הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

זרימת עבודה אופטימלית להלבנה איטרטיבית מרחיבה את ההדמיה המרובה של דגימות קליניות אוטו-פלואורסצנטיות מאוד

1.4K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/67980

⸱

11 ביולי 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Critical Care Medicine and Pulmonary Branch, National Heart, Lung and Blood Institute, National Institutes of Health, 2Lymphocyte Biology Section and Center for Advanced Tissue Imaging, Laboratory of Immune System Biology, NIAID, NIH, 3Leica Microsystems Inc., 4T Lymphocyte Biology Section, Laboratory of Parasitic Diseases, National Institute of Allergy and Infectious Disease, National Institutes of Health

במאמר זה

סיכום

היישום של טכניקת הקרנה פוטו-ארבלית בעלות נמוכה בשיטת IBEX הידנית מאפשר הדמיה אופטימלית של רקמות אנושיות עם אוטופלואורסצנציה טבעית משמעותית. פרוטוקול זה מפרט כיצד להשיג תמונות מרובות ושקופיות שלמות מדגימות קליניות בארכיון באמצעות מיקרוסקופ הפוך, ריאגנטים זמינים באופן נרחב ותוכנת קוד פתוח ליישור ועיבוד תמונה.

תקציר

השכיחות של מחלות ריאה עקב מיקובקטריות שאינן שחפתיות (NTM) גדלה ברחבי העולם. למרות שמחלת ריאות הנגרמת על ידי NTM מופיעה לעתים קרובות עם ברונכיאקטזיס, קשריות ריאה ומחלת חללים, תגובת המארח הקשורה לדפוסי פגיעה ריאתית מובהקים אלה לא אופיינה היטב באתרה. ביקשנו להעריך מנגנונים של פתולוגיה הנגרמת על ידי NTM על ידי ביצוע ניתוח פנוטיפי עמוק של אוכלוסיות תאי חיסון ברקמת הריאה מאנשים עם מחלת NTM בהשוואה לתקן זהב של דלקת גרנולומטית, מחלת ריאות שחפת (שחפת).

גושי ריאות קבועים בפורמלין, משובצים בפרפין (FFPE) מחולים עם NTM מפושט, NTM ריאתי או מחלת שחפת ריאתית נחתכו ונצבעו בעקבות גרסה שונה של שיטת ההדמיה IBEX. אופטימיזציה של שיטת IBEX נדרשה תחילה כדי לטפל בפלואורסצנטיות האנדוגנית המשמעותית של קטעי ריאה בשל הצפיפות הגבוהה של קולגן, אלסטין ואריתרוציטים שמקורם ברקמת הריאה, המחמירה על ידי שימור FFPE וגיל גושי ה-FFPE. בפרוטוקול זה, אנו מפרטים פרוטוקול קרינת אור ושיטת אחזור אנטיגן שונה המפחיתה את האוטופלואורסצנציה של דגימות בארכיון קליני.

יתר על כן, אנו מספקים הנחיות לגבי תכנון פאנל נוגדנים, כולל אתגרים נפוצים כגון תגובתיות צולבת, אובדן אפיטופ בעקבות קרינת אור, חפיפה ספקטרלית בין פלואורופורים סמוכים ואות לרעש נמוך עבור מטרות מסוימות. כדי להקל על הדמיה יעילה של קטעי רקמת ריאה שלמים, השקופיות צולמו במיקרוסקופ רחב שדה ועובדו לאחר מכן עם תוכנת קוד פתוח כדי לשפר את איכות התמונה. יחד, זרימת עבודה זו עונה על צורך קריטי על ידי תיעוד כיצד להשיג תמונות מרובות מאוד, ברזולוציה גבוהה, שקופיות שלמות מדגימות מאתגרות באמצעות מכשור וריאגנטים זמינים באופן נרחב. מעבר להדמיה כמותית של דגימות קליניות, ניתן ליישם טכניקות אלו על סוגי דגימות מגוונים כדי להתגבר על מקורות פלואורסצנטיים אנדוגניים ואקסוגניים כאחד.

מבוא

שחפת היא אחד מגורמי המוות המובילים, כאשר כ-1.3 מיליון אנשים מתים מזיהום בשחפתמדי שנה. למרות שאינה קטלנית כמו שחפת, חלה עלייה משמעותית בזיהומים ריאתיים ומחלות שלאחר מכן הנגרמות על ידי מיקובקטריות שאינן שחפתיות (NTM) בשנים האחרונות2. ברמת הרקמה, התגובה החיסונית של המארח לזיהום Mycobacterium tuberculosis ריאתי (Mtb) נחקרה היטב וכוללת היווצרות גרנולומות, אגרגטים הטרוגניים של לימפוציטים, תאים דנדריטיים, מקרופאגים ונויטרופילים3. בעוד שדלקת גרנולומטית היא גם מאפיין בסיסי של חסינות המארח לזיהום NTM, אוכלוסיות תאי החיסון והמאפיינים המרחביים של תגובה זו נותרו לא נחקרים. השגת הבנה מפורטת של מרכיבי הרקמה של אימונופתולוגיה לעומת ריפוי פצעים היא קריטית לפיתוח טיפולים (למשל, טיפולים מכוונים מארח) ואסטרטגיות טיפוליות מונעות (כלומר, חיסונים).

במחקר זה, לצוות שלנו הייתה גישה לדגימות קליניות נדירות ומאוחסנות בארכיון שנרכשו במהלך כריתת ריאות או נתיחות לאחר המוות מחולים עם זיהום Mtb או NTM. רוב הדגימות הללו היו בנות יותר מ-10 שנים ונשמרו כדגימות קבועות בפורמלין, משובצות פרפין (FFPE), מה שהגביל את השימוש בהן למבחנים היסטולוגיים. כדי להתגבר על מגבלות הסמנים של הדמיה אימונוהיסטוכימית מסורתית (IHC) ואימונופלואורסצנציה (IF), השתמשנו בשיטת ההלבנה האיטרטיבית מרחיבה ריבוי (IBEX), שיטת הדמיה בקוד פתוח ומרובה מאוד 4,5. הרחבת שיטת IBEX לדגימות FFPE של ריאות אנושיות דרשה אופטימיזציה משמעותית בשל רמות גבוהות של פלואורסצנטיות אנדוגנית, מכשול מתואר היטב להדמיה מבוססת נוגדנים מרובים6.

כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט להפחתת אוטופלואורסצנציה באמצעות שיטת הקרנה פוטו-איראלית המותאמת לקטעי רקמת FFPE של הריאות 7,8. חשוב לציין, השיטה המתוארת כאן משתמשת בקופסת אור זולה וזמינה שניתן להרחיב לתכשירים דגימיים אחרים עם אוטופלואורסצנטיות גבוהה. בנוסף להפחתת האוטו-פלואורסצנציה לפני רכישת תמונה, אנו מספקים הנחיות לגבי תכנון פאנל נוגדנים כגון זיווג סמני שפע נמוך עם תוויות פלואורופור בהירות, הערכת השפעת הקרנת האור על תיוג הנוגדנים והגברה עם נוגדנים משניים בתעלות עם פלואורסצנטיות אנדוגנית גבוהה. בממוצע, עיבדנו חמש שקופיות המתאימות לקטע רקמה אחד, כל אחת נעה בין 37 ל-114 מ"מ2. לבסוף, אנו מדגימים כיצד לרכוש תמונות של שקופיות שלמות באמצעות מכשיר שדה רחב. לסיכום, פרוטוקול זה מתאר את אימוץ IBEX לדגימות קליניות המאוחסנות בארכיון ובנוסף מציע הנחיות כיצד לפתור בעיות נפוצות בהדמיית דגימות אוטו-פלואורסצנטיות גבוהות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

קטעי רקמת ריאה של נתיחה שלאחר המוות וכריתת רקמת ריאה כירורגית נאספו תחת פרוטוקול 09-H-0172 (NCT00943514), היסטוריה טבעית של ברונכיאקטזיס, במעבדה לפתולוגיה של המרכז הקליני של המכונים הלאומיים לבריאות. פרוטוקול זה אושר על ידי IRB, והמשתתפים סיפקו הסכמה מדעת.

1. אחזור אנטיגן אוטומטי

הערה: דה-פרפיניזציה ואחזור אנטיגן בוצעו באמצעות פלטפורמת צביעה מחקרית אוטומטית (איור 1). עבודה קודמת קבעה כי גישת אחזור אנטיגן כפולה המורכבת מ-30 דקות עם תמיסת אחזור אפיטופ pH 6 מבוססת ציטראט (ER1) ולאחר מכן 30 דקות עם תמיסת אחזור אפיטופ pH 9 מבוססת EDTA (ER2) הניבה את תוצאות התיוג החיסוני הטובות ביותר עבור רקמות FFPE9. ניתן להשיג תוצאות דומות באמצעות הסרת שעווה ידנית ואחזור אנטיגן כפול באמצעות שיטות מתוארות אחרות ותמיכה הניתנת על ידי קהילת ההדמיה של IBEX10,11.

  1. אסוף שקופיות וציוד אחזור אנטיגן אוטומטי (כיסויי שקופיות, מערכת זיהוי מחקר, תמיסת אחזור אפיטופ pH 6 מבוססת ציטראט (ER1), תמיסת אחזור אפיטופ pH 9 מבוססת EDTA (ER2) וכו').
  2. הפעל את המכשיר, אפשר לו לאתחל למשך 20 דקות, הנח את זרוע זיהוי המחקר לתוך המכשיר והכנס מיכלי ריאגנטים לתחתית המכונה.
  3. פתח את התוכנה, לחץ על הגדרת שקופית ובחר הוסף מחקר, וצור שם חדש למחקר.
  4. בחר הוסף שקופית וסמן את השקופיות כרצונך.
  5. כדי לעקוב אחר פרוטוקול זה, בצע פרוטוקול אפייה והסרת שעווה עם פרוטוקול HIER המורכב מ-30 דקות של ER1 ו-30 דקות של ER2.
  6. הדפס תוויות ומקם אותן מעל השקופיות. הסר את מתלה השקופיות השחור מהמכשיר והנח את השקופיות המעניינות על המתלה. הנח כיסויי שקופיות שקופים על כל שקופית, החזר את מתלה השקופיות למכשיר ולחץ על הכפתור מתחת למתלה כדי להנחות את המכשיר לבצע סריקת ברקוד של השקופיות.
  7. בחר הפעל | אישור ותן לאחזור האנטיגן האוטומטי להתחיל עם משך משוער של 3 שעות.

2. תיוג נוגדנים לפני הקרנת אור

  1. לאחר השלמת אחזור האנטיגן, טבלו את השקופיות ב-PBS.
    הערה: אפיטופים מסוימים רגישים לקרינת אור ומתפרקים לאחר חשיפה לילית ל-LED. אפיטופים רגישים חייבים להיקבע באופן אמפירי וכאשר הם מתגלים, תיוג חיסוני של אפיטופים אלה צריך להתרחש בשלב זה. ודא שהמגלשה נשארת רטובה בכל עת לאחר אחזור האנטיגן.
  2. הסר שקופית אחת מ-PBS וייבש את כל עודפי ה-PBS בשקופית באמצעות מגבון נטול מוך; היזהר לא לגעת ברקמה. צייר גבול סביב הרקמה בעזרת עט הידרופובי. חזור על התהליך עבור כל השקופיות הנותרות. הניחו למחסום ההידרופובי להתייבש במשך 10 דקות.
  3. הכן תא לחות שקופיות על ידי הנחת כמות קטנה של מים בתחתית כל באר. הנח שקופיות בתא הלחות של השקופיות. נדפו PBS מהרקמה מבלי לגעת ישירות בדגימת הרקמה.
  4. הוסף 200 מיקרוליטר של מאגר חוסם (טבלת חומרים) לכל שקופית. הנח את תא הלחות בשקופיות במיקרוגל מדעי שאינו מחמם עם מנגנון לשמירה על טמפרטורה קבועה.
  5. חסום תיוג נוגדנים לא ספציפי על ידי ביצוע התוכנית הבאה שנקבעה קודם לכן4: תוכנית 2-1-2-1-2-1-1-2, כאשר "2" מציין 2 דקות ב-100 W ו-"1" מציין דקה אחת ב-0 W. הפעל את התוכנית לעיל פעם אחת לחסימה. אם מכשיר זה אינו זמין, חסום את קטעי הרקמה (5-10 מיקרומטר) למשך שעה ב-37 מעלות צלזיוס כמתואר קודם לכן5.
  6. צור תמיסת צביעת נוגדנים ראשונית #1 (מחזור 1) (טבלת חומרים) במהלך חסימת הדגירה של המאגר. הכן תערובות נוגדנים לפי טבלת החומרים. מערבבים בעדינות את קוקטייל הנוגדנים וסובבו את תערובת הנוגדנים עם מיני צנטריפוגה ב-2,680 × גרם למשך 30 שניות.
    הערה: תמיסת צביעה זו מכילה דילול של 1:5000 של Hoechst שאמור להספיק למשך הניסוי הדו-מחזורי. ייתכן שמשתמשים יצטרכו לבצע טיטרציה של Hoechst ונוגדנים אחרים כדי להשיג תוצאות מיטביות עבור הרקמות ותצורת ההדמיה שלהם.
  7. הסר את תא הלחות של השקופיות מהמיקרוגל לאחר השלמת המחזור ושחרר את תמיסת החיץ החוסמת מכל רקמה. הוסף 200 מיקרוליטר של תמיסת צביעת נוגדנים ראשונית #1 (מחזור 1) (טבלת חומרים) לכל שקופית. הנח את התא עם שקופיות בחזרה למיקרוגל והפעל את תוכנית הנוגדנים העיקרית למשך כ-30 דקות: בצע את תוכנית 2-1-2-1-2-1-2-1-2 פעמיים לסימון נוגדנים ראשוניים.
    הערה: כאן, 200 מיקרוליטר של תמיסת נוגדנים ראשונית היא הערכה. השתמש בנפח תמיסה מתאים כדי לכסות את כל שטח קטע הרקמה.
  8. לאחר השלמת שלב תיוג הנוגדנים העיקרי, שטפו כל שקופית עם 1,000 מיקרוליטר PBS על ידי הטיית השקף אנכית, פיפטינג PBS על הרקמה ומתן ל-PBS לברוח. חזור על שלב זה 3-5x.
  9. הסר עודפי PBS ותקן את השקופיות עם 1% פרפורמלדהיד (PFA) למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר בתא הלחות.
    הערה: קיבוע PFA יכול להסוות אפיטופים, ולמנוע מנוגדנים לקשור את המטרות המיועדות להם. בעת הקמת פאנל נוגדנים בפעם הראשונה, אנו ממליצים להעריך את ההשפעה של קיבוע עדין (1% PFA למשך 10 דקות) על ידי השוואת דפוס התיוג של קטעי רקמה שטופלו עם או בלי קיבוע לפני התיוג החיסוני. אם נוגדן רגיש לקיבוע PFA של 1%, הזז את הנוגדן הזה לפני שלב הקיבוע.
  10. שטפו את השקופיות בהרחבה עם 1,000 מיקרוליטר PBS 3-5x. השאירו PBS על הרקמה עד לשלב ההקרנה.

3. הקרנת רקמות

  1. כדי להכין את קופסת הפוטו-אירקרינה (איור 2), השיגו מנורת LED 150 W, מנורת LED הצפה RGBW 40 W, מיכל פלסטיק גדול (נפח 20 ליטר [75.71 ליטר] או יותר), PBS 1x טרי וצלחת פטרי.
  2. הניחו את צלחת הפטרי במרכז מנורת 150 וואט ומלאו אותה ב-1x PBS. השתמש בעוצמת קול מספקת כדי לטבול את השקופיות ב-PBS. בצע את תהליך הקרנת האור בחדר הקירור כדי למזער את יצירת החום ממנורות.
  3. הסר את השקופיות מתא הלחות של השקופיות והנח אותן בצלחת פטרי, וודא שכל השקופיות שקועות ב-PBS.
  4. הנח את מנורת 40 וואט ישירות על גבי צלחת הפטרי כשמקור האור פונה למגלשות. ודא שה-40 וואט lamp מוגדר להגדרת אור אדום לפני המיקום.
  5. הפעל גם את מנורות 150 וואט וגם 40 וואט. כסו את מערך הקרנת האור במכסה מיכל הפלסטיק. שמור על מנורת 40 וואט על הגדרת האור האדום למשך שעתיים, ולאחר מכן עבור להגדרת האור הירוק באמצעות השלט המצורף למשך 16 השעות הנותרות.
    הערה: חובה לבצע הקרנת אור בכ-4 מעלות צלזיוס כדי למנוע עיוות חום לא רצוי של רקמת השקופיות. נקודת הפסקה: ניתן לבצע הקרנת אור במהלך הלילה וניתן לחדש את הפרוטוקול למחרת בבוקר.

4. תיוג נוגדנים לאחר הקרנת אור

  1. הסר את השקופיות מצלחת הפטרי וטבל אותן ב-1x PBS בצנצנת קופלין, צינור חרוטי של 50 מ"ל או דלי ממערכת צביעת השקופיות. הכן את תמיסת צביעת הנוגדנים העיקרית #2 (מחזור 1) (טבלת החומרים) בדילולים המומלצים (טבלה 1). השתמש ב-200 מיקרוליטר של התמיסה עבור כל שקופית.
  2. נדפו עודפי PBS מכל שקופית בודדת עם מגבון נטול מוך והקפידו לייבש את האזור סביב הטישו מבלי לגעת ברקמה עצמה. הנח את המגלשות בתא הלחות של השקופיות.
  3. מערבל בעדינות תמיסת צביעת נוגדנים ראשונית #2 (מחזור 1) והוסף 200 מיקרוליטר לכל שקופית, כדי להבטיח שכל הרקמה מכוסה.
  4. הנח את תא הלחות עם המגלשות בחזרה למיקרוגל והפעל את תוכנית הנוגדנים העיקרית למשך כ-30 דקות כמפורט בשלב 2.7
  5. במהלך תיוג הנוגדנים הראשוניים, הכינו את תמיסת צביעת הנוגדנים המשנית #1 (מחזור 1) (טבלת החומרים).
  6. לאחר השלמת תוכנית המיקרוגל, הסר את תא הלחות של השקופיות ושטוף כל שקופית 3-5x עם 1,000 מיקרוליטר של 1x PBS.
  7. נדפו עודפי PBS מכל שקופית בודדת עם ניגוב נטול מוך, מערבלו את תמיסת צביעת הנוגדנים המשנית והוסיפו 200 מיקרוליטר לכל שקופית.
  8. הנח את תא הלחות בשקופיות במיקרוגל והפעל את תוכנית הנוגדנים המשנית: תוכנית 2-1-2-1-2-1-2-1-2, כאשר "2" מציין 2 דקות ב-100 W ו-"1" מציין דקה אחת ב-0 W. בצע את התוכנית לעיל פעם אחת לתיוג נוגדנים משני.
  9. שטפו את השקופיות בהרחבה 3-5x עם 1 מ"ל של 1x PBS והסירו עודפי PBS מכל שקופית.
  10. הוסף תמיסת צביעת נוגדנים ראשונית #3 (מחזור 1) המכילה נוגדנים מצומדים ישירות לכל שקופית. בצע צביעת נוגדנים באמצעות המיקרוגל או החלופה (שעה אחת ב-37 מעלות צלזיוס) כמתואר בשלב 2.7.
  11. שטפו את השקופיות שוב 3-5x עם 1 מ"ל של 1x PBS והסירו בזהירות עודפי PBS מכל שקופית.
  12. הוסף 30 מיקרוליטר של מדיום הרכבה ישירות לכל קטע רקמה והנח כיסוי המכסה את כל קטע הרקמה. בדוק את המגלשה לאיתור בועות אוויר ודחף בועות אוויר להיקף המגלשה בלחץ עדין. חזור על התהליך עבור השקופיות הנותרות.
  13. הסר עודפי אמצעי הרכבה עם מגבון נטול מוך והשתמש במנקה עדשות אופטי כדי לנקות את כל השאריות שנותרו על פני הכיסוי. אפשר לכל השקופיות להתייצב למשך 10-15 דקות בטמפרטורת החדר לפני ביצוע רכישת תמונה במיקרוסקופ.

5. הגדרת מיקרוסקופיה ורכישת תמונות

  1. הפעל את מיקרוסקופ השדה הרחב ואת מקור האור LED8; הפעל את התוכנה. בחר את המטרה (כאן, יעד יבש של 20x/0.8). הנח את המצלמה במצב 16 סיביות בכרטיסיית התצורה . בחר את הערוצים הנדרשים על סמך הפלואורופורים הקיימים בלוחות הנוגדנים (ראה טבלה 1 להנחיות נוספות).
    הערה: השלבים הבאים מפורטים עבור המיקרוסקופ המוזכר. ניתן להשתמש במיקרוסקופ שדה רחב שווה ערך עם מקור אור דומה וקוביות סינון לעירור ופליטה של מספר פלואורופורים ושלב דיוק.
  2. נקה את הכיסוי עם מנקה עדשות ונייר עדשות מיד לפני ההדמיה. בדוק ויזואלית את הכיסוי והסר אבק או מוך מהמשטח לפני ההדמיה. מקם את השקופית בחוזקה בפינה השמאלית העליונה (או שווה ערך) של תוספת הבמה, כך שהרקמה תמוקם באופן עקבי במישור ה-XY (קריטי ליישור תמונות מחזוריות).
  3. הגדר את הגדרות הרכישה על ידי יצירת ערוץ המתאים לכל פלואורופור הכלול בלוח הנוגדנים. בחר את קוביית המסנן והנורית המתאימה עבור כל פלואורופור. התאם את העוצמה של כל LED ואת זמני החשיפה עבור כל ערוץ. ראה טבלה 1 לרשימה של הגדרות התמונה המשמשות כאן.
  4. לפני רכישת תמונה, בחר בערוץ Hoechst והפעל הצללה מקושרת. השתמש באשף הצללה מקושרת כדי להגדיר זאת עבור המטרה שנבחרה.
    הערה: פרוטוקול זה מפרט כיצד לבצע תמונות שקופיות שלמות באמצעות רכישת סריקות אריחים גדולות. יש צורך בתיקון הצללה או הצללה מקושרים כדי להתגבר על תאורה לא אחידה על פני תמונות אריחים.
  5. בתוכנה, לחץ על שידור חי כפתור כדי לדמיין את ערוץ Hoechst. השתמש בכפתור המיקוד הגס כדי להביא את חלק הרקמה למיקוד.
  6. בחר כל תעלה פלואורסצנטית והעריך את קטע הרקמה עבור דפוס הצביעה הצפוי עבור כל הנוגדנים המסומנים פלואורסצנטית במחזור.
  7. בחר נווט בתוכנה. באמצעות תעלת Hoechst ופונקציית הספירלה ב-Navigator, מפה את כל קטע הרקמה או אזור העניין שיש לצלם. אם מספר מקטעי רקמה יצולמו בכל שקופית, חזור על שלב זה כדי ליצור מפה של הרקמה באמצעות Navigator.
  8. זהה את ההחזר על ההשקעה שיש לצלם באמצעות המצולע, שרביט הקסמים או כלים אחרים לבחירת החזר ROI ב-Navigator. צייר בזהירות את מתאר הרקמה כדי ללכוד את האריחים הקטנים ביותר הדרושים כדי לכסות את ההחזר על ההשקעה הרצוי. מחק אריחים נוספים כדי לקצר את זמן הרכישה הכולל.
  9. לאחר יצירת החזר ROI, סקור והתאם את הגדרות הערוץ כדי למזער פיקסלים רוויים ולייעל את האות לרעש. בחר את טבלת בדיקת המידע של מפת החום בחלון תצוגת התמונה. הצבעים מציינים את רמת המילוי של הפיקסלים, כאשר אדומים, כתומים, צהובים ולבנים מציינים וריאציות קלות יותר לראייה. פיקסלים כחולים מציינים פיקסלים רוויים. כדי למנוע אובדן מידע ופגיעה באיכות התמונה, צמצמו את זמן החשיפה כדי למזער את מספר הפיקסלים הרוויים (כחולים).
  10. ב - Navigator, השתמש בכלי מפת מיקוד כדי ליצור מפה טופוגרפית של הרקמה. הגדר נקודת מפת מיקוד כל 3-4 FOVs עבור אריחים גדולים או דגימות לא אחידות.
    הערה: שלב זה הוא קריטי עבור סריקות האריחים הגדולים הנדרשות להדמיית שקופיות שלמות. באופן כללי, איכות התמונה משתנה עם מספר נקודות מפת המיקוד שנבחרו; עם זאת, תהליך זה עשוי לגזול זמן רב, במיוחד עבור סריקות אריחים גדולות.
    1. צור נקודות מפת מיקוד בסדר שבו הן ייסרקו על ידי המיקרוסקופ. כדי להתאים את סדר סריקת האריחים של המיקרוסקופ שאליו מתייחסים, בחר נקודות מפת מיקוד לאורך נתיב נחש התואם את הנתיב המשמש את המיקרוסקופ.
    2. הגדר את נקודת מפת המיקוד הראשונה באמצעות פוקוס ידני. השתמש במיקוד אוטומטי עבור נקודות מפת המיקוד הנותרות. שבו וצפו כדי לוודא שהמיקוד האופטימלי נבחר עבור כל נקודת מפת מיקוד. כוונן ידנית את נקודות מפת המיקוד לפי הצורך. הגדל את הטווח המשמש למציאת כל נקודת מפת מיקוד עבור רקמות לא אחידות או גדולות.
  11. הגדר את העיבוד באמצעות הפרמטרים הבאים: סליקה חישובית בנפח קטן (SVCC) עם מקדם שבירה (RI) המוגדר כך שיתאים למדיום ההרכבה (כאן, 1.4); חוזק מוגדר ל-98%, וגודל תכונה מוגדר ל-2,000 ננומטר עבור סמני ממברנה או 3,000 ננומטר עבור סמנים גרעיניים. הפעל את פרוטוקול הניקוי החישובי במהלך רכישת תמונה.
  12. התחל את סריקת האריחים. רשום את מספר האריח ושמור על החזר ההשקעה קבוע לאורך כל המחזורים.
  13. לאחר רכישת התמונה, מזג את התמונות שנוקו מבחינה חישובית עם Mosaic Merge שנמצא בכרטיסייה Process , כאשר האפשרות Smooth נבחרה. בדוק חזותית כל תמונה לאיתור שגיאות תפירה וחזור על Mosaic Merge עם פרמטרים חדשים אם קיימות שגיאות אריחים.
    הערה: תמונות לא מיושרות ימנעו רישום של תמונות שנרכשו באופן איטרטיבי.
  14. במידת הצורך, השתמש במודול הפרדת הצבע כדי לפצות על זליגה ספקטרלית בין ערוצים כמתואר קודם לכן5.

6. מחזורים של השבתת צבע, תיוג נוגדנים ורכישת תמונות

  1. לאחר השלמת רכישת התמונה, טבלו את השקופיות בצינור חרוטי של 50 מ"ל של PBS סטרילי 1x עד שהכיסויים נופלים. אם הכיסוי לא נופל, העבירו את ה-PBS ישירות מעל המגלשה או השתמשו בפינצטה כדי להסיר בעדינות את הכיסוי.
  2. הכן תמיסת ליתיום בורוהידריד (LiBH4) על ידי מדידת 3-5 מ"ג אבקה לתוך סירת משקל מפלסטיק. הוסף diH2O ביחס של 1:1 ישירות לאבקה (למשל, 3.2 מ"ג של LiBH4 ו-3.2 מ"ל של diH2O) והומוגניזציה של התמיסה עם פיפטה. השתמש במזרק כדי להעביר את התמיסה דרך מסנן של 0.2 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי של 50 מ"ל ורשום את הריכוז והזמן המדויק שבו נוצרה התמיסה. הניחו לתמיסה לדגור בטמפרטורת החדר למשך 3-5 דקות עד שנראות בועות גדולות בכל התמיסה.
    הערה: אנו ממליצים להשתמש בתמיסת השבתת הצבע תוך 4 שעות מההכנה. זהירות: בצע את השלבים הבאים במכסה אדים כימי והשתמש בציוד מגן אישי מתאים (PPE). תגובה זו יכולה לייצר גז מימן, שהוא דליק מאוד. חשוב לעבוד עם כמויות קטנות של LiBH4 (<10 מ"ג) בכל עת. להדרכה נוספת, צפו בסרטוני ההדרכה כיצד להכין את LiBH4 בבטחה במאגר הידע של IBEX10,11.
    יש להחליף את בקבוקון LiBH4 לאחר 4 שבועות של שימוש עקב ירידה ביעילות ההלבנה לאחר חשיפה חוזרת לאוויר. אנו ממליצים לקנות כמויות קטנות של LiBH4 (1 גרם).
  3. הסר כל שקופית מהשריית PBS 1x, נדף עודפי PBS עם מגבון נטול מוך, והנח אותו בתא הלחות של השקופית.
  4. טפל בכל מגלשה שאינה מכוסה עם LiBH4 למשך 30 דקות על ידי פיפטינג התמיסה ישירות על המגלשה בנפח מספיק כדי לכסות את הרקמה. הסר את תמיסת LiBH4 הישנה מכל שקופית ורענן עם מנה חדשה של LiBH4 ב-10 דקות ו-20 דקות מאותו פתרון מלאי LiBH4 .
  5. שטפו את השקופיות בהרחבה 3-5x עם 1x PBS. השתמש בהחלפות מהירות של PBS, השריית השקופיות למשך דקה אחת לכל כביסה.
  6. כדי לרכוש תמונה לחיסור רקע, הנח כיסוי חדש על כל שקופית כמתואר בשלבים 4.12-4.13 ורכוש תמונות של הרקמה לאחר השבתת הצביעה. צור פרויקט חדש עבור תמונת חיסור הרקע וחזור על שלבים 5.2-5.14 כדי להשיג את התמונה. תמונה המשתמשת באותו מספר אריחים, ערוצים, הגדרות ערוצים ו-FOVs שנקבעו עבור תמונת מחזור 1. שמור את נקודות מפת המיקוד באותם FOVs, אך השתמש במיקוד אוטומטי כדי להתאים כל נקודת מפת מיקוד עבור תמונה חדשה זו.
    הערה: השתמש בערוץ המכיל את הסמן החוזר (Hoechst) כדי לזהות מבנים ייחודיים (צורות גרעיניות) הקיימים בתמונה 'חיה' (תמונת חיסור רקע, למשלample) ובתמונה הקודמת (מחזור 1).
  7. כדי למזער אותות פלואורסצנטיים לא ספציפיים מנוגדנים ביוטיניים במחזור הנוגדנים השני, בצע חסימת אבידין וביוטין.
    1. נדפו עודפי PBS ומרחו תמיסת חסימת avidin על כל שקופית בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.
    2. שטפו את השקופיות פי 3-5 עם 1x PBS והסירו עודפי PBS בסיום הכביסה.
    3. מרחו תמיסת חסימת ביוטין על כל שקופית בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות ושטפו את השקופיות 3-5x עם 1x PBS כמו בשלב 6.7.2.
  8. הכן מאגר חסימה חדש ללא BSA (מחזור 2) (טבלת חומרים) עבור
    תמיסת צביעת נוגדנים ראשונית #4 (מחזור 2) ותמיסת צביעת נוגדנים משנית #2 (מחזור 2).
    הערה: פתרונות אלה לא ידרשו אלבומין בסרום בקר מכיוון ש-BSA יכול לפגוע בשלב חסימת אבידין/ביוטין.
  9. לדלל נוגדנים ראשוניים בריכוזים המומלצים על ידי היצרן בתמיסת צביעת הנוגדנים העיקריים #4 (מחזור 2). מערבל בעדינות את התמיסה הזו והוסף לכל שקופית בתוך תא הלחות, וודא שהרקמה מכוסה לחלוטין בתמיסת הנוגדנים העיקרית. הנח את תא הלחות עם המגלשות לתוך המיקרוגל והפעל את תוכנית הנוגדנים העיקרית למשך כ-30 דקות כמפורט בשלב 2.7-2.8.
  10. בצע תיוג נוגדנים משני עם תמיסת צביעת נוגדנים משנית #2 (מחזור 2) כמפורט בשלבים 4.6-4.9. לאחר השלמת הצביעה, הנח כיסוי חדש על כל שקופית כמתואר קודם לכן בשלבים 4.12-4.13. הנח את השקופית בחזרה על המיקרוסקופ tagה ומקם מחדש את השקופית כך שתהיה באותו מישור XY עבור התמונות הקודמות.
    הערה: השתמש בערוץ המכיל את הסמן החוזר (Hoechst) כדי לזהות מבנים ייחודיים (צורות גרעיניות) הקיימים בתמונה 'חיה' (מחזור 2, למשלample) ובתמונה הקודמת (מחזור 1).
  11. צור פרויקט חדש עבור תמונת מחזור 2 וחזור על שלבים 5.2-5.14 כדי להשיג את תמונת מחזור 2. תמונה המשתמשת באותו מספר אריחים, ערוצים, הגדרות ערוצים ו-FOVs שנקבעו עבור תמונת מחזור 1. שמור את נקודות מפת המיקוד באותם FOVs אך השתמש במיקוד אוטומטי כדי להתאים כל נקודת מפת מיקוד עבור תמונה חדשה זו. לאחר רכישת תמונת מחזור 2, המשך ליישור התמונה או חזור על השלבים בסעיף 6 למחזורים נוספים עם נוגדנים מצומדים ישירות. הערה: השתמש בערוץ המכיל את הסמן החוזר (Hoechst) כדי לזהות מבנים ייחודיים (צורות גרעיניות) הקיימים בתמונה 'החיה' (תמונת מחזור 2, למשלample) ובתמונה הקודמת (מחזור 1). מחזורים נוספים דורשים נוגדנים מצומדים ישירות מכיוון ש-IBEX אינו מסיר נוגדנים.

7. יישור תמונה

  1. המר תמונות גולמיות מקבצי .lif פלט המיקרוסקופ לקבצי .ims עם ממיר הקבצים החינמי ועיבוד תמונה עם תוכנת הקוד הפתוח כפי שתואר קודם לכן5 ומפורט בסרטונים במאגר הידע של IBEX10,11.
  2. עבור כל מחזור הדמיה, ערוך את הקובץ והחל את כל שלבי העיבוד הרצויים (לדוגמה, מתן שמות לערוץ, פסאודו-צביעה של ערוץ).
    1. בצע חיסור רקע וסף ערוצים באמצעות פונקציות אריתמטיקה של ערוצים שנוצרו עבור SimpleITK כדי להקטין את אות האוטופלואורסצנטי (https://niaid.github.io/imaris_extensions/XTChannelArithmetic.html).
      הערה: אנו מבצעים שלבים אלה בכל תמונה (למשל, מחזור 1, מחזור 2) לפני יישור אותם לתמונה מורכבת אחת. הסיבה לכך היא שקל יותר לעבוד על התמונות הקטנות והבודדות מאשר על התמונה המשולבת הגדולה יותר.
  3. תכנן אסטרטגיית שמות עקבית לשימוש בתוכנת הרישום. תן שם לערוצים עם קידומת-מפריד-תו-פוסט-קידומת (למשל 'Cycle1 CD8_AF647') עם רווח כתו מפריד כדי לציין את הערוץ שבו נעשה שימוש בנוגדני אנטי-CD8 AF647 במחזור הראשון.
    הערה: עיין בסיומת קובץ העזרה לקבלת פרטים נוספים: https://niaid.github.io/imaris_extensions/XTRegisterSameChannel.html.
  4. לאחר שכל הערוצים קיבלו שמות מתאימים, הפעל את תוכנת הרישום, לחץ על Imaris Extensions | מניית SimpleITK | אפין.
  5. העלה את קובץ ה- .ims עבור כל מחזור באמצעות לחצן העיון לצד שמות קבצים. הזן את תו הפרדת הקידומת של שם הערוץ. אם אתה פועל לפי הדוגמה לעיל, הקלד רווח בודד ולאחר מכן לחץ על הבא.
  6. בחר את ערוץ הרישום המשמש כסמן הנאמנות המשותף בין מחזורים (למשל Hoechst).
  7. בחר את התמונה הקבועה, התמונה שאליה יירשמו תמונות אחרות.
    הערה: אנו ממליצים להירשם למחזור 2 של תמונות איטרטיביות.
  8. בחר את הספרייה הרצויה עבור 'קובץ הפלט'. האפשרות התחל רישום ברזולוציה תוגדר ברזולוציה מקסימלית כברירת מחדל כדי לאפשר את הרישום הטוב ביותר האפשרי. אם כוח המחשוב מוגבל, צמצם פרמטר זה.
    הערה: עבור הנתונים המתוארים כאן (12-15 GB לתמונה) השתמשנו ברזולוציה מקסימלית של 5.
  9. לחץ על הירשם כדי להתחיל. לאחר השלמת ההרשמה, המתן עד שיופיע כפתור הדגימה מחדש ושמור תמונה משולבת , לחץ עליו והמתן עד שסרגל ההתקדמות יגיע לסיום.
  10. פתח את קובץ הפלט שהושלם בתוכנת העיבוד. התמונה הרשומה עם כל המחזורים ומידע הערוץ תהיה זמינה ומוכנה לניתוח או לפרסום.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

תכנון פאנל הדמיה מבוסס נוגדנים מרובים דורש זמן, מאמץ ומשאבים משמעותיים12. אתגרים אלה בולטים במיוחד בעת תכנון פאנל עבור דגימות FFPE בארכיון מרקמות אוטו-פלואורסצנטיות מאוד כמתואר כאן (איור 1). כדי להתגבר על אתגרים אלה, זיהינו תחילה את הפלואורופורים הבהירים ביותר התואמים לפרוטוקול השבתת הצבע שלנו (טבלה 1). לדוגמה, דווח כי לנוגדנים משניים של Alexa Fluor Plus יש אות לרעש גדול פי 4 במבחני אימונופלואורסצנציה בהשוואה לעמיתיהם של Alexa Fluor (מקור: גיליונות נת...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

פתולוגיה ריאתית קלינית משחפת ריאתית מאופיינת בדלקת גרנולומטית נמקית. פתולוגיה ריאתית NTM מתרחשת בעיקר בשתי אוכלוסיות חולים נפרדות עם שני דפוסים פתולוגיים נפרדים: פגיעה ריאתית מבודדת המסומנת על ידי דלקת גרנולומטית עם מחיקת סימפונות והיווצרות חורים באנשים בעלי יכולת חיסונית, או מחלה נודולרית מפושטת הפוגעת בריאות ובאיברים אחרים אצל אנשים חסרי חיסון 13,14,15,16. כא...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

A.J.R. הוא עובד ב-Leica Microsystems, Inc. המחברים האחרים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי תוכנית המחקר הפנימי של DIR/NIAID, NCI ו-NHLBI. איור 1 נוצר באמצעות BioRender תחת הסכם רישיון מוסדי עם ה-NIH.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.3% טריטון-X-100סיגמא-אולדריץ'T8787פתרון לחסימת מאגר
1% BSAסיגמא-אולדריץ'א4503פתרון לחסימת מאגר
1% בלוק BD Fc אנושיBD Biosciences564220חסימת Fc נדרשת לחסימת מאגר
מנורת לד 150 וואטאמזוןB07VH3CVSFמקור אור LED להקרנת רקמות
1x PBS ג'יבקו10010-023פתרון לחסימת שלבי חיץ וכביסה
מיכל אחסון 20 ליטראמזוןB001B1C4G0מיכל לתהליך הקרנת אור
מנורת LED הצפה RGBW 40 W אמזוןB08QFPJSMDמקור אור RGB להקרנת רקמות
אג85באבקםab43019/NAנוגדנים להדמיית IBEX. ראה טבלה 1.
אקטין שריר חלק אלפא DyLight 755נובוס ביולוגיתNBP2-345221R/NAנוגדנים להדמיית IBEX. ראה טבלה 1.
ערכת חסימת אבידין/ביוטיןאבקםאב64212תמיסת חסימת אבידין וביוטין
BD ציטופיקס / ציטופרםBD Biosciences554714פתרון קיבוע
תמיסת הסרת שעווה BONDלייקה ביוסיסטמסNC0221076פתרון דה-פרפיניזציה
פתרון אחזור אפיטופ BOND 1לייקה ביוסיסטמסNC0235529תמיסת אחזור אפיטופ pH 6 מבוססת ציטראט (ER1)
פתרון אחזור אפיטופ BOND 2לייקה ביוסיסטמסNC0235530תמיסת אחזור אפיטופ pH 9 מבוססת EDTA (ER2)
מערכת גילוי מחקר BONDלייקה ביוסיסטמסNC0396648מגיב צביעת מחקר אוטומטי
מכתש מחקר BOND RXלייקה ביוסיסטמסנהפלטפורמת צביעת מחקר אוטומטית
פתרון כביסה BONDלייקה ביוסיסטמסNC0221077מאגר כביסה
תקליטור 15BD Biosciences347420/AB_400298נוגדנים להדמיית IBEX. ראה טבלה 1.
CD20 eFluor 660תרמו פישר סיינטיפיק50-0202-82/AB_11150959נוגדנים להדמיית IBEX. ראה טבלה 1.
CD4 אלקסה פלואור 488מו"פ D מערכותFAB8165G/AB_2728839נוגדנים להדמיית IBEX. ראה טבלה 1.
CD45 פיקואריתרין (PE)נובוס ביולוגיתNBP2-34528PE/NAנוגדנים להדמיית IBEX. ראה טבלה 1.
CD68 iFluor 594Caprico Biotechnologies1064135/AB_2892745נוגדנים להדמיית IBEX. ראה טבלה 1.
חמור נגד עזים IgG Alexa Fluor Plus 488תרמו פישר סיינטיפיקA32814/AB_2762838נוגדנים להדמיית IBEX. ראה טבלה 1.
חמור נגד עכבר IgG Alexa Fluor Plus AF647תרמו פישר סיינטיפיקA32787/ AB_2762830נוגדנים להדמיית IBEX. ראה טבלה 1.
חמור נגד עכבר IgM Alexa Fluor 488ג'קסון אימונוסקר715-545-020/AB_2340844נוגדנים להדמיית IBEX. ראה טבלה 1.
חמור נגד ארנב IgG Alexa Fluor Plus AF555תרמו פישר סיינטיפיקA32794/AB_2762834נוגדנים להדמיית IBEX. ראה טבלה 1.
מערכת צביעה EasyDipהיצע למשתמשים חדשים5300 קיטמערכת צביעת שקופיות
פלואורומאונט - Gתרמו פישר סיינטיפיק00-4958-02מדיית הרכבה
הוכסטביוטיום40046כתם גרעיני להדמיית IBEX. ראה טבלה 1.
ממיר קבצים Imaris x64 10.2.0אימאריס אוקספורד אינסטרומנטסממיר קבצים בחינם
תוכנת ImarisViewer x64 10.2.0אימאריס אוקספורד אינסטרומנטסתוכנה חינמית לעיבוד תמונה
עט ImmEdgeמעבדות וקטורH-4000עט מחסום הידרופובי
ליתיום בורוהידריד (1 גרם)STREM כימיקלים93-0397כימיקל להשבתת צבע, קנו כמויות קטנות של כימיקל זה (1 גרם)
ביוטין Lumicanמו"פ D מערכותBAF2846נוגדנים להדמיית IBEX. ראה טבלה 1.
משקפי Micro CoverVWR48393-241כיסויי זכוכית
פאן-ציטוקרטין אלקסה פלואור 750נובוס ביולוגיתNBP2-33200AF750/AB_2868569נוגדנים להדמיית IBEX. ראה טבלה 1.
מערכת מיקרוגל PELCO BioWave Proטד פלה בע"מ36500-230מיקרוגל מדעי שאינו מחמם
PELCO SteadyTemp Proטד פלה בע"מ50062בקרת טמפרטורה אוטומטית לחלוטין למיקרוגל מדעי
סימפל איטקתוכנת קוד פתוחתוכנת רישום ועיבוד ערוצים
סטרפטווידין אלכסה פלואור 594תרמו פישר סיינטיפיקעונה 11227מגיב תיוג להדמיית IBEX. ראה טבלה 1.
מיקרוסקופ שדה רחבלייקה מיקרוסיסטמסנהמצלמת THUNDER של Leica Microsystems עם מקור אור LED8 ותוכנת LAS X (3.7.1.21655). להדמיית פלואורסצנטיות, נעשה שימוש במסנן מרובע פס מותאם אישית עם גלגל מסנן חיצוני (PN: 11536075) עם שני מסננים נוספים בעלי פס יחיד (PN: 8118215) להדמיית שבעה ערוצי צבע בכל מעבר. קווי עירור המסנן, הדיכרואי והפליטה הם (1) קוביית Quad-Band: דיכרואי ב-391/32, 479/33, 554/24, 638/31, ללא מסנני עירור או פליטה; (2) גלגל מסנן חיצוני מיקום 1: 434/32, מיקום 2: 520/40, מיקום 3: 585/20, מיקום 4: 720/60, מיקום 5: מעבר; (3) פס יחיד 1— עירור 585/22, 594 דיכרואיק, פליטת 625/30; (4) פס יחיד 2— עירור 635/20, 647 דיכרואיק, פליטת 667/30.
מנקה עדשות אופטי ZeissאמזוןB00GPVQVCOמיקרוסקופ מנקה עדשות אובייקטיבי
<חזק>נוגדנים
אג85באבקםאילן אלכסנדרארנב פוליקלונלי IgG, מחזור 1
אקטין שריר חלק אלפא DyLight 755נובוס ביולוגיתNBP2-345221R1A4/asm-1, מחזור 1
CD4 אלקסה פלואור 488מו"פ D מערכותFAB8165GIgG עז פוליקלונלית, מחזור 1
CD8 אלקסה פלואור 647ביולג'נד372906C8/144B, מחזור 1
CD68 iFluor 594Caprico Biotechnologies1064135KP1, מחזור 1
חמור נגד עזים IgG Alexa Fluor Plus 488תרמו פישר סיינטיפיקא32814חמור רב-שבטי, מחזור 1
חמור נגד עכבר IgG Alexa Fluor Plus AF647תרמו פישר סיינטיפיקא32787חמור רב-שבטי, מחזור 1
חמור נגד ארנב IgG Alexa Fluor Plus AF555תרמו פישר סיינטיפיקא32794חמור רב-שבטי, מחזור 1
הוכסטביוטיום40046תווית גרעינית, מחזור 1
תקליטור 15BD Biosciences347420MMA, מחזור 2
CD20 eFluor 660תרמו פישר סיינטיפיק50-0202-82L26, מחזור 2
CD45 פיקואריתרין (PE)נובוס ביולוגיתNBP2-34528PE2B11 + PD7/26, מחזור 2
חמור נגד עכבר IgM Alexa Fluor 488ג'קסון אימונוסקר715-545-020חמור רב-שבטי, מחזור 2
ביוטין Lumicanמו"פ D מערכותBAF2846IgG עז פוליקלונלית, מחזור 2
פאן-ציטוקרטין אלקסה פלואור 750נובוס ביולוגיתNBP2-33200AF750AE-1/AE-3, מחזור 2
סטרפטווידין אלכסה פלואור 594תרמו פישר סיינטיפיקעונה 11227לא ישים, מחזור 2
הוכסטביוטיום40046מחזור 2
<חזק>פתרונות
Blocking Buffer (מחזור 1)
טריטון-X-100סיגמא-אולדריץ'T87870.3% בנפח
BSAסיגמא-אולדריץ'א45031% בנפח
בלוק BD Fc אנושיBD Biosciences5642201% בנפח
1x PBS ג'יבקו10010-02397.7% לפי נפח
<תמיסת צביעת נוגדנים חזקה>ראשונית #1 (מחזור 1)
מאגר חוסם (מחזור 1)ראה למעלההגדלת הנפח לאחר הוספת נוגדנים
הוכסטביוטיום400461:5000
CD8 AF647ביולג'נד3729061:10
<תמיסת צביעת נוגדנים חזקה>עיקרית #2 (מחזור 1)
מאגר חוסם (מחזור 1)ראה למעלההגדלת הנפח לאחר הוספת נוגדנים
CD4  AF488מו"פ D מערכותFAB8165G1:10
אג85באבקםab43019/NA1:100
<תמיסת צביעת נוגדנים חזקה>משנית #1 (מחזור 1)
מאגר חוסם (מחזור 1)ראה למעלההגדלת הנפח לאחר הוספת נוגדנים
חמור נגד עיזים AF Plus 488תרמו פישר סיינטיפיקA32814/AB_27628381:100
חמור נגד ארנב AF פלוס 555תרמו פישר סיינטיפיקA32794/AB_27628341:100
חמור נגד עכבר AF פלוס 647תרמו פישר סיינטיפיקA32787/AB_27628301:50
<תמיסת צביעת נוגדנים חזקה>ראשונית #3 (מחזור 1)
מאגר חוסם (מחזור 1)ראה למעלההגדלת הנפח לאחר הוספת נוגדנים
CD68 iF594Caprico Biotechnologies10641351:10
א-SMA DL755נובוס ביולוגיתNBP2-345221R/NA1:30
מאגר חוסם ללא BSA (מחזור 2) 
טריטון-X-100סיגמא-אולדריץ'T87870.3% בנפח
בלוק BD Fc אנושיBD Biosciences5642201% בנפח
1x PBS ג'יבקו10010-02398.7% לפי נפח
<תמיסת צביעת נוגדנים חזקה>עיקרית #4 (מחזור 2)
מאגר חוסם ללא BSA (מחזור 2)ראה למעלההגדלת הנפח לאחר הוספת נוגדנים
תקליטור 15BD Biosciences3474201:30
ביוטין Lumicanמו"פ D מערכותBAF28461:100
CD45 PEנובוס ביולוגיתNBP2-34528PE1:20
CD20 eFluor 660תרמו פישר סיינטיפיק50-0202-821:10
פאן-ציטוקרטין AF750נובוס ביולוגיתNBP2-33200AF7501:10
<תמיסת צביעת נוגדנים משנית חזקה>משנית #2 (מחזור 2)
מאגר חוסם ללא BSA (מחזור 2)ראה למעלההגדלת הנפח לאחר הוספת נוגדנים
חמור נגד עכבר IgM AF488ג'קסון אימונוסקר715-545-020/AB_23408441:100
סטרפאווידין AF594תרמו פישר סיינטיפיקעונה 112271:200

מקורות

  1. Global tuberculosis report 2023. , World Health Organization. https://iris.who.int/bitstream/handle/10665/373828/9789240083851-eng.pdf?sequence=1 (2023).
  2. Dahl, V. N., et al. Global trends of pulmonary infections with nontuberculous mycobacteria: A systematic review. Int J Infect Dis. 125, 120-131 (2022).
  3. Cadena, A. M., Fortune, S. M., Flynn, J. L. Heterogeneity in tuberculosis. Nat Rev Immunol. 17 (11), 691-702 (2017).
  4. Radtke, A. J., et al. Ibex: A versatile multiplex optical imaging approach for deep phenotyping and spatial analysis of cells in complex tissues. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (52), 33455-33465 (2020).
  5. Radtke, A. J., et al. Ibex: An iterative immunolabeling and chemical bleaching method for high-content imaging of diverse tissues. Nat Protoc. 17 (2), 378-401 (2022).
  6. Hickey, J. W., et al. Spatial mapping of protein composition and tissue organization: A primer for multiplexed antibody-based imaging. Nat Methods. 19 (3), 284-295 (2022).
  7. Duong, H., Han, M. A multispectral led array for the reduction of background autofluorescence in brain tissue. J Neurosci Methods. 220 (1), 46-54 (2013).
  8. Nolta, N. F., Liberti, A., Makol, R., Han, M. Gelatin embedding and LED autofluorescence reduction for rodent spinal cord histology. J Neurosci Methods. 346, 108924(2020).
  9. Radtke, A. J., et al. Multi-omic profiling of follicular lymphoma reveals changes in tissue architecture and enhanced stromal remodeling in high-risk patients. Cancer Cell. 42 (3), 444-463.e10 (2024).
  10. Radtke, A. J., et al. The IBEX knowledge-base: A central resource for multiplexed imaging techniques. PLoS Biol. 23 (3), e3003070(2025).
  11. Yaniv, Z., et al. The IBEX imaging knowledge-base: A community resource enabling adoption and development of immunofluoresence imaging methods. ArXiv. , (2024).
  12. Quardokus, E. M., et al. Organ mapping antibody panels: A community resource for standardized multiplexed tissue imaging. Nat Methods. 20 (8), 1174-1178 (2023).
  13. Mcshane, P. J., Glassroth, J. Pulmonary disease due to nontuberculous mycobacteria: Current state and new insights. Chest. 148 (6), 1517-1527 (2015).
  14. Hsu, A. P., et al. Mutations in GATA2 are associated with the autosomal dominant and sporadic monocytopenia and mycobacterial infection (monomac) syndrome. Blood. 118 (10), 2653-2655 (2011).
  15. Vinh, D. C., et al. Autosomal dominant and sporadic monocytopenia with susceptibility to mycobacteria, fungi, papillomaviruses. Blood. 115 (8), 1519-1529 (2010).
  16. Filipe-Santos, O., et al. X-linked susceptibility to mycobacteria is caused by mutations in nemo impairing CD40-dependent IL-12 production. J Exp Med. 203 (7), 1745-1759 (2006).
  17. Galeotti, T., Van Rossum, G. D., Mayer, D. H., Chance, B. On the fluorescence of NAD(P)H in whole-cell preparations of tumours and normal tissues. Eur J Biochem. 17 (3), 485-496 (1970).
  18. Schneckenburger, H., Gessler, P., Pavenstadt-Grupp, I. Measurements of mitochondrial deficiencies in living cells by microspectrofluorometry. J Histochem Cytochem. 40 (10), 1573-1578 (1992).
  19. Harman, D. Lipofuscin and ceroid formation: The cellular recycling system. Adv Exp Med Biol. 266, 3-15 (1989).
  20. Brunk, U. T., Terman, A. Lipofuscin: Mechanisms of age-related accumulation and influence on cell function. Free Radic Biol Med. 33 (5), 611-619 (2002).
  21. Jung, T., Bader, N., Grune, T. Lipofuscin: Formation, distribution, and metabolic consequences. Ann N Y Acad Sci. 1119, 97-111 (2007).
  22. Sherratt, M. J. Tissue elasticity and the ageing elastic fibre. Age (Dordr). 31 (4), 305-325 (2009).
  23. Laurent, G. J. Lung collagen: More than scaffolding. Thorax. 41 (6), 418-428 (1986).
  24. Lakowicz, J. R. Principles of frequency-domain fluorescence spectroscopy and applications to cell membranes. Subcell Biochem. 13, 89-126 (1988).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

דימוי מולטיפלקסדגימות עם פלואורסצנציה עצמיתפרוטאומיקה מרחביתרקמת ריאה בקיבוע פורמלין ושימור בפרפין (FFPE)פרוטוקול הקרנה פוטוניתתכנון פאנל נוגדניםדימוי של סלייד שלםדלקת גרנולומטניתמיפוי תאי חיסון
זרימת עבודה אופטימלית להלבנה איטרטיבית מרחיבה את ההדמיה המרובה של דגימות קליניות אוטו-פלואורסצנטיות מאוד
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.