מיצוי DNA מיקובקטריאלי באמצעות מכות חרוזים במאגר מותאם אישית ואחריו זרימת עבודה של NGS

Jason D. Limberis; Alina Nalyvayko; Janré Steyn; Jennifer Williams; Melanie Grobbelaar; Robin M. Warren; John Z. Metcalfe

doi:10.3791/68037

Method Article

מיצוי DNA מיקובקטריאלי באמצעות מכות חרוזים במאגר מותאם אישית ואחריו זרימת עבודה של NGS

DOI:

10.3791/68037

⸱

June 13th, 2025

Jason D. Limberis*¹ , Alina Nalyvayko*¹ , Janré Steyn² , Jennifer Williams² , Melanie Grobbelaar² , Robin M. Warren*² , John Z. Metcalfe*³

¹Division of Experimental Medicine, University of California, San Francisco, ²DSI-NRF Centre of Excellence for Biomedical Tuberculosis Research, SAMRC for Tuberculosis Research, Division of Molecular Biology and Human Genetics, Faculty of Medicine and Health Sciences, Stellenbosch University, ³Division of Pulmonary and Critical Care Medicine, Zuckerberg San Francisco General Hospital and Trauma Centre, University of California, San Francisco

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מראה שהכאת חרוזים בשילוב עם טיהור חרוזי לכידת DNA מספקת שיטה מהירה ועקבית לחילוץ DNA מדגימות Mycobacterium tuberculosis , מה שהופך אותה לבחירה יעילה עבור יישומי ריצוף של הדור הבא.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שחפת היא מחלה קטלנית, והופעת עמידות לתרופות אנטיביוטיות בחיידק הגורם הסיבתי, Mycobacterium tuberculosis, מחמירה את תוצאות הטיפול. יש צורך בזיהוי מדויק ומהיר של עמידות לתרופות באמצעות טכנולוגיות ריצוף כדי לשפר את תוצאות חולי השחפת באמצעות משטרי טיפול מותאמים אישית. שיטת מיצוי ה-DNA היא קריטית לבדיקות מולקולריות במורד הזרם והיא מסובכת על ידי דופן התא הקשיחה של מיקובקטריום, העומס החיידק הנמוך של דגימות קליניות רבות והמורכבות של מטריצת הליחה. ישנן שיטות רבות למיצוי DNA של M. tuberculosis מדווחות, אך כרגע אין תקן זהב. יתר על כן, מעט מהשיטות הללו הוכחו כעובדות באופן עקבי, ורבות מהן אינן מתאימות לסביבות שחפת דלות משאבים ועומס גבוה. כתוצאה מכך, מעבדות מציגות לעתים קרובות שינויים בהליכים משלהן, וכתוצאה מכך שונות משמעותית בשיטה. כאן, אנו מציגים פרוטוקול חסכוני, מהיר וסטנדרטי למיצוי DNA מיקובקטריאלי הן מליחה קלינית והן מתרבית המייצר DNA המתאים ל-qPCR, ואשר יש לשקול לשימוש במעבדות אבחון קליני.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חילוץ DNA באיכות גבוהה מ-M. tuberculosis הכרחי לזיהוי שחפת עמידה לתרופות (TB) באמצעות ריצוף ממוקד של הדור הבא (NGS) וריצוף גנום שלם (WGS), אך לעתים קרובות מתעלמים ממנו. פיתחנו פרוטוקול סטנדרטי כדי לספק DNA עקבי ואיכותי ליישומי NGS קליניים, כולל גישות NGS ממוקדות כמו Deeplex-MycTB (GenoScreen) וריצוף גנום שלם, המומלצות כעת על ידי ארגון הבריאות העולמי (WHO) לאבחון שחפת עמידה לתרופות. יש לציין כי בעוד שארגון הבריאות העולמי ממליץ על אסטרטגיות אבחון מבוססות NGS, הוא אינו מפרט את פרוטוקולי מיצוי ה-DNA הספציפיים כדי לתמוך בהן. ניתן להשתמש בשיטה שלנו עם בדיקות שאושרו על ידי ארגון הבריאות העולמי וכן עם טכנולוגיות מתפתחות הדורשות DNA מ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה נערך באוניברסיטת קליפורניה בסן פרנסיסקו (UCSF) באישור ועדת הבטיחות הביולוגית המוסדית (BUA #BU198320-01GBUA/BABB) ועוקב אחר הנחיות האתיקה של המחקר של UCSF. השגנו דגימות ליחה שנאספו על ידי Discovery Life Sciences תחת פרוטוקול ויתור על הסכמה שאושר על ידי IRB מאנשים עם בעיות נשימה שאינן שחפת.

1. הכנת מאגרים

מאגר טריטון מותאם אישית (טבלה 1): כדי להכין 100 מ"ל של מאגר טריטון מותאם אישית, התחל בשילוב של 2 מ"ל של 5 M NaCl, 1 מ"ל של 1 M Tris-HCl (pH 8), 1 מ"ל של Triton X-100 ו-0.2 מ"ל של 0.5 M חומצה אתילנדיאמינטטראצטית (EDTA). הוסיפו מים טהורים במיוחד כדי להביא את הנפח הכולל ל-100 מ"ל. יש לסנן לע....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בדקנו את פרוטוקול מיצוי ה-DNA הן על דגימות ליחה מתורבתות של M. tuberculosis והן על דגימות ליחה של M. tuberculosis (n = 3 לכל מצב). באמצעות תרבית M. tuberculosis H37Rv mc² 7901, תיקננו את הקלט ל-8.4 x 10⁶ תאים לכל 50 מיקרוליטר, שווה ערך ל-1 מ"ל של תרבית MGIT ב-200 GU. עבור ניסויי כיח, העלינו 1 מ"ל של ליחה שנאספה מאנשים עם מצבים נשימתיים שאינם שחפת (שהושגו באופן מסחרי) עם שני ריכוזי חיידקים שונים (50,000, בערך דרגת מריחת כיח 1+, ו-10,000 בצילים, בערך דרגת מריחת כיח זעומה) כדי להעריך את.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בעבודה זו, אנו מציגים פרוטוקול חזק ומאומת לחילוץ DNA איכותי של M. tuberculosis באמצעות הכאת חרוזים עם ניקוי חרוזים מגנטיים עבור יישומים מולקולריים ו-NGS במורד הזרם.

השיטה מציעה מספר יתרונות על פני פרוטוקולי מיצוי ה-DNA הקיימים של M. tuberculosis . בעוד שמיצוי פנול-כלורופורם מסורתי אורך בדרך כלל מספר ימים ומכניס כימיקלים מסוכנים, שיטה זו מסתיימת תוך פחות מ-60 דקות עם מינימום פסולת מסוכנת. גישה זו מספקת גמישות במיקור ריאגנטים - ניתן לרכוש את המ.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

R01AI153213 המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות (NIAID).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 מ"מ חרוזי זירקוניה-סיליקט	מוצרי Biospec	ברקוד 11079101ז	חרוזים המשמשים לשלב הכאת חרוזים לליזה של תאים מיקובקטריאליים
חרוזי AMPure XP	בקמן קולטר	א63880	חרוזים מגנטיים לניקוי DNA לאחר ליזה
EDTA (0.5M, pH 8.0)	תרמו פישר סיינטיפיק	AM9260G	רכיבי מאגר טריטון מותאמים אישית / EDTA נמוך
הכנה מהירה 24	MPbio, ארצות הברית	116004500	ציוד להכאת חרוזים במהירות 6.5 מ'/שנייה
פריימר קדימה	תרמו פישר סיינטיפיק	סינתזה מותאמת אישית	רצף פריימר: AATTCCTGGTGTAGCGGTGG
H₂O (דרגת מים, ביולוגיה מולקולרית)	תרמו פישר סיינטיפיק	BP2819-1	רכיבי מאגר טריטון מותאמים אישית / EDTA נמוך
בדיקה אוניברסלית לונה	מעבדות ביולוגיות של ניו אינגלנד	M3004	מגיב qPCR לספירת DNA מיקובקטריאלית
ערכת MycoPrep	ב.ד.	מק"ט/REF 240863	עיכול דגימת BD MycoPrep לעיבוד כיח NALC-NaOH
NaCl (נתרן כלורי, תמיסת 5M)	תרמו פישר סיינטיפיק	AM9759	רכיבי מאגר טריטון מותאמים אישית / EDTA נמוך
PBS	מיליפור סיגמא	עמ' 2272	עיבוד ליחה
פריימר הפוך	תרמו פישר סיינטיפיק	סינתזה מותאמת אישית	רצף פריימר: GTTTACGGCGTGGACTACCA
בדיקה של TaqMan	תרמו פישר סיינטיפיק	סינתזה מותאמת אישית	רצף בדיקה: AGGAGGAACACCGGTGGCGA
Tris-HCl (1M, pH 8.0)	תרמו פישר סיינטיפיק	AM9855G	רכיבי מאגר טריטון מותאמים אישית / EDTA נמוך
טריטון X-100	תרמו פישר סיינטיפיק	28314	רכיבי מאגר טריטון מותאמים אישית / EDTA נמוך

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jouet, A., et al. Deep amplicon sequencing for culture-free prediction of susceptibility or resistance to 13 anti-tuberculous drugs. Eur Respir J. 57 (3), 2002338(2021).
George, S., et al. DNA Thermo-Protection Facilitates Whole Genome Sequencing of Mycobacteria Direct from Clinical Samples by the Nanopore Platform.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

מיצוי DNA מיקובקטריאלי באמצעות מכות חרוזים במאגר מותאם אישית ואחריו זרימת עבודה של NGS

In This Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles