Method Article

מיצוי DNA מיקובקטריאלי באמצעות מכות חרוזים במאגר מותאם אישית ואחריו זרימת עבודה של NGS

DOI:

10.3791/68037

⸱

June 13th, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Experimental Medicine, University of California, San Francisco, 2DSI-NRF Centre of Excellence for Biomedical Tuberculosis Research, SAMRC for Tuberculosis Research, Division of Molecular Biology and Human Genetics, Faculty of Medicine and Health Sciences, Stellenbosch University, 3Division of Pulmonary and Critical Care Medicine, Zuckerberg San Francisco General Hospital and Trauma Centre, University of California, San Francisco

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מראה שהכאת חרוזים בשילוב עם טיהור חרוזי לכידת DNA מספקת שיטה מהירה ועקבית לחילוץ DNA מדגימות Mycobacterium tuberculosis , מה שהופך אותה לבחירה יעילה עבור יישומי ריצוף של הדור הבא.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שחפת היא מחלה קטלנית, והופעת עמידות לתרופות אנטיביוטיות בחיידק הגורם הסיבתי, Mycobacterium tuberculosis, מחמירה את תוצאות הטיפול. יש צורך בזיהוי מדויק ומהיר של עמידות לתרופות באמצעות טכנולוגיות ריצוף כדי לשפר את תוצאות חולי השחפת באמצעות משטרי טיפול מותאמים אישית. שיטת מיצוי ה-DNA היא קריטית לבדיקות מולקולריות במורד הזרם והיא מסובכת על ידי דופן התא הקשיחה של מיקובקטריום, העומס החיידק הנמוך של דגימות קליניות רבות והמורכבות של מטריצת הליחה. ישנן שיטות רבות למיצוי DNA של M. tuberculosis מדווחות, אך כרגע אין תקן זהב. יתר על כן, מעט מהשיטות הללו הוכחו כעובדות באופן עקבי, ורבות מהן אינן מתאימות לסביבות שחפת דלות משאבים ועומס גבוה. כתוצאה מכך, מעבדות מציגות לעתים קרובות שינויים בהליכים משלהן, וכתוצאה מכך שונות משמעותית בשיטה. כאן, אנו מציגים פרוטוקול חסכוני, מהיר וסטנדרטי למיצוי DNA מיקובקטריאלי הן מליחה קלינית והן מתרבית המייצר DNA המתאים ל-qPCR, ואשר יש לשקול לשימוש במעבדות אבחון קליני.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חילוץ DNA באיכות גבוהה מ-M. tuberculosis הכרחי לזיהוי שחפת עמידה לתרופות (TB) באמצעות ריצוף ממוקד של הדור הבא (NGS) וריצוף גנום שלם (WGS), אך לעתים קרובות מתעלמים ממנו. פיתחנו פרוטוקול סטנדרטי כדי לספק DNA עקבי ואיכותי ליישומי NGS קליניים, כולל גישות NGS ממוקדות כמו Deeplex-MycTB (GenoScreen) וריצוף גנום שלם, המומלצות כעת על ידי ארגון הבריאות העולמי (WHO) לאבחון שחפת עמידה לתרופות. יש לציין כי בעוד שארגון הבריאות העולמי ממליץ על אסטרטגיות אבחון מבוססות NGS, הוא אינו מפרט את פרוטוקולי מיצוי ה-DNA הספציפיים כדי לתמוך בהן. ניתן להשתמש בשיטה שלנו עם בדיקות שאושרו על ידי ארגון הבריאות העולמי וכן עם טכנולוגיות מתפתחות הדורשות DNA מיקובקטריאלי באיכות גבוהה.

אתגר המיצוי נובע מדופן התא הייחודית של M. tuberculosis, המורכבת מחומצות מיקוליות ושומנים המקשים במיוחד על הפתיחה. לפתרונות המיצוי הנוכחיים שפורסמו יש שונות ניכרת בליזה (למשל, סוניקציה, כימיקלים, חום והכאת חרוזים) ובשיטות מיצוי DNA (למשל, מיצוי פנול-כלורופורם, משקעי אתנול, שיטות מבוססות CTAB ומבוססות עמודות וחרוזים), מה שמביא להבדלים בתפוקת ה-DNA, הטוהר והאיכות 1,2,3,4,5,6,7,8 ,9,10,11,12,13,14,15,16. בנוסף, קבוצות מחקר לעיתים רחוקות משתמשות באותה שיטת מיצוי DNA ולעתים קרובות מודדות הצלחה באופן שונה. זה מקשה על הקביעה איזו שיטה עובדת הכי טוב מכיוון שהגישה האופטימלית תלויה בסוג היישום המולקולרי. לדוגמה, פתרון וריאנטים מבניים של M. tuberculosis בכיח באמצעות ריצוף קריאה ארוכה דורש DNA איכותי יותר ופולימראז מדויק יותר מאשר הפעלת כלי אבחון בתשלום המכוון רק לאזור קטן של rpoB. מספר גורמים מסבכים עוד יותר את הצלחת מיצוי ה-DNA. כמות הדנ"א שאנו יכולים לחלץ משתנה בהתאם לסוג הדגימה, כמה חיידקים קיימים, והאם ישנם חומרים (דנ"א לא מיקובקטריאלי ומעכבי PCR) שמפריעים לתהליך. אפילו היבטים טכניים כמו עד כמה בדיוק פיפטות של טכנאי מעבדה יכולים להשפיע על התוצאות. השיטות הנוכחיות נופלות לעתים קרובות בעת עיבוד דגימות עם עומסי חיידקים נמוכים או רמות גבוהות של DNA מזהם, אשר נתקלים בדרך כלל במסגרות קליניות 17,18,19.

הכאת חרוזים במאגר מותאם אישית, ואחריה פרוטוקול ניקוי חרוזים, מציעה יתרונות מרכזיים על פני שיטות אחרות. זוהי זרימת עבודה פשוטה ומהירה המפחיתה את ההזדמנות לשונות תלויה במפעיל ושומרת על שלמות ה-DNA עבור יישומי NGS במורד הזרם. גישה סטנדרטית זו מתאימה במיוחד למעבדות קליניות המחפשות תוצאות אמינות וניתנות לשחזור באמצעות מבחני עמידות לתרופות NGS המומלצים על ידי ארגון הבריאות העולמי וכל יישומי WGS.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה נערך באוניברסיטת קליפורניה בסן פרנסיסקו (UCSF) באישור ועדת הבטיחות הביולוגית המוסדית (BUA #BU198320-01GBUA/BABB) ועוקב אחר הנחיות האתיקה של המחקר של UCSF. השגנו דגימות ליחה שנאספו על ידי Discovery Life Sciences תחת פרוטוקול ויתור על הסכמה שאושר על ידי IRB מאנשים עם בעיות נשימה שאינן שחפת.

1. הכנת מאגרים

  1. מאגר טריטון מותאם אישית (טבלה 1): כדי להכין 100 מ"ל של מאגר טריטון מותאם אישית, התחל בשילוב של 2 מ"ל של 5 M NaCl, 1 מ"ל של 1 M Tris-HCl (pH 8), 1 מ"ל של Triton X-100 ו-0.2 מ"ל של 0.5 M חומצה אתילנדיאמינטטראצטית (EDTA). הוסיפו מים טהורים במיוחד כדי להביא את הנפח הכולל ל-100 מ"ל. יש לסנן לעקר לפני השימוש. המאגר הסופי מכיל 100 מ"מ NaCl, 10 מ"מ Tris-HCl, 1 מ"מ EDTA ו-1% טריטון X-100.
  2. EDTA TE נמוך (טבלה 2): כדי להכין 100 מ"ל של מאגר TE EDTA נמוך, שלב 1 מ"ל של 1M Tris-HCl (pH 8) ו-0.02 מ"ל של 0.5 מ' EDTA. הוסיפו מים טהורים במיוחד כדי להביא את הנפח הכולל ל-100 מ"ל. המאגר הסופי מכיל 10 מ"מ Tris-HCl ו-0.1 מ"מ EDTA.

2. הכנת צינורות ליזה

  1. בעזרת להב אזמל חותכים בזהירות את החלק התחתון של צינור מכסה בורג של 1.5 מ"ל ממש מתחת לנקודת ההיפוך.
  2. חותכים את הקצה מקצה P1000, חותכים טריז בצורת V ליד הקצה ומכניסים לתוכו את החלק התחתון המוכן של צינור מכסה הבורג. עיין באיור 1 לתרשים של הסקופ.
  3. מלאו מיכל סטרילי (למשל, מאגר או צלחת פטרי) בחרוזי זירקוניה-סיליקט 0.1 מ"מ והשתמשו בכף המוכנה כדי לפזר כף אחת של חרוזים (~200 מ"ג) לצינורות מכסה בורג של 1.5 מ"ל.

figure-protocol-1
איור 1: סקופ הפצת חרוזים פנימי. הסקופ תוכנן להעברה קלה של ~200 מ"ג של חרוזי זירקוניום 0.1 מ"מ לצינורות עיבוד. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

3. הכנת קלט

הערה: כל הכנת הדגימה צריכה להתבצע בהתאם לפרוטוקולי הבטיחות הביולוגית של המתקן שלך. אנו ממליצים בחום לטפל בחומרים זיהומיים בתוך ארון בטיחות ביולוגית Class II (BSC) כדי למזער את הסיכון לחשיפה לאירוסול.

  1. תרבית תאי חיידקים
    1. צנטריפוגה ~ 5 מ"ל של תרבית שחפת (MGIT או תרבית נוזלית עכורה) בצינור צנטריפוגה חרוטי של 15 מ"ל במהירות מקסימלית (≥ 3,000 x גרם) למשך 10 דקות.
    2. בעזרת פיפטה סרולוגית של 10 מ"ל, הסר בזהירות את כל הסופרנטנט מלבד ~ 500 מיקרוליטר מבלי להפריע לגלולה. הסר את הסופרנטנט שנותר בעזרת פיפטה P1000 מבלי להפריע לגלולה.
    3. השעו מחדש את הגלולה ב-350 מיקרוליטר של מאגר טריטון מותאם אישית על ידי פיפטינג למעלה ולמטה. במידת הצורך (כלומר, להסיר דגימות לעיבוד מחוץ ל-BSL-3), השבת את הדגימה בהתאם לנהלי ההפעלה הסטנדרטיים.
  2. הכנת ליחה
    1. העבר 1-5 מ"ל של דגימת ליחה (ספונטנית או מושרית) לצינור צנטריפוגה סטרילי של 50 מ"ל.
  3. נזילות DTT
    1. הוסף ארבעה נפחים של 100 מ"מ דיתיותרייטול לדגימת הליחה (הנפח עשוי להשתנות). אם אתה משתמש במגיב מסחרי, עקוב אחר הוראות הדילול של היצרן.
    2. מערבולת ביסודיות במשך 30 שניות. דגירה בטמפרטורת החדר (20-25 מעלות צלזיוס) למשך 7 דקות. מערבולת שוב למשך 30 שניות.
    3. חזור על שלבים 3.3.1. ו-3.3.2. 1x, עבור דגימות צמיגות מאוד, בצע עד 5 מחזורי דגירה-מערבולת.
    4. צנטריפוגה במהירות מרבית (≥ 3,000 x גרם) למשך 10 דקות. בעזרת פיפטה סרולוגית של 10 מ"ל, השליכו בזהירות את כל הסופרנטנט מלבד ~ 500 מיקרוליטר. הסר את הסופרנטנט שנותר בעזרת פיפטה P1000 מבלי להפריע לגלולה.
    5. השעו מחדש את הגלולה ב-350 מיקרוליטר של מאגר טריטון מותאם אישית.
  4. הנזלת NALC-NaOH
    1. להכנת תמיסת NALC-NaOH, עקוב אחר הוראות היצרן להכנה ודילול.
    2. הוסף ארבעה נפחים של תמיסת NALC-NaOH לדגימת הליחה (ספונטנית או מושרית, הנפח עשוי להשתנות).
    3. מערבולת למשך 30 שניות. דגירה בטמפרטורת החדר (20-25 מעלות צלזיוס) למשך 7 דקות. חזור על שלבים 3.4.1 ו- 3.4.2. פי 1. עבור דגימות צמיגות מאוד, בצע עד 5 מחזורי דגירה-מערבולת.
    4. הוסף PBS לסימן 50 מ"ל. מערבולת קצרה לערבב. צנטריפוגה במהירות מרבית (≥ 3,000 x גרם) למשך 10 דקות.
    5. בעזרת פיפטה סרולוגית של 50 מ"ל, השליכו בזהירות את כל הסופרנטנט מלבד ~ 500 מיקרוליטר. הסר את הסופרנטנט שנותר בעזרת פיפטה P1000 מבלי להפריע לגלולה.
    6. השעו מחדש את הגלולה ב-350 מיקרוליטר של מאגר טריטון מותאם אישית. במידת הצורך (כלומר, להסיר דגימות לעיבוד מחוץ ל-BSL-3), השבת את הדגימה בהתאם לנהלי ההפעלה הסטנדרטיים.

4. מיצוי DNA

  1. העבירו את תרחיף החיידקים המומת (350 מיקרוליטר משלב 3) לצינור מכסה בורג חדש של 1.5 מ"ל המכיל ~250 מיקרוליטר של חרוזי זירקוניה-סיליקט 0.1 מ"מ.
  2. ביד ניצח את הליזאט במהירות של 6.5 מטר לשנייה למשך 45 שניות עם מנוחה של 2 דקות בין ריצות. חזור על הפעולה בסך הכל שלושה מחזורי הכאת חרוזים.
  3. צנטריפוגה במהירות מקסימלית (≥ 12,000 x גרם) למשך 2 דקות והעברת 150 מיקרוליטר של הסופרנטנט לצינור חדש מסומן היטב. הקפד לא להעביר חרוזים או פסולת תאים.
  4. אפשר לחרוזים מגנטיים לניקוי להתאזן לטמפרטורת החדר למשך 30 דקות ולמערבולת היטב כדי להבטיח השעיה מלאה לפני השימוש.
  5. הוסף 180 מיקרוליטר (נפח פי 1.2) של חרוזים מגנטיים לניקוי וערבב על ידי פיפטינג למעלה ולמטה פי 10. דוגרים בטמפרטורת החדר למשך 2 דקות.
  6. מניחים על מתלה מגנטי ומחכים שהתמיסה תתבהר ~ 2 דקות. בעזרת פיפטה P200, השליכו בזהירות את הסופרנטנט מבלי להפריע לחרוזים המגנטיים.
  7. כשהצינור עדיין על המדף המגנטי, הוסף 500 מיקרוליטר של אתנול טרי של 70% (v/v), והוציא לאורך דופן הצינור הנגדית לחרוזים המגנטיים. המתן 30 שניות.
  8. חזור על שלבים 4.5. - 4.7. בסך הכל שתי כביסות. בתום הכביסה האחרונה, הסר שאריות אתנול בעזרת פיפטה P10. יבש את החרוזים בקצרה למשך ~ 2 דקות.
  9. מיד לאחר שגלולת החרוז הופכת אטומה, הסר את הצינור מהמתלה המגנטי והשהה מחדש ב-20 מיקרוליטר של מאגר טריס EDTA נמוך. אל תאפשר לחרוזים להתייבש ולהיסדק.
  10. מערבבים על ידי פיפטינג או מערבולת כדי להבטיח שכל החרוזים בתמיסה. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
  11. מניחים על מתלה מגנטי ומחכים שהתמיסה תתבהר ~ 2 דקות. העבר את ה-DNA המנוקה לצינור חדש מסומן היטב לניתוח במורד הזרם. שאפו <20 מיקרוליטר של DNA שחולץ כדי למנוע העברת חרוזים מגנטיים.

5. ספירת qPCR של DNA מיקובקטריאלי

  1. כדי לכמת DNA מיקובקטריאלי באמצעות PCR כמותי המכוון ל-99 נוקלאוטידים של ה-atpE המיקובקטריאלי (Rv1305), הרכיבו תערובת תגובה של 10 מיקרוליטר לדגימה על קרח המכילה 5 מיקרוליטר של תערובת אב בדיקה אוניברסלית (2x), 0.4 מיקרוליטר כל אחד של פריימר קדמי (5'-AATTCCTGGTGTAGCGGTGG-3', 10 מיקרומטר), ופריימר הפוך (5'-GTTTACGGCGTGGACTACCA-3', 10 מיקרומטר), 0.2 מיקרוליטר של בדיקת TaqMan (5'-VIC-AGGAGGAACCGGTGGCGA-MGB-3', 10 מיקרומטר), 2 מיקרוליטר של תבנית דנ"א ו-2 מיקרוליטר של מים נטולי נוקלאז (טבלה 3).
  2. הפעל את התגובה באמצעות תנאי המחזור התרמי הבאים: דנטורציה ראשונית ב-95 מעלות צלזיוס למשך 60 שניות, ואחריה 35 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס למשך 10 שניות ו-60 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות (עם לכידה כאן, באמצעות קצב רמפה של 2.11 מעלות צלזיוס לשנייה; טבלה 4).
    הערה: במקרה זה, qPCR בוצע באמצעות בדיקת TaqMan עם בדיקה עם תווית VIC במערכת PCR בזמן אמת QuantStudio 3,
  3. הפעל את כל הדגימות, התקנים והבקרות במשולש טכני. צור עקומות סטנדרטיות באמצעות דילול סדרתי של DNA מטוהר של M. tuberculosis . לבצע ניתוח כימות יחסי באמצעות תוכנת ניתוח.
  4. ייצא את ערכי הכימות היחסיים המתקבלים לפורמט CSV והדמיה באמצעות R Studio (גרסה 2024.09.1+394) כדי ליצור עלילות קופסה המשווים תפוקות DNA על פני שיטות מיצוי.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בדקנו את פרוטוקול מיצוי ה-DNA הן על דגימות ליחה מתורבתות של M. tuberculosis והן על דגימות ליחה של M. tuberculosis (n = 3 לכל מצב). באמצעות תרבית M. tuberculosis H37Rv mc² 7901, תיקננו את הקלט ל-8.4 x 106 תאים לכל 50 מיקרוליטר, שווה ערך ל-1 מ"ל של תרבית MGIT ב-200 GU. עבור ניסויי כיח, העלינו 1 מ"ל של ליחה שנאספה מאנשים עם מצבים נשימתיים שאינם שחפת (שהושגו באופן מסחרי) עם שני ריכוזי חיידקים שונים (50,000, בערך דרגת מריחת כיח 1+, ו-10,000 בצילים, בערך דרגת מריחת כיח זעומה) כדי להעריך את...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בעבודה זו, אנו מציגים פרוטוקול חזק ומאומת לחילוץ DNA איכותי של M. tuberculosis באמצעות הכאת חרוזים עם ניקוי חרוזים מגנטיים עבור יישומים מולקולריים ו-NGS במורד הזרם.

השיטה מציעה מספר יתרונות על פני פרוטוקולי מיצוי ה-DNA הקיימים של M. tuberculosis . בעוד שמיצוי פנול-כלורופורם מסורתי אורך בדרך כלל מספר ימים ומכניס כימיקלים מסוכנים, שיטה זו מסתיימת תוך פחות מ-60 דקות עם מינימום פסולת מסוכנת. גישה זו מספקת גמישות במיקור ריאגנטים - ניתן לרכוש את המ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

R01AI153213 המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות (NIAID).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.1 מ"מ חרוזי זירקוניה-סיליקטמוצרי Biospecברקוד 11079101זחרוזים המשמשים לשלב הכאת חרוזים לליזה של תאים מיקובקטריאליים
חרוזי AMPure XPבקמן קולטרא63880חרוזים מגנטיים לניקוי DNA לאחר ליזה
EDTA (0.5M, pH 8.0) תרמו פישר סיינטיפיקAM9260Gרכיבי מאגר טריטון מותאמים אישית / EDTA נמוך
הכנה מהירה 24MPbio, ארצות הברית116004500ציוד להכאת חרוזים במהירות 6.5 מ'/שנייה
פריימר קדימהתרמו פישר סיינטיפיקסינתזה מותאמת אישיתרצף פריימר: AATTCCTGGTGTAGCGGTGG
H2O (דרגת מים, ביולוגיה מולקולרית)תרמו פישר סיינטיפיקBP2819-1רכיבי מאגר טריטון מותאמים אישית / EDTA נמוך
בדיקה אוניברסלית לונהמעבדות ביולוגיות של ניו אינגלנדM3004מגיב qPCR לספירת DNA מיקובקטריאלית
ערכת MycoPrepב.ד.מק"ט/REF 240863עיכול דגימת BD MycoPrep לעיבוד כיח NALC-NaOH
NaCl (נתרן כלורי, תמיסת 5M)תרמו פישר סיינטיפיקAM9759רכיבי מאגר טריטון מותאמים אישית / EDTA נמוך
PBSמיליפור סיגמאעמ' 2272עיבוד ליחה
פריימר הפוךתרמו פישר סיינטיפיקסינתזה מותאמת אישיתרצף פריימר: GTTTACGGCGTGGACTACCA
בדיקה של TaqManתרמו פישר סיינטיפיקסינתזה מותאמת אישיתרצף בדיקה: AGGAGGAACACCGGTGGCGA
Tris-HCl (1M, pH 8.0)תרמו פישר סיינטיפיקAM9855Gרכיבי מאגר טריטון מותאמים אישית / EDTA נמוך
טריטון X-100תרמו פישר סיינטיפיק28314רכיבי מאגר טריטון מותאמים אישית / EDTA נמוך

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jouet, A., et al. Deep amplicon sequencing for culture-free prediction of susceptibility or resistance to 13 anti-tuberculous drugs. Eur Respir J. 57 (3), 2002338(2021).
  2. George, S., et al. DNA Thermo-Protection Facilitates Whole Genome Sequencing of Mycobacteria Direct from Clinical Samples by the Nanopore Platform. bioRxiv. , (2020).
  3. Doyle, R. M., et al. Direct whole-genome sequencing of sputum accurately identifies drug-resistant mycobacterium tuberculosis faster than MGIT culture sequencing. J Clin Microbiol. 56 (8), e00666-e00718 (2018).
  4. Noordhoek, G. T., et al. Sensitivity and Specificity of PCR for Detection of Mycobacterium Tuberculosis: A Blind Comparison Study among Seven Laboratories. J Clin Microbiol. 32, (1994).
  5. Jaber, M., Rattan, A., Verma, A., Tyagi, J., Kumar, R. A simple method of DNA extraction from Mycobacterium tuberculosis. Tubercle Lung Dis. 76 (6), 578-581 (1995).
  6. Käser, M., Ruf, M. T., Hauser, J., Marsollier, L., Pluschke, G. Optimized method for preparation of DNA from pathogenic and environmental mycobacteria. Appl Environ Microbiol. 75 (2), 414-418 (2009).
  7. De Almeida, I. N., Da Silva Carvalho, W., Rossetti, M. L., Costa, E. R. D., De Miranda, S. S. Evaluation of Six Different DNA Extraction Methods for Detection of Mycobacterium Tuberculosis by Means of PCR-IS6110: Preliminary Study. BMC Res Notes. 6, 561(2013).
  8. Pan, S., et al. Comparison of four DNA extraction methods for detecting Mycobacterium tuberculosis by real-time PCR and its clinical application in pulmonary tuberculosis. J Thorac Dis. 5 (3), 251-257 (2013).
  9. Kelly-Cirino, C., Niles, J., Ray, B., Stewart, A. Maximizing Mycobacterium Tuberculosis DNA Yield for Molecular Methods with PrepIT.MAX. PD-WP-00045 (Issue 2/2015-11), Accessed January 27 (2020).
  10. Votintseva, A. A., et al. Same-day diagnostic and surveillance data for tuberculosis via whole-genome sequencing of direct respiratory samples. J Clin Microbiol. 55 (5), 1285-1298 (2017).
  11. Odumeru, J., Gao, A., Chen, S., Raymond, M., Mutharia, L. Use of the Bead Beater for Preparation of Mycobacterium Paratuberculosis Template DNA in Milk. Can J Vet Res. 65 (4), 201-205 (2001).
  12. Oh, T. S., et al. An Effective Method of RNA Extraction from Mycobacterium tuberculosis. Ann Clin Microbiol. 19 (1), 20-23 (2016).
  13. Miyata, M., et al. Assessment of the quality of dna extracted by two techniques from mycobacterium tuberculosis for fast molecular identification and genotyping. Braz J Microbiol. 42 (2), 774-777 (2011).
  14. Votintseva, A. A., et al. Mycobacterial DNA extraction for whole-genome sequencing from early positive liquid (MGIT) cultures. J Clin Microbiol. 53 (4), 1137-1143 (2015).
  15. Kolia-Diafouka, P., et al. Optimized Lysis-Extraction Method Combined With IS6110-Amplification for Detection of Mycobacterium tuberculosis in Paucibacillary Sputum Specimens. Front Microbiol. 9, 2224(2018).
  16. Bonnet, I., et al. A Comprehensive Evaluation of GeneLEAD VIII DNA Platform Combined to Deeplex Myc-TB Assay to Detect in 8 Days Drug Resistance to 13 Antituberculous Drugs and Transmission of Mycobacterium tuberculosis Complex Directly From Clinical Samples. Front Cell Infect Microbiol. 11, 707244(2021).
  17. Mann, B. C., et al. Systematic review and meta-analysis of protocols and yield of direct from sputum sequencing of Mycobacterium tuberculosis. bioRxiv. , (2024).
  18. Schwab, T. C., et al. Field evaluation of nanopore targeted next-generation sequencing to predict drug-resistant tuberculosis from native sputum in South Africa and Zambia. J Clin Microbiol. 63 (3), e0139024(2025).
  19. Colman, R. E., Seifert, M., De la Rossa, A., et al. Evaluating culture-free targeted next-generation sequencing for diagnosing drug-resistant tuberculosis: a multicentre clinical study of two end-to-end commercial workflows. Lancet Infect Dis. 25 (3), 325-334 (2025).
  20. Oberacker, P., et al. Bio-On-Magnetic-Beads (BOMB): Open platform for high-throughput nucleic acid extraction and manipulation. PLoS Biol. 17 (1), e3000107(2019).
  21. Limberis, J. D., Metcalfe, J. Z. Turbolysis: A low-cost, small footprint alternative to commercial bead beaters for cell lysis. HardwareX. 19, e00576(2024).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Mycobacterial DNA ExtractionBead BeatingCustom BufferTuberculosis DiagnosticsDrug Resistance DetectionSputum Sample ProcessingMagnetic Bead CleanupQuantitative PCRNext Generation SequencingCell Lysis

Related Articles