הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

יצירת אורגנואידים במעי אפיקלי החוצה והערכת קצב התפשטות האורגנואידים באמצעות תיוג EdU

2.5K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/68039

⸱

28 במרץ 2025

 ,  ,  ,  , 
1Small Animal Internal Medicine, Department for Small Animals and Horses, University of Veterinary Medicine, 2Cluster of Excellence Physics of Life, TU Dresden, 3Unit for Microbiology, Center for Pathobiology, Department for Biological Sciences and Pathobiology, University of Veterinary Medicine

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מתארים פרוטוקול ליצירת אורגנואידים במעי אפיקליים מתרביות אורגנואידים סטנדרטיות משובצות מטריצה. הוא גם מתאר את השילוב הבא של EdU בתאים המתרבים באופן פעיל ואת הכימות האוטומטי למחצה של תאים חיוביים ל-EdU.

תקציר

כאן, אנו מתארים את הדור של תרביות צפות של אורגנואידים במעי הקודקודים מתרביות אורגנואידים במעי משובצות הידרוג'ל. במקביל, תרביות אורגנואידים צפות בבסיס החוצה נקבעות להשוואה ישירה בין אורגנואידים קודקודיים ובזאליים החוצה. אורגנואידים אפיקליים ובסיסיים כפופים לאחר מכן לאנלוגי התימידין 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU), המשולב ב-DNA החדש שסונתז במהלך שלב ה-S של חלוקת התא. ניתן לדמיין שילוב זה ב-DNA באורגנואידים שלמים מבחינה מורפולוגית באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית של סריקת לייזר. תאים המסומנים ב-Hoechst33342 ו-EdU מכומתים לאחר מכן בצורה חצי אוטומטית באמצעות תוכנת ניתוח תמונה. חישוב אחוז התאים החיוביים ל-EdU ממספר התאים הכולל מאפשר ניתוח של התפשטות תאים באורגנואידים תלת מימדיים (3D). למרות שהוא משמש כאן לניתוח התפשטות באורגנואידים במעי, הפרוטוקול ישים לניתוח של כתמים ספציפיים לגרעין מסוגים שונים גם באורגנואידים אחרים או בתרביות תאים דו-ממדיות.

מבוא

אורגנואידים במעי הם מודלים תלת מימדיים במבחנה המסכמים את אפיתל המעי המורכב מסוגי תאים שונים. ניתן ליצור אורגנואידים אלה בקלות מתאי גזע בוגרים המבודדים מקריפטות מעיים1. מכיוון שאורגנואידים קרובים הרבה יותר לאפיתל in vivo, הם הופכים חשובים יותר ויותר במחקר ביו-רפואי. אורגנואידים של המעי משמשים לא רק לניתוח מנגנונים פיזיולוגיים (למשל, איתות נישת מעיים 2,3 והתמיינות תאים 4,5) אלא גם למחקר על מחלות זיהומיות 6,7. עם זאת, גידול תאים מקוטבים בתלת מימד הסוגר לומן מרכזי הוא מאתגר, מכיוון שמשטח התא האפיקלי בסופו של דבר אינו נגיש בתוך לומן האורגנואיד. בחינת ההבדלים בין משטחי תאים אפיקליים ובסיסיים יכולה להיות חשובה במחקרים מטבוליים, כפי שמודגם על ידי הבדלים בספיגת חומצות שומן8 ומחקר מחלות זיהומיות 9,10,11,12.

יצירת מה שנקרא אורגנואידים אפיקליים היא אפשרות קלה להתגבר על בעיה זו. על ידי הסרת המטריצה החוץ-תאית מתרביות אורגנואידים סטנדרטיות (כלומר, אורגנואידים בסיסיים, משובצים במטריצה) וזריעת אורגנואידים אלה בתווך נטול מטריצה, ניתן לגרום למתג קוטביות9.

כפי שפרסמנו בעבר, רוב האורגנואידים הופכים את הקוטביות שלהם תוך 12 שעות. עם זאת, לוקח 48-72 שעות להשיג תרבית עם יותר מ-90% אורגנואידים אפיקליים. למרות יתרונם בכך שהם מאפשרים גישה למשטח התא האפיקלי, אורגנואידים אפיקליים מראים ירידה משמעותית בהתפשטות לאחר היפוך הקוטביות בעוד ששיעורי מוות התאים עולים13. גורם הפעילות הפרוליפרטיבית יכול לייצג משתנה מבלבל בניתוחים שונים ויש לזכור אותו בעת תכנון ניסוי.

כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט להקמת תרביות אורגנואידים אפיקליים במעי ואורגנואידים בקרה בזאליים צפים לניתוחים במורד הזרם. יתר על כן, אנו מתארים תיוג עם 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU), המשולב ב-DNA שסונתז לאחרונה ובכך מסמן תאים מתרבים באופן פעיל. אנו מתארים עוד את ניתוח התמונה החצי אוטומטי של קצב התפשטות האורגנואידים באמצעות התוכנה arivis Pro (Zeiss) על ידי כימות של תאי EdU+ . סכימה של התהליך מתוארת באיור 1.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

נעשה שימוש באורגנואידים במעי שמקורם בתאי גזע בוגרים מכלבים, שהוקמו על פי Kramer et al., 202014 . בהתבסס על הנחיות ועדת האתיקה המוסדית, השימוש בחומר רקמה שנאסף במהלך כריתה טיפולית או לאחר המוות נכלל ב"הסכמת הבעלים לטיפול" של האוניברסיטה, שנחתמה על ידי כל בעלי המטופלים.

1. תרבות אורגנואידים

  1. תרבית אורגנואידים במעי שמקורם בתאי גזע בוגרים המוטבעים במטריצת תמצית קרום הבסיס (BME) לבחירה בצלחות של 24 בארות ופיצול אותם באופן מכני באמצעות פיפטות זכוכית כמתואר בפירוט ב- Pleguezuelos et al., 202015.
    הערה: עבור הפרוטוקול המתואר כאן, Geltrex שימש כ-BME.
  2. הסר בזהירות את המדיום המזוקק (טבלה 1) מהאורגנואידים המוטבעים ב-BME.
  3. הוסף 500 מיקרוליטר של 0.05% טריפסין-EDTA לבאר ונתק את כל כיפות המטריצה מהבאר על ידי פיפטינג למעלה ולמטה שוב ושוב. העבירו את האורגנואידים לצינור של 15 מ"ל והשעו היטב כדי לנתק לחלוטין את מטריצת ההידרוג'ל.
  4. דגירה של אורגנואידים עם 0.05% טריפסין-EDTA ב-37 מעלות צלזיוס באמבט מים עד שכל האורגנואידים מתפרקים לתאים בודדים או לאשכולות קטנים של תאים.
  5. לדלל את תרחיף הטריפסין/תא במדיום בסיסי (טבלה 1). השתמש לפחות פי שניים במדיום בסיסי מאשר טריפסין.
  6. תאי צנטריפוגה בטמפרטורה של 8 מעלות צלזיוס בטמפרטורה של 420 × גרם למשך 5 דקות. הסר כמה שיותר סופרנטנט.
  7. תאי זרע משובצים ב-BME בכמה בארות ששימשו לטריפסיניזציה בשלב 1.3. ולספק להם מדיום מזוקק (טבלה 1).
  8. דגרו תאים למשך 3 ימים בחממת תרבית תאים והמשיכו לשלב 2.1.

2. אינדוקציה של היפוך קוטביות ותיוג EdU

  1. הסר בזהירות את המדיום מהאורגנואידים המוטבעים ב-BME.
  2. הוסף 500 מיקרוליטר של תמיסת קציר אורגנואידים לכל באר ונתק את כל כיפות המטריצה מהבאר על ידי פיפטינג למעלה ולמטה שוב ושוב. העבירו את האורגנואידים לצינור של 15 מ"ל והשעו היטב כדי לנתק לחלוטין את מטריצת ההידרוג'ל.
  3. דגרו את צינור ה-15 מ"ל על קרח למשך שעה וחצי. יש לנער היטב את הצינור כל 10 דקות כדי למנוע התגבשות של האורגנואידים ולהבטיח דיסוציאציה אחידה של רכיבי ההידרוג'ל הנותרים.
  4. במהלך הדגירה, מצפים צלחת של 96 בארות בתמיסה נגד הידבקות. עבור כל באר של צלחת של 24 בארות שעברו טריפסין בשלב 1.3., מצפים 8 בארות של צלחת של 96 בארות. דגירה למשך שעה לפחות בטמפרטורת החדר (RT).
  5. הוסף לפחות פי שניים PBS מאשר תמיסת קצירת אורגנואידים ששימשה לצינור של 15 מ"ל וצנטריפוגה ב-8 מעלות צלזיוס ב-150 × גרם למשך 5 דקות.
  6. הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש את האורגנואידים ב-1 מ"ל של PBS.
  7. העבירו 500 מיקרוליטר של מתלה האורגנואיד/PBS בצינור נפרד של 15 מ"ל וצנטריפוגה את שני הצינורות שוב ב-8 מעלות צלזיוס ב-150 × גרם למשך 5 דקות.
  8. הסר את כל התמיסה נגד הידבקות מצלחת 96 הבארות.
  9. הסר כמה שיותר סופרנטנט לאחר הצנטריפוגה.
  10. השתמש באחד הצינורות ליצירת אורגנואידים בזליים צפים (BO) ובצינור השני לאורגנואידים אפיקליים (AO).
  11. עבור אורגנואידים של BO, הוסף 100 מיקרוליטר של מדיום מזוקק המכיל 7.5% BME לבאר של צלחת 96 הבארות לצינור אחד. מערבבים היטב ומפזרים את האורגנואידים באופן שווה על פני מספר הבארות הרצוי של צלחת 96 הבארות המצופה מראש.
  12. עבור אורגנואידים של AO, הוסף 100 מיקרוליטר מדיום מזוקק רגיל (ללא תוספת BME) לכל באר של צלחת 96 הבארות לצינור השני. מערבבים היטב ומפזרים את האורגנואידים באופן שווה על פני מספר הבארות הרצוי של צלחת 96 הבארות המצופה מראש.
  13. דגרו על האורגנואידים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 למשך 3 ימים.
    הערה: הבדלים מורפולוגיים יתחילו להופיע לאחר היום הראשון. עם זאת, תוצאות שפורסמו בעבר מראות כי לוקח לרוב המכריע של האורגנואידים כ-3 ימים להציג קוטביות אפיקלית13.
  14. בנקודות זמן מוגדרות, למשל, 24 שעות/48 שעות/72 שעות לאחר אינדוקציה של היפוך קוטביות, הוסף 50 מיקרוליטר של 3 מיקרומטר EdU מדולל במדיום מזוקק לכל בארות האורגנואידים שיש לסמן, כדי לקבל ריכוז סופי של 1 מיקרומטר EdU בכל באר.
  15. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 למשך 1.5 שעות.
  16. אסוף אורגנואידים עם תווית EdU באמצעות קצות רחבים והעביר אותם לצינור של 15 מ"ל.
  17. הוסף כמות שווה של 4% PFA לכל שפופרת (אורגנואידים BO ו-AO; ריכוז סופי של PFA = 2%) וערבב בזהירות.
  18. דגירה ב- RT למשך 15 דקות.
  19. הוסף לפחות פי שניים מכמות ה-PBS מכיוון שיש נפח בצינור 15 מ"ל וצנטריפוגה ב-8 מעלות צלזיוס ב-80 × גרם למשך 5 דקות.
  20. הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש את האורגנואידים ב-1 מ"ל של PBS.
  21. שוב צנטריפוגה ב-8 מעלות צלזיוס ב-80 × גרם למשך 5 דקות.
  22. הסר את הסופרנטנט, השהה מחדש את האורגנואידים ב-1 מ"ל PBS והעביר אותם לצינור של 1.5 מ"ל. אחסן את האורגנואידים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד לביצוע תגובת הצביעה של EdU (ראה סעיף 3).
  23. חזור על שלבים 2.14-2.22 עבור כל נקודת זמן שיש לנתח.

3. תגובת צביעה של Click-it EdU וצביעה של Hoechst 33342

  1. צנטריפוגה את האורגנואידים הקבועים (משלב 2.22.) בצינור של 1.5 מ"ל ב-4 מעלות צלזיוס ב-50 × גרם למשך 5 דקות.
  2. הסר את ה-supernatant והשהה מחדש את האורגנואידים ב-1 מ"ל של אלבומין סרום בקר 3% (BSA) מדולל ב-PBS באמצעות קצות קדח רחבים.
  3. חזור על שלבים 3.1. ו -3.2 (שלבי כביסה).
  4. הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש את האורגנואידים ב-1 מ"ל של 0.5% טריטון X-100 מדולל ב-PBS.
  5. דגירה ב- RT למשך 20 דקות.
  6. אורגנואידים צנטריפוגות ב-RT ב-50 × גרם למשך 5 דקות.
  7. בשפופרת טרייה, הכינו תוסף חיץ 1x על ידי ערבוב של 45 מיקרוליטר של H2O עם 5 מיקרוליטר של תוסף מאגר 10x.
  8. בשפופרת אחרת, הכינו את קוקטייל התגובה על ידי ערבוב הרכיבים הבאים: 385.8 מיקרוליטר של H2O, 43 מיקרוליטר של מאגר תגובה 10x, 20 מיקרוליטר של CuSO 4,1.2 מיקרוליטר של Alexa Fluor 647 אזיד, ו-50 מיקרוליטר o 1x תוסף מאגר (משלב 3.7).
    הערה: תערובת זו מספיקה לחמש תגובות וניתן להגדיל ולהקטין אותה בהתאם למספר הנדרש של תגובות צביעה.
  9. חזור על שלבים 3.1. ו-3.2. פעמיים (שלבי כביסה).
  10. הסר את הסופרנטנט והוסף 100 מיקרוליטר קוקטייל תגובה (שלב 3.8.) לכל צינור עם אורגנואידים.
  11. דגירה ב-RT למשך 30 דקות בחושך.
  12. חזור על שלבים 3.1. ו -3.2 (שלבי כביסה).
  13. אורגנואידים צנטריפוגות במשקל 50 × גרם למשך 5 דקות ב-RT.
  14. השעו אורגנואידים ב-1 מ"ל של 10 מיקרוגרם/מ"ל Hoechst33342 מדולל ב-PBS.
  15. דגירה ב-RT למשך 45 דקות בחושך.
  16. חזור על שלבים 3.1. ו -3.2 (שלבי כביסה).
  17. אורגנואידים צנטריפוגה במשקל 50 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
  18. זרעי אורגנואידים במטריצת BME לבחירה בשקופית התואמת למיקרוסקופיה קונפוקלית (למשל, באר μ-שקופית 18)
  19. דמיין אורגנואידים תחת מיקרוסקופ קונפוקלי.

4. ניתוח תמונה חצי אוטומטי

הערה: לצורך ניתוח זה, נעשה שימוש ב-arivis Pro גרסה 4.2.2 (תוכנת ניתוח תמונות).

  1. ייבא את תמונות המיקרוסקופ הקונפוקלי לתוכנת ניתוח התמונות והגדר תיקיה בה יישמר קובץ הניתוח. השתמש באפשרות תמונות כנקודות זמן כדי לייבא תמונות מרובות (שכפול תמונות, נקודות זמן שונות, טיפולים שונים וכו'). לאחר מכן כל תמונה תטופל כנקודת זמן אחת, מה שיאפשר מעבר קל בין התמונות הבודדות.
  2. פתח את לוח הניתוח וייבא את צינור הניתוח שסופק כקובץ משלים 1 (arivis_EdU_pipeline).
  3. השתמשו בכלי Place New Objects וב-Sphere עם התג Organoid כדי להקיף בקלות את כל האורגנואידים המופרדים היטב.
  4. עבור לתמונה הבאה, כלומר לנקודת הזמן הבאה, והמשך לסמן אורגנואידים עבור כל התמונות.
  5. עבור אורגנואידים הקרובים מאוד זה לזה ולכן לא ניתן להפריד אותם באמצעות מצב Sphere , פתח את רשימת האובייקטים והפעל את התג Organoid.
  6. המשך להשתמש בכלי Draw Objects במצב מצולע כדי לסמן קווי מתאר אורגנואידים באופן ידני.
    הערה: ברשימת האובייקטים, כל האורגנואידים מסומנים כעת ומוקצים לנקודת זמן מסוימת. נקודת זמן זו תואמת לסדר התמונות שיובאו בשלב 4.1. כעת ניתן לשנות את שמות נקודות הזמן הללו כך שיתאימו לשם התמונה המקורי אם אתה מעדיף.
  7. ברשימת האובייקטים, סמן את כל האובייקטים (=אורגנואידים) ולחץ באמצעות לחצן העכבר הימני ולאחר מכן לחץ על הסר תגים כדי להסיר את התג Manual מכל האובייקטים.
  8. השבת את התג Organoid ברשימת האובייקטים וסמן את כל האזורים בתוך אובייקטים שהוגדרו קודם לכן שיש לא לכלול בניתוח באמצעות הכלי Draw Objects במצב מצולע . אזורים אלה עשויים לכלול תאים מתים בתוך לומן האורגנואיד או אזורים מטושטשים, מה שעלול להטות את הניתוח.
  9. בעת פתיחת רשימת האובייקטים, ודא שכל האורגנואידים מופיעים עם התג Organoid וכל האזורים שיש לא לכלול כוללים את התג Manual.
  10. התחל את צינור הניתוח על ידי לחיצה על החץ בחלונית השמאלית העליונה.
    הערה: התוכנה מפלחת כעת את כל הגרעינים בערוצי Hoechst33342 ו-EdU. צינור ניתוח זה מתייחס רק לגרעיני Hoechst33342+ ו-EdU+ מפולחים בגודל של יותר מ-15 מיקרומטר2 (כלומר, שטח במקטע הגרעין) כדי להבטיח שגרעינים קטנים, שמקורם ככל הנראה בתאים מתים, אינם נכללים בניתוח.
  11. חפש את תוצאות הניתוח ברשימת האובייקטים על-ידי לחיצה על התגית עמודות תכונה .
  12. עבור לתצוגת פרטי מאסטר ובחר את התג Organoids בחלונית העליונה ואת התכונה First Timepoint.
  13. בחלונית התחתונה, בחר את התכונות שיוצגו לכל אורגנואיד. השתמש בשטח הקרנה (x/y/z) (ווקסל), עוצמה ממוצעת # 1 (ערוץ EdU) ועוצמות SD #1.
  14. ייצא את התוצאות (דוח פירוט ראשי) באמצעות הפונקציה ייצוא של Excel .
  15. שמור את קובץ הניתוח וסגור את התוכנה.

5. קביעת שיעורי התפשטות אורגנואידים

  1. פתח את קובץ דוח פרטי האב המיוצא בשלב 4.14.
  2. יש כרטיסייה נפרדת אחת לכל תמונה מנותחת. חשב את סכום השטח/ווקסל עבור גרעינים וכתם EdU עבור כל תמונה. לאחר מכן, העתק את כל הנתונים המתקבלים לכרטיסייה קולקטיבית חדשה וקבץ את כל הנתונים המתייחסים לאותה נקודת זמן.
  3. לאחר מכן, חשב את השטח הכולל של גרעיני התא (כלומר, הסכום של שטח Hoechst33342+ ושטח EdU+ ) עבור כל תמונה.
  4. לאחר מכן, חלקו את השטח הכולל בפני עצמו (= 100%) ואת שטח ה-EdU+ הממוצע בשטח הכולל (=אחוז ה-DNA של EdU+ ).
  5. שרטט את אחוז ה-DNA המתפשט של אורגנואידים BO ו-AO על ציר ה-y ואת נקודות הזמן השונות על ציר ה-x.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

אורגנואידים שגדלו במשך 3 ימים לאחר טריפסיניזציה צריכים להיות באופן אידיאלי בין 50-250 מיקרומטר, כפי שמתואר באיור 2A. אורגנואידים גדולים בהרבה מזה עשויים שלא להפוך את הקוטביות שלהם ביעילות. אורגנואידים גדולים יותר עשויים גם להתחיל לנבוט, ושמנו לב שלאורגנואידים אלה יכולות להיות בעיות גם בהיפוך קוטביות יעיל. אורגנואידים בסיסיים וקודקודיים מציגים הבדלים מורפולוגיים ברורים כבר בהדמיית שדה בהיר. בעוד שאורגנואידים בסיסיים שומרים על לומן גדול (איור 2

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

פרוטוקול זה מתאר בפירוט כיצד לגרום להיפוך קוטביות בתרביות אורגנואידים סטנדרטיות שמקורן בתאי גזע בוגרים. אורגנואידים אפיקליים משרתים את המטרה של קבלת גישה למשטח התא האפיקלי, המכוון בדרך כלל לכיוון לומן האורגנואיד. היכולת לחקור את המשטח האפיקלי יכולה להיות בעלת חשיבות גבוהה עבור יישומים מסוימים מכיוון שזהו החלק של קרום התא החשוף לכל תכולת מערכת העיכול בתנאים פיזיולוגיים in vivo. שיטות אחרות לאתגר את המשטח האפיקלי באופן ספציפי הן מיקרו-הזרקה16, שימוש בחד-שכב...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין ניגוד עניינים.

תודות

מחקר זה נתמך באמצעות משאבים של מתקן הליבה של VetImaging (VetCore, Vetmeduni, אוסטריה). אנו רוצים להודות לאורסולה רייכרט על תמיכתה בניתוח תמונה כמותי למחצה. GC הוא זוכה מלגת DOC (מענק מספר 26349) של האקדמיה האוסטרית למדעים (ÖAW) במחלקה לרפואה פנימית של בעלי חיים קטנים ב-Vetmeduni.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
24 צלחות בארBiologix07-6024
[Leu15]-Gastrin I אנושי, ≥ 95% (HPLC)Sigma-AldrichG-9145
µ-Slide 18 באר זכוכית תחתונהibidi81817
100X תוסף פניצילין-סטרפטומיצין למדיהGibco/Thermo15140122
A 83-01 טוקריס ביוסיינס2939/10 
תמיסת שטיפה נגד היצמדותStemCell Technologies7010
arivis Pro Zeissגרסה 4.2.2
B27 סרום תוסף תזונה (50X),Gibco/Thermo17504044
Bisbenzimide H 33342 (Hoechst 33342)Abcamab145597
סרום בקר אלבומיןSigma-AldrichA7906-100G
Click-iT EdU ערכת התפשטות תאים להדמיה, Alexa Fluor 647 צבעThermo ScientificC10340
DMEM-F12Gibco/Thermo11320033
GeltrexGibco/ThermoA1413202
תוסף GlutaMAX Gibco / Thermo35050061
HEPES 1 M, נוזליGibco / Thermo15630056
Human FGF-basicPeproTech100-18B-100 & micro; G
אנושי HGF PeproTech100-39-100& G 
IGF-I  אנושי;PeproTech100-11-100& G
נוגין אנושי (יונקים) PeproTech120-10C-200& G 
N-אצטיל-L-ציסטאין, נבדק בתרבית תאים, BioReagent סיגמא-אולדריץ'A9165-5G 
תמיסת קציר אורגנואידיםThermoC10340
Triton(TM) X-100, לביולוגיה מולקולריתSigma-AldrichT8787-250ML
Trypsin-EDTA (0.05%), פנולאדום Gibco/Thermo25300054
נוזלי תמיסת חיץ

מקורות

  1. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, 262-265 (2009).
  2. Li, Y., et al. BMP suppresses Wnt signaling via the Bcl11b-regulated NuRD complex to maintain intestinal stem cells. EMBO J. 43 (23), 6032-6051 (2024).
  3. Gaowa, A., Leangpanich, S., Park, E. J., Kawamoto, E., Shimaoka, M. Irisin promotes intestinal epithelial cell proliferation via Wnt/β-catenin and focal adhesion kinase signaling pathways. Sci Rep. 14, 25702(2024).
  4. Basak, O., et al. Induced quiescence of Lgr5+ stem cells in intestinal organoids enables differentiation of hormone-producing enteroendocrine cells. Cell Stem Cell. 20 (2), 177-190 (2017).
  5. Ludikhuize, M. C., et al. Mitochondria define intestinal stem cell differentiation downstream of a FOXO/Notch axis. Cell Metab. 32 (5), 889-900.e7 (2020).
  6. Ettayebi, K., et al. Replication of human noroviruses in stem cell-derived human enteroids. Science (1979). 353 (6306), 1387-1393 (2016).
  7. Zhou, J., et al. Infection of bat and human intestinal organoids by SARS-CoV-2. Nat Med. 26 (7), 1077-1083 (2020).
  8. Joo, S. -S., et al. Porcine intestinal apical-out organoid model for gut function study. Animals. 12 (3), 372(2022).
  9. Co, J. Y., et al. Controlling epithelial polarity: A human enteroid model for host-pathogen interactions. Cell Rep. 26, 2509-2520.e4 (2019).
  10. Sasaki, N., et al. Development of a scalable coculture system for gut anaerobes and human colon epithelium. Gastroenterology. 159 (1), 388-390.e5 (2020).
  11. Mayorgas, A., et al. A novel strategy to study the invasive capability of adherent-invasive escherichia coli by using human primary organoid-derived epithelial monolayers. Front Immunol. 12, 646906(2021).
  12. Csukovich, G., et al. Neutralising effects of different antibodies on clostridioides difficile toxins TcdA and TcdB in a translational approach. Int J Mol Sci. 24 (4), 3867(2023).
  13. Csukovich, G., et al. Polarity reversal of canine intestinal organoids reduces proliferation and increases cell death. Cell Prolif. 57 (2), e13544(2023).
  14. Kramer, N., et al. Generation of differentiating and long-living intestinal organoids reflecting the cellular diversity of canine intestine. Cells. 9 (4), 822(2020).
  15. Pleguezuelos-Manzano, C., et al. Establishment and culture of human intestinal organoids derived from adult stem cells. Curr Protoc Immunol. 130 (1), e106(2020).
  16. Dutta, D., Heo, I., O'Connor, R. Studying infection in 3D tissue-derived human organoid culture systems by microinjection. J Vis Exp. (151), e59610(2019).
  17. Kumar, A., et al. Decreased SLC26A3 expression and function in intestinal epithelial cells in response to Cryptosporidium parvum infection. Am J Physiol Cell Physiol. 317 (6), C1205-C1212 (2019).
  18. Dutta, D., Clevers, H. Organoid culture systems to study host-pathogen interactions. Curr Opin Immunol. 48, 15-22 (2017).
  19. Csukovich, G., Pratscher, B., Burgener, I. A. The world of organoids: Gastrointestinal disease modelling in the age of 3R and one health with specific relevance to dogs and cats. Animals. 12 (18), 2461(2022).
  20. Han, X., et al. Creating a more perfect union: Modeling intestinal bacteria-epithelial interactions using organoids. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 12 (2), 769-782 (2021).
  21. Li, Y., et al. Next-generation porcine intestinal organoids: an apical-out organoid model for swine enteric virus infection and immune response investigations. J Virol. 94 (21), e01006-e01020 (2020).
  22. Smith, D., et al. The development of ovine gastric and intestinal organoids for studying ruminant host-pathogen interactions. Front Cell Infect Microbiol. 11, 733811(2021).
  23. Nash, T. J., Morris, K. M., Mabbott, N. A., Vervelde, L. Inside-out chicken enteroids with leukocyte component as a model to study host-pathogen interactions. Commun Biol. 4 (1), 377(2021).
  24. Hanson, K. I., Weiss, A. A. Intestinal tissue response to Shiga toxin exposure. mBio. 15 (9), e0123224(2024).
  25. Hovhannisyan, P., et al. Infection of human organoids supports an intestinal niche for Chlamydia trachomatis. PLoS Pathog. 20 (8), e1012144(2024).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

אורגנואידים עם צד אפקלי החוצהאורגנואידים עם צד בסאלי החוצהמיקרוסקופיה קונפוקליתתרבית אורגנואידים צפההיפוך קוטביות תאיתצביעת גרעיןתוכנה לניתוח תמונות
יצירת אורגנואידים במעי אפיקלי החוצה והערכת קצב התפשטות האורגנואידים באמצעות תיוג EdU
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.