Method Article

זרימת עבודה אופטימלית להלבנה איטרטיבית מרחיבה את ההדמיה המרובה של דגימות קליניות אוטו-פלואורסצנטיות מאוד

DOI:

10.3791/67980

⸱

July 11th, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Critical Care Medicine and Pulmonary Branch, National Heart, Lung and Blood Institute, National Institutes of Health, 2Lymphocyte Biology Section and Center for Advanced Tissue Imaging, Laboratory of Immune System Biology, NIAID, NIH, 3Leica Microsystems Inc., 4T Lymphocyte Biology Section, Laboratory of Parasitic Diseases, National Institute of Allergy and Infectious Disease, National Institutes of Health

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

היישום של טכניקת הקרנה פוטו-ארבלית בעלות נמוכה בשיטת IBEX הידנית מאפשר הדמיה אופטימלית של רקמות אנושיות עם אוטופלואורסצנציה טבעית משמעותית. פרוטוקול זה מפרט כיצד להשיג תמונות מרובות ושקופיות שלמות מדגימות קליניות בארכיון באמצעות מיקרוסקופ הפוך, ריאגנטים זמינים באופן נרחב ותוכנת קוד פתוח ליישור ועיבוד תמונה.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השכיחות של מחלות ריאה עקב מיקובקטריות שאינן שחפתיות (NTM) גדלה ברחבי העולם. למרות שמחלת ריאות הנגרמת על ידי NTM מופיעה לעתים קרובות עם ברונכיאקטזיס, קשריות ריאה ומחלת חללים, תגובת המארח הקשורה לדפוסי פגיעה ריאתית מובהקים אלה לא אופיינה היטב באתרה. ביקשנו להעריך מנגנונים של פתולוגיה הנגרמת על ידי NTM על ידי ביצוע ניתוח פנוטיפי עמוק של אוכלוסיות תאי חיסון ברקמת הריאה מאנשים עם מחלת NTM בהשוואה לתקן זהב של דלקת גרנולומטית, מחלת ריאות שחפת (שחפת).

גושי ריאות קבועים בפורמלין, משובצים בפרפין (FFPE) מחולים עם NTM מפושט, NTM ריאתי או מחלת שחפת ריאתית נחתכו ונצבעו בעקבות גרסה שונה של שיטת ההדמיה IBEX. אופטימיזציה של שיטת IBEX נדרשה תחילה כדי לטפל בפלואורסצנטיות האנדוגנית המשמעותית של קטעי ריאה בשל הצפיפות הגבוהה של קולגן, אלסטין ואריתרוציטים שמקורם ברקמת הריאה, המחמירה על ידי שימור FFPE וגיל גושי ה-FFPE. בפרוטוקול זה, אנו מפרטים פרוטוקול קרינת אור ושיטת אחזור אנטיגן שונה המפחיתה את האוטופלואורסצנציה של דגימות בארכיון קליני.

יתר על כן, אנו מספקים הנחיות לגבי תכנון פאנל נוגדנים, כולל אתגרים נפוצים כגון תגובתיות צולבת, אובדן אפיטופ בעקבות קרינת אור, חפיפה ספקטרלית בין פלואורופורים סמוכים ואות לרעש נמוך עבור מטרות מסוימות. כדי להקל על הדמיה יעילה של קטעי רקמת ריאה שלמים, השקופיות צולמו במיקרוסקופ רחב שדה ועובדו לאחר מכן עם תוכנת קוד פתוח כדי לשפר את איכות התמונה. יחד, זרימת עבודה זו עונה על צורך קריטי על ידי תיעוד כיצד להשיג תמונות מרובות מאוד, ברזולוציה גבוהה, שקופיות שלמות מדגימות מאתגרות באמצעות מכשור וריאגנטים זמינים באופן נרחב. מעבר להדמיה כמותית של דגימות קליניות, ניתן ליישם טכניקות אלו על סוגי דגימות מגוונים כדי להתגבר על מקורות פלואורסצנטיים אנדוגניים ואקסוגניים כאחד.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שחפת היא אחד מגורמי המוות המובילים, כאשר כ-1.3 מיליון אנשים מתים מזיהום בשחפתמדי שנה. למרות שאינה קטלנית כמו שחפת, חלה עלייה משמעותית בזיהומים ריאתיים ומחלות שלאחר מכן הנגרמות על ידי מיקובקטריות שאינן שחפתיות (NTM) בשנים האחרונות2. ברמת הרקמה, התגובה החיסונית של המארח לזיהום Mycobacterium tuberculosis ריאתי (Mtb) נחקרה היטב וכוללת היווצרות גרנולומות, אגרגטים הטרוגניים של לימפוציטים, תאים דנדריטיים, מקרופאגים ונויטרופילים3. בעוד שדלקת גרנולומטית היא גם מאפיין בסיסי של חסינות המארח לזיהום NTM, אוכלוסיות תאי החיסון והמאפיינים המרחביים של תגובה זו נותרו לא נח....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

קטעי רקמת ריאה של נתיחה שלאחר המוות וכריתת רקמת ריאה כירורגית נאספו תחת פרוטוקול 09-H-0172 (NCT00943514), היסטוריה טבעית של ברונכיאקטזיס, במעבדה לפתולוגיה של המרכז הקליני של המכונים הלאומיים לבריאות. פרוטוקול זה אושר על ידי IRB, והמשתתפים סיפקו הסכמה מדעת.

1. אחזור אנטיגן אוטומטי

הערה: דה-פרפיניזציה ואחזור אנטיגן בוצעו באמצעות פלטפורמת צביעה מחקרית אוטומטית (איור 1). עבודה קודמת קבעה כי גישת אחזור אנטיגן כפולה המורכבת מ-30 דקות עם תמיסת אחזור אפיטופ pH 6 מבוססת ציטראט (ER1) ולאחר מכן 30 דקות עם תמיסת אחזור אפיטופ pH 9 מבוססת EDTA (ER2) הניבה את תוצ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תכנון פאנל הדמיה מבוסס נוגדנים מרובים דורש זמן, מאמץ ומשאבים משמעותיים12. אתגרים אלה בולטים במיוחד בעת תכנון פאנל עבור דגימות FFPE בארכיון מרקמות אוטו-פלואורסצנטיות מאוד כמתואר כאן (איור 1). כדי להתגבר על אתגרים אלה, זיהינו תחילה את הפלואורופורים הבהירים ביותר התואמים לפרוטוקול השבתת הצבע שלנו (טבלה 1). לדוגמה, דווח כי לנוגדנים משניים של Alexa Fluor Plus יש אות לרעש גדול פי 4 במבחני אימונופלואורסצנציה בהשוואה לעמיתיהם של Alexa Fluor (מקור: גיליונות נת.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פתולוגיה ריאתית קלינית משחפת ריאתית מאופיינת בדלקת גרנולומטית נמקית. פתולוגיה ריאתית NTM מתרחשת בעיקר בשתי אוכלוסיות חולים נפרדות עם שני דפוסים פתולוגיים נפרדים: פגיעה ריאתית מבודדת המסומנת על ידי דלקת גרנולומטית עם מחיקת סימפונות והיווצרות חורים באנשים בעלי יכולת חיסונית, או מחלה נודולרית מפושטת הפוגעת בריאות ובאיברים אחרים אצל אנשים חסרי חיסון 13,14,15,16. כא.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A.J.R. הוא עובד ב-Leica Microsystems, Inc. המחברים האחרים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי תוכנית המחקר הפנימי של DIR/NIAID, NCI ו-NHLBI. איור 1 נוצר באמצעות BioRender תחת הסכם רישיון מוסדי עם ה-NIH.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.3% טריטון-X-100סיגמא-אולדריץ'T8787פתרון לחסימת מאגר
1% BSAסיגמא-אולדריץ'א4503פתרון לחסימת מאגר
1% בלוק BD Fc אנושיBD Biosciences564220חסימת Fc נדרשת לחסימת מאגר
מנורת לד 150 וואטאמזוןB07VH3CVSFמקור אור LED להקרנת רקמות
1x PBS ג'יבקו10010-023פתרון לחסימת שלבי חיץ וכביסה
מיכל אחסון 20 ליטראמזוןB001B1C4G0מיכל לתהליך הקרנת אור
מנורת LED הצפה RGBW 40 W אמזוןB08QFPJSMDמקור אור RGB להקרנת רקמות
אג85באבקםab43019/NAנוגדנים להדמיית IBEX. ראה טבלה 1.
אקטין שריר חלק אלפא DyLight 755נובוס ביולוגיתNBP2-345221R/NAנוגדנים להדמיית IBEX. ראה טבלה 1.
ערכת חסימת אבידין/ביוטיןאבקםאב64212תמיסת חסימת אבידין וביוטין
BD ציטופיקס / ציטופרםBD Biosciences554714פתרון קיבוע
תמיסת הסרת שעווה BONDלייקה ביוסיסטמסNC0221076פתרון דה-פרפיניזציה
פתרון אחזור אפיטופ BOND 1לייקה ביוסיסטמסNC0235529תמיסת אחזור אפיטופ pH 6 מבוססת ציטראט (ER1)
פתרון אחזור אפיטופ BOND 2לייקה ביוסיסטמסNC0235530תמיסת אחזור אפיטופ pH 9 מבוססת EDTA (ER2)
מערכת גילוי מחקר BONDלייקה ביוסיסטמסNC0396648מגיב צביעת מחקר אוטומטי
מכתש מחקר BOND RXלייקה ביוסיסטמסנהפלטפורמת צביעת מחקר אוטומטית
פתרון כביסה BONDלייקה ביוסיסטמסNC0221077מאגר כביסה
תקליטור 15BD Biosciences347420/AB_400298נוגדנים להדמיית IBEX. ראה טבלה 1.
CD20 eFluor 660תרמו פישר סיינטיפיק50-0202-82/AB_11150959נוגדנים להדמיית IBEX. ראה טבלה 1.
CD4 אלקסה פלואור 488מו"פ D מערכותFAB8165G/AB_2728839נוגדנים להדמיית IBEX. ראה טבלה 1.
CD45 פיקואריתרין (PE)נובוס ביולוגיתNBP2-34528PE/NAנוגדנים להדמיית IBEX. ראה טבלה 1.
CD68 iFluor 594Caprico Biotechnologies1064135/AB_2892745נוגדנים להדמיית IBEX. ראה טבלה 1.
חמור נגד עזים IgG Alexa Fluor Plus 488תרמו פישר סיינטיפיקA32814/AB_2762838נוגדנים להדמיית IBEX. ראה טבלה 1.
חמור נגד עכבר IgG Alexa Fluor Plus AF647תרמו פישר סיינטיפיקA32787/ AB_2762830נוגדנים להדמיית IBEX. ראה טבלה 1.
חמור נגד עכבר IgM Alexa Fluor 488ג'קסון אימונוסקר715-545-020/AB_2340844נוגדנים להדמיית IBEX. ראה טבלה 1.
חמור נגד ארנב IgG Alexa Fluor Plus AF555תרמו פישר סיינטיפיקA32794/AB_2762834נוגדנים להדמיית IBEX. ראה טבלה 1.
מערכת צביעה EasyDipהיצע למשתמשים חדשים5300 קיטמערכת צביעת שקופיות
פלואורומאונט - Gתרמו פישר סיינטיפיק00-4958-02מדיית הרכבה
הוכסטביוטיום40046כתם גרעיני להדמיית IBEX. ראה טבלה 1.
ממיר קבצים Imaris x64 10.2.0אימאריס אוקספורד אינסטרומנטסממיר קבצים בחינם
תוכנת ImarisViewer x64 10.2.0אימאריס אוקספורד אינסטרומנטסתוכנה חינמית לעיבוד תמונה
עט ImmEdgeמעבדות וקטורH-4000עט מחסום הידרופובי
ליתיום בורוהידריד (1 גרם)STREM כימיקלים93-0397כימיקל להשבתת צבע, קנו כמויות קטנות של כימיקל זה (1 גרם)
ביוטין Lumicanמו"פ D מערכותBAF2846נוגדנים להדמיית IBEX. ראה טבלה 1.
משקפי Micro CoverVWR48393-241כיסויי זכוכית
פאן-ציטוקרטין אלקסה פלואור 750נובוס ביולוגיתNBP2-33200AF750/AB_2868569נוגדנים להדמיית IBEX. ראה טבלה 1.
מערכת מיקרוגל PELCO BioWave Proטד פלה בע"מ36500-230מיקרוגל מדעי שאינו מחמם
PELCO SteadyTemp Proטד פלה בע"מ50062בקרת טמפרטורה אוטומטית לחלוטין למיקרוגל מדעי
סימפל איטקתוכנת קוד פתוחתוכנת רישום ועיבוד ערוצים
סטרפטווידין אלכסה פלואור 594תרמו פישר סיינטיפיקעונה 11227מגיב תיוג להדמיית IBEX. ראה טבלה 1.
מיקרוסקופ שדה רחבלייקה מיקרוסיסטמסנהמצלמת THUNDER של Leica Microsystems עם מקור אור LED8 ותוכנת LAS X (3.7.1.21655). להדמיית פלואורסצנטיות, נעשה שימוש במסנן מרובע פס מותאם אישית עם גלגל מסנן חיצוני (PN: 11536075) עם שני מסננים נוספים בעלי פס יחיד (PN: 8118215) להדמיית שבעה ערוצי צבע בכל מעבר. קווי עירור המסנן, הדיכרואי והפליטה הם (1) קוביית Quad-Band: דיכרואי ב-391/32, 479/33, 554/24, 638/31, ללא מסנני עירור או פליטה; (2) גלגל מסנן חיצוני מיקום 1: 434/32, מיקום 2: 520/40, מיקום 3: 585/20, מיקום 4: 720/60, מיקום 5: מעבר; (3) פס יחיד 1— עירור 585/22, 594 דיכרואיק, פליטת 625/30; (4) פס יחיד 2— עירור 635/20, 647 דיכרואיק, פליטת 667/30.
מנקה עדשות אופטי ZeissאמזוןB00GPVQVCOמיקרוסקופ מנקה עדשות אובייקטיבי
<חזק>נוגדנים
אג85באבקםאילן אלכסנדרארנב פוליקלונלי IgG, מחזור 1
אקטין שריר חלק אלפא DyLight 755נובוס ביולוגיתNBP2-345221R1A4/asm-1, מחזור 1
CD4 אלקסה פלואור 488מו"פ D מערכותFAB8165GIgG עז פוליקלונלית, מחזור 1
CD8 אלקסה פלואור 647ביולג'נד372906C8/144B, מחזור 1
CD68 iFluor 594Caprico Biotechnologies1064135KP1, מחזור 1
חמור נגד עזים IgG Alexa Fluor Plus 488תרמו פישר סיינטיפיקא32814חמור רב-שבטי, מחזור 1
חמור נגד עכבר IgG Alexa Fluor Plus AF647תרמו פישר סיינטיפיקא32787חמור רב-שבטי, מחזור 1
חמור נגד ארנב IgG Alexa Fluor Plus AF555תרמו פישר סיינטיפיקא32794חמור רב-שבטי, מחזור 1
הוכסטביוטיום40046תווית גרעינית, מחזור 1
תקליטור 15BD Biosciences347420MMA, מחזור 2
CD20 eFluor 660תרמו פישר סיינטיפיק50-0202-82L26, מחזור 2
CD45 פיקואריתרין (PE)נובוס ביולוגיתNBP2-34528PE2B11 + PD7/26, מחזור 2
חמור נגד עכבר IgM Alexa Fluor 488ג'קסון אימונוסקר715-545-020חמור רב-שבטי, מחזור 2
ביוטין Lumicanמו"פ D מערכותBAF2846IgG עז פוליקלונלית, מחזור 2
פאן-ציטוקרטין אלקסה פלואור 750נובוס ביולוגיתNBP2-33200AF750AE-1/AE-3, מחזור 2
סטרפטווידין אלכסה פלואור 594תרמו פישר סיינטיפיקעונה 11227לא ישים, מחזור 2
הוכסטביוטיום40046מחזור 2
<חזק>פתרונות
Blocking Buffer (מחזור 1)
טריטון-X-100סיגמא-אולדריץ'T87870.3% בנפח
BSAסיגמא-אולדריץ'א45031% בנפח
בלוק BD Fc אנושיBD Biosciences5642201% בנפח
1x PBS ג'יבקו10010-02397.7% לפי נפח
<תמיסת צביעת נוגדנים חזקה>ראשונית #1 (מחזור 1)
מאגר חוסם (מחזור 1)ראה למעלההגדלת הנפח לאחר הוספת נוגדנים
הוכסטביוטיום400461:5000
CD8 AF647ביולג'נד3729061:10
<תמיסת צביעת נוגדנים חזקה>עיקרית #2 (מחזור 1)
מאגר חוסם (מחזור 1)ראה למעלההגדלת הנפח לאחר הוספת נוגדנים
CD4  AF488מו"פ D מערכותFAB8165G1:10
אג85באבקםab43019/NA1:100
<תמיסת צביעת נוגדנים חזקה>משנית #1 (מחזור 1)
מאגר חוסם (מחזור 1)ראה למעלההגדלת הנפח לאחר הוספת נוגדנים
חמור נגד עיזים AF Plus 488תרמו פישר סיינטיפיקA32814/AB_27628381:100
חמור נגד ארנב AF פלוס 555תרמו פישר סיינטיפיקA32794/AB_27628341:100
חמור נגד עכבר AF פלוס 647תרמו פישר סיינטיפיקA32787/AB_27628301:50
<תמיסת צביעת נוגדנים חזקה>ראשונית #3 (מחזור 1)
מאגר חוסם (מחזור 1)ראה למעלההגדלת הנפח לאחר הוספת נוגדנים
CD68 iF594Caprico Biotechnologies10641351:10
א-SMA DL755נובוס ביולוגיתNBP2-345221R/NA1:30
מאגר חוסם ללא BSA (מחזור 2) 
טריטון-X-100סיגמא-אולדריץ'T87870.3% בנפח
בלוק BD Fc אנושיBD Biosciences5642201% בנפח
1x PBS ג'יבקו10010-02398.7% לפי נפח
<תמיסת צביעת נוגדנים חזקה>עיקרית #4 (מחזור 2)
מאגר חוסם ללא BSA (מחזור 2)ראה למעלההגדלת הנפח לאחר הוספת נוגדנים
תקליטור 15BD Biosciences3474201:30
ביוטין Lumicanמו"פ D מערכותBAF28461:100
CD45 PEנובוס ביולוגיתNBP2-34528PE1:20
CD20 eFluor 660תרמו פישר סיינטיפיק50-0202-821:10
פאן-ציטוקרטין AF750נובוס ביולוגיתNBP2-33200AF7501:10
<תמיסת צביעת נוגדנים משנית חזקה>משנית #2 (מחזור 2)
מאגר חוסם ללא BSA (מחזור 2)ראה למעלההגדלת הנפח לאחר הוספת נוגדנים
חמור נגד עכבר IgM AF488ג'קסון אימונוסקר715-545-020/AB_23408441:100
סטרפאווידין AF594תרמו פישר סיינטיפיקעונה 112271:200

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Global tuberculosis report 2023. , World Health Organization. https://iris.who.int/bitstream/handle/10665/373828/9789240083851-eng.pdf?sequence=1 (2023).
  2. Dahl, V. N., et al. Global trends of pulmonary infections with nontuberculous mycobacteria: A systematic review. Int J Infect Dis. 125, 120-131 (2....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Iterative BleachingMultiplex ImagingAutofluorescent SamplesSpatial ProteomicsFFPE Lung TissuePhotoirradiation ProtocolAntibody Panel DesignWhole Slide ImagingGranulomatous InflammationImmune Cell Mapping

Related Articles