרם KH2PO4 במסנן רשת מים מזוקקים
Anping Jiufeng Wire Mesh Manufacturing Co., בע"מ200 רשת (0.075 מ"מ), 400 רשת (0.038 מ"מ), 800 רשת (0.018 מ"מ) הסר מזון לא מעוכל וחלקיקים קטנים יותר מדגימות הצואה
מיקרו-צינורות ויצירת טיפות שבב מיקרופלואידיLuoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.MISC-B2לייצור טיפות ודגירת טיפות
שמן תאים MISSLuoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.MISS תא-BOS-Bשלב השמן למיקרופלואידיקה טיפתית
תוכנת תאמיס Luoyang TMAXTREE ביוטכנולוגיה ושות', בע"מתא MISS V3.2.4בצע פעולות ניסיוניות על מכשיר התא
MISS Na2HPO4SolarbioD7292רכיבים של תמיסת מלח חוצץ פוספט (תמיסת PBS)רשימת המרכיבים: 8 גרם/ליטר NaCl, 0.2 גרם KCl, 1.44 גרם Na2HPO4, 0.24 גרם KH2PO4 במים מזוקקים
NaClGENERAL-REAGENTG81793Jמרכיבי תמיסת המלח הפיזיולוגית
רשימת המרכיבים:
9 גרם/ליטר NaCl במים מזוקקים
Pipetteeppendorf2.5 μ L, 10 ו-mu; L, 100μ L, 1000μ Lלטיפול בנוזלים
צינור פוליטטרפלואורואתילןשנזן WOER חומר מתכווץ בחום ושות', בע"מ3401000141לדגירת טיפות. חומר זה כבר נכלל במיקרו-צינורות ויצירת טיפות שבב מיקרו-נוזלי
בקבוק מדגםLuoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.דגימת בקבוק תא MISSשל תמיסה מיקרוביאלית
מערכת אומיקס תרבית מיקרוליטר טיפה חד תאית (תא MISS)Luoyang TMAXTREE ביוטכנולוגיה ושות', בע"מMISS cell-G3fביצוע הבידוד החד-שבטי המיקרוביאלי, הטיפוח, הזיהוי והאיסוף
Superspeed צנטריפוגהתרמו פישרסורוול לינקס 4000 הכן את התמיסה המיקרוביאלית לריצוף
מזרקJiangsu Zhiyu Medical Instructment Co., Ltd10 מ"ללשאוב את המים המזוקקים ולהזריק אותם למכשיר האדים בתא גידול טיפות
מקרר בטמפרטורה נמוכה במיוחדSANYO נמוך במיוחד MDF-U4086S לשימור הזן (-80 ו-deg; ג)
'

מקורות

  1. Hurst, C. J. Isolation and cultivation of bacteria. The structure and function of aquatic microbial communities. , Springer International Publishing. Cham. 313-351 (2019).
  2. Xu, M. Q., Pan, F., Peng, L. H., Yang, Y. S. Advances in the isolation, cultivation, and identification of gut microbes. Mil Med Res. 11 (1), 34(2024).
  3. Lattermann, C., Büchs, J. Microscale and miniscale fermentation and screening. Curr Opin Biotechnol. 35, 1-6 (2015).
  4. Huang, Y., et al. High-throughput microbial culturomics using automation and machine learning. Nat Biotechnol. 41 (10), 1424-1433 (2023).
  5. Brehm-Stecher Byron, F., Johnson Eric, A. Single-cell microbiology: Tools, technologies, and applications. Microbiol Mol Biol Rev. 68 (3), 538-559 (2004).
  6. Jian, X., et al. Single-cell microliter-droplet screening system (miss cell): An integrated platform for automated high-throughput microbial monoclonal cultivation and picking. Biotechnol Bioeng. 120 (3), 778-792 (2023).
  7. Hu, B., et al. One cell at a time: Droplet-based microbial cultivation, screening and sequencing. Mar Life Sci Technol. 3 (2), 169-188 (2021).
  8. Leygeber, M., et al. Analyzing microbial population heterogeneity-expanding the toolbox of microfluidic single-cell cultivations. J Mol Biol. 431 (23), 4569-4588 (2019).
  9. He, Z., Wu, H., Yan, X., Liu, W. Recent advances in droplet microfluidics for microbiology. Chinese Chemical Letters. 33 (4), 1729-1742 (2022).
  10. Kaminski, T. S., Garstecki, P. Controlled droplet microfluidic systems for multistep chemical and biological assays. Chem Soc Rev. 46 (20), 6210-6226 (2017).
  11. Sender, R., Fuchs, S., Milo, R. Are we really vastly outnumbered? Revisiting the ratio of bacterial to host cells in humans. Cell. 164 (3), 337-340 (2016).
  12. Simrén, M., et al. Intestinal microbiota in functional bowel disorders: A rome foundation report. Gut. 62 (1), 159-176 (2013).
  13. Periyannan Rajeswari, P. K., Joensson, H. N., Andersson-Svahn, H. Droplet size influences division of mammalian cell factories in droplet microfluidic cultivation. Electrophoresis. 38 (2), 305-310 (2017).
  14. Jian, X., et al. Microbial microdroplet culture system (mmc): An integrated platform for automated, high-throughput microbial cultivation and adaptive evolution. Biotechnol Bioeng. 117 (6), 1724-1737 (2020).
  15. Baret, J. -C. Surfactants in droplet-based microfluidics. Lab on a Chip. 12 (3), 422-433 (2012).
  16. Kubie, L. S. The solubility of O2, CO2, and N2 in mineral oil and the transfer of carbon dioxide from oil to air. J Biol Chem. 72 (2), 545-548 (1927).
  17. Poon, C. Measuring the density and viscosity of culture media for optimized computational fluid dynamics analysis of in vitro devices. J Mech Behav Biomed Mater. 126, 105024(2022).
  18. Yao, J., Lin, F., Kim, H. S., Park, J. The effect of oil viscosity on droplet generation rate and droplet size in a t-junction microfluidic droplet generator. Micromachines. 10 (12), 808(2019).
  19. Venkateshwarlu, A., Bharti, R. P. Effects of capillary number and flow rates on the hydrodynamics of droplet generation in two-phase cross-flow microfluidic systems. Journal of the Taiwan Institute of Chemical Engineers. 129, 64-79 (2021).
  20. Nekouei, M., Vanapalli, S. A. Volume-of-fluid simulations in microfluidic t-junction devices: Influence of viscosity ratio on droplet size. Physics of Fluids. 29, 032007(2017).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים