מאמר שיטה

חיזוי ואימות הוויסות של פגיעה בפודוציטים וטיפול במחלת כליות סוכרתית מאת Yinhuo Tang

812 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/67939

⸱

20 ביוני 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Nephropathy Department, the Affiliated Hospital to Changchun University of Chinese Medicine, 2College of Integrated Chinese and Western Medicine, Changchun University of Chinese Medicine

במאמר זה

סיכום

באמצעות פרמקולוגיה של רשת ואימות ניסיוני, פרוטוקול זה חושף את מנגנון הפעולה של Yinhuo Tang (YHT) בטיפול במחלת כליות סוכרתית (DKD) וכיצד YHT מפחית נזק לפודוציטים בעכברי DKD באמצעות עיכוב מסלול האיתות PI3K/AKT/NF-κB.

תקציר

מחלת כליות סוכרתית (DKD) היא מחלת כליות כרונית המאופיינת בפרוטאינוריה מסיבית וירידה בקצב הסינון הגלומרולרי. המאפיין הפתולוגי העיקרי של DKD הוא מיקרואנגיופתיה כלייתית, ו~40% מחולי הסוכרת יפתחו DKD. החלבונים הקשורים לפודוציטים CD2AP ו-WT-1 ממלאים תפקיד מכריע בשמירה על התפקוד התקין של הפודוציטים ועל שלמות מחסום הסינון הגלומרולרי. כאשר מבנה או תפקוד הפודוציטים משובשים - עקב דלקת, מתח חמצוני או עלבונות פתולוגיים אחרים - הסרעפת החריץ ושלד הציטו אקטין נפגעים, מה שמוביל לחדירות מוגברת של מחסום הסינון הגלומרולרי וכתוצאה מכך לפרוטאינוריה. Yinhuo Tang (YHT) הוא מרשם לרפואה סינית מסורתית שתפקידו להפחית פרוטאינוריה ולעכב את הידרדרות תפקוד הכליות; עם זאת, המנגנון של YHT בטיפול ב-DKD אינו ברור. במאמר זה, המבוסס על פרמקולוגיה ברשת וניסויים בבעלי חיים, בחנו את הגלוקוז בדם, תפקודי הכבד, תפקוד הכליות, שומנים בדם, פתולוגיה כלייתית ורמות ביטוי של חלבוני סמן פודוציטים CD2AP ו-WT-1, כמו גם את מסלול האיתות PI3K/AKT/NF-κB בעכברי db/db לאחר מתן YHT במשך 8 שבועות. התוצאות שלנו מראות כי YHT מפחית את רמות הביטוי של גורמים דלקתיים על ידי עיכוב מסלול האיתות PI3K/AKT/NF-κB, ובכך מפחית את נזק הפודוציטים למלא תפקיד בעיכוב התקדמות DKD.

מבוא

מחלת כליות סוכרתית (DKD) היא סיבוך שכיח וחמור של סוכרת, והיא נותרה הגורם המוביל לאי ספיקת כליות סופנית ברחבי העולם1. המחלה מתקדמת דרך סדרה של תהליכים פתולוגיים מורכבים, כגון הגדלה גלומרולרית, התרחבות מזנגיאלית, פיברוזיס טובולואינטרסטיציאלי והצטברות מוגזמת של רכיבי מטריצה חוץ-תאית 2,3. למרות השיפורים בניהול הסוכרת, הטיפולים הנוכחיים מכוונים בעיקר לשלוט ברמות הגלוקוז בדם ובלחץ הדם, מה שרק מאט את התקדמות ה-DKD במקום להפוך את השינויים הפתולוגיים הבסיסיים שלו. זה מדגיש את הצורך הדחוף באפשרויות טיפול מקיפות ויעילות יותר 4,5.

הרפואה הסינית המסורתית (TCM) התגלתה כטיפול אלטרנטיבי מבטיח בטיפול במחלות כרוניות כגון DKD 6,7,8. הרפואה הסינית המסורתית שמה דגש על גישת טיפול הוליסטית, שיכולה לטפל באופי המורכב ומרובה המטרות של DKD. בין התכשירים השונים של הרפואה הסינית המסורתית, הוכח כי יש ל-Yinhuo Tang (YHT) תפקידים פיזיולוגיים מרובים, כגון הזנת יין (להשלמת נפח הדם), חיזוק הכליות (לשיפור תפקוד הכליות), פינוי חום (לדיכוי דלקת) והכנעת יאנג (להורדת לחץ הדם)9,10,11. עם זאת, עדיין חסרה הבנה מקיפה של המנגנונים שבאמצעותם YHT מקל על DKD.

החלבון הקשור לפודוציטים CD2AP הוא חלבון מפתח בפודוציטים, חיוני לשמירה על שלמות מחסום הסינון, בעוד WT-1 ממלא תפקיד קריטי בהתפתחות הכליות ופיברוזיס 12,13,14,15,16. לכן, התפקוד התקין של שני החלבונים הללו חיוני לתפקוד תקין של סינון גלומרולרי. הספרות הקיימת מצביעה על כך שמטרות אלה מעורבות בהתקדמות של DKD, ואנו משערים שהמרכיבים הפעילים של YHT עשויים לקיים אינטראקציה עם מטרות אלה כדי להפעיל השפעות טיפוליות. מחקר זה נועד לאשר את האינטראקציות הללו ולספק תובנות עמוקות יותר לגבי האופן שבו YHT מווסת את מסלולי המחלה של DKD.

במחקר זה, אנו משתמשים בשילוב של פרמקולוגיה רשת וניסויים בבעלי חיים כדי לחקור את המנגנונים הטיפוליים של YHT ב-DKD. פרמקולוגיה רשתית, המשלבת כלים ביואינפורמטיים לניתוח האינטראקציות המורכבות בין תרכובות פעילות ומטרות ביולוגיות, מאפשרת לנו לחקור את האופי הרב-מטרתי והרב-מסלולי, של פעולת YHT 17,18,19. שיטות מסורתיות לגילוי תרופות מדגישות לעתים קרובות התערבויות חד-מטרתיות. לעומת זאת, פרמקולוגיה של רשת משמשת ככלי חיזוי המסייע בזיהוי מסלולים פוטנציאליים ומטרות מולקולריות, ומציע תובנות ראשוניות לגבי מנגנוני הפעולה האפשריים של טיפולים מורכבים. למרות שהיא אינה מחליפה את הצעדים הניסיוניים והרגולטוריים הקפדניים הנדרשים לפיתוח תרופות, פרמקולוגיה ברשת יכולה להנחות יצירת השערות ולייעל מחקר בשלב מוקדם20.

בסופו של דבר, מחקר זה נועד לגשר על הפער בין הרפואה המסורתית למודרנית, ולספק ראיות מדעיות לשילוב הרפואה הסינית המסורתית בטיפול ב-DKD. תוצאות מחקר זה עשויות לסייע בפיתוח אסטרטגיות טיפול יעילות ובטוחות יותר ל-DKD, ולהציע אלטרנטיבה לטיפול סטנדרטי שלעתים קרובות מוגבל על ידי תופעות לוואי. על ידי הבהרת המנגנונים המולקולריים של YHT ואימות הפוטנציאל הטיפולי שלו, אנו מקווים להדגים את היישום הרחב של הרפואה הסינית המסורתית בטיפול ב-DKD.

פרוטוקול

בסך הכל נבחרו למחקר זה 30 עכברי סוכרת ספונטניים מסוג II (C57BL/Ksj db/db) ושישה עכברי ביקורת זכרים שאינם סוכרתיים (db/m) עם אותו רקע גנטי. העכברים שוכנו במשך שבועיים בסביבה סטרילית בדרגת SPF במרכז הניסויים בבעלי חיים של אוניברסיטת צ'אנגצ'ון לרפואה סינית מסורתית (מספר רישיון: SYXK (JI) 2023-0014). במהלך תקופה זו, הם קיבלו תזונה קבועה ומים סטריליים. גלוקוז בדם בצום נמדד בעכברי db/db בתחילת ובסוף התקופה של שבועיים, ורק אלה עם תוצאות העולות על 11.1 ממול/ליטר בשתי הבדיקות נכללו בניסוי. המחקר אושר על ידי ועדת האתיקה של אוניברסיטת צ'אנגצ'ון לרפואה סינית מסורתית (מספר תעודת זהות: 2024147).

1. הכנת תרופות

  1. הכנת YHT (טבלה 1)
    1. בחרו Rehmannia glutinosa (30 גרם), Ophiopogon japonicus (10 גרם), Morindae Officinalis Radix (10 גרם), Poria cocos (15 גרם) ו-Schisandra chinensis (6 גרם), ושטפו את עשבי התיבול במים כדי להסיר זיהומים ואבק מפני השטח. לאחר מכן, מערבבים 71 גרם מעשבי התיבול הגולמיים עם 710 מ"ל מים מזוקקים ומשרים בעציצי קרמיקה למשך 60 דקות
    2. לאחר רתיחה ב-100 מעלות צלזיוס, מורידים את טמפרטורת המרתח ל-80 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות ולאחר מכן מסננים את הפסולת דרך שתי שכבות של גזה רפואית. אחסן את הנוזל במקרר בחום של 4 מעלות צלזיוס.
    3. הוסף 710 מ"ל מים מזוקקים לפסולת לעיל, וחזור על ההשריה משלב 1.1.1 ושלב 1.1.2 פעם אחת; אחסן את הנוזל במקרר בחום של 4 מעלות צלזיוס.
    4. מערבבים את שני נוזלי המרפא הנ"ל משלבים 1.1.2 ו-1.1.3 ומניחים אותם במגש החומר של ליופילייזר הוואקום. הפעל את משאבת הוואקום כדי להוציא את האוויר מתא ייבוש ההקפאה, הגדר את הטמפרטורה ל-40 מעלות צלזיוס ושמור עליה למשך 6 שעות כדי להקפיא את המים בתמיסת התרופה למצב מוצק. לאחר מכן, כוונן את הטמפרטורה ל-20 מעלות צלזיוס למשך 36 שעות כדי להפוך את המים לגבישי קרח לגז. לבסוף, הגדר את הטמפרטורה ל-40 מעלות צלזיוס, שמור עליה למשך 24 שעות כדי להסיר את הלחות שנותרה מתמיסת התרופה, כבה את משאבת החימום והוואקום והסר את האבקה המיובשת בהקפאה (אבקת YHT).
    5. שוקלים 0.4615 גרם, 0.923 גרם ו-1.846 גרם של אבקת YHT ליופילית, משעים 1 מ"ל מי מלח, ויוצרים את התרחיף של YHT בריכוזים של 0.4615 גרם/מ"ל, 0.923 גרם/מ"ל ו-1.846 גרם/מ"ל, בהתאמה.
  2. הכנת ולסרטן
    1. יש להוסיף ולסרטן (10.29 מ"ג) ל-50 מ"ל של PEG300 ולנער היטב עד להמסה מלאה.
    2. הוסף 50 מ"ל מי מלח לתמיסה משלב 1.2.1 ונער היטב להומוגניזציה ולקבלת תמיסת ולסרטן בריכוז של 10.29 מ"ג/מ"ל.

2. טיפולים תרופתיים

הערה: הניסוי חולק לשש קבוצות: קבוצת הביקורת הנורמלית (CON), קבוצת המודל (MOD), קבוצת הביקורת החיובית לולסרטן (POS), קבוצת המינון הנמוך של YHT (YH-L), קבוצת המינון הבינוני של YHT (YH-M) וקבוצת המינון הגבוה של YHT (YH-H). בני אדם בוגרים זקוקים ל-71 גרם YHT ליום. על פי נוסחת ההמרה של מינון תרופות ניסיוני של עכברים ובני אדם, המינון היומי לעכבר היה ~9.23 גרם/ק"ג:

מינון ניסיוני שווה ערך לעכבר (גרם/ק"ג) = מינון אנושי (גרם)/משקל גוף (70 ק"ג) × 9.1

  1. אחוז בחוזקה בגב העכברים ביד הלא דומיננטית כך שראשיהם, צווארם וגופם יהיו בקו ישר (כדי למנוע מאבק) ומקם את מחט הגאווג' של 1 מ"ל כראוי בזווית הדומה לעקמומיות הפיזיולוגית של הוושט של העכברים. דחפו את מחט הגאווג' דרך זווית הפה של העכברים, לחצו אותה כלפי מטה על הלשון, לחצו אותה על החך ודחפו אותה בעדינות פנימה לתוך הבטן.
  2. דחף לאט את התרופה פנימה באמצעות האצבע המורה של היד הדומיננטית, ומשוך את המחט אנכית כדי להשלים את פעולת הגוואג'.
    הערה: מינון התרופה היה 10 מ"ל/ק"ג למשך 4 שבועות בסך הכל.
    1. יש לתת 10 מ"ל∙kg-1∙day-1 מי מלח על ידי gavage לעכברי CON ו-MOD.
    2. יש לתת תרחיף ולסרטן במינון 10.29 מ"ג∙ק"ג-1∙יום-1 על ידי גבאז' לעכברים מקבוצת הקופה.
    3. לתת את המינונים הבאים של YHT על ידי gavage לקבוצות אלה: 4.615 g∙kg-1∙day-1 לקבוצת YH-L; 9.23 גרם∙ק"ג-1∙יום-1 לקבוצת YH-M; 18.46 גרם∙ק"ג-1∙יום-1 לקבוצת YH-H.

3. הערכת יעילות YHT

  1. איתור אינדקסים ביוכימיים של דם ושתן
    1. לאחר 8 שבועות של מתן תרופות רצוף, אספו שתן 24 שעות מעכברים באמצעות כלוב מטבולי, צנטריפוגה של השתן שנאסף ב-7,992 × גרם למשך 10 דקות, הסירו את הסופרנטנט ומדדו את רמת החלבון בשתן באמצעות ערכת בדיקת חלבון השתן.
    2. אחוז בגב העכבר ביד הלא דומיננטית כדי לתקן את העכבר והשתמש באצבע הקטנה ובאצבע הקמיצה של אותה יד לא דומיננטית כדי לתקן את זנב העכבר. עקר את קצה זנב העכבר בעזרת כדורי צמר גפן אדי יוד. ביד הדומיננטית, החזק מחט איסוף דם כדי לנקב במהירות את קצה זנב העכבר, לחץ משורש זנב העכבר לקצה הזנב והטיל את הדם על נייר בדיקת הגלוקוז בדם.
    3. בעזרת היד הלא דומיננטית, אחוז בזנב העכבר, תוך אבטחת אזור השכמה עם האגודל והאצבע, וודא שבטן העכבר פונה כלפי מעלה. ביד הדומיננטית, החזיקו מזרק של 1 מ"ל מלא בנתרן פנוברביטל. הכנס את המחט (בעומק 3-5 מ"מ) לחלל הבטן בזווית של 30-45 מעלות, תוך התמקדות באזור שבין הטבור לגפיים האחוריות, כשהמחט מכוונת לכיוון הראש. משוך לאט את בוכנת המזרק כדי לבדוק אם יש דם; אם נשאב דם, מקם מחדש את המחט בהתאם.
    4. יש להזריק לאט את תמיסת הנתרן פנטוברביטל כדי להבטיח מתן אחיד, ולהוציא את המזרק לאחר השלמת ההזרקה. המתן 10 דקות, ולאחר מכן עם מלקחיים ביד הדומיננטית, צבט בעדינות את אצבעות הגפיים האחוריות של העכבר כדי לבדוק אם יש תגובה. אם עדיין נצפתה תגובה, יש לתת מנה קטנה נוספת (10 מ"ג/ק"ג) לפי הצורך.
      הערה: בהנחה שעכבר שוקל 60 גרם והתמיסה הפנוברביטלית היא 1% w/v, 0.06 מ"ל הוא המינון הנוסף שיש לתת במקרה של תגובה כלשהי.
    5. השתמש במספריים כדי לקצץ את השפם והשיער סביב עיני העכברים, השתמש ביד הלא דומיננטית כדי ללחוץ על העור סביב העיניים שממנו יש להסיר את גלגלי העיניים כך שגלגלי העיניים יבלטו. עקרו את העור סביב גלגלי העיניים עם אתנול, השתמשו בפינצטה כדי להוציא במהירות את גלגלי העיניים כך שהדם יטפטף לתוך צינורות המיקרו-צנטריפוגה (1.5-2 מ"ל), דגרו את הצינורות בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות, צנטריפוגות את הצינורות למשך 10 דקות ב-7,992 × גרם, וחלצו את תמיסת הסופרנטנט.
    6. מדוד את רמות הביטוי של קריאטינין בסרום (Scr), חנקן אוריאה בדם (BUN), אלבומין (ALB), אלנין אמינוטרנספראז (ALT), אספרטט אמינוטרנספראז (AST), טריגליצרידים (TG) וכולסטרול כולל (TC) בסרום בהתאם להוראות הערכה.
  2. הפרדת רקמות כליה
    1. לאחר דגימת דם, יש לקבע את העכברים על צלחת הניתוח במצב שכיבה, לגזור את שיער אזור בית החזה הקדמי של העכברים, לעקר את אזור בית החזה הקדמי באמצעות אתנול, לחתוך את עור הבטן במספריים ולדחוף הצידה את המעי הדק והגס כדי לחשוף את הכליות.
    2. הסר את רקמת הכליה של העכבר, השתמש במלקחיים המוסטטיים כדי להפריד בצורה קהה את הפריאוסטאום, והנח את הכליה השמאלית במקפיא של -80 מעלות צלזיוס לאחסון ואת הכליה הימנית בצינור של 20 מ"ל המכיל תמיסת פרפורמלדהיד 4% לקיבוע הכליה.
    3. הסר את הכליות הימניות מהפורמלדהיד לאחר 24 שעות, שטוף לזמן קצר במים מזוקקים למשך 5 דקות, יבש באמצעות שיפוע של אתנול נטול מים (100% → 95% → 85% → 75%, 5 דקות כל אחד), שקוף באמצעות שיפוע קסילן (2 x 10 דקות), הטמע בשעוות פרפין ואפשר לגושי השעווה להתמצק בטמפרטורת החדר21. לאחר מכן, הכניסו אותו למקפיא של -20 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
    4. מסירים את גוש השעווה, פורסים אותו בעובי של 3 מיקרומטר, מניחים אותו במים כדי להיפתח, ואז דגים אותו בעזרת שקופית, ומכניסים לתנור בטמפרטורה קבועה בטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס לאפייה למשך 30 דקות ולאחר מכן מאחסנים אותו לניתוח לאחר מכן
  3. ניתוח היסטופתולוגי כלייתי
    1. הסר את הכליה הימנית, בצע הסרת שעווה קסילן שיפוע והתייבשות אתנול נטול מים כאמור לעיל (שלב 3.2.3), ושטוף במים מזוקקים.
    2. בצע צביעה על פי ההוראות של צביעת המטוקסילין ואאוזין (H&E), צביעת חומצה-שיף תקופתית (PAS) וערכות צביעה מאסון.
    3. בצע שוב התייבשות אתנול נטול מים בשיפוע ושקיפות קסילן כמו בשלב 3.2.3.
    4. לאחר ייבוש בטמפרטורת החדר, הרכיבו את חלקי הרקמה על השקופיות בעזרת כיסוי באמצעות מסטיק ניטרלי כאמצעי ההרכבה. התבונן בשקופיות וצלם אותן תחת מיקרוסקופ אור בהגדלה של פי 400.
  4. ניתוח אימונוהיסטוכימי של רקמת הכליה
    1. הסר את הכליה הימנית, הסר שעווה וייבש את החלקים כמתואר בשלב 3.2.3, הנח אותם בתמיסת חיץ נתרן ציטראט של 10 מ"מ (pH 6.0), וחום (125 מעלות צלזיוס, 103 kPa) למשך 5 דקות לתיקון אנטיגן. לאחר 10 דקות, הסר את החלקים, מצנן לטמפרטורת החדר ושטוף אותם 3X5 דקות ב-1x PBS.
    2. הנח את החלקים בתמיסת מי חמצן 3% למשך 10 דקות כדי לחסום פרוקסידאז אנדוגני ושטוף 3 x 5 דקות ב-PBS.
    3. הוסף 10% סרום עיזים טיפתי לחלקים, וודא שסרום העיזים מכסה באופן שווה את כל החלק. מניחים את החלקים בקופסה רטובה, מדגרים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, ושוטפים 3X5 דקות עם PBS.
    4. הוסף נוגדנים ראשוניים COI-I (1:200), α-SMA (1:200), WT-1 (1:200), CD2AP (1:200) טיפתית (ראה טבלת חומרים), ודגירה בקופסה רטובה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס במקרר למשך הלילה.
    5. הסר את החלק, שטוף עם PBS 3 x 5 דקות, הוסף נוגדן משני (1:3,000) טיפה, דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות ושטוף עם PBS למשך 3 x 5 דקות.
    6. הוסף תמיסת פיתוח צבע 3,3'-diaminobenzidine (DAB) למשך 10 דקות, שטוף את תמיסת פיתוח הצבע במים מזוקקים, דגירה עם 100 מיקרוליטר המטוקסילין למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, ושטוף במים מזוקקים למשך 5 דקות.
    7. לייבש, לשקוף ולאטום כמתואר בשלב 3.2.3, ולאסוף את התמונות באמצעות מיקרוסקופ אופטי.
  5. ניתוח בדיקת תגובת שרשרת פולימראז כמותית בזמן אמת (qRT-PCR)
    1. קח ~100 מ"ג של רקמת כליה קפואה בצינור הומוגנייזר של 10 מ"ל, טוחן אותה היטב עם עלי עד שאין מסת רקמה ברורה, ולאחר מכן, הוסף 1 מ"ל של מגיב מיצוי RNA להומוגניזציה.
    2. מוסיפים 250 מיקרוליטר כלורופורם, מנערים במיקסר מערבולת למשך 10 שניות, מדגרים אותו על קרח למשך 5 דקות, מצנטריפוגה אותו ב-15,984 × גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס, ופיפטה החוצה את השלב המימי העליון לצינור חדש.
    3. מוסיפים 500 מיקרוליטר איזופרופנול לשלב הימי, מערבבים היטב בעזרת מערבל מערבולת למשך 10 שניות, ודוגרים את התערובת על קרח למשך 5 דקות. לאחר מכן, צנטריפוגה ב -15,984 × גרם למשך 10 דקות. הסר בזהירות את הסופרנטנט, ושטוף את כדור ה-RNA עם 1 מ"ל של 75% אתנול. לאחר מערבולת קצרה, הצנטריפוגה שוב ב-15,984 × גרם למשך 10 דקות. השלך את האתנול ואפשר לכדור ה-RNA להתייבש באוויר בטמפרטורת החדר.
    4. הוסף 30 מיקרוליטר של מי פירוקרבונט דיאתיל כדי להמיס את ה-RNA, ומדוד את הספיגה של תמיסת ה-RNA ב-260 ננומטר ו-280 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר לחישוב ריכוז ה-RNA.
      הערה: טוהר ה-RNA מוערך על ידי יחס A260/A280 . יחס אידיאלי של260/A280 צריך להיות בין 1.8 ל-2.0, מה שמעיד על טוהר RNA טוב. אם היחס נמוך מ-1.8, זה עשוי להצביע על נוכחות של זיהום חלבון או פנול, ונדרש טיהור נוסף, כגון ביצוע מיצוי פנול-כלורופורם נוסף או משקעי אתנול להסרת מזהמים.
    5. מערבבים 3 מיקרוגרם של RNA כולל, 4 מיקרוליטר של תערובת מגבים של 4 gDNA ו-ddH2O ללא RNase לנפח סופי של 16 מיקרוליטר, צנטריפוגה ב-1,250 × גרם למשך 10 שניות, ודגירה ב-42 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות. הוסף 4 מיקרוליטר של טרנסקריפטאז הפוך פי 5 ל-16 מיקרוליטר של התמיסה הנ"ל, צנטריפוגה ב-1,250 × גרם למשך 10 שניות. בצע את תוכנית התמלול ההפוך ב-50 מעלות צלזיוס (15 דקות) →-85 מעלות צלזיוס (5 שניות) →-4 מעלות צלזיוס (10 דקות). אחסן את ה-cDNA המסונתז ב-20 מעלות צלזיוס.
    6. הוציאו את תמיסת ה-cDNA מהמקפיא ובצעו דנטורציה מוקדמת ב-90 מעלות צלזיוס (10 דקות), ולאחר מכן 40 מחזורים של 94 מעלות צלזיוס (30 שניות) →-60 מעלות צלזיוס (30 שניות) →-72 מעלות צלזיוס (24 שניות), ולבסוף ליזה בסדר גודל של 95 מעלות צלזיוס (15 שניות) →-60 מעלות צלזיוס (60 שניות) →-95 מעלות צלזיוס (350 שניות, 60 מעלות צלזיוס עולות בהדרגה ל-95 מעלות צלזיוס בקצב של 0.1 מעלות צלזיוס לשנייה).
    7. חשב את הביטוי היחסי של WT-1, CD2AP, PI3K, AKT, NF-κB ו-IL-1β באמצעות שיטת 2-ΔΔCt בהתבסס על ערך ה-Ct של כל דגימה עם Gapdh כהתייחסות הפנימית (ΔΔCt = ערך Ct של גן היעד - ערך Ct של גן הייחוס הפנימי) (ראה טבלה 2).
  6. ניתוח בדיקת כתם מערבי (WB).
    1. קח ~100 מ"ג של רקמת כליה קפואה בצינור הומוגנייזר של 10 מ"ל, ואחריו 500 מיקרוליטר של תמיסת ליזה (מעכב פרוטאז: מעכב פוספטאז: RIPA= 1: 1: 100), וטחן אותה עם עלי מספיק עד שאין מסת רקמה ברורה.
    2. דגרו את הצינור על קרח למשך 30 דקות, צנטריפוגה ב-15,984 × גרם למשך 10 דקות, ושאבו את הסופרנטנט.
    3. קבע את ריכוז החלבון של כל דגימה באמצעות בדיקת BCA. בהתבסס על הריכוזים הנמדדים, פיפטה מכירים כמויות שוות של חלבון כולל (למשל, 30 מיקרוגרם) מכל קבוצה לצינורות חדשים ומתאימים את הנפח הסופי באמצעות PBS כדי להבטיח עקביות. לאחר מכן, מוסיפים 5x חוצץ העמסת חלבון, מרתיחים ב-100 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, ולאחר מכן מוציאים ומצננים לטמפרטורת החדר.
    4. השתמש באלקטרופורזה של ג'ל 12.5% SDS-PAGE כדי להפריד את החלבונים. ראשית, השתמש ב-80 וולט כדי לגרום לדגימה לעבור דרך ג'ל הריכוז לאט, ולאחר מכן כוונן את המתח ל-120 וולט עד שהדגימה תגיע לתחתית ג'ל ההפרדה, וכבה את היחידה.
    5. משרים נייר פילטר במאגר העברת הממברנה, השתמש בפינצטה כדי להחזיק פינה של קרום ה- PVDF ולטבול אותו במתנול כדי להפעיל אותו. הסר את הג'ל, השתמש בצלחת פלסטיק כדי לחתוך את הג'ל המרוכז ואת תחתית ג'ל ההפרדה, ולאחר מכן, בהתאם למבנה הסנדוויץ' של נייר המסנן/ג'ל/ממברנת PVDF/נייר סינון כדי להגדיר את התקן העברת הממברנה (ג'ל כקוטב השלילי, קרום PVDF כקוטב החיובי), הנח את ההתקנה במיכל העברת ממברנה מלא במאגר העברה מקורר מראש, הקיפו אותו בקוביות קרח כדי לשמור על טמפרטורה נמוכה, ובצעו את ההעברה בזרם קבוע של 200 mA.
      הערה: החליטו על זמן ההעברה בהתאם למשקל המולקולרי של החלבון (ככל שהמשקל המולקולרי גדול יותר, כך זמן ההעברה ארוך יותר).
    6. הנח את קרום ה-PVDF במאגר החוסם, נער את המאגר החוסם למשך 90 דקות בטמפרטורת החדר, ושטוף עם TBST (50 מ"ל של 20x TBS ו-0.5 מ"ל Tween-20 לליטר TBST) למשך 3 x 5 דקות.
    7. באמצעות נוגדנים ראשוניים מדללים נוגדנים ראשוניים: WT-1 (1:1,000), CD2AP (1:1,000), P-PI3K (1:1,000), P-AKT (1:1,000), P-NF-κB (1:1,000) ו-IL-1β (1:1,000), מוסיפים נוגדן ראשוני על קרום ה-PVDF ודוגרים בקופסה רטובה במקרר של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה (ראה טבלת חומרים).
    8. הסר את קרום ה-PVDF מהמקרר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, שטוף עם TBST למשך 3 x 5 דקות, השתמש בדילול נוגדן משני מדלל נוגדן משני (1:10000), הוסף נוגדן משני דגירה בטמפרטורת החדר למשך 60 דקות, שטוף עם TBST למשך 3 x 5 דקות, הנח את קרום ה-PVDF בהדמיית הכימילומינסנציה, והוסף באופן אחיד נוזל זוהר ECL טיפה (A: B = 1:1).

4. ניתוח פרמקולוגיה ברשת של YHT לטיפול ב-DKD

  1. סינון חומרים פעילים ומטרות של YHT
    1. קבע את הרכיבים הפעילים של Radix Rehmanniae Praeparata, Morindae Officinalis Radix, Poria ו-Schisandra Chinensis באמצעות מסד הנתונים TCMSP (https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php) ושל Maitake ממסד הנתונים BATMAN-TCM (http://bionet.ncpsb.org/batmantcm). הגדר זמינות ביולוגית דרך הפה (OB) ≥ 30% ודמיון לתרופות (DL) ≥ 0.18 כקריטריוני הסינון לזיהוי החומרים הפעילים.
    2. חפש במסד הנתונים של TCMSP (https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php) את יעדי הפעולה של החומרים הפעילים מהרפואה הסינית המסורתית לעיל.
    3. הפחת את הדגש על היעדים של החומרים הפעילים לעיל ושלב אותם ברשימה לניתוח נוסף. תקנן את שמות המטרות באמצעות מסד הנתונים של חלבון Uniprot (https://www.uniprot.org).
  2. בניית רשת היעד של החומרים הפעילים של YHT
    1. ייבא את החומרים הפעילים ואת היעדים המתאימים להם ל-theoftware: בנה את רשת "החומר הפעיל-יעד" על ידי בחירה ב-File | יבוא | רשת וטעינת הנתונים הרלוונטיים.
    2. ביצוע ניתוח טופולוגיית רשת על-ידי ניווט אל כלים | ניתוח רשת | לנתח רשת כדי להמחיש את הקשרים בין תרופות, חומרים פעילים, מטרות ומחלות. בהדמיית הרשת, הצמתים מייצגים את החומרים הפעילים, והקצוות מייצגים את האינטראקציות בין החומרים הפעילים והמטרות.
  3. סינון מטרות הקשורות ל-DKD
    1. שימוש במחלת כליות סוכרתית כמונח החיפוש והגדרת המין כאנושי, סינון מטרות הקשורות ל-DKD ממאגרי המידע הבאים: מסד הנתונים של GeneCards (https://www.genecards.org); מסד נתונים של OMIM (http://www.omim.org); מסד נתונים TTD (https://www.ttd.cn); מסד הנתונים של DrugBank (http://www.drugbank.ca); מסד נתונים DisGeNET (http://www.disgenet.org).
    2. לאחר השגת התוצאות מחמשת מסדי הנתונים, מזג אותן לגיליון אלקטרוני והסר כפילויות באמצעות הפונקציה Remove Duplicates בתפריט נתונים , כדי להבטיח שרק השמות הייחודיים של יעדים הקשורים ל-DKD יישמרו.
  4. בניית PPI (אינטראקציה בין חלבון לחלבון) וסינון מטרות ליבה
    1. השתמש בתוכנת גיליון אלקטרוני כדי לזהות את יעדי ההצטלבות של YHT ו-DKD על ידי הזנת רשימת יעדי ה-YHT בעמודה אחת ורשימת יעדי ה-DKD בעמודה אחרת. החל עיצוב מותנה כדי לסמן ערכים משותפים בשתי העמודות, ובכך לזהות את יעדי ההצטלבות.
    2. פתח את אתר מסד הנתונים של המחרוזות (https://cn.string-db.org/), בחר קלט | הדבק/העלה כדי לייבא את הנתונים באצווה, והגדר את הסף דרגה ≥ 1 כדי לסנן יעדים חופשיים (יעדים ללא אינטראקציות) ברשת.
    3. בחר קובץ | יבוא | רשת וייבא את יעדי הצומת המסוננים לתוכנה כדי ליצור את ההדמיה הסופית.
    4. נווט אל ניתוח רשת | נתח את הרשת וסנן את יעדי הליבה של YHT-DKD על סמך ערך התואר.
  5. ניתוח פונקציונלי של אונטולוגיה גנטית (GO) וניתוח העשרת מסלול העשרה של אנציקלופדיית קיוטו לגנים וגנומים (KEGG)
    1. פתח את פלטפורמת Metascape על ידי ביקור ב-http://metascape.org/gp/index.html, בחר התחל ניתוח כדי להתחיל, הדבק את רשימת היעדים עבור YHT ו-DKD בתיבת הקלט בקטע ניתוח מותאם אישית, הגדר את המינים להומו ספיינס מהתפריט הנפתח, בחר ניתוח מותאם אישית והגדר את סף ערך ה-P ל-<0.01, ולחץ על שלח כדי להפעיל את הניתוח.
    2. לאחר החזרת התוצאות מ-Metascape, עבור אל http://www.bioinformatics.com.cn/, בחר מונח כלים | העשרה GO, הדבק את מונחי GO מהתוצאות ולחץ על שלח כדי ליצור תרשימי בועות. הצג באופן חזותי את 10 מונחי GO המובילים על-ידי מיונם על סמך ערך P.
    3. מיין את מסלולי KEGG על סמך ערך ה-P מתוצאות הניתוח של Metascape. עבור לאותו אתר מיקרוביולוגיה (http://www.bioinformatics.com.cn/), בחר העשרת מסלול KEGG, הדבק את 10 מסלולי KEGG המובילים שנבחרו ולחץ על שלח כדי להמחיש את דיאגרמות הבועות של KEGG.

5. ניתוח סטטיסטי

  1. אם הנתונים עוקבים אחר התפלגות נורמלית והשונות הומוגנית, השתמש ב-ANOVA חד-כיווני. אם השונות אינה הומוגנית, השתמש במבחן T3 של דאנט או במבחן t מדגם בלתי תלוי.
  2. עבור נתונים שאינם עוקבים אחר התפלגות נורמלית, השתמש במבחן Rank-Sum משיטות לא פרמטריות.
  3. קחו בחשבון את P < 0.05 מובהקות סטטיסטית.

תוצאות

שיפור בגלוקוז בדם, בתפקודי כבד וכליות והפרעות במטבוליזם של שומנים בעכברי DKD
לאחר 8 שבועות של מתן החיסון, מינונים שונים של YHT הפחיתו באופן משמעותי את רמות הגלוקוז האקראי בדם, 24 שעות של UTP, Scr ו-BUN, שיפרו את תפקוד הכליות (איור 1A-D); העלה את רמת ה-ALB; הפחיתו את רמות ה- ALT וה- AST; תפקוד כבד משופר (איור 1E-G); הפחיתו את רמות ה-TC וה-TG; ושיפר את ויסות חילוף החומרים של השומנים (איור 1H,I). התוצאות לעיל הצביעו על כך של-YHT יש השפעות מגנות על הגלוקוז בדם, תפקוד הכבד והכליות וויסות השומנים.

שיפור הפגיעה ההיסטופתולוגית בכליות בעכברי DKD
כדי לבחון אם YHT יכול לשפר את הפגיעה בכליות בעכברי DKD, נבדק היקף הפגיעה הפתולוגית ברקמות הכליה באמצעות צביעת H&E, PAS ומאסון, כמו גם IHC. צביעת H&E ו-PAS חשפה ניוון גלומרולרי, התרחבות של אזור הטוניקה אלבוגינאה, נפיחות וניתוק של תאי אפיתל צינוריים, חדירת תאים דלקתיים אינטרסטיציאליים ושקיעת גליקוגן גלומרולרית ברורה בקבוצת MOD (איור 2A,B). צביעת מאסון הראתה עלייה משמעותית בסיבי קולגן כחולים בכליות של קבוצת MOD בהשוואה לקבוצת CON (איור 2C,D). IHC הראה שאחוזי האזורים החיוביים ל-COI-I ו-α-SMA היו גבוהים משמעותית בקבוצת MOD מאשר בקבוצת CON (איור 2E-G). לעומת זאת, לאחר השימוש ב-YHT ו-POS, הוקלו משמעותית אטרופיה גלומרולרית, הרחבת האזור הקשורים, נפיחות ונשירה של תאי אפיתל צינוריים, מידת חדירת תאים דלקתיים אינטרסטיציאליים ושקיעת גליקוגן גלומרולרי; שטח סיבי הקולגן הכחולים הצטמצם משמעותית; ואחוזי האזורים החיוביים ל-COI-I ו-α-SMA ירדו משמעותית. התוצאות לעיל הצביעו על כך ש-YHT יכול להחליש פגיעה פתולוגית כלייתית ופיברוזיס כלייתי בעכברי DKD.

הנחתה של פגיעה בפודוציטים בעכברי DKD
הנזק לתאי כף הרגל בעכברי DKD נצפה על ידי IHC, PCR ו-WB. תוצאות IHC הראו כי רמות הביטוי של חלבוני הסמן התפקודי של תאי כף הרגל, CD2AP ו-WT-1, ירדו משמעותית בקבוצת MOD בהשוואה לקבוצת CON, מה שמצביע על כך שתאי כף הרגל הכלייתית נפגעו. טיפול YHT העלה את רמות הביטוי של CD2AP ו-WT-1 והפחית את הנזק לתאי כף הרגל (איור 3A-C). תוצאות PCR ו-WB הראו כי רמות ביטוי ה-mRNA והחלבון היחסיות של חלבוני הסמן התפקודי של תאי כף הרגל, CD2AP ו-WT-1, ירדו באופן משמעותי בקבוצת ה-MOD בהשוואה לקבוצת CON, ורמות ה-mRNA וביטוי החלבון היחסיות של CD2AP ו-WT-1 עלו באופן משמעותי לאחר הטיפול ב-YHT (איור 3D-H). התוצאות לעיל הצביעו על כך ש-YHT יכול להחליש את הפגיעה בפודוציטים בעכברי DKD.

הבהרת המטרות הפוטנציאליות ומסלולי האיתות הקשורים להשפעות של YHT על DKD באמצעות פרמקולוגיה ברשת
החומרים הפעילים של YHT (291) נבדקו באמצעות מסדי נתונים TCMSP ו-BATMAN-TCM, מתוכם 39 חומרים פעילים עמדו בקריטריונים של OB ≥ 30% ו-DL ≥ 0.18. החומרים הפעילים נערכו חיפושים במסד הנתונים כדי לזהות את המטרות שלהם, ולאחר מיזוג ומחיקה של ערכים כפולים, התקבלו בסך הכל 303 מטרות (איור 4A). לאחר מיזוג התוצאות של חמישה מאגרי מידע, כולל GeneCards, OMIM, TTD, Drugbank ו-DisGeNET, והסרת ערכים כפולים, הושגו לבסוף 1,867 מטרות הקשורות ל-DKD. לאחר מכן, http://www.bioinformatics.com.cn/ שימש כדי לחתוך את החומרים הפעילים של YHT המסוננים עם מטרות DKD, וכתוצאה מכך 84 מטרות מצטלבות (איור 4B). 84 המטרות הללו יובאו לתוכנת Cytoscape כדי לצייר דיאגרמת רשת PPI, וזוהו מטרות מפתח פוטנציאליות לטיפול YHT ב-DKD, כולל AKT, IL-1 β, CASP3, APOE ו-JUN (איור 4C). ניתוח העשרה פונקציונלית של GO הניב בסך הכל 1,246 פריטים, מה שמצביע על כך ש-YHT עשוי להפעיל השפעות טיפוליות על DKD על ידי ויסות תהליכים ביולוגיים כגון תגובה להורמונים, ותפקודים מולקולריים כולל פעילות הומודימריזציה של חלבונים ופעילות אוקסידורדוקטאז, כמו גם רכיבים תאיים כגון רפסודות ממברנה ומיקרו-דומיינים של ממברנה (איור 4D). בסך הכל התקבלו 263 תוצאות העשרה של KEGG, בעיקר במסלול האיתות AGE-RAGE במתחמי סוכרת, מחלת כבד אלכוהולית, מסלול שומנים וטרשת עורקים. בהתבסס על ערך P, 10 התוצאות המובילות נבחרו כדי לצייר תרשים בועות ויזואליזציה של KEGG (איור 4E). מסלול האיתות AGE-RAGE מועשר מאוד בקומפלקסים סוכרתיים, ומטרות ליבה מרובות ב-PPI, כגון PI3K, AKT ו-IL-1β, מועשרות במסלול זה. לכן, מסלול איתות זה נבחר לאימות לאחר מכן.

הנחתה של פגיעה בפודוציטים על ידי עיכוב מסלול האיתות PI3K/AKT/NF-κB
רמות הביטוי של גנים וחלבונים הקשורים למסלול האיתות PI3K/AKT/NF-κB נבדקו עוד על ידי PCR ו-WB. תוצאות ה-PCR הראו שרמות ביטוי ה-mRNA היחסיות של Pi3k, Akt, Nf-κb ו-Il-1β בקבוצת MOD היו גבוהות משמעותית בהשוואה לקבוצת ה-CON וירדו משמעותית לאחר מתן YHT (איור 5A-D). תוצאות WB הראו שרמות החלבון היחסיות של P-PI3K, P-AKT, P-NF-κB ו-IL-1β היו גבוהות באופן משמעותי גם בקבוצת MOD בהשוואה לקבוצת CON, בעוד שהן ירדו באופן משמעותי לאחר מתן YHT (איור 5E-I). תוצאות אלה הציעו עוד כי YHT יכול לעכב את מסלול האיתות PI3K/AKT/NF-κB על ידי הנחתת פגיעה בפודוציטים בעכברי DKD.

figure-results-1
איור 1: שיפור בגלוקוז בדם, בתפקודי הכבד והכליות, והפרעות במטבוליזם של שומנים בעכברי DKD. השפעות של YHT על (A) גלוקוז אקראי בדם; (B-D) תפקוד כלייתי, כולל חלבון שתן 24 שעות, קריאטינין בדם וחנקן אוריאה; (E-G) תפקוד הכבד, כולל אלבומין בסרום, אלנין אמינוטרנספראז ואספרטט אמינוטרנספראז; ו-(H,I) ויסות חילוף החומרים של השומנים, כולל כולסטרול כולל וטריגליצרידים. הנתונים מבוטאים כממוצע ± סטיות תקן של שישה מדגמים בלתי תלויים, בהשוואה לקבוצה הריקה, *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ובהשוואה לקבוצת המודל, #p < 0.05, ##p < 0.01, ###p < 0.001, הסימונים הסטטיסטיים הללו משמשים באופן עקבי בכל האיורים. קיצורים: YHT = yinhuo Tang; DKD = מחלת כליות סוכרתית; ALB = אלבומין; ALT = אלנין אמינוטרנספראז; AST = אספרטט אמינוטרנספראז; TC = כולסטרול כולל; TG = טריגליצרידים; CON = קבוצת ביקורת; MOD = קבוצת מודלים; POS = valsartan קבוצת ביקורת חיובית; YH-L = קבוצת מינון נמוך של YHT; YH-M = קבוצת המינון הבינוני של YHT; YH-H = קבוצת מינון גבוה של YHT. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: שיפור הנזק ההיסטופתולוגי של הכליות בעכברי DKD. (A,B) היסטולוגיה כלייתית על ידי צביעת H&E ו-PAS (סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר); (ג) צביעת מאסון כדי לצפות במידת הפיברוזיס הכלייתי ו-(ד) ניתוח כמותי למחצה באמצעות תוכנת ImageJ; (א-ג) ניתוח חצי כמותי של רמות הביטוי היחסיות של COI-I ו-α-SMA ברקמות הכליה באמצעות תוכנות IHC ו-ImageJ (סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר). קיצורים: YHT = yinhuo Tang; DKD = מחלת כליות סוכרתית; H&E = כתם המטוקסילין ואאוזין; PAS = כתם חומצה-שיף תקופתי; COI-I = קולגן מסוג I; α-SMA = α-שריר חלק אקטין; CON = קבוצת ביקורת; MOD = קבוצת מודלים; POS = valsartan קבוצת ביקורת חיובית; YH-L = קבוצת מינון נמוך של YHT; YH-M = קבוצת המינון הבינוני של YHT; YH-H = קבוצת מינון גבוה של YHT. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: הנחתה של פגיעה בפודוציטים בעכברי DKD. (A-C) IHC זיהה את רמות הביטוי היחסיות של CD2AP ו-WT-1 ברקמות כליה (סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר); (ד,ה) PCR זיהה את ביטוי ה-mRNA היחסי של CD2AP ו-WT-1 ברקמות הכליה, וניתוח כמותי למחצה בוצע באמצעות תוכנת Image J; (פ-ח) WB זיהה את רמות ביטוי החלבון היחסיות של CD2AP ו-WT-1 ברקמות הכליה, וניתוח כמותי למחצה בוצע באמצעות תוכנת ImageJ. ניתוח כמותי באמצעות תוכנת Image J. קיצורים: YHT = yinhuo Tang; DKD = מחלת כליות סוכרתית; IHC = אימונוהיסטוכימיה; WB = כתמים מערביים; CD2AP = חלבון הקשור ל-CD2; WT-1 = גידול וילמס 1; CON = קבוצת ביקורת; MOD = קבוצת מודלים; POS = valsartan קבוצת ביקורת חיובית; YH-L = קבוצת מינון נמוך של YHT; YH-M = קבוצת המינון הבינוני של YHT; YH-H = קבוצת מינון גבוה של YHT. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4
איור 4: ניתוח פרמקולוגי רשת של YHT לטיפול ב-DKD. (A) תרשים יעד של מחלת החומר הפעיל של YHT לטיפול ב-DKD. (B) דיאגרמת ון של מטרות מצטלבות של YHT ו-DKD. צבע כתום מייצג את מספר המטרות הרלוונטיות ל-DKD; צבע ירוק מייצג את מספר המטרות הטיפוליות של החומרים הפעילים של YHT; והחלק המצטלב מייצג את מספר המטרות המצטלבות (מספר המטרות של YHT עבור DKD). (C) דיאגרמת רשת PPI של המטרות המצטלבות של YHT ו-DKD. (D) ניתוח העשרה של GO של 10 היעדים החשובים ביותר של YHT לטיפול ב-DKD. (E) ניתוח העשרה של KEGG של 10 היעדים החשובים ביותר לטיפול ב-YHT ב-DKD. קיצורים: YHT = yinhuo Tang; DKD = מחלת כליות סוכרתית; PPI = אינטראקציה בין חלבון לחלבון; GO = אונטולוגיה של גנים; KEGG = אנציקלופדיית קיוטו לגנים וגנומים; CON = קבוצת ביקורת; MOD = קבוצת מודלים; POS = valsartan קבוצת ביקורת חיובית; YH-L = קבוצת מינון נמוך של YHT; YH-M = קבוצת המינון הבינוני של YHT; YH-H = קבוצת מינון גבוה של YHT. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-5
איור 5: הנחתה של פגיעה בפודוציטים על ידי עיכוב מסלול האיתות PI3K/AKT/NF-κB. (א-ד) PCR כדי לזהות את ביטוי ה-mRNA היחסי של Pi3k, Akt, Nf-κb ו-Il-1β ברקמות הכליה. (ה-י) WB לאיתור רמות ביטוי החלבון היחסיות של P-PI3K, P-AKT, P-NF-κB ו-IL-1β ברקמות הכליה, וניתוח כמותי למחצה בוצע באמצעות תוכנת ImageJ. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה 1: ההרכב של יינהואו טאנג. אנא לחץ כאן להורדת טבלה זו.

טבלה 2: פרטים על פריימרים qRT-PCR. אנא לחץ כאן להורדת טבלה זו.

דיון

אחד השלבים הקריטיים בפרוטוקול זה הוא השימוש בפרמקולוגיה של רשת כדי לזהות את המרכיבים הפעילים של YHT ולחזות את האינטראקציות שלהם עם מטרות הקשורות ל-DKD. שלב זה כולל ניתוח נתונים ביולוגיים בקנה מידה גדול באמצעות כלים ביואינפורמטיים כגון מסדי נתונים (למשל, TCMSP, DrugBank ו-GeneCards) כדי למפות את המסלולים המולקולריים והרשתות הביולוגיות הפוטנציאליות המושפעות מ-YHT. לאחר תחזית זו בוצע אימות ניסיוני באמצעות מודלים של בעלי חיים של DKD, שם נבדקו ההשפעות המשוערות של YHT על מסלולים אלה. השילוב של תחזיות חישוביות עם נתונים הוא היבט מכריע בגישה שלנו, מכיוון שהוא משפר את מהימנות הממצאים שלנו ומגשר על הפער בין תחזיות תיאורטיות לתוצאות מעשיות. בנוסף, השימוש במודלים של בעלי חיים הוא צעד קריטי נוסף באימות ההשפעות הטיפוליות של YHT. DKD בבעלי חיים מחקה מקרוב את התקדמות המחלה האנושית, ומאפשר הערכה יעילה של השפעת YHT הן על נזק גלומרולרי והן על פיברוזיס כלייתי. ניטור קפדני של סמני תפקוד כליות כגון Scr, BUN ופרוטאינוריה, לצד הערכות היסטופתולוגיות, חיוני להערכת היעילות הטיפולית של YHT.

בעוד שהפרוטוקול שלנו משלב שיטות חישוביות וניסיוניות חזקות, ישנן מספר מגבלות. ראשית, גישת פרמקולוגיה של הרשת מסתמכת במידה רבה על נתונים זמינים במאגרי מידע ציבוריים, וייתכנו הטיות או מידע חסר לגבי רכיבים מסוימים של מסלולים הקשורים ל-YHT או DKD. למרות שהצלבנו מסדי נתונים מרובים כדי לצמצם בעיה זו, ייתכן שעדיין יתעלמו מאינטראקציות רלוונטיות מסוימות. שנית, מחקר זה חקר רק את המנגנון של YHT בהפחתת פגיעה בפודוציטים ברמת חיות הניסוי, ויש צורך בניסויים תאיים ומחקרים קליניים במדגם גדול כדי לאמת את תוצאות הניסוי. לבסוף, פרמקולוגיה ברשת הראתה כי הטיפול ב-DKD עם YHT היה קשור גם למחלת כבד אלכוהולית, חילוף חומרים של שומנים וטרשת עורקים, וויסות ליפוליזה באדיפוציטים. מחקר זה רק בדק אם אפנון מסלול האיתות PI3K/AKT/NF-κB על ידי YHT יכול לעכב את התקדמות ה-DKD; התוצאות זקוקות למחקר נוסף.

מסלול האיתות PI3K/AKT/NF-κB הוא מסלול איתות תוך-תאי חשוב המעורב בוויסות של מגוון תהליכים ביולוגיים כגון צמיחת תאים, התפשטות, הישרדות ותגובות דלקתיות22. מחקרים הראו כי הוא ממלא תפקיד חשוב בהתקדמות פציעת פדיקולוציטים 23,24. NF-κB הוא מרכיב חשוב במורד הזרם של מסלול PI3K/Akt ומשתתף בהעברת מגוון אותות תוך-תאיים ובביטוי של גנים מרובים. עיכוב מסלול האיתות PI3K/AKT מוביל לפירוק החלבון המעכב NF-κB IκB, אשר בתורו מוביל לזרחון של NF-κB וכניסתו לגרעין, ולייצור מגוון כימוקינים וגורמים דלקתיים, מה שמוביל לפגיעה בפודוציטים ופיברוזיס אינטרסטיציאליכלייתי 25. כמה מחקרים הראו כי עיכוב הפעלת מסלול האיתות PI3K/AKT/NF-κB יכול לדכא ביעילות תגובות דלקתיות ופיברוזיס כלייתי, ובכך לעכב את התקדמות DKD26.

מחקרים הראו כי הפרעות בחילוף החומרים של השומנים ממלאות תפקיד משמעותי בהופעה ובהתקדמות של DKD27,28. חולי DKD מראים לעתים קרובות חילוף חומרים לא תקין של שומנים בשומן, כולל רמות גבוהות של LDL, TG והצטברות חומצות שומן. חריגות אלו קשורות קשר הדוק לשינויים פתולוגיים כגון גלומרולוסקלרוזיס ופיברוזיס טובולואינטרסטיציאלי29,30. מחקרים מצביעים על כך שהפרעות במטבוליזם של שומנים יכולות לקדם התקדמות DKD דרך מסלולי איתות מרובים31,32. ראשית, מסלול האיתות mTOR הוא מסלול מפתח בוויסות חילוף החומרים של השומנים; הפעלת היתר שלו מובילה לפגיעה בפודוציטים ולפרוטאינוריה33,34. סביבה עתירת שומן יכולה לקדם הצטברות שומנים דרך ציר PI3K/AKT/mTOR, לגרום לאפופטוזיס של פודוציטים ובסופו של דבר להחמיר את ההידרדרות בתפקוד הכליות 35,36,37. שנית, חלבון קינאז המופעל על ידי AMP (AMPK), מווסת קריטי של חילוף החומרים של אנרגיה תאית, מגן על הכליה מפני הפרעות מטבוליות על ידי קידום חמצון חומצות שומן, עיכוב סינתזת שומנים והפחתת ליפוטוקסיות 38,39,40. השבתת AMPK נחשבת למנגנון חשוב בהתקדמות DKD. מפעילי AMPK, כגון מטפורמין, הראו השפעות רנו-פרוטקטיביות משמעותיות ומייצגים יעד טיפולי מבטיח ל-DKD41.

לבסוף, מחקרים הראו כי קולטנים α/γ המופעלים על ידי פרוקסיזום (PPARα/γ) ממלאים תפקיד חיוני בוויסות חילוף החומרים של השומנים ו-DKD42,43. הפעלת PPARα מקדמת חמצון חומצות שומן ומפחיתה הצטברות שומנים בכליות, בעוד PPARγ משפר את הרגישות לאינסולין ומפעיל השפעות אנטי דלקתיות44,45. אגוניסטים של PPAR, כגון פיברטים, הראו יתרונות קליניים פוטנציאליים בהפחתת פרוטאינוריה בחולי DKD46. לסיכום, הפרעות במטבוליזם של שומנים משפיעות על ההתקדמות הפתולוגית של DKD דרך מסלולי איתות מרובים. האינטראקציות בין המסלולים הללו יוצרות רשת פתולוגית מורכבת. התמקדות במטבוליזם של שומנים יכולה לספק אסטרטגיות טיפוליות חדשות ל-DKD.

משפחת הקספאז (CASP), משפחה של פרוטאזות ספציפיות לציסטאין, היא קבוצה של פרוטאזות הנמצאות באופן נרחב בתאים ומעורבות בעיקר בוויסות אפופטוזיס ותגובות דלקתיות47,48. חברים במשפחת CASP חולקים קווי דמיון מבניים ובדרך כלל קיימים כזימוגנים, המופעלים באמצעות מפל של תגובות, ובכך מעוררים אפופטוזיס, פירופטוזיס ותהליכי מוות תאי מתוכנתים אחרים49. ביניהם, CASP3, חבר במשפחת הקספאז (CASP) עם מבנה משומר הקיים בדרך כלל כזימוגן, הוא פרוטאז מרכזי בשלב הביצוע של אפופטוזיס המזרז את המחשוף של חלבונים תאיים ספציפיים, ובכך ממלא תפקיד קריטי בוויסות צמיחת תאים תקינה ושמירה על הומאוסטזיס פנימי50,51. Caspase-8 פועל כיוזם של מפלים אפופטוטיים ומשתתף באפנון תגובות דלקתיות באמצעות הפעלת NPK, המהווה גורם מפתח בוויסות הצמיחה התאית. Caspase-8 פועל כיוזם של מפל האפופטוטיקה ומשתתף גם בוויסות התגובה הדלקתית על ידי הפעלת שלפוחיות דלקתיות כגון NLRP1 ו-NLRP3, ובכך מפעיל פירופטוזיס תאי52. בהתבסס על התפקיד החשוב של מסלול האיתות CASP בתיווך אפופטוזיס ופירופטוזיס בתאים עם רגליים, יש צורך בחקירות מעמיקות נוספות של הקשר בין YHT, CASP3/8, תאים עם רגליים ו-DKD בעתיד.

בהשוואה לגישות גילוי תרופות קונבנציונליות המדגישות בדרך כלל מנגנונים מוגדרים היטב של מטרה אחת לבהירות רגולטורית ויכולת חיזוי, האסטרטגיה מבוססת הפרמקולוגיה של הרשת שלנו מאפשרת חקירה שיטתית של האינטראקציות מרובות המטרות הטבועות בניסוחים של TCM כמו YHT. בעוד שמורכבות זו משקפת את האופי ההוליסטי של הרפואה הסינית המסורתית ואת ההיקף הטיפולי הפוטנציאלי שלה, היא גם מדגישה את האתגר של השפעות לא מכוונות מחוץ למטרה, הדורשות תיקוף ופרשנות קפדניים. על ידי בחינת האופי הרב-מטרתי והרב-מסלולי, אנו מספקים הבנה הוליסטית יותר של ההשפעות הטיפוליות שלו בטיפול ב-DKD. יתר על כן, פרמקולוגיה ברשת מאפשרת חיזוי של אינטראקציות פוטנציאליות עם תרופות ותופעות לוואי, דבר חיוני להבטחת הבטיחות והיעילות של טיפולים מרובי רכיבים. הטיפולים הנוכחיים ב-DKD מתמקדים בעיקר בניהול תסמינים או האטת התקדמות במקום לטפל במנגנוני המחלה הבסיסיים. על ידי שילוב כלים ביואינפורמטיים מודרניים עם אימות ניסיוני, מחקר זה מדגיש את החשיבות של ביולוגיה מערכתית בשיפור היעילות של הרפואה הסינית המסורתית, במיוחד במחלות כרוניות כמו DKD.

במבט קדימה, טכניקה זו טומנת בחובה הבטחה משמעותית להרחבת היקף הפרמקולוגיה של הרשת במחקר הרפואה הסינית המסורתית, במיוחד בטיפול במחלות מורכבות כמו DKD. ניתן ליישם את הגישה שלנו כדי לחקור פורמולות אחרות של הרפואה הסינית המסורתית או צמחי מרפא בודדים עבור הפוטנציאל הטיפולי שלהם בטיפול במחלות כליות, מחלות לב וכלי דם והפרעות מטבוליות. יתר על כן, ניתן להרחיב מתודולוגיה זו כדי לחקור ייעוד מחדש של תרופות על ידי זיהוי שימושים חדשים לתרופות קיימות בטיפול ב-DKD. יישום פוטנציאלי נוסף של הגישה שלנו טמון ברפואה מותאמת אישית. על ידי שילוב נתונים ספציפיים למטופל, ניתן להשתמש בפרמקולוגיה של הרשת כדי להתאים אסטרטגיות טיפול ברפואה סינית מסורתית המבוססות על פרופילים מולקולריים אינדיבידואליים, לשפר את יעילות הטיפול ולמזער תופעות לוואי.

גילויים

למחברים אין ניגודי אינטרסים להצהיר עליהם.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן למדעי הטבע של מחוז ג'ילין (מס' 20210101201JC).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
אתנול נטול מיםסין National Pharmaceutical Group Chemical Reagent Co., Ltd10009218
מרכז ניסויים בבעלי חייםאוניברסיטת צ'אנגצ'ון לרפואה סינית מסורתיתSYXK (JI) 2023-0014
מסד נתונים של BATMAN-TCMhttp://bionet.ncpsb.org/batmantcm---
ערכת בדיקת חלבון BCASolarbioPC0020
חסימת מאגרBeyotimeP0023B
סירי קרמיקהMideaMD-DG30E103
מערכת הדמיה כימילומינסנציהHangzhou Shenhua Technology Co., LtdSH-523
ChloroformChina National Pharmaceutical Group Chemical Reagent Co., Ltd10006818
Cytoscape 3.8.0 תוכנה----
ערכת ריאגנט DABServicebioG1212-200T
db/db עכבריםנאנג'ינג ג'אנק חברה ביולוגית בע"מSCXK (Su) 2020-009
ECL פתרון מצעזיקהKF8003
סיר אמבט מים חשמלי בטמפרטורה קבועהFisaff Instrument (Hebei) Co., LtdDK-20000-IIIL
אלקטרופורזה מכשיר ספק כוחבייג'ינג Longfang טכנולוגיה ושות', בע"מLF-600S
זכוכית הומוגנייזרSolarbioYA0852
זכוכית שקופיתNantong Meiweide מדעי החיים ושות', בע"מPC2-301
עז אנטי-ארנב IgG HRP (נוגדן משני)AffinityS00011:3000 עבור IHC, 1:10000 עבור WB
HematoxylinWuhan Lingsi Biotechnology Co., LtdG1140
צנטריפוגות קירור במהירות גבוהה הונאן קצ'נג ציוד מכשירים ושות', בע"מH1-16KR
HiScript II Q RT SuperMix עבור qPCR (+ מגב gDNA)VAZYMER223-01
שייקר אופקיג'יאנגסו היימן Qilin Bell Instrument Manufacturing Co., LtdTS-1
מערכת הדמיהNikonNikon DS-U3
מערבל חימום מגנטי דיגיטלי אינטליגנטיHangzhou Miou Instrument Co., בע"מTP-350E +
Isopropanolסין לאומית פרמצבטיקה קבוצה כימית ריאגנט ושות', בע"מ80109218
סמן (20-120KD)GenScriptM00521
Masson צביעת ערכתBASOBA4079B
גזה רפואיתJianerkang רפואי-
Metascape פלטפורמתhttp://metascape.org/gp/index.html--
מתנולתרמו67-56-1
אתר מיקרוביולוגיהhttp://www.bioinformatics.com.cn/--
מיקרוסקופNikonECLIPSE Ci
תנור מיקרוגלGalanz מיקרוגל מכשיר חשמלי ושות', בע"מP70D20TL-P4
מטחנת רקמות מרובת דגימהשנחאי Jingxin תעשייתי פיתוח ושות', בע"מTissuelyser-24L
רב תכליתי אנליטי איזון אלקטרוניChangzhou מזל ציוד אלקטרוני משחק חברהFA1204
שרף ניטרליווהאן Lingsi ביוטכנולוגיה ושות', בע"מG8590
נורמלי עז סרוםSolarbioSL038
תנורשנחאי Huitai מכשיר ייצור ושות', בע"מDHG-9140A
צנטריפוגהדקלים ווהאן לינגסי ביוטכנולוגיה ושות', בע"מD1008E
ערכת צביעה PASBASOBA4114B
פורס פתולוגישנחאי Leica Instrument Co., LtdRM2016
PBSSolarbioP1020
PCR מכשירהאנגג'ואו Miou Instrument Co., LtdPR-96
אקדח פיפטהDragonKE0003087/KA0056573
חוצץ דילול נוגדנים ראשוניBeyotimeP0023A
קומפלקס מעכבי חלבון פוספטאזMeilunbioMB12707-1
PVDF ממברנה (0.22 μ m)SolarbioISEQ00010
מדלל נוגדנים ראשוני/משני מהירSolarbioA1811
Rabbit anti-CD2APAffinityDF22981:200 עבור IHC, 1:1000 עבור WB
Rabbit anti-COI-IAffinityDF121491:200 עבור IHC, 1:1000 עבור WB
Rabbit anti-IL-1βAffinityAF51031:1000 עבור WB
Rabbit anti-P-AKTAffinityAF00161:1000 עבור WB
Rabbit anti-P-NF-Κ bAffinityAF32191:1000 עבור WB
Rabbit anti-P-PI3KAffinityAF32421:1000 עבור WB
Rabbit anti-WT-1AffinityDF63311:200 עבור IHC, 1:1000 עבור WB
Rabbit anti-α-SMAAffinityAF10321:200 עבור IHC, 1:1000 עבור WB
Rabbit anti-β-ActinAffinityAF70181:1000 עבור WB
מערכת PCR בזמן אמתABIQuantStudio 6
RIPA מאגר ליזהMeilunbioMA0151
ללא RNase ddH2OSolarbioR1600
מאגר דילול נוגדנים משניBeyotimeP0023D
זכוכית שקופיות וכיסויג'יאנגסו שיטאי ציוד ניסיוני ושות', בע"מ10212432C
SPSS 26.0 תוכנה----
אתר מאגר מחרוזות https://cn.string-db.org/--מכשיר
מים טהורים סופרZhiang Instrument (שנחאי) ושות', בע"מClever-S15
Taq Plus DNA פולימראזTIANGENET105-02
מסד נתונים TCMSP https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php---
מטחנת רקמותקיר יפהMB-96
TrizolAmbion15596-026
Tween 20סין National Pharmaceutical Group Chemical Reagent Co., Ltd30189328
ספקטרופוטומטר אולטרה מיקרו UV גלויHangzhou Miou Instrument Co., LtdND-100
מאגר חלבונים Uniprothttps://www.uniprot.org--מיקרוסקופ
אופטי זקוףNikonEclipse CI
ערכת בדיקת חלבון שתןנאנג'ינג Jiancheng מכון המחקר לביו-הנדסהC035-2
ליופילייזר ואקוםNingbo Xinzhi Biotechnology Co.A01-1-NA0959
טנק אלקטרופורזה אנכיבייג'ינג 61 מפעל מכשיריםDYCZ-24DN
מערבולת מערבלווהאן לינגסי ביוטכנולוגיה ושות', בע"מMX-F
מאגר חסימה מערביSolarbioSW3010
קסילןסין לאומית פרמצבטיקה קבוצה כימית ריאגנט ושות', בע"מ10023418
Yihongווהאן לינגסי ביוטכנולוגיה ושות', בע"מE8090

מקורות

  1. Naaman, S. C., Bakris, G. L. Diabetic nephropathy: Update on pillars of therapy slowing progression. Diabetes Care. 46 (9), 1574-1586 (2023).
  2. Glastras, S. J., Pollock, C. A. Targeted identification of risk and treatment of diabetic kidney disease. Nat Rev Nephrol. 20 (2), 75-76 (2024).
  3. Gregory, G. A., et al. Global incidence, prevalence, and mortality of type 1 diabetes in 2021 with projection to 2040: a modelling study. Lancet Diabetes Endocrinol. 10 (10), 741-760 (2022).
  4. Rao, B. V., Tan, S. H., Candasamy, M., Bhattamisra, S. K. Diabetic nephropathy: An update on pathogenesis and drug development. Diabetes Metab Syndr. 13 (1), 754-762 (2019).
  5. Guo, M., He, F., Zhang, C. Molecular therapeutics for diabetic kidney disease: An update. Int J Mol Sci. 25 (18), 10051(2024).
  6. Shen, S., et al. Advances in traditional Chinese medicine research in diabetic kidney disease treatment. Pharm Biol. 62 (1), 222-232 (2024).
  7. Han, C., et al. Yi-Shen-Hua-Shi granule ameliorates diabetic kidney disease by the "gut-kidney axis". J Ethnopharmacol. 10 (307), 116257(2023).
  8. Ma, X., et al. Advances in oxidative stress in pathogenesis of diabetic kidney disease and efficacy of TCM intervention. Ren Fail. 45 (1), 2146512(2023).
  9. Liu, M., et al. A systematic review on polysaccharides from Morinda officinalis How: Advances in the preparation, structural characterization and pharmacological activities. J Ethnopharmacol. 28 (328), 118090(2024).
  10. Zhang, X., et al. Network pharmacology-based identification of key pPharmacological mechanism of Shen-qi-di-huang decoction acting on uremia. Altern Ther Health Med. 30 (1), 44-50 (2024).
  11. Linlin, Z., et al. A multi-target and multi-channel mechanism of action for Jiawei Yinhuo Tang in the treatment of social communication disorders in autism: Network pharmacology and molecular docking studies. Evid Based Complement Alternat Med. 8 (2022), 4093138(2022).
  12. Husain, S. Role of podocyte in kidney disease. Front Biosci (Landmark Ed). 29 (7), 250(2024).
  13. Pavenstädt, H., Kriz, W., Kretzler, M. Cell biology of the glomerular podocyte. Physiol Rev. 83 (1), 253-307 (2003).
  14. Torban, E., et al. From podocyte biology to novel cures for glomerular disease. Kidney Int. 96 (4), 850-861 (2019).
  15. Yue, J. I., et al. Acupuncture improve proteinuria in diabetic kidney disease rats by inhibiting ferroptosis and epithelial-mesenchymal transition. Heliyon. 10 (13), e33675(2024).
  16. Liu, X. Q., et al. Wogonin protects glomerular podocytes by targeting Bcl-2-mediated autophagy and apoptosis in diabetic kidney disease. Acta Pharmacol Sin. 43 (1), 96-110 (2022).
  17. Nogales, C., et al. Network pharmacology: curing causal mechanisms instead of treating symptoms. Trends Pharmacol Sci. 43 (2), 136-150 (2022).
  18. Zhang, P., et al. Network pharmacology: towards the artificial intelligence-based precision traditional Chinese medicine. Brief Bioinform. 25 (1), bbad518(2023).
  19. Zhao, L., et al. Network pharmacology, a promising approach to reveal the pharmacology mechanism of Chinese medicine formula. J Ethnopharmacol. 12 (309), 116306(2023).
  20. Meek, R. L., et al. Glomerular cell death and inflammation with high-protein diet and diabetes. Nephrol Dial Transplant. 28 (7), 1711-1720 (2013).
  21. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Paraffin embedding tissue samples for sectioning. CSH Protoc. 2008, (2008).
  22. Yusuf, J. A., et al. Molecular mechanism underlying stress response and adaptation. Prog Brain Res. 291, 81-108 (2025).
  23. Yu, M., et al. Baicalein increases cisplatin sensitivity of A549 lung adenocarcinoma cells via PI3K/Akt/NF-κB pathway. Biomed Pharmacother. 12 (90), 677-685 (2017).
  24. Chen, H., et al. The PI3K/AKT pathway in the pathogenesis of prostate cancer. Front Biosci (Landmark Ed). 21 (5), 1084-1091 (2016).
  25. Wang, J., et al. Critical roles of PI3K/Akt/NF-κB survival axis in angiotensin II-induced podocyte injury. Mol Med Rep. 20 (6), 5134-5144 (2019).
  26. Zhang, S. J., et al. Integrated network pharmacology analysis and experimental validation to elucidate the mechanism of acteoside in treating diabetic kidney disease. Drug Des Devel Ther. 12 (18), 1439-1457 (2024).
  27. Rong, J., et al. Mechanisms of hepatic and renal injury in lipid metabolism disorders in metabolic syndrome. Int J Biol Sci. 20 (12), 4783-4798 (2024).
  28. Bi, Z., et al. Development of a clinical prediction model for diabetic kidney disease with glucose and lipid metabolism disorders based on machine learning and bioinformatics technology. Eur Rev Med Pharmacol Sci. 28 (3), 863-878 (2024).
  29. Wei, L., Gao, J., Wang, L., Tao, Q., Tu, C. Multi-omics analysis reveals the potential pathogenesis and therapeutic targets of diabetic kidney disease. Hum Mol Genet. 33 (2), 122-137 (2024).
  30. Vartak, T., Godson, C., Brennan, E. Therapeutic potential of pro-resolving mediators in diabetic kidney disease. Adv Drug Deliv Rev. 178 (4), 113965(2021).
  31. Liu, S., et al. Renal tubule ectopic lipid deposition in diabetic kidney disease rat model and in vitro mechanism of leptin intervention. J Physiol Biochem. 78 (2), 389-399 (2022).
  32. Tang, C., et al. Fenofibrate attenuates renal tubular cell apoptosis by up-regulating MCAD in diabetic kidney disease. Drug Des Devel Ther. 17 (2), 1503-1514 (2023).
  33. Lu, H. T., et al. Unraveling DDIT4 in the VDR-mTOR pathway: a novel target for drug discovery in diabetic kidney disease. Front Pharmacol. 15 (10), 1344113(2024).
  34. Tang, G., et al. Clinical efficacies, underlying mechanisms and molecular targets of Chinese medicines for diabetic nephropathy treatment and management. Acta Pharm Sin B. 11 (9), 2749-2767 (2021).
  35. Zhang, P., et al. Huaiqihuang (HQH) protects podocytes from high glucose-induced apoptosis and inflammation response by regulating PI3K/AKT/mTOR pathway. Arch Physiol Biochem. 11 (27), 1-8 (2024).
  36. Zhaoan, G., et al. Qizhi Jiangtang capsule activates podocyte autophagy in diabetic kidney disease by inhibiting phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B/mammalian target of rapamycin pathways. J Tradit Chin Med. 43 (4), 667-675 (2023).
  37. Jin, D., et al. Jiedu Tongluo Baoshen formula enhances podocyte autophagy and reduces proteinuria in diabetic kidney disease by inhibiting PI3K/Akt/mTOR signaling pathway. J Ethnopharmacol. 293 (3), 115246(2022).
  38. Zhou, Y., et al. Metrnl alleviates lipid accumulation by modulating mitochondrial homeostasis in diabetic nephropathy. Diabetes. 72 (5), 611-626 (2023).
  39. Shao, M., et al. Canagliflozin regulates metabolic reprogramming in diabetic kidney disease by inducing fasting-like and aestivation-like metabolic patterns. Diabetologia. 67 (4), 738-754 (2024).
  40. Tian, S., et al. GLP-1 receptor agonists alleviate diabetic kidney injury via β-klotho-mediated ferroptosis inhibition. Adv Sci (Weinh). 12 (4), e2409781(2024).
  41. Song, Y., et al. Identification of circular RNAs and functional competing endogenous RNA networks in human proximal tubular epithelial cells treated with sodium-glucose cotransporter 2 inhibitor dapagliflozin in diabetic kidney disease. Bioengineered. 13 (2), 3911-3929 (2022).
  42. Fan, Y., et al. Identification of potential key lipid metabolism-related genes involved in tubular injury in diabetic kidney disease by bioinformatics analysis. Acta Diabetol. 61 (8), 1053-1068 (2024).
  43. Pan, S., et al. A comprehensive weighted gene co-expression network analysis uncovers potential targets in diabetic kidney disease. J Transl Int Med. 10 (4), 359-368 (2023).
  44. Chen, Y., et al. Curcumin targets CXCL16-mediated podocyte injury and lipid accumulation in diabetic kidney disease treatment. Arch Pharm Res. 47 (12), 924-939 (2024).
  45. Liu, K., et al. Design, synthesis, and biological evaluation of a novel dual peroxisome proliferator-activated receptor alpha/delta agonist for the treatment of diabetic kidney disease through anti-inflammatory mechanisms. Eur J Med Chem. 218 (5), 113388(2021).
  46. Kitada, M., Kanasaki, K., Koya, D. Clinical therapeutic strategies for early stage of diabetic kidney disease. World J Diabetes. 5 (3), 342-356 (2014).
  47. Galluzzi, L., Kepp, O., Kroemer, G. Caspase-3 and prostaglandins signal for tumor regrowth in cancer therapy. Oncogene. 31 (23), 2805-2808 (2012).
  48. Li, L., Wang, S., Zhou, W. Balance cell spoptosis and pyroptosis of caspase-3-activating chemotherapy for better antitumor therapy. Cancers (Basel). 15 (1), 26(2022).
  49. Fan, T. J., et al. Caspase family proteases and apoptosis. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 37 (11), 719-727 (2005).
  50. Asadi, M., et al. Caspase-3: Structure, function, and biotechnological aspects. Biotechnol Appl Biochem. 69 (4), 1633-1645 (2022).
  51. Eskandari, E., Eaves, C. J. Paradoxical roles of caspase-3 in regulating cell survival, proliferation, and tumorigenesis. J Cell Biol. 221 (6), e202201159(2022).
  52. Pang, J., Vince, J. E. The role of caspase-8 in inflammatory signalling and pyroptotic cell death. Semin Immunol. 42 (70), 101832(2023).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

CD2APWT 1PI3K AKT NF B
הסרטון יגיע בקרוב

מאמרים קשורים