מאמר שיטה

בידוד מהיר של שלפוחיות חוץ-תאיות שמקורן בחלב אם

805 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/67954

⸱

14 בנובמבר 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatrics/Division of Neonatology and Center of Glial Biology in Medicine, University of Alabama at Birmingham School of Medicine, 2School of Health Professions/Department of Clinical and Diagnostic Sciences, University of Alabama at Birmingham, 3Department of Biological Sciences, Alabama State University, 4Department of Pediatric Surgery, Washington University-St. Louis

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה נועד לזרז ולאפשר בידוד יעיל של שלפוחיות חוץ-תאיות מחלב אם אנושי בטוהר גבוה.

תקציר

שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs), חלקיקים בגודל ננומטר בגודל של כ-20-1000 ננומטר, מושכות במהירות תשומת לב בשל הפוטנציאל הטיפולי שלהן. באופן ספציפי, שלפוחיות חוץ-תאיות שמקורן בחלב אם אנושי (HBMDEVs) הוכחו כמעניקות הגנה במודלים ניסיוניים של דלקת מעיים נמקית, מחלת מעיים הפוגעת בעיקר בפגים, וכתוצאה מכך תמותה של עד 50%. עם זאת, טכניקות בידוד שלפוחית חוץ-תאיות מסורתיות, כגון אולטרה-צנטריפוגה דיפרנציאלית, כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל וכו', גוזלות זמן או דורשות מכשור מיוחד, שאף אחד מהם אינו מעשי בסביבה הקלינית. לפיכך, יש צורך בשיטת בידוד פשוטה שתאפשר מתן תגובתי מהיר של HBMDEVs לחולים. מוצע כאן שילוב של צנטריפוגה של חלב אם אנושי להסרת שומן ופסולת תאית, יחד עם אולטרה-סינון מהיר של החלב הרזה שנותר המייצר תפוקה גבוהה ושלפוחיות חוץ-תאיות פונקציונליות. שימוש בטכניקה זו עשוי לאפשר שימוש ב-HBMDEVs כאופציה טיפולית מעשית במסגרת הקלינית.

מבוא

שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) הן ננו-חלקיקים בכל מקום בגודל של כ-20-1000 ננומטר, או דרך מסלולים אנדוזומיים (כאשר גופים מיקרו-שלפוחיתיים מתמזגים עם קרום הפלזמה, מה שמקל על שחרור מטען תאי לחלל החוץ-תאי) או מסלולי קרום פלזמה (כלומר, ניצנים). EVs מכילים מטען תאי מארח כגון שומנים, חלבונים, חומצות גרעין, מטבוליטים שונים ותכנים אחרים בהתאם למקורם. יתר על כן, EVs חשובים בתקשורת בין-תאית, אנגיוגנזה, דיכוי חיסוני, שיפוץ מיקרו-סביבה של גידול, התקדמות סרטן וכו'.1,2,3,4. יש לציין כי חלב אם אנושי (HBM) עשיר ב-EV ונגיש בקלות מאמהות מניקות5. לאחרונה, EVs שמקורם בחלב אם אנושי (HBMDEVs) זוכים לתשומת לב כווקטורים טיפוליים לטיפול במחלות 1,2. יילודים פגים או במשקל לידה נמוך רגישים למספר זיהומים, כולל דלקת מעיים נמקית. דלקת מעי נמקית, המאופיינת בנמק איליאלי או מעי גס, נעה בין דלקת מעיים קלה לאי ספיקת איברים רב-מערכתית עם שיעור תמותת תינוקות גבוה עד 50%6. טיפול מקדים ב-EVs שמקורם בחלב אם מספיק כדי להגן מפני דלקת מעיים במודלים ניסיוניים של NEC במבחנה וב-in vivo 2,7. לפיכך, שימוש ב-HBMDEVs עשוי להיות אופציה בת קיימא לטיפול ב-NEC במסגרות קליניות.

למרות ההבטחה הטיפולית של HBMDEVs, ישנן מגבלות ידועות בשימוש בטכניקות הבידוד הנוכחיות בכך שהן גוזלות זמן או דורשות ציוד מיוחד, שאף אחת מהן אינה מעשית באופן אוניברסלי לסביבה הקלינית. "תקן הזהב" של בידוד EV כולל מספר סבבים של אולטרה-צנטריפוגה דיפרנציאלית, שלמרות שהיא מייצרת תפוקה משביעת רצון של רכבים חשמליים, עשויה להשפיע על שלמותם המבנית והפונקציונליות שלהם 8,9. בנוסף, זמני אולטרה-צנטריפוגה עשויים להיות שעתיים לפחות, משאב יקר בסביבה הקלינית9. ערכות בידוד הוכיחו את עצמן כחוסכות זמן וחסכוניות במידת מה. עם זאת, בידוד בשיטות כאלה מביא גם לתשואות נמוכות ומכאן מדרגיות נמוכה. לפיכך, יש צורך בטכניקות בידוד HBMDEV שהן גם חוסכות זמן וגם חסכוניות מבלי להקריב את תפוקת ה-EV.

פרוטוקול זה נועד להתוות שיטה צעד אחר צעד לבידוד מהיר של רכבים חשמליים מ-HBM באמצעות כלים קיימים זמינים קלינית ומאושרים על ידי ה-FDA. כדי להשיג זאת, נעשה שימוש בצנטריפוגה סטנדרטית ומערכת הארכת מסנן בדרגה קלינית כדי לבודד EVs מ-HBM. שלפוחיות אלו נמצאות בטווח הגודל הצפוי, מציגות מורפולוגיה התואמת לרכבים חשמליים ידועים, מועשרות לסמני EV, ודומות מבחינה פונקציונלית לרכבים חשמליים המבודדים באמצעות טכניקות בידוד אולטרה-צנטריפוגה מסורתיות. לפיכך, פרוטוקול בידוד HBM EV זה עשוי לאפשר בידוד ויישום מעשי ומהיר של EVs המבודדים מ-HBM בסביבה הקלינית.

פרוטוקול

חלב אם נאסף ביחידה לטיפול נמרץ אזורי של אוניברסיטת אלבמה בברמינגהם (UAB). דגימות נבלות נאספו לאחר שחלב אם הופשר לשימוש המטופל, והמטופלת לא הייתה מסוגלת לקחת את כל ההאכלה. הזנות אלה מושלכות בדרך כלל, אך נאספו למטרות מחקר. דגימות נאספו מאנשים לא מזוהים ואוחסנו בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד למועד הניסויים. האוסף אושר על ידי פרוטוקול מועצת הביקורת הפנימית של UAB N160203002. הריאגנטים והציוד המשמש מפורטים בטבלת החומרים.

1. בידוד שלפוחית חוץ תאית (אולטרה צנטריפוגה דיפרנציאלית)

  1. בארון בטיחות ביולוגית, יש לדלל חלב אם 1:10 ב-PBS סטרילי בצינור חרוטי של 15 מ"ל.
  2. צנטריפוגה את חלב האם ב-300 x גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. לאחר הצנטריפוגה, צריכות להיות 3 שכבות נפרדות: שומן חלב (שכבה עליונה), חלב מי גבינה או חלב רזה (שכבה מימית אמצעית), ותאים ופסולת אחרת (גלולה בתחתית). בארון בטיחות ביולוגית, סננו שומן חלב ושכבות מי גבינה דרך מסנן של 70 מיקרומטר (מאפשר הסרה קלה יותר של שומן) תוך השארת הגלולה ללא הפרעה. העבר את הזרימה לצינור חדש.
  3. צנטריפוגה את הדגימה ב-2600 x גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. שאריות שומן חלב, תאים ופסולת מוסרים בשלב זה. בארון בטיחות ביולוגית, סנן את הסופרנטנט דרך מסנן של 70 מיקרומטר. העבירו את הסופרנטנט לצינור אולטרה-צנטריפוגה. ודא שיש לפחות 10 מ"ל נוזל בצינור לפני אולטרה-צנטריפוגה.
  4. אולטרה-צנטריפוגה הדגימה ב-20,000 x גרם למשך 45 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. לאחר אולטרה-צנטריפוגה, עשויות להיות שלוש שכבות הדומות לשלב 1.2: שומן חלב, מי גבינה או חלב דל שומן, ותאים ופסולת אחרת. בארון בטיחות ביולוגית, סננו שומן חלב ושכבות מי גבינה דרך מסנן של 70 מיקרומטר מבלי להפריע לגלולה. העבירו את הסופרנטנט לצינור חרוטי של 15 מ"ל.
  5. בארון בטיחות ביולוגית, מזרק מסנן את חלב האם עם מסנן של 0.22 מיקרומטר. העבירו את הסופרנטנט לצינור אולטרה-צנטריפוגה חדש. ודא שיש לפחות 10 מ"ל נוזל בצינור לפני אולטרה-צנטריפוגה.
  6. אולטרה-צנטריפוגה הדגימה ב-110,000 x גרם למשך 70 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. שאפו את הסופרנטנט, והשעו מחדש את הכדור ב-10 מ"ל של PBS סטרילי.
  7. אולטרה-צנטריפוגה הדגימה שוב ב-110,00 x גרם למשך 70 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
  8. בארון בטיחות ביולוגית, השעו מחדש את הגלולה ב-150-200 מיקרוליטר של PBS סטרילי.

2. בידוד שלפוחית חוץ-תאית (שיטת סינון מהיר)

  1. בארון בטיחות ביולוגית, יש לדלל את חלב האם (1:10) ב-PBS סטרילי.
  2. צנטריפוגה את חלב האם ב-300 x גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. לאחר הצנטריפוגה, צריכות להיות שלוש שכבות נפרדות: שומן חלב (שכבה עליונה), חלב מי גבינה או חלב רזה (שכבה מימית אמצעית), ותאים ופסולת אחרת (כדורים בתחתית). בארון בטיחות ביולוגית, סננו שומן חלב ושכבות מי גבינה דרך מסנן של 70 מיקרומטר (מאפשר הסרה קלה יותר של שומן) תוך השארת הגלולה ללא הפרעה. העבר את הזרימה לצינור חדש.
  3. צנטריפוגה את הדגימה ב-2600 x גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. שאריות שומן חלב, תאים ופסולת מוסרים בשלב זה. בארון בטיחות ביולוגית, סנן סופרנטנט דרך מסנן של 70 מיקרומטר. מעבירים את הסופרנטנט לצינור של 15 מ"ל.
  4. בארון בטיחות ביולוגית, הכינו סט הארכת מסנן של 0.22 מיקרומטר בגודל 16 אינץ' עם PBS של 5.4 מ"ל.
    1. למערכת הראשונית, קח 5.4 מ"ל של PBS סטרילי במזרק ושטוף את המערכת עד שנגמר PBS מהקצה השני של הצינור.
  5. מזרק מסנן את חלב האם דרך סט הארכת מסנן של 0.22 מיקרומטר בגודל 16 אינץ'. שאריות שומן חלב, תאים ופסולת מוסרים בשלב זה.
    הערה: ייתכן שיהיה צורך ביותר מערכת הארכת מסנן אחת בהתאם לכמות הפסולת הקיימת בדגימה.
  6. אוספים את הזרימה בצינור חרוטי של 15 מ"ל.

3. ניתוח מעקב ננו-ראייה

  1. יש לדלל את הדגימה (1:1000) ב-PBS סטרילי. ניתן להשתמש בדגימות מסוננות מהירות ללא דילול.
  2. מערבול קצר את הדגימה. טען 1 מ"ל מהדגימה למזרק טוברקולין.
  3. חבר את המזרק למנגנון ההזרקה ואבטח את המזרק.
  4. הגדר את משאבת ההזרקה ל-50. הפעל את המצלמה כדי לוודא שהחלקיקים שנצפו אינם רבים מדי או מעטים מדי. ודא שזרימת החלקיקים קבועה ללא דילוגים פנימה או קפיצות פתאומיות בזרימת הדגימה.
  5. הגדר את משאבת ההזרקה ל-100. הפעל את הפרוטוקול.
    הערה: התוכנה הוגדרה לקריאה אחת לדקה ובסך הכל 5 קריאות.
  6. קרא את המדגם.
  7. שטוף את Nanosight בין דגימות עם PBS.
    הערה: נעשה שימוש במערכת ניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים לקביעת גודל החלקיקים וריכוז החלקיקים למיליליטר. הריכוז הממוצע של הדגימה האולטרה-צנטריפוגית היה 3.30 e+08 +/- 4.08 e+06 חלקיקים/מ"ל, בעוד ששיטת הסינון המהירה הייתה 5.50e+08 +/- 1.16e+08 חלקיקים/מ"ל.

4. צביעה שלילית של שלפוחיות חוץ-תאיות ומיקרוסקופ אלקטרונים הולכה

הערה: דגימות עם ריכוז אקסוזום בטווח של10-8 שימשו למיקרוסקופ אלקטרונים הולכה (TEM).

  1. רשתות EM של רשת נחושת מצופה סרט זוהר/פורמבר לפריקת זוהר למשך 25 שניות ב-20 mA באמצעות מנגנון הפריקה.
  2. טען 7 מיקרוליטר מתמיסת מתלי EV על הרשת ודגירה למשך דקה אחת.
  3. נדפו עודפים עם נייר סינון Whatman על ידי פתילה מתחת לרשת כדי "למשוך" את הדגימה לכיוון הרשת ולא הרחק ממנה.
  4. צבעו את הדגימה מיד עם 7 מיקרוליטר של תמיסת אורניל אצטט מסוננת 1% (UA) על פני רשת ה-EM על ידי פיפטה.
  5. לאחר 15 שניות, תמיסת UA עודפת הוסרה מהרשת על ידי מגע עם קצה הרשת עם נייר סינון. צפה במדגם מיד (תוך 24 שעות) ב-TEM ב-80 קילוואט.

5. ריכוז חלבון

  1. אצטון משקע 250 מיקרוליטר של EVs מטוהרים (1:4) למשך שעה אחת ב-20 מעלות צלזיוס.
    הערה: השתמש ב-100 מיקרוליטר של אקסוזומים מטוהרים לשיטת האולטרה-צנטריפוגה.
  2. צנטריפוגה את הדגימה ב-16,000 x גרם למשך 30 דקות.
  3. יבש את הגלולה באוויר, ולאחר מכן השעיה מחדש ב-100 מיקרוליטר של מאגר RIPA.
  4. עקוב אחר פרוטוקול ערכת בדיקת החלבון BCA כדי לקבוע את ריכוזי החלבון. הספיגה נמדדה ב-562 ננומטר באמצעות קורא מיקרו-פלטות.
    הערה: 1 מ"ל חלב אם מניב בדרך כלל כ-1.3 מיקרוגרם/מ"ל חלבון באמצעות אולטרה-צנטריפוגה וכ-0.2-1 מיקרוגרם/מ"ל חלבון באמצעות סינון מהיר.

6. כתם מערבי

  1. דגרו דגימת חלבון בנפח 1 עם סמן נתיב 4 נפחים, הפחיתו את מאגר הדגימה והרתיחו אותו במשך 7 דקות ב-90 מעלות צלזיוס.
  2. טען והפעל 10 מיקרוגרם חלבון על ג'ל SDS 10% ב-70 וולט למשך 15 דקות. לאחר מכן, הגדל את המתח ל -100 וולט והפעל למשך 90 דקות נוספות.
  3. העבירו את הג'ל לקרום ניטרוצלולוזה באמצעות המנגנון היבש למחצה למשך 30 דקות ב -15 וולט.
  4. שוטפים את הממברנה 3 פעמים עם TBS-0.1% Tween (TBS-T) למשך 10 דקות כל אחת.
  5. חסום את הממברנה למשך 30 דקות באמצעות תמיסת חיץ חסימה מהירה (מדולל ל-1x).
  6. דגירה של נוגדן ראשוני (Hsp70-1:1000; CD63-1:1000 ו-CD9-1:1000) בתמיסת חיץ 1x, לילה ב-4 מעלות צלזיוס על נדנדה 10,11,12.
  7. שוטפים את הממברנה שלוש פעמים למשך 10 דקות כל אחת עם TBS-T.
  8. הוסף (H+L) נוגדן משני מצומד נגד עכברים HRP, בדילול של 1:1000 עבור כל החלבונים הנחקרים (Hsp70, CD9 ו-CD63) בחלב 2% ב-TBS-T ודגר במשך שעתיים בטמפרטורת החדר על נדנדה.
  9. שוטפים את הממברנה שלוש פעמים למשך 10 דקות כל אחת עם TBS-T.
  10. פיתוח באמצעות ECL (1:1) וסרט עם המפתח.

7. תרבית חוץ גופית של תאי IEC-6

  1. זרע 1.0 x 106 תאים בבקבוק T-25 ב-5 מ"ל של מדיית RPMI מלאה. תן לתאים להיצמד למשך הלילה.
  2. הסר את המדיה המלאה ושטוף עם 1-2 מ"ל PBS.
  3. שאפו PBS והוסיפו 5 מ"ל של RPMI שלם ללא EV.
  4. הוסף ריכוז סופי של 400 מיקרומטר H,2O2 לבאר ו-10 מיקרוגרם/מ"ל של EVs בו זמנית לתאים למשך הלילה.
  5. הסר מדיה ושטוף תאים עם 1-2 מ"ל PBS.
  6. שאפו את ה-PBS והוסיפו 1 מ"ל טריפסין.
    1. מניחים את התאים בחממה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
  7. השבת את הטריפסין על ידי הוספת נפח כפול של RPMI מלא. העבירו תאים לצינור של 15 מ"ל וצנטריפוגה בטמפרטורה של 125 x גרם למשך 5 דקות.
  8. שאפו את הסופרנטנט והשעו מחדש את הגלולה ב-1 מ"ל של PBS.
  9. ספור תאים באמצעות מונה תאים.

תוצאות

בידוד רכבים חשמליים באמצעות אולטרה-צנטריפוגה ובידוד מהיר
מבחינה דוגמטית, בידוד EV מ-HBM כרוך בצנטריפוגה להסרת שומן חלב וחלקיקים גדולים אחרים, ולאחר מכן סינון, מספר סבבים של אולטרה-צנטריפוגה והשעיה מחדש של הדגימה המועשרת ב-EV ב-PBS. שיטת הסינון המהיר משתמשת בצנטריפוגה להסרת שומן חלב ופסולת תאית, ואחריה סינון באמצעות מסנן מאריך מסנן של 0.22 מיקרומטר, תוך הסרת פסולת שיורית, המניבה דגימה מועשרת ב-EV הדומה לאולטרה-צנטריפוגה מסורתית (איור 1).

אפיון HBMDEVs ממערכת הסינון המהיר של הארכת המסנן
ניתוח מעקב ננו-ראייה חשף גודל חלקיקים דומה בין אולטרה-צנטריפוגה (איור 2A) לבין HBMDEVs מבודדים מסננים מהירים (איור 2B). שתי השיטות מצביעות על כך שלרכבים חשמליים מבודדים יש גודל ממוצע של כ-100 ננומטר. EVs נושאים מטענים שונים (כלומר, חלבונים, שומנים, miRNA וכו') להפרשה מתאי המארח למטרותיהם השונות. לפיכך, חלבון המטרה הראשון שנבדק היה חלבון הלם חום 70 (Hsp70), חלבון הידוע כמועבר באמצעות EVs13. ניתוח כתמים מערביים מראה כי EVs שבודדו באמצעות סינון מהיר הראו ביטוי דומה של Hsp70, כמו אלה שבודדו באמצעות אולטרה-צנטריפוגה (איור 3A ואיור משלים 1A). בנוסף, ניתן לזהות EVs באמצעות ביטוי פני השטח של טטרספנינים כגון CD9 ו-CD6314. ניתוח כתמים מערביים גילה כי EVs שבודדו באמצעות סינון מהיר אכן מבטאים CD9 (איור 3B ואיור משלים 2B) ו-CD63 (איור 3C ואיור משלים 3C). לבסוף, ניתוח מורפולוגי של HBMDEVs באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים שידור חשף מורפולוגיה דומה של שלפוחית בין שתי טכניקות הבידוד (איור 4A-D).

מספר מעבדות הראו כי EVs מעניקים תכונות הגנה המקדמות את הישרדות התאים במהלך לחץ תאי 2,3,7. בדומה לדיווחים שפורסמו בעבר, EVs שבודדו בשיטת הסינון המהיר מסוגלים להגן על תאי אפיתל המעי (IEC-6) מפני מוות תאים הנגרם על ידי מי חמצן2 (איור 5A,B). נתונים אלה מצביעים על כך ש-HBMDEVs המבודדים בשיטת הסינון המהיר לא רק בעלי איכויות השוואתיות לאלו המבודדים באמצעות אולטרה-צנטריפוגה דיפרנציאלית, אלא גם דומים מבחינה תפקודית.

figure-results-1
איור 1: סכמטי המתאר את ההבדלים בין אולטרה-צנטריפוגה לשיטות סינון מהירות של בידוד EVs מחלב אם. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: ניתוח מעקב ננו-ראייה של EVs שבודדו מחלב אם אנושי באמצעות אולטרה-צנטריפוגה ושיטת סינון מהיר. (A) NTA של EVs מחלב אם אנושי (מדולל 1:1000 ב-1x PBS) מבודד באמצעות אולטרה-צנטריפוגה. הנתונים המוצגים הם ייצוג יחיד של 3-4 ניסויים עצמאיים. (B) NTA של EVs מחלב אם אנושי שבודדו באמצעות סינון מהיר. הנתונים המוצגים הם ייצוג יחיד של 3-4 ניסויים עצמאיים. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: ניתוח כתמים מערביים של רכבים חשמליים מבודדים באמצעות אולטרה-צנטריפוגה וסינון מהיר. (A) חשיפה של שנייה אחת של 10 מיקרוגרם של חלבון הלם חום 70 (Hsp70). "L" מציין סולם, "U" מציין אולטרה-צנטריפוגה, ו-"R" מציין סינון מהיר. דגימות שהתקבלו על ידי סינון מהיר רוכזו עוד יותר על ידי צנטריפוגה ב-110,000 × גרם למשך 70 דקות, שבוצעו פעמיים. התמונה המוצגת מייצגת אחד מארבעה ניסויים עצמאיים. (B) חשיפה של 22 שניות של 10 מיקרוגרם של CD9. "L" מציין סולם, "U" מציין אולטרה-צנטריפוגה, ו-"R" מציין סינון מהיר. דגימות סינון מהירות רוכזו על ידי צנטריפוגה ב-110,000 × גרם למשך 70 דקות, שבוצעו פעמיים. התמונה המוצגת מייצגת אחד מארבעה ניסויים עצמאיים. (C) חשיפה של עשרים שניות של 10 מיקרוגרם של CD63. "L" מציין סולם, "U" מציין אולטרה-צנטריפוגה, ו-"R" מציין סינון מהיר. דגימות סינון מהירות רוכזו על ידי צנטריפוגה ב-110,000 × גרם למשך 70 דקות, שבוצעו פעמיים. התמונה המוצגת מייצגת אחד מארבעה ניסויים עצמאיים. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4
איור 4: ניתוח מיקרוסקופ אלקטרונים שידור של רכבי EV מבודדים באמצעות אולטרה-צנטריפוגה וסינון מהיר. (A) מיקרוגרף אלקטרונים של רכבים חשמליים מבודדים באמצעות אולטרה-צנטריפוגה בהגדלה של 8,000×. סרגל קנה מידה = 800 ננומטר. התמונה המוצגת מייצגת אחד משלושה ניסויים עצמאיים. (B) מיקרוגרף אלקטרונים של רכבים חשמליים שבודדו באמצעות אולטרה-צנטריפוגה בהגדלה של 20,000× סרגל קנה מידה = 200 ננומטר. התמונה המוצגת מייצגת אחד משלושה ניסויים עצמאיים. (C) מיקרוגרף אלקטרונים של רכבים חשמליים מבודדים באמצעות סינון מהיר בהגדלה של 8,000×. סרגל קנה מידה = 800 ננומטר. רכבים חשמליים רוכזו על ידי צנטריפוגה ב-110,000 × גרם למשך 70 דקות, שבוצעו פעמיים. התמונה המוצגת מייצגת אחד משלושה ניסויים עצמאיים. (D) מיקרוגרף אלקטרונים של רכבים חשמליים מבודדים באמצעות סינון מהיר בהגדלה של 20,000×. סרגל קנה מידה = 200 ננומטר. רכבים חשמליים רוכזו על ידי צנטריפוגה ב-110,000 × גרם למשך 70 דקות, שבוצעו פעמיים. התמונה המוצגת מייצגת אחד משלושה ניסויים עצמאיים. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-5
איור 5: ניתוח פונקציונלי של רכבים חשמליים מבודדים באמצעות אולטרה-צנטריפוגה וסינון מהיר. (A) כדאיות התאים של תאי IEC-6 שגודלו במדיום RPMI-1640 שלם ללא EV. התאים טופלו במהלך הלילה ב-400 מיקרומטר H,2O2 ו-10 מיקרוגרם/מ"ל של EVs בו זמנית. הנתונים המוצגים מייצגים אחד משני ניסויים עצמאיים. (B) ספירת תאים של תאי IEC-6 שגודלו במדיום RPMI-1640 שלם ללא EV. התאים טופלו במהלך הלילה ב-400 מיקרומטר H,2O2 ו-10 מיקרוגרם/מ"ל של EVs בו זמנית. הנתונים המוצגים מייצגים אחד משני ניסויים עצמאיים. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור משלים 1: אפיון כתם מערבי של Hsp70 ברכבים חשמליים שבודדו באמצעות אולטרה-צנטריפוגה וסינון מהיר. חשיפה של שנייה אחת של 10 מיקרוגרם של חלבון הלם חום 70 (Hsp70). "L" מציין סולם, "U" מציין אולטרה-צנטריפוגה, ו-"R" מציין סינון מהיר. דגימות סינון מהירות רוכזו על ידי צנטריפוגה ב-110,000 × גרם למשך 70 דקות, שבוצעו פעמיים. כל דגימה מייצגת שכפול ביולוגי יחיד. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

איור משלים 2: אפיון כתם מערבי של CD9 ברכבים חשמליים שבודדו באמצעות אולטרה-צנטריפוגה וסינון מהיר. חשיפה של חמש דקות של 10 מיקרוגרם CD9. "L" מציין סולם, "U" מציין אולטרה-צנטריפוגה, ו-"R" מציין סינון מהיר. דגימות סינון מהירות רוכזו על ידי צנטריפוגה ב-110,000 × גרם למשך 70 דקות, שבוצעו פעמיים. כל דגימה מייצגת שכפול ביולוגי יחיד. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

איור משלים 3: אפיון כתם מערבי של CD63 ברכבים חשמליים שבודדו באמצעות אולטרה-צנטריפוגה וסינון מהיר. חשיפה של עשר דקות של 10 מיקרוגרם CD63. "L" מציין סולם, "U" מציין אולטרה-צנטריפוגה, ו-"R" מציין סינון מהיר. דגימות סינון מהירות רוכזו על ידי צנטריפוגה ב-110,000 × גרם למשך 70 דקות, שבוצעו פעמיים. כל דגימה מייצגת שכפול ביולוגי יחיד. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

דיון

EVs מושכים תשומת לב מכיוון שהספרות מצביעה על כך שהם עשויים לווסת מנגנונים דלקתיים שונים ועשויים להציע יתרונות הגנה. עם זאת, מגבלה של השימוש המעשי ברכבים חשמליים במסגרות קליניות היא הזמן הדרוש לבידוד רכבים חשמליים ולהפקת תשואה מספקת 8,15. כאן, הוצג פרוטוקול שלב אחר שלב לבידוד מהיר ויעיל של רכבים חשמליים מ-HBM באמצעות מערכת סינון מאושרת על ידי ה-FDA. התועלת של שיטה זו מפחיתה את שיטות בידוד ה-EV המסורתיות בחצי מבלי להקריב את התשואה. לפיכך, פרוטוקול זה עשוי לאפשר יישום טיפולי מעשי של EVs שמקורם בחלב אם אנושי במסגרת קלינית, אם טיפול EV יאושר בעתיד הנראה לעין.

פרוטוקולי בידוד EV קיימים הוכיחו תפוקה עקבית ויעילה של רכבים חשמליים מנוזל המקור שלהם. עם זאת, אמצעי בידוד מסורתיים, בין אם מדובר בתקן הזהב, אולטרה-צנטריפוגה דיפרנציאלית או שימוש בערכות מסחריות, אינם חפים ממגבלותיהם. בידוד רכבים חשמליים באמצעות אולטרה-צנטריפוגה דיפרנציאלית, למרות שהוא יעיל, גוזל זמן עם פרוטוקולים הכוללים זמני סחיטה משולבים של מינימום ~3 שעות 2,8,15. זמן בידוד בשילוב עם פרוטוקולים לכימות נכון של מספרי EV יהפכו את השימוש בהם תחת אילוצי זמן בסביבה קלינית למאתגר. יתר על כן, ערכות מסחריות, למרות יעילותן, הן יקרות. בנוסף, מספר הדגימות שניתן לעבד לכל ערכה נמוך, בהתחשב בעלויות הגבוהות של ערכות אלו 8,15.

פרוטוקול זה מציע פתרון למגבלות אלו שחוסך זמן וכסף מבלי להקריב את תפוקת ה-EV או טוהר הרכב. כדי שפרוטוקול זה יהיה יעיל, ישנם שלבים מרכזיים שיש לבצע בעת ביצוע הפרוטוקול. דילול וצנטריפוגה ראשונית של חלב אם אנושי נחוצים להסרת פסולת חוץ-תאית ושומן חלב מדגימת החלב. הסרת פסולת זו היא קריטית למניעת סתימה של מערכת הארכת המסנן ובכך מונעת את הצורך להשתמש במספר מסננים עבור דגימה אחת. בנוסף, שטיפת מערכת הארכת המסנן עם PBS היא קריטית מכיוון שהיא מכינה את המסנן לקראת הדגימה. תחול עוזר להבטיח שהדגימה לא תאבד במהלך תהליך ההתחלה. יש לציין כי בהתאם לתכולת דגימת חלב האם, ייתכן שיהיה צורך ביותר מערכת הארכת מסנן אחת, ללא קשר לדילול וצנטריפוגה של הדגימה לפני הסינון. במקרה שזה קורה, ניתן להשתמש ביותר ממסנן אחד; עם זאת, יש להכין את ערכת הרחבת המסנן החדשה לפני סינון הדגימה.

פרוטוקול זה יעיל ועקבי בבידוד EVs מחלב אם אנושי, עם זאת, ישנן כמה מגבלות שיש לקחת בחשבון. יש צורך בשלבי הצנטריפוגה (~20 דקות זמן כולל בין שני הסיבובים) לפני סינון הדגימה. ניסיונות לסנן את הדגימה המדוללת ללא צנטריפוגה יובילו לסתימה חוזרת ונשנית של מערכת הארכת המסנן, אובדן דגימה ויוסיפו זמן נוסף לפרוטוקול בידוד EV. יתר על כן, הדגימה לא הייתה טהורה, כפי שמעידים ניתוח NTA ו-TEM. ניסיונות להשתמש בדגימות שלא עברו צנטריפוגה לפני הסינון עלולים להכניס מזהמים לא רצויים לדגימה, מה שעלול לייצר השפעות מחוץ למטרה בהתאם ליישום עתידי במורד הזרם של EVs מבודדים. בנוסף, פרוטוקול זה יושם רק ביחס לבידוד EVs מחלב אם. לפיכך, היעילות של פרוטוקול זה בבידוד EVs מנוזלים אחרים לא נחקרה. בהתחשב באופי המימי של כל נוזלי הגוף, לא צפוי שיהיו הבדלים בטוהר והתפוקה של EV אם פרוטוקול זה ישמש לבידוד רכבים חשמליים ממקורות אחרים.

כמו כן, יש לציין כי פרוטוקול זה יעיל בבידוד שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות (sEV). על פי NTA, רכבים חשמליים שמקורם ב-HBM היו בגודל של ~100 ננומטר, מה שמצביע על כך שרכבים חשמליים גדולים יותר לא היו קיימים במדגם. הסיבה היא שהדגימות סוננו באמצעות מסנן של 0.22 מיקרומטר, המשמש בעיקר לבידוד אקסוזומים ורכבים חשמליים קטנים אחרים, מוקד עיקרי של המעבדה בזמן מחקר זה. בתיאוריה, שימוש במסנן עם גדלי נקבוביות גדולים יותר עשוי לאפשר בידוד של רכבים חשמליים גדולים יותר. עם זאת, שאלות אלה חורגות מתחום המחקר הנוכחי.

EVs שמקורם בחלב אם אנושי מייצגים מקור טיפולי טבעי הנגיש בקלות לשימוש קליני. מגבלה אחת להבאת עבודת EV לסביבה הקלינית היא בידוד רכבים חשמליים בשיטה מעשית שכל מתקן יכול להשתמש בה. פרוטוקול זה נועד להתגבר על מגבלה זו וניתן ליישם אותו בקלות בסביבת בית החולים וליישם אותו באמצעות מערכת סינון קיימת ברמת בית חולים, מאושרת על ידי ה-FDA, זמינה מסחרית, או שניתן לרכוש אותו בהרבה פחות מהאולטרה-צנטריפוגה הסטנדרטית. שיטה זו חסכונית ומייצרת דגימה עשירה ב-EV וטהורה ממערכת סינון שכבר נמצאת בשימוש בסביבה הקלינית.

גילויים

המחבר/ים לא הצהירו על ניגודי אינטרסים פוטנציאליים ביחס למחקר, המחבר ו/או הפרסום של מאמר זה.

תודות

תמונות ודמויות נוצרו באמצעות biorender.com. המחקר המדווח בפרסום זה נתמך על ידי מתקן ההדמיה ברזולוציה גבוהה של UAB. עבודה זו נתמכה על ידי NIH/NICHD 5R21HD104481.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
(H+L) HRP-אנטי-עכבר צמודביו-ראד1721011
(H+L) HRP-אנטי-ארנב צמודביו-ראד1706515
מסנן מזרק 0.20פישרברנד09-719C
מסננת תא 0.70 umקורנינג431751
1.5 מטר טריס HCLיוצר בתוך החברה
צינורות 15 מ"לפלקון352096
סט הארכת מסננים בגודל 16 אינץ'ב-בראוןFE2012F
1M טריס HCLטקנובהT1068
1x PBSגיבקו10010-031
צינורות 50 מ"לפלקון353070
בופר דגימה מפחית פי 5תרמו-סיינטיפיק39000
אצילמידפישר סיינטיפיק  BP1410-1
אמפוטריצין Bגיבקו15290-018
מצלמת AMT NanoSprint43 Mark-IIAMT
אנטי-אנטיגיבקו15240-062
אנטי-CD63נובוסביוNBP2-32830
אנטי-CD9Invitrogen10626D
APSתרמו-סיינטיפיק17874
ערכת בדיקת חלבון BCAפירס23227
צינורות בקמןבקמן קולטר 344059
BrightStar ECL Chemiluminescentאלקלי סיינטיXR92
FBS מדולדל אקסוזוםפישר סיינטיפיקNC0464480
בופר חסימה מהירפירס37575
סרום בקר עובריטכנולוגיות חיים10082147
HSP70InvitrogenMA3-006
אינסולין אנושיסיגמא-אלדריץ'I9278-5ML
מי חמצןפישר סיינטיפיקH325-500
IEC-6 ATCCCRL-1592
ג'אול 1400 פלאש טםJEOL USA Inc
סימון נתיב מפחית את בופר הדגימהתרמו-סיינטיפיק39000
אבקת חלבעולם ביולוגי30620074-1
Nanosight NS 300מלוורן אינסטרומנטס בע"מ
ממברנת ניטרוצלולוזטכנולוגיות חיים88018
PELCO easi, מכשיר פריקת Glowטד פלה
טבליות מיני מעכבות פרוטאזפירסA32955
בופר RIPAפירס89901
RPMI 1640פישר סיינטיפיק  11875119
SDSפישר סיינטיפיק  BP2436-200
בקבוק T-25תרמו-סיינטיפיק156367
TBSיוצר בתוך החברה
TEMEDביו-ראד161-0801
טריפסין EDTAגיבסו25200-056
גיל 20תרמו-סיינטיפיקJ20605-AP

מקורות

  1. Galley, J. D., Besner, G. E. The therapeutic potential of breast milk-derived extracellular vesicles. Nutrients. 12 (3), 745(2020).
  2. Martin, C., et al. Human breast milk-derived exosomes attenuate cell death in intestinal epithelial cells. Innate Immun. 24 (5), 278-284 (2018).
  3. Hock, A., et al. Breast milk-derived exosomes promote intestinal epithelial cell growth. J Pediatr Surg. 52 (5), 755-759 (2017).
  4. Alexander, M., et al. Exosome-delivered microRNAs modulate the inflammatory response to endotoxin. Nat Commun. 6, 7321(2015).
  5. Lasser, C., et al. Human saliva, plasma, and breast milk exosomes contain RNA: Uptake by macrophages. J Transl Med. 9, 9(2011).
  6. Chan, C. C., et al. Type I interferon sensing unlocks dormant adipocyte inflammatory potential. Nat Commun. 11 (1), 2745(2020).
  7. Miyake, H., et al. Human breast milk exosomes attenuate intestinal damage. Pediatr Surg Int. 36 (2), 155-163 (2020).
  8. Gao, J., et al. Recent developments in isolating methods for exosomes. Front Bioeng Biotechnol. 10, 1100892(2022).
  9. Patel, G. K., et al. Comparative analysis of exosome isolation methods using culture supernatant for optimum yield, purity and downstream applications. Sci Rep. 9 (1), 5335(2019).
  10. Gandhi, J., Naik, M. N., Mishra, D. K., Joseph, J. Proteomic profiling of Aspergillus flavus endophthalmitis-derived extracellular vesicles in an in vivo murine model. Med Mycol. 60 (9), myac064(2022).
  11. Palinski, W., et al. Lysosome purinergic receptor p2x4 regulates neoangiogenesis induced by microvesicles from sarcoma patients. Cell Death Dis. 12 (9), 797(2021).
  12. Tantengco, O. aG., Radnaa, E., Shahin, H., Kechichian, T., Menon, R. Cross talk: Trafficking and functional impact of maternal exosomes at the feto-maternal interface under normal and pathologic statesdagger. Biol Reprod. 105 (6), 15621576(2021).
  13. Caruso Bavisotto, C., et al. Exosomal hsp60: A potentially useful biomarker for diagnosis, assessing prognosis, and monitoring response to treatment. Expert Rev Mol Diagn. 17 (9), 815-822 (2017).
  14. Feng, X., et al. Latest trend of milk-derived exosomes: Cargos, functions, and applications. Front Nutr. 8, 747294(2021).
  15. Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z. Progress in exosome isolation techniques. Theranostics. 7 (3), 789-804 (2017).

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

EVs מחלב אםסינון מהיראולטרה-צנטריפוגציהבידוד אקסוזומיםWestern Blotמיקרוסקופיה אלקטרונית חודרת (TEM)מעקב NanoSightסמן CD63
בידוד מהיר של שלפוחיות חוץ-תאיות שמקורן בחלב אם
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.